CN105492462B - 凝集素样氧化的ldl受体1抗体和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合人凝集素样氧化的LDL(低密度脂蛋白)受体1(下文中，有时称为“LOX‑1”)的单克隆抗体，以及包含其的药物组合物和治疗方法。

Description

凝集素样氧化的LDL受体1抗体和使用方法
背景技术
血管疾病仍然是全世界发病率和死亡率的主要原因之一。靶向传统风险因素的药物降低了部分血管疾病的风险。然而，实验和临床数据表明，其他新的因素可解释更多部分的冠状动脉、大脑动脉和外周动脉疾病的风险和其临床表现。
由清道夫受体介导的血管细胞对氧化修饰的低密度脂蛋白(LDL)颗粒(oxLDL)的摄取失调被认为是动脉粥样硬化形成的关键步骤。除了介导氧化脂质的摄取外，所述清道夫受体可以介导促氧化和促炎症信号传导途径的活化，这些途径参与内皮细胞和巨噬细胞的活化，并从而导致动脉粥样硬化的进展和斑块侵蚀/破裂，以及微血管功能障碍，损害组织灌注和氧输送/利用，导致心肌或下肢缺血。
凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)是一种表达于血管内皮细胞、单核细胞和巨噬细胞、血管平滑肌细胞和血小板的多功能清道夫受体。LOX-1结合oxLDL和其他氧化脂质，导致NADPH氧化酶的活化，生成活性氧，包括超氧阴离子。超氧阴离子失活内皮一氧化氮，并活化MAP激酶和NF-κB。这进而诱导炎性粘附分子、细胞因子和趋化因子、以及基质金属蛋白酶和促凋亡调节子的表达。
在内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞中oxLDL-LOX-1介导的信号传导的促炎症、促氧化和促凋亡结果被认为在动脉粥样硬化进展和斑块不稳定中起关键作用，并且还可以在损害组织灌注和氧输送中发挥作用，导致缺血。晚期动脉粥样硬化和器官缺血的临床后果包括：急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、不稳定心绞痛、中风、心绞痛、跛行和严重肢体缺血。另外，氧化应激、血管炎症和导致的微血管功能障碍被认为引起糖尿病性血管疾病，包括糖尿病肾脏病变和糖尿病视网膜病变。
在正常生理条件下基础LOX-1的内皮表达水平是相对低的，然而，在血管疾病相关的病症中血管LOX-1表达上调。已表明氧化应激、促炎细胞因子、C-反应蛋白(CRP)和血管紧张素II增加内皮LOX-1水平。在动脉粥样硬化和糖尿病动物的内皮中，以及在分离自血管疾病患者的单核细胞/巨噬细胞中，LOX-1也上调。高血糖症、高级糖化终产物和致动脉粥样硬化脂蛋白也上调LOX-1的表达，为糖尿病和血管并发症之间提供特定的分子关联机制。
细胞因子和CRP上调LOX-1还表明在高风险患者和糖尿病患者中常规血管风险因素和加速血管疾病之间的联系。在急性冠脉综合征患者中CRP和可溶性LOX-1二者升高。体外数据表明，抗LOX-1抗体防止CRP介导的单核细胞粘附至人主动脉内皮细胞，进一步支持了LOX-1作为粘附分子与血管炎症相关的作用(Li等人,Circulation Research 2004,95:877-883)。
增加表达的LOX-1偶联至升高水平的oxLDL及其他氧化脂蛋白，部分地通过活化NADPH氧化酶和产生活性氧诱导内皮功能障碍。实验上，中和抗LOX-1抗体可逆转ApoE-敲除小鼠中氧化应激诱导的内皮功能障碍(Xu等人,Arteriosclerosis,Thrombosis andVascular Biology 2007,27:871-877)。在这项研究中，抗LOX-1抗体增加生物可利用的一氧化氮和eNOS蛋白二者的表达。
体内实验数据显示，在氧化脂质的存在下血管和巨噬细胞型LOX-1的过表达通过活化促氧化和促炎症信号传导途径导致动脉粥样硬化和微血管功能障碍。因此，预期抑制LOX-1可防止动脉粥样硬化的发生和进展，以及防止其急性并发症，例如急性冠脉综合征、心肌梗塞和不稳定型心绞痛。此外，LOX-1的抑制还有望改善微血管功能障碍，防止组织缺血的临床表现，如慢性心绞痛、顽固性心绞痛、跛行和严重肢体缺血。
LOX-1的抑制不仅在治疗和预防动脉粥样硬化血管疾病中是有用的，在治疗特征在于氧化应激和炎症的其他病理病症中也是有用的，如类风湿性关节炎、各种形式的血管炎、葡萄膜炎、年龄相关的黄斑变性，以及在预防自体免疫性疾病的心血管事件中是有用的(如红斑狼疮，牛皮癣)。
总之，实验和临床数据表明，LOX-1可能是与氧化应激、炎症和血管疾病相关的重要氧化脂质的受体。本发明所述的抗LOX-1抗体和抗原结合片段抑制oxLDL和其他氧化脂质/脂蛋白与LOX-1结合，防止LOX-1活化，从而减少血管氧化应激和炎症。这些抗体预期能预防和改善血管疾病的急性和慢性表现，并防止和改善特征在于氧化应激和炎症的其他疾病。
发明内容
本发明涉及结合人凝集素样氧化的LDL(低密度脂蛋白)受体1(下文中，有时称为“LOX-1”)的单克隆抗体，以及包含该单克隆抗体的药物组合物和治疗方法。
本文所述的分离的抗LOX-1抗体或抗原结合片段，以小于或等于100pM的平衡解离常数(KD)结合LOX-1。例如，本文所述的分离的抗体或抗原结合片段可以小于或等于100pM、小于或等于50pM、小于或等于45pM、小于或等于40pM、小于或等于35pM的KD结合人LOX-1。更具体而言，本文所述的分离的抗体或抗原结合片段也可以小于或等于34pM的KD结合人LOX-1，如通过Biacore测量的，或以小于或等于4pM的KD结合人LOX-1，如通过溶液平衡滴定试验(SET)测量的；并且还可以小于或等于53pM的KD结合食蟹猴LOX-1，如通过Biacore测量的，或以小于或等于4pM的KD结合食蟹猴LOX-1，如通过SET测量的。
本发明涉及结合人和食蟹猴LOX-1的分离的抗体或其抗原结合片段。本发明还涉及结合LOX-1C末端凝集素样结构域(oxLDL结合结构域)的分离的抗体或其抗原结合片段。本发明还涉及结合包含人LOX-1的氨基酸残基228-246(FRVRGAVSQTYPSGTCAYI；SEQ ID NO：3)的表位的分离的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括结合包含人LOX-1(SEQ ID NO：1)上人LOX-1氨基酸残基Arg229和Arg231的表位的分离的抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其结合LOX-1，并且进一步地与表1所述的抗体竞争结合。本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其与表1所述的抗体结合相同的表位。
可通过溶液平衡滴定(SET)来确定本文描述的分离的抗体和抗原结合片段的结合亲和力。SET方法是本领域已知的，并且在下面进一步详细描述。或者，可通过Biacore试验来确定本文所述的分离的抗体或片段的结合亲和力。Biacore动力学试验方法是本领域已知的，并在下面进一步详细描述。
本中所述的分离的抗LOX-1抗体和抗原结合片段可用于抑制LOX-1结合oxLDL(也称为修饰的LDL)。
本文所述的分离的抗LOX-1抗体和抗原结合片段可用于抑制LOX-1以小于或等于100nM、小于或等于50nM、小于或等于35nM、小于或等于25nM、小于或等于10nM或小于或等于5.2nM的IC50结合多种形式的修饰的LDL(低密度脂蛋白)。更具体地，如本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段能抑制LOX-1以小于或等于100nM、小于或等于50nM、小于或等于35nM、小于或等于25nM、小于或等于10nM或小于或等于5.2nM的IC50结合硫酸铜氧化修饰的LDL(ox-LDL)。更具体地，如本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段能抑制LOX-1以小于或等于100nM、小于或等于50nM、小于或等于35nM、小于或等于25nM、小于或等于20nM或小于或等于18nM的IC50结合丙二醛修饰的LDL。更具体地，如本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段能抑制LOX-1以小于或等于100nM、小于或等于50nM、小于或等于35nM、小于或等于25nM、小于或等于10nM或小于或等于5nM的IC50结合次氯酸盐修饰的LDL。
分离的抗LOX-1抗体或其抗原结合片段可用于降低LOX-1和/或NADPH氧化酶的表达(NADPH是NADP、或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的还原形式)。
分离的抗LOX-1抗体或其抗原结合片段可用于抑制氧化应激(例如，阻断氧化应激的诱导)，例如，通过抑制oxLDL结合LOX-1。分离的抗LOX-1抗体或其抗原结合片段可用于阻断oxLDL刺激的活性氧(ROS)产生。可使用分离的抗体或其抗原结合片段预防、治疗、或改善的血管氧化应激，可通过诱导血管收缩、损害血管舒张、以及增加需氧量导致心肌缺血。
分离的抗LOX-1抗体或其抗原结合片段可用于将内皮一氧化氮合酶(eNOS)水平恢复到健康的、体内平衡状态。内皮NOS是生成血管中一氧化氮(NO)的一氧化氮合酶，其通过抑制平滑肌收缩和血小板聚集参与调节血管张力；其下调与LOX-1相关的内皮细胞功能障碍有关。
如本文所述的分离的抗LOX-1抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、人或人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、Fv片段、F(ab')2片段、或scFv片段、和/或IgG同种型。
如本文所述的分离的抗LOX-1抗体或其抗原结合片段也可包括框架区，所述框架区中的氨基酸被取代为来自各人VH或VL种系序列的抗体框架。
本发明的另一个方面包括分离的抗体或其抗原结合片段，其具有表1所述的Fab的全长重链和轻链序列。更具体地，分离的抗体或其抗原结合片段可以具有Fab FF1、FF3、FF4、FF5和FF6的重链和轻链序列。
本发明的进一步的方面包括分离的抗体或其抗原结合片段，其具有表1所述的Fab的重链和轻链可变结构域。更具体地，分离的抗体或其抗原结合片段可以具有Fab FF1、FF3、FF4、FF5和FF6的重链和轻链可变结构域序列。
本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO：8，28，48，68和88的重链CDR1；选自SEQ ID NO：9，29，49，69和89的重链CDR2；和选自SEQ ID NO：10，30，50，70和90的重链CDR3，其中该分离的抗体或其抗原结合片段结合人LOX-1。在另一个方面，这样的分离的抗体或其抗原结合片段进一步包含选自SEQ ID NO：18，38，58，78和98的轻链CDR1；选自SEQ ID NO：19，39，59，79和99的轻链CDR2；选自SEQ ID NO：20，40，60，80和100的轻链CDR3。
本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO：18，38，58，78和98的轻链CDR1；选自SEQ ID NO：19，39，59，79和99的轻链CDR2；和选自SEQ ID NO：20，40，60，80和100的轻链CDR3，其中该分离的抗体或其抗原结合片段结合人LOX-1。
本发明还涉及结合LOX-1的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有HCDR1，HCDR2和HCDR3和LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中HCDR1，HCDR2和HCDR3包含SEQ ID NO：8，9和10，以及LCDR1，LCDR2，LCDR3包含SEQ ID NO：18，19和20；或HCDR1，HCDR2和HCDR3包含SEQ ID NO：28，29和30，以及LCDR1，LCDR2，LCDR3包含SEQ ID NO：38，39和40；或HCDR1，HCDR2和HCDR3包含SEQ ID NO：48，49和50，和LCDR1，LCDR2，LCDR3包含SEQ ID NO：58，59和60；或HCDR1，HCDR2和HCDR3包含SEQ ID NO：68，69和70，和LCDR1，LCDR2，LCDR3包含SEQ ID NO：78，79和80；或HCDR1，HCDR2和HCDR3包含SEQ ID NO：88，89和90，和LCDR1，LCDR2，LCDR3包含SEQ IDNO：98，99和100。
本发明还涉及抗体或抗原结合片段，其具有Chothia定义的SEQ ID NO：14，34，54，74或94的可变重链的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO：24，44，64，84或104的可变轻链的LCDR1，LCDR2和LCDR3。在本发明的另一个方面中，抗体或抗原结合片段可具有由Kabat定义的SEQ ID NO：14，34，54，74或94的重链可变结构域序列的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和SEQ IDNO：24，44，64，84或104的轻链可变结构域序列的LCDR1，LCDR2和LCDR3。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO：14，34，54，74和94的重链可变结构域序列。分离的抗体或抗原结合片段可进一步包含轻链可变结构域序列，其中所述重链可变结构域和轻链可变结构域结合，形成LOX-1的抗原结合位点。特别是轻链可变结构域序列可以选自SEQ ID NO：24，44，64，84和104，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合LOX-1。
本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO：24，44，64，84和104的轻链可变结构域序列，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合人LOX-1。分离的抗体或抗原结合片段可以进一步包含重链可变结构域序列，其中所述轻链可变区和重链可变结构域结合，形成LOX-1的抗原结合位点。
特别是，结合LOX-1的分离的抗体或其抗原结合片段可具有分别包含SEQ ID NO：14和24；34和44；54和64；74和84；或94和104序列的重链和轻链可变结构域。
本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与选自SEQ ID NO：14，34，54，74和94的序列具有至少90％序列同一性的重链可变结构域，其中所述抗体结合LOX-1。在一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段也包含与选自SEQ ID NO：24，44，64，84和104的序列具有至少90％序列同一性的轻链可变结构域。在本发明的另一个方面，分离的抗体或抗原结合片段具有如Kabat定义和表1中所述的HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3。
本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其具有与选自SEQ ID NO：24，44，64，84和104的序列具有至少90％序列同一性的轻链可变结构域，其中所述抗体结合LOX-1。
在本发明的另一个方面，结合LOX-1的分离的抗体或其抗原结合片段可具有包含序列SEQ ID NO：16，36，56，76或96的重链。分离的抗体还可以包括轻链，所述轻链与重链结合形成人LOX-1的抗原结合位点。特别是，轻链可具有包含SEQ ID NO：26，46，66，86或106的序列。特别是，结合LOX-1的分离的抗体或其抗原结合片段可具有分别包含序列SEQ ID NO：16和26；36和46；56和66；76和86；或96和106的重链和轻链。
本发明还进一步涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与选自SEQ ID NO：16，36，56，76或96的序列具有至少90％序列同一性的重链，其中所述抗体结合LOX-1。在一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段还包含与选自SEQ ID NO：26，46，66，86或106的序列具有至少90％序列同一性的轻链。
本发明还进一步涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与选自SEQ ID NO：26，46，66，86或106的序列具有至少90％序列同一性的轻链，其中所述抗体结合LOX-1。
本发明还涉及包含本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段的组合物。以及抗体组合物组合可药用的载体。具体地说，本发明还包括药物组合物，其包含表1的抗体或抗原结合片段，如，例如抗体FF1，FF3，FF4，FF5和FF6。本发明还涉及药物组合物，其包含两种或更多表1的分离的抗体或其抗原结合片段的组合。
本发明还涉及编码可变重链的分离的核酸序列，所述可变重链具有选自SEQ IDNO：14，34，54，74和94的序列。特别是，所述核酸具有与选自SEQ ID NO：15，35，55，75和95的序列具有至少90％序列同一性的序列。在本发明进一步的方面，序列为SEQ ID NO：15，35，55，75和95。
本发明还涉及编码可变轻链的分离的核酸序列，其具有选自SEQ ID NO：25，45，65，85和105的序列。特别是核酸具有与选自SEQ ID NO：25，45，65，85和105的序列具有至少90％序列同一性的序列。在本发明的另一个方面，序列为SEQ ID NO：25，45，65，85和105。
本发明还涉及分离的核酸，其包含编码包含轻链可变结构域的多肽的序列，所述序列与选自SEQ ID NO：25，45，65，85和105的序列具有至少90％序列同一性。
本发明还涉及一种载体，其包括一种或多种本文所述的核酸分子。
本发明还涉及一种分离的宿主细胞，其包含编码上述抗体重链的重组DNA序列，和编码上述抗体轻链的第二重组DNA序列，其中所述DNA序列有效地连接到启动子，并且能够在宿主细胞中表达。可以预期，该抗体可以是人单克隆抗体。还可以预期，该宿主细胞是非人哺乳动物细胞。
本发明还涉及降低LOX-1表达和/或NADPH氧化酶表达的方法，其中所述方法包括使细胞与有效量的组合物接触的步骤，所述组合物包含本文中所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及抑制氧化的LDL(oxLDL)与人氧化的LDL受体(LOX-1)结合、或抑制人氧化的LDL受体介导的氧化的LDL并入细胞的方法，其中所述方法包括使细胞与有效量的组合物接触的步骤，所述组合物包含本文中所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
可以预期所述细胞是人细胞。进一步预期，该细胞是在受试者中。在一个实施方案中，可以预期细胞是内皮细胞。在其他实施方案中，细胞可以是一种或多种的巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、血管平滑肌细胞(SMC)、软骨细胞和心肌细胞。还可进一步预期的是，受试者是人。
本发明还涉及治疗、改善、或预防受试者中LOX-1相关疾病的方法，其中所述方法包括向受试者施用有效量组合物的步骤，所述组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段。在一个方面，LOX-1相关疾病与跛行相关(例如，间歇性跛行、卢瑟福II/III级跛行)。在一个方面，LOX-1相关疾病与心绞痛(例如，顽固性心绞痛)相关。可以预期受试者是人。
任何上述分离的抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
术语“LOX-1蛋白”或“LOX-1抗原”或“LOX-1”或“Lox1”可互换使用，指不同物种中的凝集素样氧化的LDL受体1(LOX-1)蛋白。例如，人LOX-1具有如表1所列的序列(SEQ IDNO：1)，并在先前的报告和文献(Nature,Vol.386,p.73-77,1997；Genomics,Vol.54,No.2,p.191-199,1998；Biochem.J.,Vol.339,Part 1,P.177-184,1999；Genbank AccessionNo.NP 002534)中描述了。其是E类清道夫受体，介导通过血管细胞摄取oxLDL和在血管细胞中的oxLDL信号传导，并且同样地，其是oxLDL毒性作用的调节子。LOX-1表达在血管内皮细胞表面上，参与血管内皮细胞上的单核细胞和巨噬细胞的积聚。
此外，在本发明的上下文中，术语“LOX-1”包括天然人氧化的LDL受体的变体，其具有与上述报道中描述的天然一级结构(氨基酸序列)基本上相同的氨基酸序列。本文中，术语“具有基本上相同氨基酸序列的天然人氧化的LDL受体的突变体”指的是这样的突变体蛋白。
已表明在体外和/或体内形成的多种形式的修饰的LDL结合LOX-1。如本文所用，术语“修饰的LDL”和“氧化的LDL”(以及“oxLDL”)可互换使用以描述被细胞(如血管内皮细胞)组合各种化学和物理因素(例如，热)氧化的低密度脂蛋白。例如，LDL在血管壁内致动脉粥样化条件下被氧化，形成oxLDL。术语“修饰的LDL”可以包括以下：氧化的LDL、硫酸铜氧化修饰的LDL、乙酰LDL、氯化LDL(例如，通过化学氯化反应修饰的LDL)、髓过氧化物酶修饰的LDL、次氯酸盐修饰的LDL、琥珀酰LDL和丙二醛修饰的LDL(即，通过与丙二醛反应修饰的LDL，其在体内作为氧化应激的结果产生)。
如本文所用的术语“抗体”是指整个抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。整个抗体是包含之间通过二硫键连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域：CH1，CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为V L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域：CL组成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其散布在更保守的称为框架区(FR)的区域中。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端以下面的顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”，是指保留了特异性结合至给定抗原(例如，人氧化的LDL受体(LOX-1))的能力的完整抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段来实现。涵盖在术语抗体的抗原结合部分或抗原结合片段中的结合片段的实例包括Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包括由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,1989 Nature 341:544-546)，其由VH结构域或VL结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH由分开的基因编码，可以使用重组方法、通过人工肽接头将其连接，以使其能够制备为单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人,1988 Science 242:423-426；and Huston等人,1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。这样的单链抗体包括一种或多种的抗体的抗原结合部分或片段。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
抗原结合片段也可以并入单结构域抗体、巨抗体(maxibody)、微抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv中(见，例如，Hollinger and Hudson,2005,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136)。抗体的抗原结合部分可以被移植到基于多肽的支架如纤连蛋白III型(Fn3)(参见美国专利号6703199，其描述了纤连蛋白多肽单抗体)。
抗原结合片段可并入包括一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子，其连同互补轻链多肽，形成一对抗原结合区(Zapata等人,1995 Protein Eng.8(10):1057-1062；和美国专利号5641870)。
如本文所用，术语“亲和力”是指在单个抗原位点上抗体和抗原之间相互作用的强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力在多个位点上与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。如本文所使用的，术语抗体或其抗原结合片段(例如，Fab片段)的“高亲和力”通常是指抗体或其抗原结合片段具有10-9M或更低的KD。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指的是与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即，结合于氢、羧基、氨基的α-碳，和R基团，例如，高丝氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指化学化合物，其具有不同于氨基酸一般化学结构的结构，但是其以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用。
如本文所用的术语“结合特异性”指的是各抗体结合位点仅与一个抗原决定簇反应的能力。
短语“特异性(或选择性)结合”至抗体(例如，LOX-1结合抗体)是指在蛋白质和其他生物制品的异质群中确定同源抗原(例如，人LOX-1或食蟹猴LOX的-1)存在的结合反应。短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在本文可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“LOX-1介导的”是指当LOX-1配体(例如，oxLDL)结合到细胞表面上的LOX-1时，LOX-1受体介导的细胞反应的事实，而后其触发细胞增加某些促炎分子的产生。术语“促炎基因”是指编码任何分子(如，但不限于，细胞因子、趋化因子或细胞粘附分子)的基因，这些分子在炎性过程中发挥作用。示例性“促炎”基因包括但不限于，白介素-8(IL-8)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)。
如本文所用的“LOX-1相关疾病”、“LOX-1相关病症”、“与升高水平的LOX-1相关的疾病或病症”或类似的术语，是指任何数量的病症或疾病，其中LOX-1蛋白水平异常高和/或其中寻求LOX-1蛋白水平的降低。这些病症包括但不限于：心血管疾病，内皮细胞功能障碍，内皮细胞疾病，动脉粥样硬化，动脉硬化，高血压，高脂血症，高胆固醇血症，糖尿病，一氧化氮缺乏症，心肌梗塞，血管氧化应激，心肌缺血，缺血再灌注，败血症，糖尿病肾病，肾疾病，心肌病，心脏衰竭，外周动脉疾病，冠心病，跛行(例如，间歇性跛行、卢瑟福II/III级跛行)，外周动脉疾病(PAD)，心绞痛(例如，顽固性心绞痛)，冠状动脉疾病(CAD)(例如，由于供给心脏的动脉的动脉粥样硬化)，中风和异常内皮依赖性血管舒张。
本文所用的“内皮细胞功能障碍”，是指内皮细胞无法维持其正常功能。内皮在调节血管平滑肌张力(tone)和生长、血管通透性、炎症反应、凝血和血小板粘附中起重要作用。内皮细胞功能的非限制性实例包括维持平衡的血管张力，抑制血栓形成，抑制促炎过程，维持血管完整性(例如，脉管系统的非渗漏)，以及维持内皮和平滑肌细胞二者中的抗增殖状态。易患动脉粥样硬化的常见病症和风险因素，如血脂异常、高血压、糖尿病和吸烟，都与内皮功能障碍相关，其促进动脉粥样硬化的发生、进展和并发症。内皮功能障碍已普遍被评定为受损的内皮依赖性血管舒张。这假定内皮依赖性血管舒张是其他重要内皮功能的替代标记。这种假设的基础是观察到由来自L-精氨酸的内皮NO合酶(eNOS)合成的内皮来源的一氧化氮介导内皮依赖性血管舒张和其他内皮血管保护功能。越来越多的临床数据库表明，内皮功能障碍(受损的内皮依赖性血管舒张)与主要的心血管不良事件密切相关，包括心肌缺血和梗死，急性冠脉综合征，跛行和严重肢体缺血，短暂性脑缺血发作和中风。
积累的实验数据还表明，内皮和心内膜(endocadial)受损的eNOS来源的NO可利用性不仅可能导致异常的左心室重塑和功能障碍，促进心脏衰竭的发生和进展。
本文所用的“内皮细胞疾病”，是特征为内皮细胞功能障碍的任何疾病。特征为内皮细胞功能障碍的疾病或病症的非限制性实例包括血管生成疾病，如需要新生血管形成来支持肿瘤生长的癌症，感染性疾病，自体免疫性疾病，血管畸形，DiGeorge综合征，HHT，海绵状血管瘤，移植动脉病，与血液透析相关的血管通路狭窄，血管炎，vasculitidis，血管炎性疾病，动脉粥样硬化，肥胖，银屑病，疣，变应性皮炎，疤痕疙瘩，化脓性肉芽肿，起泡性疾病，Kaposi肉瘤，持续增生玻璃体综合征，早产儿视网膜病变，脉络膜新生血管形成，黄斑变性，糖尿病性视网膜病，眼新生血管形成，原发性肺动脉高血压，哮喘，鼻息肉，炎性肠疾病和牙周疾病，腹水，腹膜粘连，避孕，子宫内膜异位症，子宫出血，卵巢囊肿，卵巢过度刺激，关节炎，类风湿关节炎，慢性关节风湿病，滑膜炎，骨关节炎，骨髓炎，骨赘形成，败血症和血管渗漏。内皮细胞功能障碍可以使用本领域公知的试验确定，包括检测内皮粘附分子的表达增加或一氧化氮合酶(eNOS)的表达减少或生物活性降低。
本文使用的“跛行”，包括严重跛行和其他类似的术语，描述了一种活动障碍以及高度未满足的医疗需要。跛行是一种病症，其特征为下肢缺血引起肌肉疲劳、劳累时疼痛而休息时缓解、活动受限以及生活质量下降，该病症由动脉粥样硬化和异常(例如，受损的)内皮依赖性血管舒张引起。其在美国的患病率是800-1200万患者。在患有间歇性跛行的患者中，7％将接受下肢搭桥手术，4％将需要主要截肢，而16％将发展为恶化的跛行。20％患5年以上重度跛行的患者发生心血管事件，如心肌梗死和中风。当前的疗法是手术，以及通过微创手段的治疗，如施用本发明的抗LOX-1抗体，将代表巨大的治疗性突破。
本文使用的“顽固性心绞痛”，是一种标志为心肌缺血导致的胸痛的病症，一般是由于冠状动脉(例如，由于冠状动脉疾病)的阻塞或痉挛引起，伴有衰弱症状，物理活动非常受限以及生活质量较差。在美国100-180万遭受顽固性心绞痛的患者以每年10％的比率经历增加的心血管疾病死亡率；每年至少有10万例新发生的顽固性心绞痛的病例。
术语“嵌合抗体”是抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接至不同的或改变的类、效应子功能和/或物种的恒定区，或赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分被具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，可通过用人免疫球蛋白恒定区替换小鼠恒定区来修饰小鼠抗体。由于用人恒定区替换了，嵌合抗体可以保留其在识别抗原中的特异性，同时与原始小鼠抗体相比在人中具有降低的抗原性。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本上相同的序列。由于遗传密码子的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子限定丙氨酸的每个位置上，该密码子可改变成任何所述不改变所编码多肽的相应密码子。这样的核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每一核酸序列还描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个所述序列中。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括向多肽序列的个别取代、缺失或添加，其导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代列表是现有技术中公知的。这种保守修饰的变体是包括且不排除多态变体、种间同源物和本发明的等位基因。以下八组含有对于彼此为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见，例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列的修饰”被用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
术语“表位”是指能够特异性结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团组成，如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下失去了对前者的结合而非后者。
如本文所用的术语“人抗体”，旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均来自人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自此类人序列，例如，人种系序列，或人种系序列的突变版本。本发明的人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机的或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入突变)。
术语“人单克隆抗体”指显示单一结合特异性的抗体，其具有可变区，在可变区中的框架区和CDR区均来自人序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括从转基因非人动物，例如，转基因小鼠获得的融合至永生化细胞的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性而在人中的免疫原性更低的抗体。这可以通过，例如，保留非人CDR区并且抗体的剩余部分用人的对应部分替换(即，恒定区以及可变区的框架部分)来实现。例如，参见Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984；Morrison and Oi,Adv.Immunol.,44:65-92,1988；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498,1991；和Padlan,Molec.Immun.,31:169-217,1994。其他人工程化技术的实例包括，但不限于在美国5,766,886中公开的Xoma技术。
在两个或更多核酸或多肽序列的上下文中的术语“相同的”或百分比“同一性”，是指两个或更多序列或子序列是相同的。当使用下列序列比较算法之一或通过手工和目视检查测量的，比较和比对比较窗口上、或者指定区域中的最大对应时，如果两个序列具有相同的氨基酸残基或核苷酸的限定百分比(即，在限定区域上，或者，如果未限定，在整个序列上，60％同一性，任选65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性)，则两个序列“基本上相同”。任选地，同一性存在于至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)长度的区域上，或更优选100至500或1000或更多核苷酸(或20，50，200或更多氨基酸)长度的区域上。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机中，指定序列坐标，如果需要的话，指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或可以指定替代参数。然后，在程序参数基础上，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
本文使用的“比较窗口”包括涉及任一连续位置数目的区段，所述连续位置数目选自20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150，其中在两个序列最佳比对后，序列可与连续位置数目相同的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是现有技术中公知的。可通过，例如，Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:443,1970的同源比对算法、通过Pearson和Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988的搜索相似性方法、通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin遗传学软件包中GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)、或通过手工比对和目视检查(见，例如，Brent等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(Ringbou编辑,2003))进行为了比较序列的最佳比对。
适合于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个例子是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。该算法包括首先通过在查询序列中鉴别长度W的短字来鉴别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，其匹配或满足某些正值的阈值得分T。T被称为邻近字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始邻近字命中(word hits)作为起始搜索的种子以发现包含它们的更长HSP。字命中沿每条序列在两个方向上延伸，只要累积比对得分可以增加。对于核苷酸序列，累积得分使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积得分。在以下情况停止各方向上的字命中延伸：累积比对得分从其最大实现值下降了数量X时；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积得分达到0或者0以下时；或者到达任一序列的末端时。BLAST算法参数W，T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3、和期望值(E)10、以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5，N＝-4和两条链的比较作为默认值。
BLAST算法也进行两个序列之间的相似性的统计分析(见，例如，Karlin andAltschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的一种相似性的测量是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，和最优选小于约0.001，则该核酸被认为类似于参考序列。
还可确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比：使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17,1988)的算法，其已被并入ALIGN程序(2.0版本)，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分12和缺口罚分4。另外，可以使用以下确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比：Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.48:444-453,1970)的算法，其已并入GCG软件包中的GAP程序(在万维网gcg.com上可获得)，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，和缺口权重16、14、12、10、8、6、或4和长度权重1、2、3、4、5、或6。
除以上指出的序列同一性百分比外，两个核酸序列或多肽是基本相同的另一指示是，由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽的抗体具有免疫交叉反应，如下所述。因此，多肽通常与第二多肽是基本相同的，例如，其中这两个肽的不同仅在于保守取代。两个核酸序列是基本相同的另一指示是，这两个分子或其互补序列在严谨条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列是基本相同的又一指示是，相同的引物可用于扩增序列。
术语“分离的抗体”指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合LOX-1的分离的抗体基本上不含特异性结合LOX-1之外的抗原的抗体)。但是，特异性结合LOX-1的分离的抗体可能与其他抗原具有交叉反应。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
术语“同种型”指由重链恒定区基因提供的抗体类别(如IgM，IgE，如IgG1或IgG4的IgG)。同种型也包括这些类别之一的修饰版本，其中已经做了修饰，以改变Fc功能，例如以增强或降低效应子功能或结合至Fc受体。
本文所用的术语“Kassoc”或“Ka”意指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“Kdis”或“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。本文所用的术语“KD”意指解离常数，其由Kd与ka的比率(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域公知的方法测定抗体的KD值。测定抗体KD的方法包括使用生物传感器系统，如
Figure BDA0000922241250000201
系统测量表面等离子体共振，或通过溶液平衡滴定(SET)测量溶液中的亲和力。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
用于本文的术语“核酸”可与术语“多核苷酸”互换使用，指的是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其单链或双链形式的聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰主链残基或键的核酸，其是合成的、天然存在的、和非天然存在的，其与参考核酸具有类似的结合特性，并且其与参考核苷酸以类似的方式代谢。这样的类似物的例子包括但不限于，硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲基膦酸酯，手性-甲基膦酸酯，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNA)。
除非另有指明，特定核酸序列也隐含涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，如下详述的，简并密码子置换可通过产生如下序列来实现，在所述序列中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。
术语“有效地连接”指的是在两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能关系。通常情况下，该术语是指转录调控序列与转录序列的功能关系。例如，如果其刺激或调节编码序列在适当的宿主细胞或其他表达系统中的转录，则启动子或增强子序列有效地连接至编码序列。通常，有效地连接至转录序列的启动子转录调控序列在物理上邻接(contiguous)被转录序列，也就是说，它们是顺式作用。然而，一些转录调控序列，如增强子，不需要物理上邻接或位于靠近其所增强转录的编码序列。
本文所用的术语“优化的”是指核苷酸序列已被改变，以使用在生产细胞或生物体中是优选的密码子编码氨基酸序列，通常生产细胞或生物体是真核细胞，例如，毕赤酵母的细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。优化的核苷酸序列被工程化，以完全地或尽可能多地保留由起始核苷酸序列最初编码的氨基酸序列，这样的氨基酸序列也称为“亲本”序列。文中优化的序列已经被工程化为具有在哺乳动物细胞中优选的密码子。然而，在其他真核细胞或原核细胞中这些序列的优化表达在本文也是可以预期的。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也被称为优化的。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外指出，特定的多肽序列也隐含涵盖其保守修饰的变体。
如本文所用的术语“重组人抗体”，包括通过重组方法制备、表达、生产或分离的所有人抗体，如从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，从转染以表达人抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体，从重组、组合的人抗体文库分离的抗体，和通过任何其他方法制备、表达、生产或分离的抗体，所述其他方法包括所有或部分人免疫球蛋白基因的剪接，使序列连接其他DNA序列。这样的重组人抗体具有其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，这样的重组人抗体可以经历体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，在体内体细胞诱变)，从而该重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列尽管来源于人种系VH和VL序列并且是与其相关的序列，但是其可以不是天然存在于体内的人抗体种系文库中的序列。
术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)是指在其中引入了重组表达载体的细胞。但是应当理解，这样的术语意在不仅指特定的受试细胞，还指这种细胞的后代。由于突变或环境影响，在随后的世代中可能发生某些修饰，所以事实上这些后代可能不会等同于亲本细胞，但其仍然包括在本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。
术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如：哺乳动物和非哺乳动物)，如，非人灵长类(例如：食蟹猴)，羊，狗，牛，鸡，两栖动物和爬行动物。除非指出，在本文中使用的术语“患者”或“受试者”可互换。如本文所用，术语“cyno”或“食蟹猴”指的是食蟹猴(Macaca fascicularis)。
如本文所用，术语“治”或“治疗”任何疾病或病症(例如，LOX-1相关疾病)在一个实施方案中是指改善疾病或病症(即，减缓或阻止或降低疾病或疾病至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方案中“治”或“治疗”是指减轻或改善至少一个身体参数，包括那些患者可能不能辨别的身体参数。在又一个实施方案中，“治”或“治疗”是指在身体上(例如可辨别症状的稳定)或生理上(例如，身体参数的稳定)调节疾病或病患，或者两者兼有。在又一个实施方案中，“治”或“治疗”指预防或延缓疾病或病症的发作或发生或进展。
当涉及本文所描述的适应症(包括，例如，LOX-1相关疾病)时，“预防”意味着在处于所述恶化风险的患者中防止或减缓例如LOX-1相关疾病参数恶化的任何行为，如下所述。
术语“载体”意指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它指的是环状双链DNA环，其他的DNA区段可以连接至该双环DNA。另一类型的载体是病毒载体，如腺相关病毒载体(AAV或AAV2)，其中其他DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制原点和附加型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后可以整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导其有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷的逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)，其发挥同样的功能。
附图说明
图1A-1C描绘了本发明的LOX-1抗体抑制OxLDL结合LOX-1蛋白。图1A示出高结合性OxLDL，图1B示出丙二醛-LDL，以及图1C示出次氯酸盐修饰的LDL，均如本文所述。
图2描绘了LOX-1抗体抑制dil-标记的OxLDL结合人LOX-1转染的HEK293细胞。
图3描绘了在人LOX-1转染的HEK293细胞中LOX-1抗体抑制oxLDL诱导的活性氧(ROS)产生的剂量反应曲线。
图4A-4F证实在人LOX-1转染的HEK293细胞中LOX-1抗体(抗体单独或在交联Fab2存在下)抑制oxLDL诱导的活性氧(ROS)产生。图4A示出抗体FF1，图4B示出抗体FF3，图4C示出抗体FF4，图4D示出抗体FF5，图4E示出抗体FF6，和图4F示出对照hIgG1-LALA。
图5描绘了LOX-1抗体结合人嗜中性粒细胞表面上的LOX-1。
图6A-6B描绘了使用人或食蟹猴APP-Avi-LOX-1蛋白通过溶液平衡滴定(SET)试验确定的抗体解离常数(KD)。图6A描绘了人LOX-1的数据，图6B描绘了食蟹猴LOX-1的数据。
详细说明
本发明部分基于发现了特异性结合LOX-1并抑制其生物活性的抗体分子。本发明既涉及全长IgG形式的抗体又涉及其抗原结合片段，如Fab片段(例如，抗体E2E10，FF1，FF3，FF4，FF5，FF6)。
因此，本发明提供了特异性结合LOX-1(例如，人LOX-1和食蟹猴LOX-1)的抗体、药物组合物、生产方法、和使用这些抗体和组合物的方法。
LOX-1蛋白
本发明提供了特异性结合LOX-1并抑制其生物活性(包括其促氧化和促炎活性)的抗体。LOX-1是氧化修饰的LDL(oxLDLs)的受体，其表达于血管细胞(内皮细胞和平滑肌细胞)、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞和血小板的表面。此外，LOX-1在血管疾病中上调，包括在人和动物中的动脉粥样硬化病变(Kataoka H,等人,Circulation 99；3110-3117)。LOX-1也在全身性炎症/自体免疫性疾病(例如，类风湿性关节炎，葡萄膜炎，年龄相关的黄斑变性和先兆子痫)中上调。OxLDL参与血管疾病的发病机制。除了oxLDL，LOX-1还结合其他配体，包括乙酰化的LDL、晚期糖基化终产物(AGE)、热休克蛋白70(HSP70)、凋亡细胞、老化的红细胞、白细胞、活化的血小板、细菌、磷脂酰丝氨酸、和C反应蛋白(CRP)。
LOX-1是属于C型凝集素家族的II型膜蛋白。LOX-1也被归类为E类清道夫受体。LOX-1由4个结构域组成：短的N末端细胞质结构域，跨膜区，连接颈部，和在C末端的凝集素样结构域。C末端凝集素样结构域(CTLD；也称为oxLDL结合结构域)是配体结合结构域(Sawamura T,等人,Nature 386；73-77；Shi X,等人,J Cell Sci.114；1273-1282)。人LOX-1具有表1列出的序列(SEQ ID NO：1)，并在先前的报道和文献描述了(Nature,Vol.386,p.73-77,1997；Genomics,Vol.54,No.2,p.191-199,1998；Biochem.J.,Vol.339,Part 1,P.177-184,1999；Genbank Accession No.NP 002534)。
oxLDL/LOX-1途径引起氧化应激、血管炎症、动脉粥样硬化、和受损的组织血流量和氧输送。通过结合LOX-1配体(例如，oxLDL)引起的LOX-1活化导致由于NADPH氧化酶的活化而产生活性氧，以及随后NFkB和MAP激酶途径活化而导致炎症。oxLDL/LOX-1信号传导途径作为正反馈环路发挥作用，其中LOX-1诱导的活性氧导致形成额外的oxLDL和上调的LOX-1表达。oxLDL结合巨噬细胞表面表达的LOX-1还导致oxLDL的摄取，这引起泡沫细胞形成和动脉粥样硬化。重要的是，血管炎症被认为对动脉粥样硬化急性血栓并发症的病理生物学是关键的，包括心肌梗塞和缺血性中风。也已经显示LOX-1的活化通过涉及NADPH氧化酶的机制损害血管舒张，改变血管舒缩功能。已显示受损的血管舒张发生在慢性冠状动脉疾病和心绞痛的患者，以及外周动脉疾病和跛行的患者。
用LOX-1敲除小鼠和LOX-1拮抗剂抗体的研究表明，抑制LOX-1可具有有益的心血管作用。例如，敲除LOX-1防止oxLDL介导的血管松弛受损并减少动脉粥样硬化(Mehta等人,Circulation Research 2007,100:1634)。此外，已经表明抗LOX-1抗体(i)阻断人内皮细胞中oxLDL诱导的氧化应激(Ou等人,J Appl Phys 2010,108:1745)；和(ii)抑制过氧化物的产生和恢复eNOS表达，从而改善了NO的生物利用度和血管舒张(Xu等人,Arteriosclerosis,Thrombosis and Vascular Biology 2007,27:871-877)。
我们建议，例如通过施用本发明的抗LOX-1抗体抑制LOX-1，将改善缺血组织的血流和氧气输送，产生对慢性血管疾病患者(包括心绞痛、跛行和严重肢体缺血)的治疗益处。例如通过施用本发明的抗LOX-1抗体抑制LOX-1，也可以减缓或逆转动脉粥样硬化的进展，降低其急性血栓并发症的发病率(例如，急性冠状动脉综合征、不稳定型心绞痛、心肌梗死和缺血性中风)。
LOX-1抗体和抗原结合片段
本发明提供了特异性结合LOX-1的抗体。在一些实施方案中，本发明提供了特异性结合人和食蟹猴LOX-1的抗体。本发明的抗体包括但不限于如实施例描述所分离的人单克隆抗体和Fab。
本发明提供特异性结合LOX-1蛋白(例如，人和食蟹猴LOX-1)的抗体，其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：14，34，54，74或94的VH结构域。本发明还提供特异性结合LOX-1蛋白的抗体，其中所述抗体包含具有表1中列出的VH CDR中任何一个氨基酸序列的VH CDR，如下文。尤其是，本发明提供特异性结合LOX-1蛋白(例如，人和食蟹猴LOX-1)的抗体，其中，所述抗体包含(或者，由其组成)一个、两个、三个或更多VH CDR，其具有表1中列出的VH CDR中任一氨基酸序列，如下文。
本发明提供特异性结合LOX-1蛋白的抗体，所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ IDNO：24,44,64,84或104的VL结构域。本发明还提供特异性结合LOX-1蛋白(例如，人和食蟹猴LOX-1)的抗体，所述抗体包含具有表2中列出的VL CDR中任何一个氨基酸序列的VL CDR，如下文。尤其是，本发明提供特异性结合LOX-1蛋白(例如，人和食蟹猴LOX-1)的抗体，所述抗体包含(或者，由其组成)一个、两个、三个或更多VL CDR，其具有表1中列出的VL CDR中任一氨基酸序列，如下文。
本发明的其他抗体包括已被突变的氨基酸，但其CDR区与表2中所述序列的CDR区具有至少60，70，80，85，90或95同一性百分比。在一些实施方案中，其包括突变氨基酸序列，其中当与表1所述序列的CDR区比较时，在其CDR区不超过1，2，3，4或5个氨基酸已被突变。
本发明还提供了编码特异性结合LOX-1蛋白(例如，人和食蟹猴LOX-1)的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。这样的核酸序列可以被优化用于在哺乳动物细胞中表达(例如，表1示出了用于本发明抗体的重链和轻链的优化核酸序列)。
表1.LOX-1抗体、Fab和LOX-1蛋白的示例
Figure BDA0000922241250000271
Figure BDA0000922241250000281
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Figure BDA0000922241250000361
Figure BDA0000922241250000371
Figure BDA0000922241250000381
Figure BDA0000922241250000391
本发明的其他抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸被突变的那些，但是其与表1中描述的序列具有至少60，65，70，75，80，85，90或95同一性百分比。一些实施方案包括突变的氨基酸序列，其中当与表1所述序列中描述的可变区相比时，在可变区不超过1，2，3，4或5个氨基酸已被突变，同时保留基本相同的抗原结合活性。
由于这些抗体中的每个可以结合LOX-1，VH，VL，全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列)可以被“混合并匹配”，以产生本发明的其他LOX-1结合抗体。此类“混合并匹配”的LOX-1结合抗体可以用本领域已知的结合试验进行测试(例如，ELISA，和实施例部分描述的其他试验)。当这些链被混合和匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列应该被结构相似的VH序列替换。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列应该被结构相似的全长重链序列替换。同样地，来自特定VH/VL配对的VL序列应该被结构相似的VL序列替换。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应该被结构相似的全长轻链序列替换。
因此，在一个方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合区，其具有：包含选自SEQ ID NO：14，34，54，74和94的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含选自SEQ ID NO：24，44，64，84和104的氨基酸序列的轻链可变结构域，其中该抗体特异性结合LOX-1(例如，人和食蟹猴LOX-1)。
更具体地说，在某些方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合区，其具有重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域分别包含选自SEQID NO：14和24；34和44；54和64；74和84或94和104的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供(i)分离的抗体，其具有：包含选自SEQ ID NO：16，36，56，76或96的被优化用于在哺乳动物细胞中表达的氨基酸序列的全长重链，和包含选自SEQ IDNO：26，46，66，86或106的被优化用于在哺乳动物细胞中表达的氨基酸序列的全长轻链；或(ii)包含其抗原结合部分的功能性蛋白质。更具体地说，在某些方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合区，其具有重链和轻链，所述重链和轻链分别包含选自SEQ ID NO：14和24；34和44；54和64；74和84或94和104的氨基酸序列。
本文所用术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。在一般情况下，在每个重链可变区有三个CDR(HCDR1，HCDR2，HCDR3)以及在每个轻链可变区有三个CDR(LCDR1，LCDR2，LCDR3)。
给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用若干公知方案中的任意容易地确定，包括Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5次编辑Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案),Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)所述的那些。
例如，根据Kabat，抗体FF1在重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号是31-35(HCDR1)，50-66(HCDR2)和99-104(HCDR3)；在轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号是24-34(LCDR1)，50-55(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，在VH中的CDR氨基酸编号是26-32(HCDR1)，52-57(HCDR2)和99-104(HCDR3)；和在VL中的氨基酸残基编号是26-32(LCDR1)，50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合Kabat和Chothia的CDR定义，在人VH中的CDR由氨基酸残基26-35(HCDR1)，50-66(HCDR2)和90-104(HCDR3)组成，以及在人VL中由氨基酸残基24-34(LCDR1)，50-55(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。
在另一方面，本发明提供LOX-1结合抗体，其包含表1中所述的重链和轻链CDR1，CDR2和CDR3，或其组合。所述抗体的VH CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：8，28，48，68和88中。抗体的VH CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：9，29，49，69和89中。抗体的VH CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：10，30，50，70和90中。抗体的VL CDR1的氨基酸序列示于SEQ IDNO：18，38，58，78和98中。抗体的VL CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：19，39，59，79和99中。抗体的VL CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：20，40，60，80和100中。这些CDR区用Kabat系统描绘。
可替代地，如使用Chothia系统(Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948)所定义的，抗体的VH CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：11，31，51，71和91中。抗体的VH CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：12，32，52，72和92中。抗体的VH CDR3的氨基酸序列示于SEQ IDNO：13，33，53，73和93中。抗体的VL CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：21，41，61，81和101中。抗体的VL CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：22，42，62，82和102中。抗体的VL CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：23，43，63，83和103中。
鉴于这些抗体中的每一个可以结合LOX-1，并且抗原结合特异性主要由CDR1，2和3区提供，所以VH CDR1，2和3序列和VL CDR1，2和3序列可以“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以混合并匹配，尽管每个抗体优选包含VH CDR1，2和3和VL CDR1，2和3以产生本发明的其他LOX-1结合分子。如此“混合和匹配”的LOX-1结合抗体可使用本领域已知的以及在实施例中描述的那些结合试验(例如，ELISA，SET，Biacore)测试。当混合和匹配VH CDR序列时，来自特定VH序列的CDR1，CDR2和/或CDR3序列应该被结构相似的CDR序列替换。同样，当混合和匹配VL CDR序列时，来自特定VL序列的CDR1，CDR2和/或CDR3序列应该被结构相似的CDR序列替换。用与本文所示的本发明单克隆抗体CDR序列的结构相似序列取代一个或多个VH和/或VL CDR区序列，能够产生新的VH和VL序列，这对普通技术人员而言将是显而易见的。除了上述之外，在一个实施方案中，本文所述抗体的抗原结合片段可以包含VH CDR1，2和3，或VL CDR1，2和3，其中片段作为单一可变结构域结合LOX-1。
在本发明的某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以具有表1中描述的Fab的重链和轻链序列。更具体地，抗体或其抗原结合片段可具有Fab FF1，FF3，FF4，FF5和FF6的重链和轻链序列。
在本发明的其他实施方案中，特异性结合LOX-1的抗体或抗原结合片段包含重链可变区CDR1，重链可变区CDR2，重链可变区CDR3，轻链可变区CDR1，轻链可变区CDR2和轻链可变区CDR3，如Kabat定义和表1所述。在本发明的又一其他实施方案中，特异性结合LOX-1的抗体或抗原结合片段包含重链可变区CDR1，重链可变区CDR2，重链可变区CDR3，轻链可变区CDR1，轻链可变区CDR2和轻链可变区CDR3，如Chothia定义和表1中所述。
在一个具体的实施方案，本发明包括特异性结合LOX-1的抗体，其包含SEQ ID NO：8的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：9的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：10的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：18的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：19的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：20的轻链可变区CDR3。
在另一个具体的实施方案，本发明包括特异性结合LOX-1的抗体，其包含SEQ IDNO：28的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：29的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：30的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：38的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：39的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：40的轻链可变区CDR3。
在另一个具体的实施方案，本发明包括特异性结合LOX-1的抗体，其包含SEQ IDNO：48的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：49的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：50的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：58的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：59的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：60的轻链可变区CDR3。
在另一个具体的实施方案，本发明包括特异性结合LOX-1的抗体，其包含SEQ IDNO：68的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：69的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：70的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：78的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：79的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：80的轻链可变区CDR3。
在另一个具体的实施方案，本发明包括特异性结合LOX-1的抗体，其包含SEQ IDNO：88的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：89的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：90的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：98的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：99的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：100的轻链可变区CDR3。
在另一个具体的实施方案，本发明包括特异性结合LOX-1的抗体，其包含SEQ IDNO：11的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：12的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：13的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：21的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：22的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：23的轻链可变区CDR3。
在另一个具体的实施方案，本发明包括特异性结合LOX-1的抗体，其包含SEQ IDNO：31的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：32的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：33的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：41的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：42的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：43的轻链可变区CDR3。
在另一个具体的实施方案，本发明包括特异性结合LOX-1的抗体，其包含SEQ IDNO：51的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：52的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：53的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：61的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：62的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：63的轻链可变区CDR3。
在另一个具体的实施方案，本发明包括特异性结合LOX-1的抗体，其包含SEQ IDNO：71的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：72的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：73的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：81的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：82的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：83的轻链可变区CDR3。
在另一个具体的实施方案，本发明包括特异性结合LOX-1的抗体，其包含SEQ IDNO：91的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：92的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：93的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：101的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：102的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：103的轻链可变区CDR3。
在某些实施方案，本发明包括如表1所述的特异性结合LOX-1的抗体或抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，结合LOX-1的抗体或抗原结合片段是Fab FF1，FF3，FF4，FF5和FF6。
如本文所用，人抗体包含重链或轻链可变区或全长重链或轻链，如果抗体的可变区或全长链获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统，则所述重链或轻链可变区或全长重链或轻链是特定种系序列“的产物”或“源自”特定种系序列。这样的系统包括用感兴趣的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或用感兴趣的抗原筛选展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。是人种系免疫球蛋白序列“的产物”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体同样地通过如下鉴别：比较人抗体的氨基酸序列和人种系免疫球蛋白的氨基酸序列，并选择序列上最接近(即，最大的％同一性)人抗体序列的人种系免疫球蛋白序列。
是特定人种系免疫球蛋白序列“的产物”或“源自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以包含与人种系序列相比不同的氨基酸，这是由于，例如，天然发生的体细胞突变或有意引入的定点突变。然而，在VH或VL框架区，通常所选人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列是至少90％相同的，并含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比时可将人抗体鉴别为人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列是至少60％、70％、80％、90％、或至少95％、或甚至至少96％、97％、98％、或99％相同的。
通常，重组人抗体在VH或VL框架区中显示与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体可以显示与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于5个，或甚至不多于4，3，2，或1个氨基酸差异。人种系免疫球蛋白基因的实例包括但不限于下述的可变结构域种系片段，以及DP47和DPK9。
同源抗体
在又一个实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包含与表1所述序列为同源的氨基酸序列，所述抗体结合LOX-1蛋白(例如，人和食蟹猴LOX-1)，并保持表1所述那些抗体的期望的功能特征。
例如，本发明提供分离的抗体或其功能性抗原结合片段，其包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：14、34、54、74或94的氨基酸序列至少80％、至少90％、或至少95％相同的氨基酸序列；轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：24、44、64、84或104的氨基酸序列至少80％、至少90％、或至少95％相同的氨基酸序列；所述抗体特异性结合LOX-1(例如，人和食蟹猴LOX-1)。在本发明的某些方面，重链和轻链序列还包含如Kabat所定义的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，例如分别为SEQ ID NO：8、9、10、18、19和20。在本发明的某些其他方面，重链和轻链序列还包含由Chothia定义的HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3序列，例如分别为SEQ ID NO：11、12、13、21、22和23。
在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与表1所列的序列50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以相同，除了在不多于1、2、3、4或5个氨基酸位置上的氨基酸取代外。具有与表1所述的那些VH和VL区高度(即，80％或更大)相同的VH和VL区的抗体可通过如下获得：诱变(例如，定点或PCR介导的诱变)分别编码SEQ ID NO：15、35、55、75或95和SEQ ID NO：25、45、65、85或105的核酸分子，接着使用本文描述的功能试验测试所编码的改变的抗体的保留功能。
在其他实施方案中，全长重链和/或全长轻链氨基酸序列可以与表1所列序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。具有与SEQ ID NO：16、36、56、76或96中任意的全长重链和SEQ ID NO：26、46、66、86或106中任意的全长轻链具有高度(即，80％或更大)同一性的全长重链和全长轻链的抗体可通过如下获得：诱变(例如，定点或PCR介导的诱变)编码这样的多肽的核酸分子，接着使用本文描述的功能试验测试所编码的改变的抗体的保留功能。
在其他实施方案中，全长重链和/或全长轻链核苷酸序列可以与表1所列序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在其他实施方案中，重链可变区和/或轻链可变区核苷酸序列可以与表1所列序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
如本文所使用的两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性等于相同位置数/位置总数×100)，考虑了为了两个序列的最佳比对而需要引入的缺口数目和每个缺口的长度。两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定可以使用数学算法来实现，如下面的非限制性实施例描述的。
另外或可替换地，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，以针对公共数据库进行搜索，例如鉴定相关序列。例如，这样的搜索可以使用Altschul,等人,1990J.Mol.Biol.215:403-10的BLAST程序(2.0版本)来进行。
具有保守修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列的一个或多个基于本文描述的抗体具有指定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明期望的LOX-1结合抗体的功能特性。
因此，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其由包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区组成，其中：重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：8，28，48，68和88，和其保守修饰；重链可变区CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：9，29，49，69和89，和其保守修饰；重链可变区CDR3的氨基酸序列选自SEQID NO：10，30，50，70和90，和其保守修饰；轻链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：18，38，58，78和98，和其保守修饰；轻链可变区CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：19，39，59，79和99，和其保守修饰；轻链可变区CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：20，40，60，80和100，和其保守修饰；抗体或抗原结合片段特异性结合LOX-1。
在其他实施方案中，被优化用于在哺乳动物细胞中表达的本发明的抗体具有全长重链序列和全长轻链序列，其中这些序列的一个或多个基于本文所述的抗体具有指定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中该抗体保留本发明所期望的LOX-1-结合抗体的功能性质。因此，本发明提供了被优化用于在哺乳动物细胞中表达的分离的抗体，其由全长重链和全长轻链组成，其中所述全长重链具有选自SEQ ID NO：16，36，56，76或96和其保守修饰的氨基酸序列；和全长轻链具有选自SEQ ID NO：26，46，66，86或106和其保守修饰的氨基酸序列；抗体特异性结合LOX-1(例如，人和食蟹猴LOX-1)。
结合相同表位的抗体
本发明提供了与表1所述的LOX-1结合抗体结合相同表位的抗体。因此可以根据LOX-1-结合试验中其与本发明的其他抗体(如实施例中所述的那些)的竞争能力(例如，以统计学上显著的方式竞争性抑制结合)鉴定另外的抗体。测试抗体抑制本发明抗体结合LOX-1蛋白的能力证明，测试抗体可以与本发明抗体竞争结合LOX-1；根据非限制性理论，这样的抗体可以与其竞争的抗体结合相同或相关(例如，结构上相似或空间上接近)的LOX-1蛋白上的表位。在某些实施方案中，与本发明抗体结合LOX-1上相同表位的抗体是人单克隆抗体。这样的人单克隆抗体可如本文所述制备和分离。如本文所用，当存在等摩尔浓度的竞争抗体、且所述竞争抗体以超过50％(例如，80％，85％，90％，95％，98％或99％)抑制本发明抗体或抗原结合片段结合LOX-1时，抗体“竞争”结合。
在其他实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段结合LOX-1C末端凝集素样结构域(oxLDL结合结构域)，更具体地结合包含人LOX-1氨基酸残基228-246的表位(FRVRGAVSQTYPSGTCAYI；SEQ ID NO：3)。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段结合包含人LOX-1(SEQ ID NO：1)氨基酸残基Arg229和Arg231的人LOX-1上的表位。
工程化和修饰的抗体
还可以用具有一个或多个本文所示的VH和/或VL序列的抗体作为初始物质工程化修饰的抗体来制备本发明的抗体，其中修饰的抗体可具有不同于初始抗体的改变的性质。可通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)中的一个或多个残基来工程化抗体，例如在一个或多个CDR区和/或在一个或多个框架区中修饰。此外或可替换地，可通过修饰恒定区中的残基来工程化抗体，例如改变抗体的效应子功能。
一种可进行的可变区工程化的类型是CDR移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列在各个抗体之间比CDR外的序列更加多样化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以有可能通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在抗体的性质的重组抗体，所述表达载体包括来自特定天然存在抗体的CDR序列，其移植到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列(见，例如，Riechmann,L.等人,1998 Nature 332:323-327；Jones,P.等人,1986Nature 321:522-525；Queen,C.等人,1989 Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86:10029-10033；Winter的U.S.专利第5,225,539号，和Queen等人的U.S.专利第5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370号。
因此，本发明的另一实施方案涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别具有选自SEQ ID NO：8、28、48、68和88的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NO：9、29、49、69和89的氨基酸序列的CDR2序列；具有选自SEQ ID NO：10、30、50、70和90的氨基酸序列的CDR3序列；所述轻链可变区包含分别具有选自SEQ ID NO：18、38、58、78和98的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NO：19、39、59、79和99的氨基酸序列的CDR2序列；和由选自SEQ ID NO：20、40、60、80和100的氨基酸序列组成的CDR3序列。因此，此类抗体含有单克隆抗体的VH和VL CDR序列，但可以含有与这些抗体不同的框架序列。
这样的框架序列可从公共DNA数据库或出版的参考文献获得，包括种系抗体基因序列。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以发现于“VBase”人种系序列数据库(在万维网mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上可获得)，以及Kabat,E.A.,等人,1991Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美国卫生和公共服务部,NIH公开号91-3242；Tomlinson,I.M.,等人,1992 J.Mol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等人,1994 Eur.J Immunol.24:827-836中；其每一个的内容通过引用明确地并入本文。
用于本发明抗体中的框架序列的实例是结构上类似于本发明选择的抗体所使用的那些，例如，本发明的单克隆抗体中所使用的共有序列和/或框架序列。VH CDR1、2和3序列，和VL CDR1、2和3的序列，可被移植到具有与种系免疫球蛋白基因中发现的序列相同的序列的框架区，其中框架序列源自种系免疫球蛋白基因，或者CDR序列可被移植到与种系序列相比，含有一个或多个突变的框架区。例如，已经发现，在某些情况下，突变框架区内的残基对保持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(见例如，Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。可以用作在其上构建本文所述的抗体和抗原结合片段的支架的框架，包括但不局限于VH1A、VH1B、VH3、Vk1、Vl2和Vk2。其他的框架是本领域已知的，并且可以发现在，例如，万维网上的vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php？&MMN_position＝1:1的vBase数据库。
因此，本发明的一个实施方案涉及分离的LOX-1结合抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO：14、34、54、74或94的氨基酸序列，或在这样的序列的框架区具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列，所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO：24、44、64、84或104的氨基酸序列，或在这样的序列的框架区具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
另一种类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区域内的氨基酸残基，从而改善一种或多种目的抗体的结合特性(例如，亲和力)，被称为“亲和力成熟”。可进行定点诱变或PCR介导的诱变来引入突变，并在如本文所述的以及在实施例中提供的体外或体内试验中评价对抗体结合、或其他感兴趣的功能特性的效果。可以引入保守修饰(如上文讨论的)。这些突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。而且，通常在CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基被改变。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供分离的LOX-1结合抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区具有由选自SEQ ID NO：8、28、48、68和88的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：8、28、48、68和88相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列组成的VH CDR1区；具有选自SEQ ID NO：9、29、49、69和89的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：9、29、49、69和89相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR2区；具有选自SEQ ID NO：10、30、50、70和90的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：10、30、50、70和90相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR3区；具有选自SEQ ID NO：18、38、58、78和98的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：18、38、58、78和98相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR1区；具有选自SEQ ID NO：19、39、59、79和99的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：19、39、59、79和99相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR2区；和具有选自SEQ ID NO：20、40、60、80和100的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：20、40、60、80和100相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR3区。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供分离的LOX-1结合抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区具有由选自SEQ ID NO：11、31、51、71和91的氨基酸序列或与SEQ ID NO：11、31、51、71和91相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列组成的VH CDR1区；具有选自SEQ ID NO：12、32、52、72和92的氨基酸序列或与SEQ ID NO：12、32、52、72和92相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR2区；具有选自SEQ ID NO：13、33、53、73和93的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13、33、53、73和93相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR3区；具有选自SEQ ID NO：21、41、61、81和101的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21、41、61、81和101相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR1区；具有选自SEQ ID NO：22、42、62、82和102的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：22、42、62、82和102相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR2区；和具有选自SEQ ID NO：23、43、63、83和103的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：23、43、63、83和103相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR3区。
移植抗原结合结构域至替代性框架或支架
可以使用各种各样的抗体/免疫球蛋白框架或支架，只要所得多肽包括至少一个特异性结合LOX-1的结合区。此类框架或支架包括人免疫球蛋白或其片段的5个主要的独特型，并且包括其他动物物种的免疫球蛋白，优选具有人源化的方面。单一重链抗体如在骆驼中鉴定的那些在这方面是特别感兴趣的。新的框架、支架和片段继续被本领域技术人员发现和开发。
在一个方面，本发明涉及利用非免疫球蛋白支架，在其上移植本发明的CDR生成基于非免疫球蛋白的抗体。可以采用已知的或将来的非免疫球蛋白框架和支架，只要它们包含对靶LOX-1蛋白特异的结合区。已知的非免疫球蛋白框架或支架包括但不限于，纤连蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,MA)，锚蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)，结构域抗体(Domantis,Ltd.,Cambridge,MA,和Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)，载脂蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)，小模块免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)，maxybodies(Avidia,Inc.,MountainView,CA)，蛋白A(Affibody AG,Sweden)，和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil ProteinsGmbH,Halle,Germany)。
纤连蛋白支架基于纤连蛋白III型结构域(例如，纤连蛋白III型的第十模块(10Fn3结构域))。纤连蛋白III型结构域具有分布在两个β片层之间的7或8个β链，其本身彼此包裹形成蛋白质核心，并进一步含有将β链彼此连接的环(类似于CDR)，并暴露于溶剂。在β片层夹心的各边缘有至少三个这样的环，其中该边缘是垂直于β链方向的蛋白质的边界(参见US 6,818,418)。这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白，尽管总折叠与最小功能性抗体片段，重链可变区的折叠密切相关，该重链可变区在骆驼和美洲驼IgG抗体中其包含整个抗原识别单元。由于这种结构，非免疫球蛋白抗体模拟在本质和亲和力上与那些抗体相似的抗原结合特性。这些支架可用于体外的环随机化和改组策略中，其类似于体内的抗体亲和力成熟过程。这些基于纤连蛋白的分子可用作支架，其中所述分子的环区可以使用标准克隆技术被本发明的CDR替换。
锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白衍生的重复模块的蛋白质作为支架，以带有可用于结合不同靶标的可变区。锚蛋白重复模块是33个氨基酸的多肽，其由两个反平行α螺旋和β转角组成。可变区的结合主要通过使用核糖体展示优化。
Avimer是衍生自含有A-结构域的天然蛋白质，例如LRP-1。这些结构域被天然使用，用于蛋白质-蛋白质的相互作用，在人中超过250个蛋白质在结构上基于A结构域。Avimer由通过氨基酸接头连接的若干不同的“A结构域”单体(2-10)组成。可以使用文中描述的方法生成结合靶标抗原的Avimer，例如，美国专利申请公开号20040175756；20050053973；20050048512和20060008844中描述的。
亲和体亲和配体是由三螺旋束组成的小的、简单的蛋白质，其基于蛋白A的IgG结合结构域之一的支架。蛋白A是来自细菌金黄色葡萄球菌的表面蛋白质。该支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个随机产生具有大量配体变体的亲和体文库(见例如，美国5,831,012)。亲和体分子模拟抗体，其分子量为6kDa，而抗体的分子量是150kDa。尽管其尺寸小，亲和体分子的结合位点与抗体相似。
Anticalin是由Pieris ProteoLab AG公司开发的产品。其衍生自脂质运载蛋白，一组普遍存在的小而稳健的蛋白质，其通常涉及化学敏感或不溶化合物的生理运输或储存。一些天然的脂质运载蛋白存在于人体组织或体液。该蛋白质结构让人联想起免疫球蛋白，在刚性框架顶部具有高变环。然而，与抗体或其重组片段相反，脂质运载蛋白由具有160至180个氨基酸残基的单个多肽链组成，只比单个免疫球蛋白结构域稍大。构成结合口袋的该四环组，显示显著的结构可塑性并耐受多个侧链。因此结合位点可在专有过程中重塑，以高亲和力和特异性识别不同形状的规定靶分子。脂质运载蛋白家族的一种蛋白质，大菜粉蝶(Pieris Brassicae)的胆汁三烯结合蛋白(BBP)通过诱变四环组已用于开发Anticalin。描述Anticalin的专利申请的一个例子是PCT公开号WO 199916873。
Affilin分子是小的非免疫球蛋白蛋白质，其设计对蛋白质和小分子具有特异亲和力。新的Affilin分子可从两个文库非常迅速地选择，其中每一个是基于不同的人来源的支架蛋白。Affilin分子不显示任何与免疫球蛋白的结构同源性。目前，有两种Affilin支架被使用，其中一个是γ结晶人结构性眼晶状体蛋白质，另一个是“泛素”超家族蛋白。两个人支架均非常小，显示高的温度稳定性和基本对pH改变和变性剂的抗性。这种高稳定性主要是由于蛋白质的膨胀β片结构。γ结晶衍生的蛋白质的实例在WO200104144中描述，以及“泛素-样”蛋白质的实例在WO2004106368中描述。
蛋白质表位模拟物(PEM)是中等大小、环状、肽样分子(MW 1-2kDa)，其模拟蛋白质的β-发夹二级结构，主要的参与蛋白质-蛋白质的相互作用的二级结构。
本发明提供特异性结合LOX-1蛋白的完全人抗体。相比于嵌合或人源化抗体，当施用于人受试者时本发明的人LOX-1结合抗体具有进一步降低的抗原性。
骆驼抗体
已经在尺寸、结构复杂性和对人受试者的抗原性方面表征了从骆驼和单峰骆驼(双峰驼(Camelus bactrianus)和单峰驼(Calelus dromaderius))家族成员，包括新世界成员如骆马种(Lama paccos，大羊驼和喇嘛小羊驼属)获得的抗体蛋白。在自然界中发现的该哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，因而在结构上不同于其他动物抗体的具有两条重链和两条轻链的典型的四链四级结构。见PCT/EP93/02214(WO 94/04678公布于1994年3月)。
骆驼抗体的区域是鉴定为VHH的小的、单一的可变结构域，其可通过基因工程获得，以产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质，得到的低分子量抗体衍生的蛋白质被称为“骆驼纳米抗体”。见美国专利号5,759,808，发行于1998年6月2日；还参见Stijlemans,B.等人,2004 J Biol Chem 279:1256-1261；Dumoulin,M.等人,2003 Nature 424:783-788；Pleschberger,M.等人2003 Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo,V.等人2002 Int J Cancer 89:456-62；and Lauwereys,M.等人1998 EMBO J 17:3512-3520。骆驼抗体和抗体片段的工程化文库是可商购的，例如从Ablynx,Ghent,Belgium获得。作为非人源的其他抗体，骆驼抗体的氨基酸序列可以重组改变，以获得更类似于人序列的序列，即纳米抗体可以“人源化”。从而可以进一步降低骆驼抗体对人的天然低抗原性。
骆驼纳米抗体的分子量大约是人IgG分子的十分之一，该蛋白质具有仅仅几纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是骆驼纳米抗体结合对于较大抗体蛋白功能上不可见的抗原位点的能力，即，骆驼纳米抗体可用作检测抗原的试剂，而这些抗原使用经典的免疫学技术是隐秘的，并且可能作为治疗剂。因而，小尺寸的另一个结果是，骆驼纳米抗体由于在靶蛋白的凹槽或窄裂缝中结合特异性位点，因而能抑制这些位点，因此其比经典抗体更可用于更类似于低分子量药物功能中的能力。
低分子量和紧凑尺寸进一步导致骆驼纳米抗体极端耐热、对极端pH和蛋白质水解消化稳定，以及弱的抗原性。另一个结果是，骆驼纳米抗体易于从循环系统移动进入组织，甚至穿过血脑屏障而可以治疗影响神经组织的疾病。纳米抗体可进一步促进穿过血脑屏障的药物转运。参见公开于2004年8月19日的美国专利申请20040161738。这些特性再加上低的对人的抗原性，表明极大的治疗潜力。此外，这些分子可以完全表达于原核细胞如大肠杆菌，并作为融合蛋白与噬菌体表达，并且是有功能的。
因此，本发明的特征是具有对LOX-1高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在本文的某些实施方案，骆驼抗体或纳米抗体天然产生于骆驼科动物，即，使用本文描述的用于其他抗体的技术，用LOX-1或其肽片段免疫后由骆驼产生。可替代地，LOX-1结合骆驼纳米抗体是工程化的，即，例如，如本文中实施例中所述，LOX-1作为靶标使用淘选方法，通过从展示适当诱变的骆驼纳米抗体蛋白的噬菌体文库选择而产生。工程化的纳米抗体可进一步通过基因工程定制，以在受体受试者中具有从45分钟至两周的半衰期。在一个具体的实施方案中，骆驼抗体或纳米抗体通过移植本发明的人抗体的重链或轻链的CDR序列至纳米抗体或单一结构域抗体框架序列获得，如，例如在PCT/EP93/02214描述的。
双特异性分子和多价抗体
在另一个方面，本发明的特征是本发明的双特异性或多特异性分子，包含LOX-1结合抗体或其片段。本发明的抗体或其抗原结合区可以衍生或连接至另一个功能性分子，例如，另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)，以产生结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。本发明的抗体实际上可以被衍生或连接至超过一个的其他功能性分子，以产生结合超过两个的不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；本文所用的这样的多特异性分子也意欲被术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可以功能性地连接(例如，通过化学偶联，基因融合，非共价结合或其他方式)至一个或多个其他结合分子，如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而产生双特异性分子。
因此，本发明包括双特异性分子，其包含至少一个LOX-1的第一结合特异性和第二靶表位的第二结合特异性。例如，第二靶表位是不同于第一靶表位的另一LOX-1表位。
此外，对于本发明，其中双特异性分子是多特异性的，除了对第一和第二靶表位之外，所述分子可以进一步包括第三结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体或其抗体片段，包括，例如，Fab，Fab'，F(ab')2，Fv或单链Fv。该抗体还可以是轻链或重链二聚体，或任何其最小片段，如Fv或单链构建体，如Ladner等人的美国专利号4,946,778。
双抗体是二价、双特异性分子，其中VH和VL结构域表达于单一多肽链上，其通过非常短的接头连接，从而不允许在相同链上的两个结构域之间配对。VH和VL结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger等人,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak等人,1994 Structure 2:1121-1123)。可以通过在相同细胞内表达具有VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)结构、或具有VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)结构的两条肽链生成双抗体。其中的大多数可以在细菌中以可溶形式表达。单链双抗体(ScDb)通过用约15个氨基酸残基的接头连接两个形成双抗体的多肽链生成(参见Holliger和Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(3-4):128-30；Wu等人,1996 Immunotechnology,2(1):21-36)。ScDb可以可溶的活性单体形式在细菌中表达(参见Holliger和Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(34):128-30；Wu等人,1996Immunotechnology,2(1):21-36；Pluckthun和Pack,1997 Immunotechnology,3(2):83-105；Ridgway等人,1996 Protein Eng.,9(7):617-21)。双抗体可以与Fc融合以产生“二-双抗体”(见Lu等人,2004 J.Biol.Chem.,279(4):2856-65)。
可在本发明的双特异性分子中采用的其他抗体是鼠、嵌合的和人源化单克隆抗体。
双特异性分子可通过使用本领域中已知的方法缀合组分结合特异性制备。例如，双特异性分子的每一种结合特异性可单独生成，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见，例如，Karpovsky等人,1984 J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等人,1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等人,1985 Science229:81-83),和Glennie等人,1987J.Immunol.139:2367-2375)中描述的那些。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者都可从Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)获得。
当结合特异性是抗体时，其可以通过两条重链C末端铰链区的巯基键合来缀合。在一个特别实施方案中，修饰铰链区以在缀合前包含奇数个巯基残基，例如一个。
可替代地，两种结合特异性可以被编码在相同的载体中，并在相同的宿主细胞中表达和组装。当双特异性分子是mAb x mAb,mAb x Fab,Fab x F(ab')2或配体x Fab融合蛋白时，这个方法特别有用。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或者是包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号5260203；美国专利号5455030；美国专利号4881175；美国专利号5132405；美国专利号5091513；美国专利号5476786；美国专利号5013653；美国专利号5258498和美国专利号5482858。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)，放射免疫试验(REA)，FACS分析，生物试验(例如，生长抑制)或蛋白质印迹试验确认。这些试验中的每一个通常通过使用特异于目的复合物的标记试剂(例如，抗体)来检测特定目的蛋白质-抗体复合物的存在。
在另一方面，本发明提供包含本发明的结合LOX-1的抗体的至少两个相同或不同的抗原结合部分的多价化合物。抗原结合部分可以通过蛋白质融合或共价或非共价键连接在一起。可替换地，连接方法已被描述用于双特异性分子。可以通过例如交联本发明抗体的抗体和与本发明抗体的恒定区(例如在Fc或铰链区)结合的抗体来获得四价化合物。
三聚结构域例如描述于Borean专利EP 1 012 280B1中。五聚模块例如描述于PCT/EP97/05897。
具有延长的半衰期的抗体
本发明提供了特异性结合LOX-1蛋白的抗体，其在体内具有延长的半衰期。
许多因素可能会影响体内蛋白质的半衰期。例如，肾脏的过滤，在肝脏中的代谢，被蛋白质水解酶(蛋白酶)的降解，和免疫原性应答(例如，通过抗体的蛋白质中和和被巨噬细胞和树突状细胞的摄取)。多种策略可用于延长本发明抗体的半衰期。例如，通过化学键接至聚乙二醇(PEG)，reCODE PEG，抗体支架，聚唾液酸(PSA)，羟乙基淀粉(HES)，白蛋白结合配体，和碳水化合物屏蔽；通过基因融合至结合血清蛋白的蛋白，如白蛋白，IgG，FcRn，和转移；通过偶联(遗传的或化学的)至结合血清蛋白的其他结合部分，如纳米抗体，Fab，DARPins，avimer，亲和体，和Anticalin；通过基因融合至rPEG，白蛋白，白蛋白结构域，白蛋白结合蛋白，和Fc；或通过并入纳米载体，缓释配方，或医疗器械。
为了延长抗体在体内的血清循环，惰性聚合物分子例如高分子量的PEG可以使用或不使用多功能接头通过PEG与抗体N或C末端的位点特异性缀合、或通过存在于赖氨酸残基上的ε-氨基连接于抗体或其片段。为了聚乙二醇化抗体，抗体或其片段通常在其中一个或多个PEG基团可连接到抗体或抗体片段的条件下，与聚乙二醇(PEG)反应，如PEG的反应性酯或醛衍生物。聚乙二醇化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在包括任何形式的PEG，其已被用于衍生其他蛋白质，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。将使用导致生物活性损失最小的直链或支链的聚合物衍生。缀合程度可以通过SDS-PAGE和质谱密切监测，以确保PEG分子与抗体的正确缀合。未反应的PEG可通过大小排阻或通过离子交换色谱法从抗体-PEG缀合物分离。可使用本领域技术人员公知的方法测试PEG衍生抗体的结合活性以及体内效力，例如通过本文描述的免疫试验进行测试。将蛋白质PEG化的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明的抗体。参见例如，Nishimura等人的EP 0 154 316，和Ishikawa等人的EP0 401 384。
其他修饰的聚乙二醇化技术包括重构化学正交指导工程技术(ReCODE PEG)，其通过重构系统(包括tRNA合成酶和tRNA)将化学指定侧链并入生物合成蛋白质。该技术能够使超过30个新氨基酸并入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中的生物合成蛋白质中。在琥珀密码子定位的任何地方，tRNA并入非天然氨基酸，将琥珀从终止密码子转换为发出并入化学指定氨基酸的信号的密码子。
重组聚乙二醇化技术(rPEG)也可用于血清半衰期的延长。此技术包括遗传融合300-600个氨基酸的非结构化蛋白质尾至现有的药物蛋白。因为这样的非结构化蛋白质链的表观分子量比其实际分子量大约15倍，该蛋白质的血清半衰期大大增加。与传统的聚乙二醇化相反，这需要化学缀合和再纯化，制造过程是大大简化了，且产品是均质的。
聚唾液酸化是另一种技术，它利用天然聚合物聚唾液酸(PSA)来延长治疗性肽和蛋白质的活性寿命，提高稳定性。PSA是唾液酸(糖)的聚合物。当用于蛋白质和治疗肽药物递送时，聚唾液酸提供缀合上的保护性微环境。这增加了治疗性蛋白在循环中的活性寿命并防止其被免疫系统识别。PSA聚合物天然发现在人体内。它被经数百万年进化的某些细菌利用来包被其壁。这些天然唾液酸化的细菌然后能凭借分子模拟，阻挡人体的防御系统。PSA，自然界中的终极隐身技术，可以容易地从这些细菌大量产生，且具有预定的物理特性。细菌PSA完全是非免疫原性的，即使当其与蛋白质偶联时，因为其在化学上与人体内的PSA是相同的。
另一技术包括使用连接于抗体的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物。HES是从糯玉米淀粉衍生的修饰的天然聚合物，其可以通过体内的酶代谢。通常施用HES溶液来替代缺陷血容量和改善血液的流变性能。抗体的HES化通过增加分子的稳定性以及通过减少肾清除使得循环半衰期延长，导致增加的生物学活性。通过改变不同的参数，如HES的分子量，可定制范围广泛的HES抗体缀合物。
也可以通过向IgG恒定结构域，或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链Fc结构域片段)引入一个或多个氨基酸修饰(即，取代，插入或缺失)产生具有体内半衰期增加的抗体。见，例如，国际公开号WO 98/23289；国际公开号WO 97/34631；和美国专利号6277375。
此外，为了使抗体或抗体片段在体内更稳定或具有更长的体内半衰期，抗体可以缀合到白蛋白(例如，人血清白蛋白；HSA)。该技术是本领域公知的，见，例如，国际公开号WO93/15199，WO 93/15200和WO 01/77137；和欧洲专利EP 413622。此外，在如上所述的双特异性抗体的上下文中，可以设计该抗体的特异性使得该抗体的一个结合结构域与LOX-1结合，而抗体的第二结合结构域与血清白蛋白，优选HSA结合。
用于增加半衰期的策略在期望增加其体内半衰期的纳米抗体、基于纤连蛋白的结合物和其他抗体或蛋白质中特别有用。
抗体缀合物
本发明提供了特异性结合LOX-1蛋白的抗体或其片段，其重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至异源蛋白或多肽(或其片段，优选至少10，至少20，至少30，至少40，至少50，至少60，至少70，至少80，至少90或至少100个氨基酸的多肽)以产生融合蛋白质。尤其是，本发明提供融合蛋白，其包含本文所述的抗体的抗原结合片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)和异源蛋白、多肽或肽。用于将蛋白质、多肽、或肽融合或缀合至抗体或抗体片段的方法是本领域已知的。见，例如，美国专利号5336603，5622929，5359046，5349053，5447851和5112946。欧洲专利EP 307434和EP 367166。国际公开号WO96/04388和WO 91/06570。Ashkenazi等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539；Zheng等人,1995,J.Immunol.154:5590-5600；和Vil等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341。
可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称称为“DNA改组”)的技术产生其他融合蛋白。DNA改组可用于改变本发明抗体或其片段的活性(例如，具有更高的亲和力和更低的解离速率的抗体或其片段)。一般参见美国专利号5605793，5811238，5830721，5834252和5837458；Patten等人,1997,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson,等人,1999,J.Mol.Biol.287:265-76；和Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques 24(2):308-313(这些专利和出版物中的每一个在此通过引用将其整体并入)。抗体或其片段，或编码的抗体或其片段，可以通过在重组前经历易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法的随机诱变而改变。编码特异性结合LOX-1蛋白的抗体或其片段的多核苷酸，可与一个或多个异源分子的一种或多种组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
此外，抗体或其片段可以融合到标记物序列，如肽，以促进纯化。在优选的实施方案中，标记物氨基酸序列是六-组氨酸肽，如在pQE载体中提供的标签(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)，尤其是，其中许多是市售的。如在Gentz等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824中所述，例如，六-组氨酸为融合蛋白提供了方便的纯化。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于，血凝素(“HA”)标签，其对应于来自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,1984,Cell 37:767)，和“标志”标签。
在其他实施方案中，本发明的抗体或其片段缀合诊断或检测试剂。这样的抗体作为临床测试程序的一部分对监测或预后疾病或病症的发作、发生、进展和/或严重性是有用的，例如确定特定治疗的效力。这样的诊断和检测可通过偶联抗体与可检测的物质实现，所述可检测的物质包括但不限于，各种酶，如，但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；辅基，如，但不限于，链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，如，但不限于，伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，如，但不限于，鲁米诺；生物发光物质，例如但不限于，荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质，如，但不限于，碘(131I，125I，123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In，113In，112In，和111In，)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga，67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；和使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属和无放射性的顺磁金属离子。
本发明还包括缀合至治疗性部分的抗体或其片段的用途。抗体或其片段可缀合到治疗部分，如细胞毒素，例如，细胞生长抑制剂或杀细胞剂，治疗剂或放射性金属离子，例如，α-发射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。
此外，抗体或其片段可缀合到治疗部分或药物部分，修改给定的生物反应。治疗部分或药物部分不应被解释为限于经典的化学治疗剂。例如，所述药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质、肽、或多肽。此类蛋白质可包括，例如，毒素，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子、α干扰素、β干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤溶酶原激活剂、细胞凋亡剂、抗血管生成剂；或者，生物反应调节剂，如，例如，淋巴因子。
此外，抗体可缀合到治疗部分，如放射性金属离子，如α-发射物如213Bi或大环螯合剂用于缀合放射性金属离子至多肽，所述放射性金属离子包括但不限于，131In，131LU，131Y，131Ho，131Sm。在某些实施方案中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N，N'，N”，N”'-四乙酸(DOTA)，其可通过接头分子连接到抗体上。这种接头分子通常是本领域已知的，描述于Denardo等人,1998,Clin Cancer Res.4(10):2483-90；Peterson等人,1999,Bioconjug.Chem.10(4):553-7；和Zimmerman等人,1999,Nucl.Med.Biol.26(8):943-50，每一个通过引用其整体并入本文。
缀合治疗部分与抗体的技术是公知的，见，例如，Arnon等人,“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,出自MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(编辑),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery”,出自Controlled DrugDelivery(第二次编辑),Robinson等人(编辑),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,出自Monoclonal Antibodies 84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(编辑),pp.475-506(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,出自MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(编辑),pp.303-16(Academic Press 1985),and Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.62:119-58。
抗体也可以附着于固体支持物，这对于免疫试验或靶抗原的纯化特别有用。这样的固体支持物包括但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
产生本发明的抗体的方法
编码抗体的核酸
本发明提供基本上纯化的核酸分子，其编码含有上述LOX-1结合抗体链的区段或结构域的多肽。本发明的某些核酸包含编码如SEQ ID NO：15、35、55、75或95所示的重链可变区的核苷酸序列，和/或编码如SEQ ID NO：25、45、65、85或105所示的轻链可变区的核苷酸序列。在一个具体的实施方案中，核酸分子是在表1中鉴定的那些。本发明的一些其他核酸分子包括与表1所鉴定的那些核苷酸序列基本上相同(例如，至少65，80％，95％或99％)的核苷酸序列。当从合适的表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够显示LOX-1抗原结合能力。
本发明还提供了编码来自上述LOX-1结合抗体的重链或轻链的至少一个CDR区和通常全部三个CDR区的多核苷酸。一些其他多核苷酸编码所有或基本上所有的上述LOX-1结合抗体的重链和/或轻链的可变区序列。因为密码子的简并性，多个核酸序列编码每个免疫球蛋白的氨基酸序列。
本发明的核酸分子可以编码抗体的可变区和恒定区两者。某些本发明的核酸序列包含编码与SEQ ID NO：16、36、56、76或96所示的重链序列基本上相同(例如，至少80％，90％或99％)的重链序列的核苷酸。一些其他核酸序列包含编码与SEQ ID NO：26、46、66、86或106所示的轻链序列基本上相同(例如，至少80％，90％或99％)的轻链序列的核苷酸。
多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过现有的编码LOX-1结合抗体或其结合片段的序列的PCR诱变来制备(例如，如下面实施例中所述的序列)。核酸的直接化学合成可通过本领域中已知的方法完成，如Narang等人,1979,Meth.Enzymol 68:90的磷酸三酯法；Brown等人,Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯方法；Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固体支持物法。通过PCR向多核苷酸序列引入突变可通过如下所述进行，例如PCR Technology:Principles andApplications for DNA Amplification,H.A.Erlich(编辑),Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等人(编辑),AcademicPress,San Diego,CA,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和Eckert等人,PCR Methods and Applications 1:17,1991。
在本发明中还提供了用于生产上述LOX-1结合抗体的表达载体和宿主细胞。各种表达载体可用于表达编码LOX-1结合抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒和非病毒的表达载体可用于在哺乳动物宿主细胞中生产抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体、典型地具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒，和人的人工染色体(见，例如，Harrington等人,Nat Genet 15:345,1997)。例如，用于在哺乳动物(例如，人)细胞中表达LOX-1结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A，B&C，pcDNA3.1/His，pEBVHis A，B&C，(Invitrogen,San Diego,CA)，MPSV载体和本领域中已知的用于表达其他蛋白质的大量其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP EB病毒的载体，痘苗病毒载体和Semliki森林病毒(SFV)。见，Brent等人,参见前文；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；and Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
表达载体的选择取决于预期待表达载体的宿主细胞。典型地，表达载体含有启动子和其他调控序列(例如，增强子)，其有效地连接到编码LOX-1结合抗体链或片段的多核苷酸。在一些实施方案中，采用诱导型启动子以防止插入序列在诱导条件以外的条件下表达。诱导型启动子包括，例如，阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。可以在非诱导条件下扩大转化生物体的培养物，而不偏向其表达产物更好地被宿主细胞耐受的编码序列群。除了启动子，也可能需要或期望其他调控元件以有效表达LOX-1结合抗体链或片段。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。另外，表达的效率可通过包含对所使用的细胞系统适合的增强子来增强(见，例如，Scharf等人,ResultsProbl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体也可提供分泌信号序列位置，以与插入的LOX-1结合抗体序列编码的多肽形成融合蛋白。更多的时候，插入的LOX-1结合抗体序列在包含于载体中之前与信号序列连接。用于接收编码LOX-1结合抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码其恒定区或部分。此类载体允许可变区与恒定区作为融合蛋白表达，从而导致完整抗体或其片段的生成。通常，此类恒定区是人的。
携带并表达LOX-1结合抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种用于克隆和表达本发明多核苷酸的原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括杆菌，如枯草杆菌，和其他肠细菌，如沙门氏菌、沙雷氏菌属和各种假单胞菌属。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞兼容的表达控制序列(例如，复制原点)。此外，存在任何数量的多种众所周知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自λ噬菌体的启动子系统。所述启动子通常控制表达，任选地与操纵子序列一起，并具有核糖体结合位点序列等，用于起始和完成转录和翻译。其他微生物，如酵母，也可以用来表达本发明的LOX-1结合多肽。也可使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。
在一些优选的实施方案中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的LOX-1结合多肽。例如，其可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，如实施例中描述的1D6.C9骨髓瘤杂交瘤克隆)或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，以下举例说明的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常非永生或正常或异常永生动物或人细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的适当的宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。利用哺乳动物组织细胞培养物表达多肽，一般地讨论于，例如，Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以含有表达控制序列，如复制原点、启动子和增强子(见，例如，Queen,等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，以及必要的加工信息的位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。这些表达载体通常含有来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调制的或可调节的。有用的启动子包括但不限于，金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域中公知的启动子-增强的组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(一般参见Sambrook,等人，同上)。其他方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹道方法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合体(Elliot和O'Hare,Cell 88:223,1997)、试剂增强的DNA吸收和离体转导。为了长期、高产率生产重组蛋白，往往期望稳定表达。例如，使用本发明的表达载体制备稳定表达LOX-1结合抗体链或结合片段的细胞系，所述本发明的表达载体含有病毒复制原点或内源表达元件和可选择的标记基因。在引入载体后，可被允许细胞在富集培养基中生长1-2天，而后将其转移到选择性培养基。可选择标记的目的是赋予选择抗性，其存在允许成功表达引入序列的细胞在选择性培养基上生长。抗性的、稳定转染的细胞可以使用适合于该细胞类型的组织培养技术增殖。
本发明单克隆抗体的产生
可以采用许多技术生产单克隆抗体(mAb)，包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein,1975 Nature 256:495的标准体细胞杂交技术。可以使用生产单克隆抗体的多种技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的动物系统包括鼠，大鼠和兔系统。在小鼠中生产杂交瘤是一种完善的方法。用于免疫的脾细胞的分离和融合的免疫方案和技术在现有技术中是已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
本发明的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标鼠杂交瘤获得，使用标准分子生物学技术对其工程化使含有非鼠(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了生产嵌合抗体，使用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区(见，例如，Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了生产人源化抗体，使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入到人框架。见，例如，Winter的美国专利号5225539，和Queen等人的美国专利号5530101；5585089；5693762和6180370。
在某个实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。这样的针对LOX-1的人单克隆抗体可使用携带人免疫系统部分而不是小鼠系统的转基因或染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，在本文中共同称为“人Ig小鼠”。
HuMAb小鼠
Figure BDA0000922241250000691
(Medarex,Inc.)包含人免疫球蛋白基因迷你基因座(miniloci)，其编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，以及失活内源性μ和κ链基因座的靶标突变(见，例如，Lonberg,等人,1994 Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠显示小鼠IgM或κ的表达降低，并且在对免疫的反应中，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，以产生高亲和力的人IgGκ单克隆(Lonberg,N.等人,1994，参见前文；综述于Lonberg,N.,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.and Huszar,D.,1995 Intern.Rev.Immunol.13:65-93,和Harding,F.和Lonberg,N.,1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMAb小鼠的制备和使用，以及由这种小鼠携带的基因组修饰，进一步描述在Taylor,L.等人,1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等人,1993 International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3720-3724；Choi等人,1993 Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等人,1993 EMBO J.12:821-830；Tuaillon等人,1994 J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等人,1994 International Immunology 579-591；和Fishwild,D.等人,1996Nature Biotechnology 14:845-851中，所有这些文献的内容在此明确通过引用整体并入本文。进一步参见，美国专利号5545806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5789650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429；均属于Lonberg和Kay；Surani等人的美国专利号5,545,807；PCT公开号WO 92103918,WO 93/12227,WO 94/25585,WO97113852,WO 98/24884和WO 99/45962，均属于Lonberg和Kay；和Korman等人的PCT公开号WO 01/14424。
在另一个实施方案中，本发明的人抗体可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠产生，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠。此类小鼠，在本文中称为“KM小鼠”，详细描述于Ishida等人的PCT公开WO 02/43478中。
更进一步地，表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统在本领域中可以获得，其能够用来产生本发明的LOX-1结合抗体。例如，可以使用称为Xenomouse(Abgenix,Inc.)的备选转基因系统。这种小鼠描述于，例如，Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统在本领域中可以获得，其能够用来产生本发明的LOX-1结合抗体。例如，可以使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链染色体的小鼠；此类小鼠描述于Tomizuka等人,2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727。此外，在现有技术中描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等人,2002 Nature Biotechnology 20:889-894)，并且其可以用于生产本发明的LOX-1结合抗体。
本发明的人单克隆抗体也可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因的文库的噬菌体展示方法制备。用于分离人抗体的这种噬菌体展示方法是本领域确定的或在下面的实施例中说明。参见，例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484和5571698；Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；以及Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
本发明的人单克隆抗体也可使用SCID小鼠制备，在该SCID小鼠中人免疫细胞已被重构，使得在免疫时可以产生人抗体应答。此类小鼠描述于，例如，Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767。
框架或Fc工程化
本发明的工程化抗体包括其中对VH和/或VL内的框架残基修饰、例如以改善抗体特性的那些抗体。典型地，这种框架修饰是为了降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是“回复突变”一个或多个框架残基成为相应的种系序列。更具体而言，已经经历体细胞突变的抗体可能包含与该抗体所来源的种系序列不同的框架残基。这种残基可以通过比较抗体框架序列与该抗体所来源的种系序列来鉴定。为了使框架区序列恢复为其种系构型，体细胞突变可以被“回复突变”至该种系序列，例如，通过位点定向诱变。这样“回复突变”的抗体也意在涵盖于本发明中。
另一种类型的框架修饰涉及突变框架区内、或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以除去T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也被称为“去免疫化”，其在Carr等人的美国专利公开号20030153043中进一步详细描述。
除了，或可替代地在框架区或CDR区内进行修饰，本发明的抗体可被工程化以包含在Fc区内的修饰，通常改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可以进行化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以连接到抗体上)，或者被修饰以改变其糖基化，再次改变该抗体的一种或多种功能特性。这些实施方案的每一个均在下文进一步详细描述。在Fc区内残基的编号是Kabat的EU索引。
在一个实施方案中，CH1铰链区被修饰，使得在铰链区的半胱氨酸残基数目改变，例如，增加或减少。该方法进一步在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中描述。例如，CH1铰链区的半胱氨酸残基数目改变，以促进轻链和重链的装配，或提高或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，抗体Fc铰链区进行突变，以降低该抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得抗体相对于天然Fc-铰链结构域的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合，具有受损的SpA结合。该方法更详细地描述于Ward等人的美国专利号6,165,745。
在另一个实施方案中，修饰抗体以增加其生物半衰期。各种方法是可能的。例如，可引入一个或多个下列突变：T252L，T254S，T256F，如Ward的美国专利号6,277,375描述的。或者，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体，以含有来自IgG Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022所述。
在又一个其他实施方案中，通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，一个或多个氨基酸可以被不同氨基酸残基替换，使得该抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。可以改变对其亲和力的效应配体是，例如，Fc受体或补体的C1成分。这种方法更详细地描述于美国专利号5,624,821和5,648,260，二者均属于Winter等人。
在另一个实施方案中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以被不同氨基酸残基替换，使得该抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法进一步详细地描述于Idusogie等人的美国专利号6,194,551。
在另一个实施方案中，一个或多个氨基酸残基被改变，从而改变抗体固定补体的能力。该方法进一步描述于Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351。
在另一个实施方案中，Fc区被修饰，通过修饰一个或多个氨基酸，以增加抗体介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或以增加抗体对Fcγ受体的亲和力。该方法进一步描述于Presta的PCT公开WO 00/42072。此外，已经绘制了人IgG1上对FcγRl，FcγRII，FcγRIII和FcRn的结合位点，并已描述了具有提高的结合的变体(参见Shields,R.L.等人,2001 J.Biol.Chen.276:6591-6604)。
在另一个实施方案中，抗体的糖基化被修饰。例如，可制成无糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化，例如，以增加抗体对“抗原”的亲和力。这样的碳水化合物修饰可以通过，例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以制备一个或多个氨基酸取代，导致消除一个或多个可变区框架的糖基化位点，由此消除在该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这样的方法进一步详细描述于Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861。
此外或备选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有降低的岩藻糖基残基含量的低岩藻糖化(hypofucosylated)抗体或具有增加的等分GlcNac结构的抗体。已证实这种改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。这样的碳水化合物修饰可以通过，例如，在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中已有描述，并且可以用作宿主细胞，在其中表达本发明的重组抗体，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，该FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，从而在这样的细胞系表达的抗体表现出低岩藻糖化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系，Lecl3细胞，其具有降低的将岩藻糖连接于Asn(297)-连接的碳水化合物的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(也见Shields,R.L.等人,2002 J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了细胞系被工程化以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))，使得在工程化的细胞系中表达的抗体表现出增加的等分GlcNac结构，导致增加的抗体ADCC活性(也见Umana等人,1999 Nat.Biotech.17:176-180)。
工程化改变抗体的方法
如上述讨论的，本文所示的具有VH和VL序列或全长重链和轻链序列的LOX-1结合抗体，通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列、或与之连接的恒定区，可用于创建新的LOX-1结合抗体。因此，在本发明的另一个方面，本发明LOX-1结合抗体的结构特征用于创建保留了本发明抗体的至少一种功能特性的结构相关的LOX-1结合抗体，所述本发明抗体的至少一种功能特性如结合人LOX-1，以及还抑制LOX-1的一种或多种功能特性(例如，抑制LOX-1-结合到LOX-1受体，抑制LOX-1依赖的细胞增殖)。
例如，本发明抗体的一个或多个CDR区或其变体，可以与已知的框架区和/或其他CDR重组组合，以创建本发明另外的、重组工程化的LOX-1结合抗体，如上所述。其他类型的修饰包括在上一节中描述的那些。用于工程化方法的起始物质是一个或多个本文提供的VH和/或VL序列，或一个或多个其CDR区。为了创建工程化的抗体，不需要实际制备(即，表达为蛋白质)具有一个或多个本文所提供的VH和/或VL序列、或一个或多个其CDR区的抗体。相反，序列中包含的信息被用作起始物质以创建来自原始序列的“第二代”序列，然后制备“第二代”序列并表达为蛋白质。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供用于制备LOX-1结合抗体的方法，所述LOX-1结合抗体包含重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列，所述重链可变区抗体序列具有选自SEQ ID NO：8、28、48、68和88的CDR1序列，选自SEQ ID NO：9、29、49、69和89的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO：10、30、50、70和90的CDR3序列；所述轻链可变区抗体序列具有选自SEQ ID NO：18、38、58、78和98的CDR1序列，选自SEQ ID NO：19、39、59、79和99的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO：20、40、60、80和100的CDR3序列；改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以创建至少一个改变的抗体序列；将改变的抗体序列表达为蛋白质。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供用于制备LOX-1结合抗体的方法，所述LOX-1结合抗体包含重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列，所述重链可变区抗体序列具有选自SEQ ID NO：11、31、51、71和91的CDR1序列，选自SEQ ID NO：12、32、52、72和92的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO：13、33、53、73和93的CDR3序列；所述轻链可变区抗体序列具有选自SEQ ID NO：21、41、61、81和101的CDR1序列，选自SEQ ID NO：22、42、62、82和102的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO：23、43、63、83和103的CDR3序列；改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以创建至少一个改变的抗体序列；将改变的抗体序列表达为蛋白质。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了制备用于在哺乳动物细胞中优化表达的LOX-1结合抗体的方法，所述LOX-1结合抗体由全长重链抗体序列和全长轻链抗体序列组成，所述全长重链抗体序列具有选自SEQ ID NO：16、36、56、76或96的序列；和所述全长轻链抗体序列具有选自SEQ ID NO：26、46、66、86或106的序列；改变全长重链抗体序列和/或全长轻链抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以创建至少一个改变的抗体序列；将改变的抗体序列表达为蛋白质。在一个实施方案中，重链或轻链的改变在重链或轻链的框架区内。
也可以通过筛选抗体文库制备改变的抗体序列，该抗体文库具有如US2005/0255552中描述的固定的CDR3序列或最小必需结合决定簇和CDR1和CDR2序列的多样性。筛选可以根据任何适合于从抗体文库筛选抗体的技术进行，如噬菌体展示技术。
标准分子生物学技术可以用于制备和表达改变的抗体序列。由改变的抗体序列编码的抗体是保留了本文所描述的LOX-1结合抗体的一种、一些或全部功能特性的抗体，其功能特性包括但不限于，特异性结合人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠LOX-1；和在F36E和/或Ba/F3-LOX-1R细胞增殖试验中抑制LOX-1依赖性细胞增殖的抗体。
在本发明的工程化抗体的方法的某些实施方案中，突变可以随机地或选择性地沿着LOX-1结合抗体编码序列的全部或部分引入，并且筛选所得的修饰LOX-1结合抗体的结合活性和/或如本文所述的其他功能特性。突变方法在本领域中已有描述。例如，Short的PCT公开WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接组装或其组合用于创建和筛选抗体突变的方法。可替代地，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679描述了使用计算筛选方法优化抗体生理化学特性的方法。
在本发明的某些实施方案中，抗体已被工程化以除去脱酰胺位点。已知脱酰胺在肽或蛋白质中导致结构和功能的改变。脱酰胺可以导致降低的生物活性，以及蛋白质药物的药代动力学和抗原性的改变。(Anal Chem.2005 Mar 1；77(5):1432-9)。
在本发明的某些实施方案中，抗体已被工程化以增加pI并改善其药物样特性。蛋白质的pI是分子总体生物物理特性的关键决定因素。具有低pI的抗体已知可溶性较低，不太稳定，而且容易聚集。另外，具有低pI抗体的纯化具有挑战性，尤其是在放大规模用于临床应用中是有问题的。增加本发明的抗LOX-1抗体或Fab的pI，改善了其溶解度，使得能以较高浓度(>mg/ml)配制抗体。高浓度(例如，>100mg/ml)的抗体配方提供的优势在于，能够经由玻璃体内注射向患者眼内施用较高剂量的抗体，这反过来又可以减少施用频率，对于治疗慢性疾病包括心血管疾病具有显著优势。较高pI也可以增加抗体IgG版本的FcRn介导的再循环，从而使药物在体内持续更长时间，需要更少的注射次数。最后，由于较高的pI导致更长的储存期和体内生物活性，抗体的整体稳定性显著改善。优选，pI为大于或等于8.2。
改变的抗体的功能特性可以用本领域中可用的和/或本文所述的标准试验评估，如实施例中所阐述(例如，ELISA)。
预防和治疗用途
通过向需要其的受试者施用有效量的本发明的抗体或抗原结合片段，如本文所述的结合LOX-1的抗体，可以治疗上有用的浓度用于治疗与增加的LOX-1水平和/或活性相关的疾病或疾病。本发明通过向需要其的受试者施用有效量的本发明抗体，提供了治疗LOX-1相关心血管疾病的方法。本发明通过向需要其的受试者施用有效量的本发明抗体，提供了治疗LOX-1相关心血管疾病的方法。
本发明的抗体可以用于，尤其是，预防治疗、预防和改善LOX-1相关病症或疾病，包括但不限于心血管疾病，内皮细胞功能障碍，内皮细胞疾病，动脉粥样硬化，动脉硬化，高血压，高脂血症，高胆固醇血症，糖尿病，一氧化氮缺乏症，心肌梗塞，血管氧化应激，心肌缺血，缺血再灌注，败血症，糖尿病性肾病，肾疾病，心肌病，心脏衰竭，外周动脉疾病，冠心病，跛行(例如间歇性跛行，卢瑟福II/III级跛行)，外周动脉疾病(PAD)，心绞痛(例如，顽固性心绞痛)，冠状动脉疾病(CAD)(例如，由于供给心脏的动脉的动脉粥样硬化)，中风和异常内皮依赖性血管舒张。
治疗和/或预防心血管疾病，例如，LOX-1相关的心血管疾病，可通过健康护理专业人员使用血管功能的临床相关测量来确定。LOX-1相关心血管疾病的治疗是指任何行动(例如，施用本文所描述的抗LOX-1抗体)，其导致、或考虑到其将导致改善或保留血管功能、血管解剖和/或血液动力学参数。此外，当涉及与心血管疾病相关的病症或疾病时，预防是指任何行动(例如，施用本文所描述的抗LOX-1抗体)，其防止或减缓具有所述恶化风险的患者的血管功能恶化和/或心血管疾病参数，如本文所定义。
由于oxLDL和可溶性LOX-1水平在稳定型心绞痛和急性缺血综合征中均增加，预期本发明的抗LOX-1抗体抑制血管氧化应激，降低心肌缺血和改善心绞痛和运动耐力；所述抗体具有成为第一种可用的疾病修饰抗心绞痛治疗的潜力。
所述治疗性施用的效力可通过系列评估短暂性缺血事件(动态ECG监测)和心绞痛(西雅图心绞痛问卷)的频率和持续时间，和连续运动耐量测试与灌注成像选项来测定。效力也可通过使用生物标记物例如血浆oxLDL、可溶性LOX-1和氧化应激生物标记物(F2-异前列腺素、丙二醛、髓过氧化物酶)测定。
本文使用的“跛行”，包括严重跛行和其他类似的术语，描述了一种活动障碍以及高度未满足的医疗需要。跛行是一种病症，其特征为下肢缺血引起肌肉疲劳、劳累时疼痛而休息时缓解、活动受限以及生活质量下降，该病症由动脉粥样硬化和异常(例如，受损的)内皮依赖性血管舒张引起。其在美国的患病率是800-1200万患者。在患有间歇性跛行的患者中，7％将接受下肢搭桥手术，4％将需要主要截肢，而16％将发展为恶化的跛行。20％患5年以上重度跛行的患者发生心血管事件，如心肌梗死和中风。当前的疗法是手术，以及通过微创手段的治疗，如施用本发明的抗LOX-1抗体，将代表巨大的治疗性突破。
所述治疗性施用的效力可通过运动性跛行(跖屈和跑步机)的系列评估来测量，具有端值的包括至疼痛发作的时间、运动持续时间、和行走的距离。效力也可通过使用如下测量：机械(mechanistic)的生物标记物，如血浆oxLDL和可溶性LOX-1；氧化应激的生物标记物(F2-异前列腺素、丙二醛、髓过氧化物酶)；在下肢流量的运动性变化和肌肉氧饱和度。
本发明的抗LOX-1抗体将在治疗上有用地用于另一个高度未满足的医疗需要是，顽固性心绞痛。不选择血流重建，尽管使用最佳药物治疗(如，施用长效β受体阻滞剂，硝酸盐和钙通道阻滞剂)，心绞痛受试者会复发。顽固性心绞痛是一种标志为心肌缺血导致的胸痛的病症，一般是由于冠状动脉(例如，由于冠状动脉疾病)的阻塞或痉挛引起，伴有衰弱症状，体力活动非常受限以及生活质量较差。在美国100-180万遭受顽固性心绞痛的患者以每年10％的比率经历增加的心血管疾病死亡率；每年至少有10万例新发生的顽固性心绞痛的病例。
本发明的抗体也可用于与其他药剂联合用于预防、治疗或改善LOX-1相关的疾病。例如，他汀类治疗可以与本发明的LOX-1抗体和抗原结合片段组合用于治疗患有心血管疾病的患者。
药物组合物
本发明提供包含LOX-1结合抗体(完整或结合片段)与可药用的载体一起配制的药物组合物。该组合物可以另外含有一种或多种适用于治疗或预防，例如，心血管疾病的其他治疗剂。可药用的载体增强或稳定组合物，或可用于促进组合物的制备。可药用的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。
本发明的药物组合物可以通过多种本领域已知的方法施用。施用的途径和/或方式根据所期望的结果而有所不同。优选施用是玻璃体内，静脉内，肌内，腹膜内，或皮下，或目标部位近端施用。可药用的载体应适合于玻璃体内，静脉内，肌内，皮下，肠胃外，髓内或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物(即抗体，双特异性和多特异性分子)可以被材料包被，以保护化合物免受酸和其他天然条件的作用而可能失活该化合物。
组合物应该是无菌的和流动的。例如，通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小、以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇或山梨糖醇，和氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝或明胶来实现注射组合物的长期吸收。
本发明的药物组合物可以按照本领域公知的方法和常规实践来制备。见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,第20次编辑,2000；和Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。药物组合物优选在GMP条件下生产。通常，在本发明的药物组合物中采用治疗有效剂量或有效剂量的LOX-1结合抗体。通过本领域技术人员已知的常规方法将LOX-1结合抗体配制成可药用的剂型。调节剂量方案，以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注、可以随时间施用几个分开的剂量或如治疗情况的紧急程度所示可以按比例降低或增加剂量。特别有利的是配制剂量单位形式的肠胃外组合物以易于施用和剂量的均匀。本文所用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上分开的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，其与所需药物载体组合，计算将产生期望的治疗效果。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得活性成分的量，其有效实现对特定患者、组合物和施用模式所需的治疗反应，而对患者不具毒性。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括本发明使用的特定组合物、或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所使用特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质，所治疗患者的年龄，性别，体重，状况，一般健康和之前的医疗史等因素。
医师或兽医可以以低于实现所需治疗效果需要的水平开始药物组合物中使用的本发明抗体的剂量，并逐步增加剂量，直至实现期望的效果。在一般情况下，用于治疗本文所述心血管疾病的本发明组合物的有效剂量，取决于许多不同因素，包括施用手段、靶位点、患者的生理状态，无论患者是人还是动物、施用其他药物治疗，和无论治疗是预防性的还是治疗性的。治疗剂量需要逐渐增加以优化安全性和有效性。用于全身施用的抗体，剂量范围从约宿主体重的0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至15mg/kg。用于玻璃体内施用的抗体，剂量范围可为0.1mg/眼至5mg/眼。例如为0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.3mg/ml，0.4mg/ml，0.5mg/ml，0.6mg/ml，0.7mg/ml，0.8mg/ml，0.9mg/ml，1.0mg/ml，1.1mg/ml，1.2mg/ml，1.3mg/ml，1.4mg/ml，1.5mg/ml，1.6mg/ml，1.7mg/ml，1.8mg/ml，1.9mg/ml，2.0mg/ml，2.1mg/ml，2.2mg/ml，2.3mg/ml，2.4mg/ml，2.5mg/ml，2.6mg/ml，2.7mg/ml，2.8mg/ml，2.9mg/ml，3.0mg/ml，3.1mg/ml，3.2mg/ml，3.3mg/ml，3.4mg/ml，3.5mg/ml，3.6mg/ml，3.7mg/ml，3.8mg/ml，3.9mg/ml，4.0mg/ml，4.1mg/ml，4.2mg/ml，4.3mg/ml，4.4mg/ml，4.5mg/ml，4.6mg/ml，4.7mg/ml，4.8mg/ml，4.9mg/ml，或5.0mg/ml。示例性治疗方案需要每两周全身施用一次，或每月一次或每3至6个月一次。示例性治疗方案需要每两周全身施用一次，或每月一次或每3至6个月一次。或根据需要(PRN)。
抗体通常多次施用。单剂量之间的间隔可以是每周，每月或每年。通过测量在患者中LOX-1结合抗体的血液水平所指示的，间隔也可以是不规则的。另外，可以由医生确定替代的剂量间隔，每个月施用或根据需要是有效的来确定。在全身施用的某些方法中，调整剂量以达到血浆抗体浓度1-1000μg/ml，在某些方法中25-500μg/ml。可替代地，在需要较小的施用频率的情况下，抗体可以作为持续释放配方施用。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而改变。在一般情况下，人源化抗体显示比嵌合抗体和非人抗体更长的半衰期。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性而改变。在预防性应用中，相对低的剂量以相对不频繁的间隔施用很长一段时间。一些患者在其余生持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对短的间隔施用相对高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可对患者施用预防性方案。
实施例
提供了以下实施例以进一步说明本发明但不限制其范围。本发明的其他变型对于本领域普通技术人员将是显而易见的，并涵盖于所附的权利要求。
实施例1：制备纯化的重组人可溶性LOX-1用作抗原
编码人LOX-1多肽的细胞外结构域(氨基酸残基61-273)与来自人CD33的N末端信号肽、纯化标签(EFHR)和BirA生物素化序列(GLNDIFEAQKIEWHE)(SEQ ID NO：144)的核酸序列亚克隆到哺乳动物细胞表达载体pRS5a。所得质粒，pRS5a_APP-Avi人sLOX-1(61-273)使用标准聚乙烯亚胺(PEI)转染方法瞬时转染至HEK293T细胞。细胞以悬浮培养方式在诺华培养基M11V3(Bioconcept)中繁殖，使用Wave生物反应器以1.4×106个细胞/ml的终细胞浓度在5升培养基中进行转染反应。
转染5小时后，加入5升ExCell VPRO无血清培养基(Sigma)。细胞生长在37℃和5％CO2下10天。然后将细胞通过离心收获，然后用0.22微米的无菌过滤器过滤。将澄清的上清液通过用PBS平衡的20mL抗APP亲和树脂(诺华专有)。柱用PBS洗涤直到达到在280nm处的基线吸光度。然后将柱用10倍柱体积的PBS洗涤，所述PBS含有1％Triton X-100和0.3％的三-正-磷酸丁酯，然后是25倍柱体积的PBS。然后用50mM柠檬酸钠，pH 3.0洗脱sLOX-1蛋白，级分用1/10体积的1M Tris，pH 9.0中和。合并相关级分，并彻底对PBS透析，然后等分并快速冷冻在液氮中。分析性尺寸分析表明纯化的可溶性LOX-1蛋白物质是>95％的二聚体形式，这是该蛋白质的预期形式。
实施例2：人LOX-1转染的HEK293细胞的制备
为了测试抗LOX1特异性抗体的结合特异性和功能活性，生成稳定过表达人LOX-1的HEK293细胞。使用标准的脂质体2000转染方法，用编码全长人LOX-1 cDNA和潮霉素抗性的哺乳动物表达质粒转染HEK293-6E细胞。使用流式细胞仪在转染后第3天评估转染培养物的LOX-1的表面表达，然后进行潮霉素选择(200μg/ml)以富集稳定表达的细胞。通过两轮连续的有限稀释获得克隆群，通过流式细胞仪确认表达。仅选择在培养中维持稳定的LOX-1表达超过四周的克隆并用于随后的抗体表征分析。
实施例3：单克隆抗体的制备
重组人LOX-1蛋白如实施例1所述由内部制备，并作为免疫原用于抗LOX-1的杂交瘤克隆的产生。PBS中的LOX-1抗原与等体积弗氏佐剂混合，以增强Balb/c小鼠的免疫应答。完全弗氏佐剂(Sigma F5881)用于第一次注射，不完全弗氏佐剂(Sigma F5506)用于后续免疫。
动物免疫和样品采集按照IACUC批准的标准动物使用协议进行。简单地说，用人LOX-1蛋白和佐剂的抗原乳液免疫5-6周龄的雌性Balb/c VAF小鼠(Charles RiverLaboratories)。用每只动物100μl抗原-佐剂混合物中约20μg蛋白质皮下免疫小鼠4次。每2-3周进行注射，以在动物中发生免疫应答。为了产生杂交瘤的细胞融合前三天，用相同剂量的LOX-1抗原与不完全弗氏佐剂混合，腹膜内加强免疫小鼠一次，并在细胞融合的当天，在灭菌手术条件下杀死小鼠进行脾脏收集。
在两个无菌和磨砂显微镜载玻片之间研磨来自免疫小鼠的脾脏，以制备在RPMI-1640培养基中的单细胞悬浮液。沉淀脾细胞，并用RPMI-1640培养基洗涤两次。为了使细胞融合以产生杂交瘤克隆，根据标准融合方案使用聚乙二醇1500作为融合剂使脾细胞与鼠骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(Kearney J.F.等人,1979.J.Immunol.,123:1548-1550)混合并融合(Zhang C.2012.Methods Mol.Biol.901:117-135)。细胞融合和离心之后，将细胞悬浮在含有次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)补充物(Sigma H-0262)的完全RPMI-1640培养基(200mL/脾)中，并以每孔200μL细胞悬液接种于96孔平底板(Corning-Costar 3596)中。
在37℃、5％CO2中孵育3-4天后，从板的各孔除去100μL培养上清，并用等体积的含有次黄嘌呤-胸苷(HT)补充物的完全RPMI-1640培养基(Sigma H-0137)取代。所述板在37℃下在5％CO2气氛被继续孵育，直到杂交瘤克隆生长成足够大菌落，能够筛选抗体。
实施例4：杂交瘤筛选、亚克隆和选择
在融合后第2周，当杂交瘤细胞在板孔中已成长为半汇合，并且上清液已经变成橙色的颜色时，从板取样杂交瘤上清液用于通过免疫分析的抗体筛选，如对基于细胞的LOX-1抗原的免疫荧光流式细胞术或对LOX-1蛋白抗原的ELISA。对于初次筛选，通过流式细胞仪使用LOX-1转染的293-6E细胞与未转染的细胞测试杂交瘤上清液。简言之，人LOX-1转染的细胞293-6E或未转染的细胞，分别与50μL杂交瘤上清液孵育，接着用荧光素AffiniPureFab片段山羊抗小鼠IgG(H+L)缀合物标记(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，并通过使用Becton Dickinson FACSCalibur在自动模式进行流式细胞仪分析。
通过流式细胞仪分析，从融合板上鉴定和选择与LOX-1转染的293-6E细胞反应、但不与未转染细胞反应的杂交瘤克隆。所需的杂交瘤克隆在T12板上扩大被用于进一步的表征。通过有限稀释亚克隆感兴趣的杂交瘤克隆和并显微镜下挑选单个菌落，以获得产生LOX-1特异性单克隆抗体的单克隆群。在T12板上扩大所选杂交瘤的亚克隆，冷冻用于冷冻保存或用于单克隆抗体的生产。使用市售的同种型分型试剂确定从杂交瘤克隆衍生的特异性单克隆抗体的同种型。
在筛选结果的基础上，从人LOX-1抗原免疫的小鼠中鉴定和选择了一组24个人LOX-1特异性杂交瘤克隆。这些杂交瘤克隆之一，克隆39.1E2E10(缩写为E2E10，并在本文中称为E2E10或鼠亲本)，产生具有κ轻链的IgG1单克隆抗体，其被选择作为首要候选物之一用于抗体测序和基于其LOX-1结合特性的人源化。
实施例5：筛选用于抑制OxLDL结合LOX-1的单克隆抗体
使用标准方法从杂交瘤上清液纯化LOX-1抗体(例如，蛋白A亲和色谱法)。
如实施例1所述制备纯化的APP-Avi可溶性人可溶性LOX-1(61-273)蛋白如下所示进行生物素化：在10mM ATP、10mM醋酸镁、0.1mM生物素、以及BirA生物素连接酶(Avidity)存在下，在30℃下孵育50mM Bicine pH 8.3缓冲液中终浓度约1mg/mL的纯化的可溶性LOX-1蛋白(8-10mg)1小时，然后置于4℃过夜。然后使用PBS平衡的S200 Superdex 16/60柱纯化蛋白质。合并相关级分，将蛋白质浓缩至约1mg/mL的浓度，等分，在液氮中快速冷冻。通过非生物素化和生物素化样品的质谱肽作图评估生物素化百分比。典型地，生物素化产率为>95％，并且没有检测到非生物素化物质。分析性尺寸分析表明生物素化物质是100％的二聚体形式，这是该蛋白质的预期形式。
然后将生物素化可溶性LOX-1蛋白在PBS中稀释至2.5μg/mL浓度，将0.1ml该溶液加入到NeutrAvidin96孔板(Pierce目录号15128)的孔中，并将板在4℃孵育过夜。将板用PBS洗涤三次，然后通过每孔加入0.3mL的25％阻断Ace(AbD Serotec目录号BUF029)阻断，并在室温下轻轻摇动孵育所述板2小时。然后将板用PBS洗涤一次。制备稀释在1％BSA/PBS中的LOX-1抗体的系列稀释液，向板添加0.1mL稀释的抗体。将板在室温下孵育1小时，然后用PBS洗涤三次。接着，将0.1mL oxLDL(高结合性OxLDL，Kalen Biomedical目录号770212-7)在1％BSA/PBS中稀释至最终浓度2ug/mL。
为了形成oxLDL标准曲线，使用最高浓度20ug/mL oxLDL，在没有LOX-1抗体时测试不同浓度的oxLDL。然后将板在室温下孵育2小时，然后将板用PBS洗涤三次。然后加入0.1mL/孔HRP-缀合的抗ApoB100抗体(The Binding Site,Inc.，目录号PP086)，所述抗体以1:1000稀释在1％BSA/PBS中，并在室温下孵育2小时。将板用PBS洗涤6次。然后加入0.1mL/孔TMB底物，将板在室温下孵育10分钟。将停止溶液(2N硫酸，50μL/孔)加入到每个孔中，使用适当的读板器在450nm处测量吸光度。
实施例6：单克隆抗体的人源化
小鼠单克隆抗体E2E10被人源工程化(HumaneeredTM)，使其蛋白质序列更接近人种系序列，并降低了其免疫原性。人源工程化(HumaneeredTM)技术可通过KaloBios of SouthSan Francisco获得。抗体的人源工程化(HumaneeredTM)产生工程化的人抗体，其具有与人种系序列高度同源性的V区序列，同时仍保留亲本或参照抗体的特异性和亲和力(美国专利公开2005/0255552和2006/0134098)。该方法首先鉴定了参照Fab的重链和轻链可变区中的最小抗原结合特异性决定簇(BSD)(通常是重链CDR3和轻链CDR3中的序列)。由于这些重链和轻链BSD在人源工程化(HumaneeredTM)方法中保持在所有构建的文库中，每个文库是表位为重点的，最后，完全人源工程化(HumaneeredTM)抗体保留原始鼠抗体的表位特异性。
接着，产生盒文库(其中小鼠Fab的重链或轻链可变区的一部分由人序列文库替换)。使用细菌分泌系统表达作为抗体Fab片段的文库成员，使用菌落转移结合试验(CLBA)筛选文库中结合抗原的Fab。进一步表征阳性克隆以鉴定具有最高亲和力的那些克隆。然后将鉴定的在残余小鼠序列环境中支持结合的人盒组合在最终的文库筛选中以生成完全的人V区。
产生的人源工程化(HumaneeredTM)Fab具有来自人文库的V区段序列，保留了CDR3区域内鉴定的短BSD序列，并具有人种系框架4区。通过将重链和轻链可变区克隆至IgG表达载体将这些Fab转换为完整IgG。在此方法中产生的完全人源工程化(HumaneeredTM)抗体保留了亲本鼠抗体的结合特异性，通常具有与亲本抗体同等或更高的对抗原的亲和力，和具有与人种系抗体基因相比在蛋白质水平上具有高度序列同一性的V区。
人源工程化(HumaneeredTM)LOX-1抗体FF1，FF3，FF4，FF5，和FF6的重链和轻链的组成，和其与最接近的人种系序列的相似性百分比示于表2。
表2：LOX-1抗体的重链和轻链的组成和与最接近的人种系序列的相似性百分比 (HC＝重链，LC＝轻链)
Figure BDA0000922241250000871
实施例7：LOX-1抗体抑制OxLDL结合LOX-1蛋白
使用实施例4中所述的方法测定LOX-1抗体抑制oxLDL结合LOX-1蛋白的能力。除由硫酸铜介导的LDL氧化产生的“高结合性OxLDL”来自Kalen Biomedical(目录号770212-7)外，在该试验中测试了两个其他形式的修饰的LDL：丙二醛修饰的LDL(Academy Bio-Medical Co.目录号20P-MD-L105)和次氯酸盐修饰的LDL。根据以下步骤制备次氯酸盐修饰的LDL。人LDL(Kalen Biomedical目录号770200-4)用PBS稀释至最终浓度0.25mg/ml。随后加入次氯酸钠(NaOCl,JT Baker目录号9416-01)至最终浓度0.1mM。该溶液在室温下孵育4小时，然后通过加入L-甲硫氨酸至每200μl总体积加入5μL 100mM甲硫氨酸的反应终浓度终止反应。图1A-1C示出LOX-1抗体抑制修饰的LDL结合LOX-1的代表性数据，以及描述于表3。
表3：LOX-1抗体抑制OxLDL结合LOX-1蛋白(具有IC50值的表)。
Figure BDA0000922241250000881
实施例8：LOX-1抗体抑制OxLDL结合LOX-1/HEK293细胞
huLOX-1/HEK293细胞在T瓶中作为贴壁单层维持在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM中，所述T瓶含有每75cm2表面积20ml培养基。细胞在5％CO2和37℃下、在潮湿的培养箱中孵育，每2-3天进行亚培养。为了传代细胞，将培养基除去，用10-20ml预热的PBS洗涤单层一次。洗涤后，加入1ml预热的TrypLE Express，将细胞在37℃下孵育5分钟。然后加入预热的新鲜培养基。
huLOX-1/HEK293细胞以1×106个细胞/mL再悬浮，每孔50μL接种到96孔V形底板(每孔5×104细胞)。然后向细胞添加测试培养基(DMEM+10％FBS)中的LOX-1或无关对照抗体。通常，最终抗体浓度范围为0.006μg/ml至20μg/ml。将细胞在37℃下孵育1小时，然后用温的HBSS洗涤两次。然后加入50μl分析培养基中的Dil-oxLDL(人dil-标记的“高氧化”LDL，Kalen Biomedical，目录号770262-9；Dil是1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchlorate))至最终浓度30至100μg/ml。然后将细胞在37℃下孵育2小时，然后用FACS缓冲液(PBS中含2％FBS)洗涤两次。然后通过流式细胞仪分析细胞的Di-l荧光强度，如图2和表3中所描述。
实施例9：OxLDL诱导的活性氧(ROS)生成试验
LOX-1抗体或无关对照抗体以2x最终浓度单独或在(Fab)2交联剂(多克隆山羊抗人IgG Fc(Fab)2，Abcam目录号ab98526))存在下孵育在0.05mL试验培养基(DMEM+10％FBS)，在室温下孵育15分钟。(Fab)2交联剂与LOX-1抗体的比例是变化的，包括1：1和1：2的比率。在剂量反应实验中，单独使用LOX-1或对照抗体(无交联剂)，使用的抗体浓度范围为0.005μg/mL至20μg/mL。在实验中比较单独抗体和抗体与交联剂，使用的抗体浓度范围为0.03μg/mL至20μg/mL。
使用TrypLE Express(Invitrogen目录号12605-010)分离表达人LOX-1(huLOX1/HEK293)的细胞，并用PBS洗涤一次。然后将细胞以2×106个细胞/mL再悬浮于试验培养基(DMEM+10％FBS)，并以50μl/孔(1×105个细胞/孔)接种到96孔V形底板(Costar目录号3894)中。加入50μl/孔具有或不具有交联的Fab的LOX-1(或对照)抗体溶液(如上所述制备)，并将混合物在37℃孵育15分钟。加入OxLDL(试验缓冲液中0.1mL/孔，“高oxLDL”来自Kalen，目录号770252-7)至最终浓度25μg/ml，所得混合物在37℃下孵育100分钟。H2DCFDA稀释于试验培养基中，并以0.1mL/孔加入，至最终浓度5-10μM，在37℃下孵育混合物15分钟。然后将细胞用200μl/孔含有钙和镁的HBSS洗涤一次，用200μl/孔冷的FACS缓冲液(PBS中2％FBS)洗涤一次，并将细胞再悬浮于50-100μl/孔冷的FACS缓冲液中。使用流式细胞仪测量作为H2DCFDA氧化的结果而产生的荧光(激发：488nm，发射：500/530nm)。实验结果示于图3和4，和表4。
表4：
LOX-1抗体在人LOX-1转染的HEK293细胞中抑制oxLDL诱导的活性氧(ROS)产生(具 有IC50值的表)，没有LOX-1激动剂活性的证据(单独抗体或抗体+交联的Fab2)
Figure BDA0000922241250000901
Figure BDA0000922241250000911
如图4A-4F所见，LOX-1抗体在人LOX-1转染的HEK293细胞中抑制oxLDL诱导的活性氧(ROS)产生。在缺乏oxLDL时，LOX-1抗体(单独抗体或存在交联的Fab2)不诱导ROS产生。同种型对照抗体在人LOX-1转染的HEK293细胞中对oxLDL诱导的ROS产生没有影响。
实施例10：LOX-1抗体结合天然LOX-1原代人嗜中性粒细胞
使用来自Thermo Scientific(EZ-Link Micro NHS-PEO4-生物素化试剂盒；Thermo Scientific目录号21955)的试剂盒生物素化LOX-1抗体。PBS缓冲液中浓度0.5-1.0mg/mL的抗体与过量的50倍摩尔浓度的NHS-生物素试剂在室温下孵育60分钟。然后使用在PBS中平衡的脱盐离心柱，根据制造商的说明(Zeba Desalt Spin Column 7K MWCO,Thermo Scientific目录号89882)，将生物素化的抗体从过量的生物素化试剂中分离。基于在280nm测量的吸光度测定生物素化抗体的浓度。
使用标准方法从健康供体获得的血液样品中分离嗜中性粒细胞。简言之，将人全血收集在含有EDTA的小瓶。向10mL血样中加入10mL沉降缓冲液(3％葡聚糖，0.9％氯化钠)，并且将所得溶液轻轻混合，并使其在室温下放置20分钟。包含富集白细胞的血浆的顶层在4℃以1200rpm(250-500XG)离心10分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀在室温下立即再悬浮于10mL 0.9％氯化钠。将得到的细胞悬浮液小心地转移到含有10mL Ficoll-Paque的50mL锥形管中，细胞悬浮液分层于Ficoll-Paque的顶部，然后将该管在室温下以1400rpm(400×g)离心30分钟。丢弃顶层。向得到的细胞沉淀加入10mL 0.2％冰冷的氯化钠，并将混合物孵育恰好30秒，以溶解红细胞；加入10mL冰冷的1.6％氯化钠来恢复等渗。然后将细胞悬浮液以1200rpm(250-500rpm)离心5分钟。然后弃去上清液，再重复一次红细胞裂解步骤。将得到的细胞沉淀物以2×106个细胞/mL的细胞密度再悬浮于FACS缓冲液(2mM EDTA，1％BSA和PBS中0.2％的叠氮化钠)。
将含有新鲜分离的人嗜中性粒细胞的细胞悬浮液转移(50μl/孔)到96孔V型底板(1×105个细胞/孔)(Costar，目录号3894)的孔中。加入封闭缓冲液(4％正常兔血清稀释于FACS缓冲液(2mM EDTA，1％BSA和PBS中0.2％叠氮化钠)(50ul/孔)，并将板在冰上孵育30分钟。然后将FACS缓冲液中的生物素化LOX-1抗体(10ul)加入到孔中，最终浓度范围为1ng/ml至5μg/ml，将板在冰上孵育30分钟。然后将板以1200rpm(250-300x g)离心3分钟，弃去上清液。然后将细胞用0.2mL FACS缓冲液洗涤两次，然后加入以1：250稀释在FACS缓冲液中的0.1mL PE-链霉亲和素(BD Pharmingen，目录号554061)，将板在冰上孵育30分钟。然后将板再次离心，弃去上清液，细胞用0.2mL FACS缓冲液洗涤两次。然后将细胞再悬浮于0.1mL定影缓冲液(FACS缓冲液，具有2％多聚甲醛)并使用FACS仪器分析。为了确定LOX-1抗体结合嗜中性粒细胞的EC50值，通过FACS确定的LOX-1染色强度对抗体浓度作图，如图5和表3所示。
实施例11：通过氢/氘交换质谱对表位绘图
使用氢氘交换(HDx)与质谱(MS)(Woods，2001)组合绘制抗体E2E10在LOX-1上的结合位点。在HDx中，蛋白质的可交换酰胺氢被氘替代。这个方法对蛋白质结构/动力学敏感且是溶剂易接受的，因此，能够报告配体结合。HDxMS的非侵入性质、高灵敏度、与大蛋白质工作的能力和对能绘制的结合位点的高分辨率，使该方法不同于其他方法。这些实验的目的是鉴定LOX1上E2E10的表位。
使用类似于在文献(Chalmers，2006)中描述的方法进行自动化HDx/MS实验。使用ALEAP Technologies Pal HTS液体处理器(LEAP Technologies,Carrboro,NC)用于所有的液体处理操作。液体处理器由写入LEAP Shell的自动化脚本控制，并收纳在保持在2℃的冷藏柜。6口进样阀和清洗站被安装在液体处理器轨道，有助于样品注射到色谱系统以及有助于注射器洗涤。为了在线消化，酶柱(Poroszyme固定胃蛋白酶，20×2.1×30mm，ABI，FosterCity,CA)有序放置在进样阀和捕集盒之间。色谱系统由两个附加阀(15kPSI Valco,Houston,TX)，4μLEXP Halo C18反相捕集盒((Optimize Technologies Inc.,OregonCity,OR)和分析柱(300μm ID,Halo 2.7μm C18,Michrom Bioresources Inc)组成，被安装在独立的冷藏柜中，所述冷藏柜安置在LTQ-Orbitrap质谱仪(Thermo Scientific,SanJose,CA)源的前面。容纳色谱系统的柜温度由珀尔帖(peltier)冷却器保持在0℃。
对于非氘化和氘化的对照，用15μL 50mM三乙醇胺缓冲液(pH 7.8)稀释10μL人可溶性LOX-1溶液(0.73mg/mL)。通过混合10μL LOX-1溶液(0.73mg/mL)与等摩尔量的E2E10和适量的50mM三乙醇胺缓冲液(pH 7.8)制备复合物，使总体积为25μL。形成复合物后，将溶液孵育30分钟。为了引发交换反应，加入75μL D2O缓冲液(D2O在150mM氯化钠中，CambridgeIsotopes Laboratories)，交换持续10分钟。然后通过加入0.25mL还原缓冲液(8M尿素，2M硫脲，0.25M TCEP，pH 2.5)降低混合物的pH值，以还原二硫键并减缓交换速率，有效地冷冻样品的交换状态。还原10分钟后，用0.5mL淬灭缓冲液(50mM甘氨酸，pH 2.5)稀释混合物。接着，将0.5mL样品通过线内消化柱注射到捕集处，如下所述通过LC-MS进行分析。
色谱系统使用两个单独的HPLC泵进行线内消化，将消化肽捕集到C18捕获柱上，通过分析柱洗脱捕集的肽进入质谱仪。在125μL/分钟(0.05％TFA)流速下操作“加载”泵(Surveyor MS pump,Thermo Scientific,San Jose,CA)，将样品从PAL进样阀样品环(500μL)通过胃蛋白酶柱转移进入反相捕集盒。加载步骤6分钟后，“加载”阀切换至允许缓冲液(0.25％甲酸)从“梯度”泵(Nano Acquity,Waters Corp.,Milford,MA)以20μL/分钟的流速流过捕集处，持续3分钟，脱盐期间。脱盐步骤后，将“脱盐”阀切换，以便于肽从捕集处洗脱到分析柱，并进入质谱仪的离子源。梯度泵在20分钟内输送0至40％B的梯度，随后在5分钟内输送40％至75％B。梯度的总时间为30分钟。梯度泵缓冲液组合物为A：99.75：0.25％v/v(H2O：甲酸)和B：99.75：0.25v/v％(乙腈：甲酸)。
通过串联质谱(MS/MS)测序蛋白质水解肽。同样的方法被用于采集非氘化的LOX-1、氘化的LOX-1、以及所有氘化的复合物样品，尽管只有来自非氘化的LOX1运行的MS2数据被用于肽的鉴定。对于这些采集，MS/MS在LTQ上获得，MS扫描在Orbitrap中获得。在Orbitrap中的采集在400-2000的m/z范围中以60000分辨率获得。用于所有实验的仪器参数包括喷雾电压3.5kV，最大进样时间1000ms，MS的LTQ AGC靶标50,000个离子，以及MS的FTMSAGC靶标1,000,000个离子。为了启动数据处理，使用内部程序(RawXtract)将Orbitrap.RAW文件转换成.mzXML文件(Pedrioli 2004)。随后，.mzXML文件转换成.mzBIN文件，使用SEQUEST(ThermoElectron)搜索串联MS采集。使用DTASelect(Tabb 2002)过滤SEQUEST结果。使用肽序列标识，一个内部写程序(Deutoronomy)用于自动提取每个识别序列离子的色谱图，并在指定的m/z范围和保留时间窗口生成平均光谱。然后使平均光谱平滑和质心化(centroided)以确定平均氘并入。初始自动化处理后，手动验证或使用内置到Deutoronomy的交互式数据查看器校正各平均频谱的质量和质心。
HDxMS绘制实验确定了三个显著受保护的LOX1区。肽F228RVRGAVSQTYPSGTCAYI246(SEQ ID NO.：3)观察到主要的保护。也观察到肽N100ELKEMIETL109和S207RRNPSYPWLWE218(分别为SEQ ID NO：4和5)的次要保护。将受保护的区域绘制到从蛋白质数据库(1YPQ)获得的人可溶性LOX-1C-末端凝集素样结构域(CTLD)的晶体结构上。一个受保护的区域，N100ELKEMIETL109(SEQ ID NO：4)，不存在于LOX-1CTLD的晶体结构中。肽F228RVRGAVSQTYPSGTCAYI246(SEQ ID NO.：3)绘制到涉及配体结合的LOX-1分子表面，该分子发表于定点诱变研究(Ohki等人(2005)Structure,13:905-917)。因此结果表明，E2E10可能充当LOX-1配体结合LOX-1的竞争性抑制剂。因为用于将E2E10转换为人源化变体FF1，FF3，FF4，FF5和FF6的人源工程化方法非常不可能改变抗体的表位特异性(参见实施例6)，所以这些结果还鉴定了LOX-1上FF1，FF3，FF4，FF5和FF6的主要结合位点。
由于E2E10结合LOX-1导致的并入LOX-1衍生肽的氘的改变示于表5。
表5
Figure BDA0000922241250000961
Figure BDA0000922241250000971
实施例12：制备用于LOX-1抗体结合试验中的纯化的重组食蟹猴可溶性LOX-1
为了确定食蟹猴LOX-1的核苷酸和氨基酸序列，从3只猴个体获得的器官中提取总RNA：3个器官来自Zyagen/GW的一个个体，12个器官来自Covance,Inc的2个个体。然后使用根据公共数据库(Uniprot,NCBI)设计的非翻译区引物PCR扩增总RNA。使用标准测序方法确定扩增的LOX-1mRNA的核酸序列。在食蟹猴LOX-1的细胞外结构域上(对应于氨基酸61-273)，来自3只猴个体的食蟹猴LOX-1氨基酸序列是相同的。
编码食蟹猴LOX-1多肽的胞外结构域(氨基酸残基61-273)与来自人CD33的N末端信号肽、纯化标签(EFHR)和BirA生物素化序列(GLNDIFEAQKIEWHE)(SEQ ID NO 144)的核酸序列被亚克隆到哺乳动物细胞表达载体pRS5a中。使用与实施例1描述的用于人可溶性LOX-1的方法相同的方法表达和纯化食蟹猴可溶性LOX-1。成熟APP-Avi可溶性食蟹猴LOX-1(61-273)的氨基酸序列示于表6。对于某些实验，使用与实施例5描述的用于人可溶性LOX-1的方法相同的方法生物素化食蟹猴可溶性LOX-1蛋白。
表6
Figure BDA0000922241250000981
实施例12
通过Biacore结合分析测定抗体解离常数
对于结合人和食蟹猴LOX-1的鼠LOX-1抗体E2E10，用新鲜、过滤的运行缓冲液(1×HBS-EP+(GE目录号BR-1006-60))预处理Biacore T200。使用小鼠抗体捕获试剂盒(GE目录号BR-1008-38)和胺偶联试剂盒(GE目录号BR-1000-50)准备CM5芯片(GE目录号BR-1005-30)。简言之，用EDC/NHS以10ul/分钟活化新的芯片，持续420秒。10mM醋酸盐pH 5.0中的30ug/ml抗小鼠IgG抗体以10ul/min固定，持续420秒。芯片表面用1M乙醇胺溶液(10ul/分钟，持续420秒)失活，然后用10mM甘氨酸-HCl，pH 1.5(GE目录号BR-1003-54)以60ul/分钟，持续30秒，使适应条件三次。
程序化运行方法来测量结合抗LOX-1抗体的人或食蟹猴可溶性LOX-1的动力学。如下运行5个启动循环：1)运行缓冲液，60ul/分钟持续30秒，2)运行缓冲液持续350秒，其中以60ul/分钟持续350秒的解离，用再生缓冲液(甘氨酸-HCl pH 1.5，0.05％P20(GE目录号BR-1000-54))额外洗涤，3)再生缓冲液，60ul/分钟持续60秒，4)再生缓冲液，60ul/分钟持续35秒，用运行缓冲液额外洗涤，并且包括一个延续(carry-over)的对照。
对于样本循环，1)Ms-抗Hu LOX-1mAb捕获在流动室2，3或4，持续预定时间，允许以10ul/分钟捕获大约20RU。流动室1用作参考，2)运行缓冲液以60ul/分钟持续30秒，3)人可溶性LOX-1或食蟹猴可溶性LOX-1以各种浓度稀释在运行缓冲液(其中至少两个一式两份样品，和多个用于60ul/分钟持续350秒的缓冲液空白，具有750秒或3000秒的解离时间)，4)再生缓冲液，60ul/分钟持续60秒，5)运行缓冲液，60ul/分钟持续35秒，用运行缓冲液额外洗涤，并且包括一个延续的对照。使用缓冲液空白、参考空白和1：1用于曲线拟合的结合模型分析数据，以确定结合和解离速率常数(Ka和Kd)和平衡结合常数(KD)(E2E10结果见表7-8)。
使用光学生物传感器BIAcore T200在CM5芯片上完成表面等离子体共振测量，以定量人源化的LOX-1抗体与人或食蟹猴LOX-1的相互作用。山羊-抗-hIgG(gamma)(Invitrogen H10500)以在醋酸盐缓冲液(pH 4.0)中3000 RU包被CM5芯片。所使用的运行缓冲液是PBS，pH 7.4(过滤、脱气的)。测试抗体以10μL/分钟的流速、以1μg/mL的浓度加载到个体流动室。IgG捕获的目标数量是20-30 RU，在HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05％P20)中。人或食蟹猴可溶性LOX-1稀释在HBS-EP缓冲液中，浓度33nM，然后系列稀释(1:3)低至浓度0.137nM。这代表六种不同浓度的人或食蟹猴LOX-1。将抗原以30μL/分钟的流速引入个体流动室。结合时间参数设定为700秒，解离时间设定为5,400秒。使用缓冲液空白、参考空白和1：1用于曲线拟合的结合模型分析数据，以确定结合和解离速率常数(Ka和Kd)和平衡结合常数(KD)(FF1，FF3，FF4，FF5和FF6的结果见表7-8)。
表7
通过Biacore动力学结合试验测定的结合人可溶性LOX-1的LOX-1抗体的解离常数 (KD)
Figure BDA0000922241250001001
表8
通过Biacore动力学结合试验测定的结合食蟹猴可溶性LOX-1的LOX-1抗体的解离 常数(KD)
Figure BDA0000922241250001002
实施例13：通过溶液平衡滴定(SET)试验测定抗体解离常数
使用下面的SET方案测定生物素化的结合人可溶LOX-1的E2E10的KD值。将96孔MSD板(标准结合板，MSD目录号L15XA-3)用PBS中的50μL的0.25μg/mL人可溶性LOX-1在4℃过夜孵育进行包被。通过在聚丙烯V形底96孔板中将SET稀释液(PBS，0.5％BSA，0.1％Tween-20，0.1％Triton X-100)中的人可溶性LOX-1滴定来制备溶液相样品。该稀释系列与SET稀释液中的生物素化E2E10以1：1(共100μL)组合，并且将样品在室温下摇动过夜孵育。
使用洗板机，用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween-20)洗涤包被的MSD板三次，然后倒扣板并沾在Kimwipe以除去残留的液体。然后用200μL/孔SET封闭缓冲液(PBS，2％BSA，0.1％Tween-20，0.1％Triton X-100)封闭板，并轻轻摇动孵育1小时。将板洗涤一次。向该板加入25μL/孔溶液相平衡结合样品，一式两份，并摇动孵育30分钟。将板洗涤三次。向该板加入在SET稀释液中以1：500稀释的25μL/孔链霉亲和素SULFO-TAG(MSD目录号R32AD-1)，并轻轻摇动孵育1小时。将板洗涤三次。向该板加入100μL读取缓冲液T(MSD目录号R92TC-1)，在MSD SECTOR Imager 6000上读板。通过将数据拟合至下面的等式确定KD值：
Y＝(Bmax/(CAb/2))＊((CAb/2)-((((((CAg+CAb)+KD)/2)-((((((CAg+CAb)+KD)＾2)/4)-(CAg＊CAb))＾0.5))＾2)/(2＊CAb)))，
其中的Bmax是当没有LOX-1蛋白存在于溶液中时的信号，CAb是溶液中LOX-1抗体的恒定浓度，CAg是溶液中可溶性LOX-1的浓度，以及KD是平衡结合常数。
对于人源化LOX-1抗体FF1，FF3，FF4，FF5和FF6，使用以下溶液平衡滴定(SET)试验方案测定KD值。试验在96-孔聚丙烯板中进行(Thermo Scientific，目录号AB-1127)，如下所示。恒定浓度的LOX-1抗体(1pM)与不同浓度的非生物素化人或食蟹猴LOX-1蛋白混合(3倍系列稀释，范围为1nM至0.017pM)，稀释在SET缓冲液(PBS,pH7.4无CaCl2或MgCl2,Gibco，目录号P7949；0.5％w/v牛血清白蛋白,不含脂肪酸,Calbiochem,目录号26575；和0.02％v/v Tween-20,Sigma,目录号P7949)中。最终反应体积为80μL。使用粘合剂膜(VWR，目录号60941-062)将板密封，并孵育在22℃下14小时，恒定摇动(300rpm)。
在同一期间，通过每孔与50μL封闭缓冲液(PBS，pH 7.4，5％w/v牛血清白蛋白)在4℃过夜孵育，封闭384-孔链霉亲和素包被的MSD板(Meso Scale Discovery，目录号L21SA)。然后使用洗板机(BioTek)，用洗涤缓冲液(PBS，pH 7.4和0.05％v/v Tween-20)洗涤封闭的MSD板3次。洗涤后，通过在22℃下恒定摇动(600rpm)孵育1小时，将生物素化的人或食蟹猴可溶性LOX-1蛋白(25pM，每孔15μL)固定在表面。然后如前面所描述的洗涤板3次。在一些实验中，使用非生物素化的可溶性人LOX-1蛋白(R&D systems，目录号1798-LX-050)；在这种情况下，在标准MSD板(MSD，目录号L21XA)中以1nM浓度通过过夜孵育将LOX-1蛋白固定。然后将平衡结合反应液(每孔15μL)施加至具有固定的LOX-1的MSD板，孵育30分钟。通过洗涤板去除未结合的物质，每孔加入15μL 1：500稀释的磺基标记的山羊抗-人IgG(Meso ScaleDiscovery，目录号R3AJ-1)检测捕获的抗体。然后将板恒定振荡(600rpm)孵育1小时。洗涤板3次，然后加入15μL/孔的1X MSD读取缓冲液T(Meso Scale Discovery，目录号R92TC-2)，并将板用Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery)成像。数据转移到Excel进行分析，并使用GraphPad Prism v5作图。通过将数据拟合至下面的等式确定KD值：
Y＝(Bmax/(CAb/2))＊((CAb/2)-((((((CAg+CAb)+KD)/2)-((((((CAg+CAb)+KD)＾2)/4)-(CAg＊CAb))＾0.5))＾2)/(2＊CAb)))，
其中的Bmax是当没有LOX-1蛋白存在于溶液中时的信号，CAb是溶液中LOX-1抗体的恒定浓度，CAg是溶液中可溶性LOX-1的浓度，以及KD是平衡结合常数。FF1，FF3，FF4，FF5，FF6和E2E10的结果示于表9和图6。
表9
通过溶液平衡滴定(SET)试验测定的LOX-1抗体的解离常数(KD)
Figure BDA0000922241250001021
Figure BDA0000922241250001031
通过参考引入
所有本文引用的参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，和其中引用的文献，至其不已经完成的程度，在此通过引用整体并入本文。
等同
认为前述说明书足以使本领域技术人员能够实践本发明。前面的说明书和实施例详细描述了本发明的某些优选实施方案，并描述了本发明人所考虑的最佳方式。然而，应该理解的是，无论上述内容可能多么详细地出现在文本中，本发明可以以许多方式实现，并且本发明应当根据所附权利要求书及其任何等同物来解释。
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Claims (27)

1.一种特异性结合人凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含包括互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区和包括互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中：
(i)HCDR1是SEQ ID NO:8、HCDR2是SEQ ID NO:9、HCDR3是SEQ ID NO:10；LCDR1是SEQID NO:18、LCDR2是SEQ ID NO:19和LCDR3是SEQ ID NO:20，其中所述CDR由Kabat定义；
(ii)HCDR1是SEQ ID NO:28、HCDR2是SEQ ID NO:29、HCDR3是SEQ ID NO:30；LCDR1是SEQ ID NO:38、LCDR2是SEQ ID NO:39和LCDR3是SEQ ID NO:40，其中所述CDR由Kabat定义；
(iii)HCDR1是SEQ ID NO:48、HCDR2是SEQ ID NO:49、HCDR3是SEQ ID NO:50；LCDR1是SEQ ID NO:58、LCDR2是SEQ ID NO:59和LCDR3是SEQ ID NO:60，其中所述CDR由Kabat定义；
(iv)HCDR1是SEQ ID NO:68、HCDR2是SEQ ID NO:69、HCDR3是SEQ ID NO:70；LCDR1是SEQ ID NO:78、LCDR2是SEQ ID NO:79和LCDR3是SEQ ID NO:80，其中所述CDR由Kabat定义；或
(v)HCDR1是SEQ ID NO:88、HCDR2是SEQ ID NO:89、HCDR3是SEQ ID NO:90；LCDR1是SEQID NO:98、LCDR2是SEQ ID NO:99和LCDR3是SEQ ID NO:100，其中所述CDR由Kabat定义。
2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含包括互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区和包括互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中：HCDR1是SEQ ID NO:8，HCDR2是SEQ ID NO:9，HCDR3是SEQ IDNO:10；LCDR1是SEQ ID NO:18，LCDR2是SEQ ID NO:19，并且LCDR3是SEQ ID NO:20，其中所述CDR由Kabat定义。
3.一种特异性结合人LOX-1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含包括互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区和包括互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中：
(i)HCDR1是SEQ ID NO:11、HCDR2是SEQ ID NO:12、HCDR3是SEQ ID NO:13；LCDR1是SEQID NO:21、LCDR2是SEQ ID NO:22和LCDR3是SEQ ID NO:23，其中所述CDR由Chothia定义；
(ii)HCDR1是SEQ ID NO:31、HCDR2是SEQ ID NO:32、HCDR3是SEQ ID NO:33；LCDR1是SEQ ID NO:41、LCDR2是SEQ ID NO:42和LCDR3是SEQ ID NO:43，其中所述CDR由Chothia定义；
(iii)HCDR1是SEQ ID NO:51、HCDR2是SEQ ID NO:52、HCDR3是SEQ ID NO:53；LCDR1是SEQ ID NO:61、LCDR2是SEQ ID NO:62和LCDR3是SEQ ID NO:63，其中所述CDR由Chothia定义；
(iv)HCDR1是SEQ ID NO:71、HCDR2是SEQ ID NO:72、HCDR3是SEQ ID NO:73；LCDR1是SEQ ID NO:81、LCDR2是SEQ ID NO:82和LCDR3是SEQ ID NO:83，其中所述CDR由Chothia定义；或
(v)HCDR1是SEQ ID NO:91、HCDR2是SEQ ID NO:92、HCDR3是SEQ ID NO:93；LCDR1是SEQID NO:101、LCDR2是SEQ ID NO:102和LCDR3是SEQ ID NO:103，其中所述CDR由Chothia定义。
4.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含包括互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区和包括互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中HCDR1是SEQ ID NO:11，HCDR2是SEQ ID NO:12，HCDR3是SEQ IDNO:13；LCDR1是SEQ ID NO:21，LCDR2是SEQ ID NO:22，并且LCDR3是SEQ ID NO:23，其中所述CDR由Chothia定义。
5.权利要求1-4中任一项的的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(i)SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区；
(ii)SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变区；
(iii)SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链可变区；
(iv)SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:84的氨基酸序列的轻链可变区；或
(v)SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:104的氨基酸序列的轻链可变区。
6.一种特异性结合人凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含包括互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区和包括互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区，其中HCDR1，HCDR2和HCDR3由SEQ ID NO:14的重链可变区序列的CDR组成；并且其中LCDR1，LCDR2和LCDR3由SEQID NO:24的轻链可变区序列的CDR组成。
7.权利要求1-4或6中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或者其抗原结合片段包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区。
8.权利要求1-4或6中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或者其抗原结合片段包含一个重链和一个轻链：
(i)SEQ ID NO:16的氨基酸序列重链并且SEQ ID NO:26的氨基酸序列轻链；
(ii)SEQ ID NO:36的氨基酸序列重链并且SEQ ID NO:46的氨基酸序列轻链；
(iii)SEQ ID NO:56的氨基酸序列重链并且SEQ ID NO:66的氨基酸序列轻链；
(iv)SEQ ID NO:76的氨基酸序列重链并且SEQ ID NO:86的氨基酸序列轻链；或
(v)SEQ ID NO:96的氨基酸序列重链并且SEQ ID NO:106的氨基酸序列轻链。
9.权利要求1-4或6中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或者其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链。
10.权利要求1-4或6中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段、Fv片段、F(ab′)2片段、或scFv片段。
11.权利要求1-4或6中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型。
12.分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段。
13.权利要求12的分离的核酸分子，其中所述抗体或者抗原结合片段包含：
(i)由SEQ ID NO:15的核酸序列编码的重链可变区和由SEQ ID NO:25的核酸序列编码的轻链可变区；
(ii)由SEQ ID NO:35的核酸序列编码的重链可变区和由SEQ ID NO:45的核酸序列编码的轻链可变区；
(iii)由SEQ ID NO:55的核酸序列编码的重链可变区和由SEQ ID NO:65的核酸序列编码的轻链可变区；
(iv)由SEQ ID NO:75的核酸序列编码的重链可变区和由SEQ ID NO:85的核酸序列编码的轻链可变区；或
(v)由SEQ ID NO:95的核酸序列编码的重链可变区和由SEQ ID NO:105的核酸序列编码的轻链可变区。
14.权利要求12-13中任一项的分离的核酸分子，其中所述抗体或者抗原结合片段包含由SEQ ID NO:15的核酸序列编码的重链可变区和由SEQ ID NO:25的核酸序列编码的轻链可变区。
15.权利要求12或13的分离的核酸分子，其中所述抗体或者抗原结合片段包含：
(i)由SEQ ID NO:17的核酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:27的核酸序列编码的轻链；
(ii)由SEQ ID NO:37的核酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:47的核酸序列编码的轻链；
(iii)由SEQ ID NO:57的核酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:67的核酸序列编码的轻链；
(iv)由SEQ ID NO:77的核酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:87的核酸序列编码的轻链；或
(v)由SEQ ID NO:97的核酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:107的核酸序列编码的轻链。
16.权利要求12的分离的核酸分子，其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ IDNO:17的核酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:27的核酸序列编码的轻链。
17.包含权利要求12-16中任一项的核酸分子的载体。
18.包含权利要求12-16中任一项的核酸分子或权利要求17的载体的宿主细胞。
19.制备特异性结合人LOX-1的抗体或其抗原结合片段的方法，包括在适合表达抗体或者其抗原结合片段的条件下培养权利要求18的宿主细胞。
20.一种药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项所述的抗体或其片段，和可药用的载体。
21.权利要求20的药物组合物在制备用于治疗受试者的心血管疾病的药物中的用途。
22.权利要求20的药物组合物在制备用于治疗受试者的LOX-1疾病的药物中的用途，其中所述LOX-1疾病是动脉硬化，高血压，血管氧化应激，缺血再灌注，糖尿病肾病，心肌病，心脏衰竭，外周动脉疾病(PAD)，冠心病，跛行，中风和异常内皮依赖性血管舒张。
23.权利要求22的用途，其中所述动脉硬化是动脉粥样硬化。
24.权利要求21的用途，其中所述心血管疾病是冠状动脉疾病(CAD)。
25.权利要求21的用途，其中所述心血管疾病是心肌缺血、心肌梗塞。
26.权利要求21的用途，其中所述心血管疾病是心绞痛。
27.权利要求22的用途，其中所述LOX-1疾病是间歇性跛行、卢瑟福II/III级跛行，心绞痛，外周动脉疾病(PAD)中的一种或者多种。
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