ES2857677T3 - Anticuerpos del receptor 1 de LDL oxidadas de tipo lectina y métodos de uso - Google Patents

Anticuerpos del receptor 1 de LDL oxidadas de tipo lectina y métodos de uso Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo anti-LOX-1 aislado o un fragmento del mismo, que comprende (i) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 24, o (ii) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos del receptor 1 de LDL oxidadas de tipo lectina y métodos de uso
Antecedentes de la invención
La enfermedad vascular sigue siendo una de las causas principales de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Fármacos que fijan como objetivo factores de riesgo convencionales reducen una parte del riesgo vascular. Sin embargo, los datos experimentales y clínicos sugieren que otros factores novedosos pueden explicar la mayor parte del riesgo de enfermedades arteriales coronarias, cerebrales y periféricas y sus manifestaciones clínicas.
La captación desregulada de partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) modificadas oxidativamente (oxLDL) por células vasculares mediada por receptores depuradores se considera una etapa crucial en la aterogénesis. Además de mediar en la captación de lípidos oxidados, los receptores depuradores pueden mediar en la activación de vías de señalización pro-oxidantes y pro-inflamatorias que están implicadas en la activación de células endoteliales y macrófagos, y que conducen a la progresión de la aterosclerosis y la erosión/rotura de la placa, así como a la disfunción microvascular con perfusión tisular deteriorada y suministro/utilización de oxígeno, lo que resulta en isquemia del miocardio o de las extremidades inferiores.
El receptor 1 de lipoproteínas de baja densidad oxidadas de tipo lectina (LOX-1) es un receptor depurador multifuncional que se expresa en células endoteliales vasculares, monocitos y macrófagos, células del músculo liso vascular y plaquetas. LOX-1 se une a oxLDL y otros lípidos oxidados, lo que da como resultado la activación de NADPH oxidasa y la generación de especies reactivas de oxígeno, incluyendo el anión superóxido. El anión superóxido inactiva el óxido nítrico endotelial y activa la MAP quinasa y NF-kB. A su vez, esto induce la expresión de moléculas de adhesión inflamatorias, citoquinas y quimioquinas, así como metaloproteinasas de la matriz y mediadores pro-apoptóticos.
Se cree que las consecuencias pro-inflamatorias, pro-oxidantes y pro-apoptóticas de la señalización mediada por oxLDL - LOX-1 en las células endoteliales, células del músculo liso y macrófagos juegan un papel clave en la progresión de la aterosclerosis y la inestabilidad de la placa y también pueden jugar un papel en la perfusión tisular deteriorada y el suministro de oxígeno, lo que resulta en isquemia. Las consecuencias clínicas de la aterosclerosis avanzada y la isquemia de órganos incluyen: síndromes coronarios agudos, infarto de miocardio, angina inestable, apoplejía, angina, claudicación e isquemia crítica de miembros. Además, se cree que el estrés oxidativo, la inflamación vascular y la disfunción microvascular resultante contribuyen a la enfermedad vascular diabética, incluyendo la nefropatía y la retinopatía.
Si bien los niveles de expresión endotelial de LOX-1 basal son relativamente bajos en condiciones fisiológicas normales, la expresión de LOX-1 vascular se regula al alza en las condiciones asociadas con la enfermedad vascular. Se ha demostrado que los niveles de LOX-1 endotelial aumentan por el estrés oxidativo, las citoquinas proinflamatorias, la proteína C reactiva (CRP) y la angiotensina II. LOX-1 también se regula positivamente en el endotelio de animales ateroescleróticos y diabéticos y en monocitos/macrófagos aislados de pacientes con enfermedad vascular. Hiperglucemia, productos finales glicados avanzados y lipoproteínas aterogénicas también regulan al alza la expresión de LOX-1, proporcionando un vínculo mecánico molecular específico entre la diabetes y las complicaciones vasculares.
La regulación al alza de LOX-1 por citoquinas y la CRP también sugiere un vínculo entre los factores de riesgo vascular convencionales y la enfermedad vascular acelerada en pacientes de alto riesgo y diabéticos. Tanto la CRP como la LOX-1 soluble están elevadas en pacientes con síndromes coronarios agudos. Los datos in vitro han demostrado que los anticuerpos anti-LOX-1 previenen la adhesión de monocitos mediada por CRP a las células endoteliales aórticas humanas, lo que respalda adicionalmente el papel de LOX-1 como una molécula de adhesión relevante para la inflamación vascular (Li et al., Circulation Research 20 O4 , 95: 877-883).
El aumento de la expresión de LOX-1 junto con niveles elevados de oxLDL y otras lipoproteínas oxidadas induce la disfunción endotelial, en parte, activando la NADPH oxidasa y la generación de especies reactivas de oxígeno. Experimentalmente, la disfunción endotelial inducida por estrés oxidativo puede ser revertida con un anticuerpo anti-LOX-1 neutralizante en ratones inactivados para ApoE (Xu et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2007, 27: 871-877). En este estudio, el anticuerpo anti-LOX-1 aumentó tanto el óxido nítrico biodisponible como la expresión de la proteína eNOS.
Datos experimentales in vivo indican que la sobre-expresión de LOX-1 vascular y de macrófagos en presencia de lípidos oxidados contribuye a la aterosclerosis y la disfunción microvascular, activando vías de señalización pro-oxidantes y pro­ inflamatorias. Por lo tanto, se espera que la inhibición de LOX-1 evite el desarrollo y la progresión de la aterosclerosis y sus complicaciones agudas tales como síndromes coronarios agudos, infarto de miocardio y angina inestable. Además, también se espera que la inhibición de LOX-1 mejore la disfunción microvascular, previniendo manifestaciones clínicas de isquemia tisular, tales como angina crónica, angina refractaria, claudicación e isquemia crítica de miembros.
La inhibición de LOX-1 es útil no solo en el tratamiento y la prevención de la enfermedad vascular aterosclerótica, sino también en el tratamiento de otras afecciones patológicas caracterizadas por estrés oxidativo e inflamación, tales como artritis reumatoide, diversas formas de vasculitis, uveítis, degeneración macular relacionada con la edad y prevención de eventos cardiovasculares en enfermedades autoinmunes (p. Ej., lupus eritematoso, psoriasis).
Se conocen anticuerpos contra LOX-1: Xu et al.(Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2007, 27:871-877) describe el uso de un anticuerpo neutralizante para LOX-1 en un modelo de aterosclerosis en ratón; sin embargo, el propio anticuerpo es un uso de preparación policlonal de anticuerpos. El documento EP 2444492 A1 describe anticuerpos anti-LOX-1 generados en un sistema no mamífero, a saber, pollo, que tienen una afinidad comparativamente baja. El documento EP 1418 234 A1 describe anticuerpos humanos anti-LOX-1 humano generados en un sistema de ratón modificado, mientras que el documento EP 2048161 A1 describe anticuerpos monoclonales anti-LOX-1 humano de ratón que se unen a LOX-1 soluble.
En resumen, los datos experimentales y clínicos sugieren que LOX-1 puede ser el receptor de lípidos oxidados crítico que vincula el estrés oxidativo, la inflamación y la enfermedad vascular. Los anticuerpos anti-LOX-1 y fragmentos de unión a antígeno descritos en esta invención inhiben la unión de oxLDL y otros lípidos/lipoproteínas oxidados a LOX-1, previniendo la activación de LOX-1 y reduciendo con ello el estrés oxidativo vascular y la inflamación. Se espera que estos anticuerpos prevengan y mejoren las manifestaciones agudas y crónicas de la enfermedad vascular y que prevengan y mejoren otras enfermedades caracterizadas por el estrés oxidativo y la inflamación.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen al receptor 1 de LDL (lipoproteína de baja densidad) oxidada similar a lectina humana (en adelante, aludida a veces como "LOX-1"), y a composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento que comprenden los mismos según se define en las reivindicaciones.
En particular, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-LOX-1 aislado o a un fragmento del mismo, que comprende
(i) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:
24, o
(ii) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:
44.
Estos anticuerpos anti-LOX-1 aislados, o fragmentos de unión a antígeno, como se reivindica en esta memoria, se unen a LOX-1 con una constante de disociación en equilibrio (Kd) menor que o igual a 100 pM. Por ejemplo, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión a antígeno según se reivindican en esta memoria pueden unirse a LOX-1 humano con una Kd menor que o igual a 100 pM, menor que o igual a 50 pM, menor que o igual a 45 pM, menor que o igual a 40 pM, menor que o igual a 35 pM. Más específicamente, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno según se reivindica en esta memoria pueden también unirse a LOX-1 humano con una Kd menor que o igual a 34 pM, medida por Biacore, o menor que o igual a 4 pM, medida por ensayo de valoración en equilibrio de la solución (SET); y también puede unirse a LOX-1 de mono cynomolgus con una Kd menor que o igual a 53 pM, medida por Biacore, o menor que o igual a 4 pM, medida por SET.
La presente invención se refiere a un anticuerpo aislado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo según se reivindica en esta memoria, que se une a LOX-1 humano y de mono cynomolgus. La invención también se refiere a un anticuerpo aislado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo según se reivindica en esta memoria, que se une al dominio de tipo lectina C-terminal de LOX-1 (dominio de unión a oxLDL). La invención también se refiere a un anticuerpo aislado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo según se reivindica en esta mmeoria, que se une a un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos 228-246 de LOX-1 humano (FRVRGAVSQTYPs Gt CAYI; SEQ ID n O:3). La presente invención también incluye un anticuerpo aislado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se une a un epítopo en LOX-1 humano que comprende los residuos de aminoácidos Arg229 y Arg231 de LOX-1 humano (SEQ ID NO: 1).
La afinidad de unión de los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno descritos en esta memoria se puede determinar mediante valoración en equilibrio de la solución (SET). Métodos para SET son conocidos en la técnica y se describen con más detalle más adelante. Alternativamente, la afinidad de unión de los anticuerpos aislados, o fragmentos, descritos en esta memoria, se puede determinar mediante el ensayo Biacore. Métodos para los ensayos cinéticos de Biacore son conocidos en la técnica y se describen con más detalle más adelante.
Los anticuerpos anti-LOX-1 aislados y los fragmentos de unión a antígeno según se reivindican en esta memoria pueden utilizarse para inhibir la unión de LOX-1 a oxLDL (también conocida como LDL modificadas).
Los anticuerpos anti-LOX-1 aislados y fragmentos de unión a antígeno según se reivindican en esta memoria se pueden utilizar para inhibir la unión de LOX-1 a múltiples formas de LDL modificadas (lipoproteínas de baja densidad) con una CI50 menor que o igual a 100 nM, menor que o igual a 50 nM, menor que o igual a 35 nM, menor que o igual a 25 nM, menor que o igual a 10 nM o menor que o igual a 5,2 nM. Más específicamente, un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo según se reivindican en esta memoria pueden inhibir la unión de LOX-1 a LDL modificadas oxidativamente por sulfato de cobre (ox-LDL) con una CI50 menor que o igual a 100 nM, menor que o igual a 50 nM, menor que o igual a 35 nM, menor que o igual a 25 nM, menor que o igual a 10 nM o menor que o igual a 5,2 nM. Más específicamente, un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo según se reivindican en esta memoria pueden inhibir la unión de lOX-1 a LDL modificadas con dialdehído malónico con una CI50 menor que o igual a 100 nM, menor que o igual a 50 nM, menor que o igual a 35 nM, menor que o igual a 25 nM, menor que o igual a 20 nM, o menor que o igual a 18 nM. Más específicamente, un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo según se reivindican en esta memoria pueden inhibir la unión de LOX-1 a LDL modificadas con hipoclorito con una CI50 menor que o igual a 100 nM, menor que o igual a 50 nM, menor que o igual a 35 nM, menor que o igual a 25 nM, menor que o igual a 10 nM, o menor que o igual a 5 nM.
Los anticuerpos anti-LOX-1 aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos según se reivindican en esta memoria, se pueden utilizar para reducir la expresión de LOX-1 y/o NADPH oxidasa (NADPH es la forma reducida de NADP o nicotinamida adenina dinucleótido fosfato).
Los anticuerpos anti-LOX-1 aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos según se reivindican en esta memoria, pueden utilizarse para inhibir (p. ej., bloquear la inducción de) el estrés oxidativo, p. ej., mediante la inhibición de la unión de oxLDL a LOX-1. Los anticuerpos anti-LOX-1 aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos según se reivindican en esta memoria, pueden utilizarse para bloquear la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) estimuladas por oxLDL. El estrés oxidativo vascular, que los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos según se reivindican en esta memoria, pueden utilizarse para prevenir, tratar o mejorar, causa isquemia miocárdica al inducir una vasoconstricción, alterando la vasodilatación y aumentando la demanda de oxígeno.
Los anticuerpos anti-LOX-1 aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos según se reivindican en esta memoria, pueden utilizarse para restaurar los niveles de óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) a un estado homeostático saludable. La NOS endotelial es una óxido nítrico sintasa que genera óxido nítrico (NO) en los vasos sanguíneos y está implicada en la regulación del tono vascular al inhibir la contracción del músculo liso y la agregación plaquetaria; su regulación a la baja está asociada con una disfunción de las células endoteliales relacionada con LOX-1.
Los anticuerpos anti-LOX-1 aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos según se reivindican en esta memoria pueden ser anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos o humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos F(ab')2 o fragmentos scFv y/o isotipos de IgG.
Los anticuerpos anti-LOX-1 aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, según se reivindican en esta memoria también pueden incluir un marco en el que se ha sustituido un aminoácido en el marco del anticuerpo de las respectivas secuencias de la línea germinal VH o Vl humana.
Otro aspecto de la invención incluye un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo que tienen las secuencias completas de cadena pesada y ligera de Fabs FF1 o FF3.
Un aspecto adicional de la invención incluye un anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo que tienen las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de Fabs FF1 o FF3.
En particular, el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo que se une a LOX-1, tiene dominios variables de cadena pesada y ligera que comprenden las secuencias de SEQ ID Nos: 14 y 24; o 34 y 44, respectivamente.
En particular, el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo que se une a LOX-1, puede tener una cadena pesada y una cadena ligera que comprenden las secuencias de SEQ ID NOs: 16 y 26; o 36 y 46, respectivamente.
La invención también se refiere a composiciones que comprenden el anticuerpo aislado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo según se reivindica en esta memoria, así como a composiciones de anticuerpos en combinación con un soporte farmacéuticamente aceptable. Específicamente, la invención incluye, además, composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la Tabla 1 seleccionados del anticuerpo FF1 y FF3. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una combinación de dos o más de los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos seleccionados del anticuerpo FF1 y FF3 como se describe en la Tabla 1.
La invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada variable que tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 14 y 34. En particular, el ácido nucleico tiene una secuencia de al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 15 y 35. En un aspecto adicional de la invención, la secuencia es SEQ ID NOs: 15 o 35.
La invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la cadena ligera variable que tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 25 y 45. En particular, el ácido nucleico tiene una secuencia de al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 25 y 45. En un aspecto adicional de la invención, la secuencia es SEQ ID NOs: 25 o 45.
La invención también se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que incluye un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 25 y 45.
La invención también se refiere a un vector que incluye una o más de las moléculas de ácido nucleico descritas en esta memoria.
La invención también se refiere a una célula huésped aislada que incluye una secuencia de ADN recombinante que codifica una cadena pesada del anticuerpo arriba descrito, y una segunda secuencia de ADN recombinante que codifica una cadena ligera del anticuerpo arriba descrito, en donde dichas secuencias de ADN están enlazadas operativamente a un promotor y son capaces de expresarse en la célula huésped. Se contempla que el anticuerpo pueda ser un anticuerpo monoclonal humano. También se contempla que la célula huésped sea una célula de mamífero no humano.
La invención también se refiere a un método para reducir la expresión de LOX-1 y/o la expresión de NADPH oxidasa, en el que el método incluye la etapa de poner en contacto una célula con una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo según se reivindica en esta memoria.
La invención también se refiere a un método para inhibir la unión de LDL oxidadas (oxLDL) a un receptor de LDL oxidadas humano (LOX-1) o para inhibir la incorporación mediada por el receptor de LDL oxidadas humano de LDL oxidadas en las células, en el que el método incluye la etapa de poner en contacto una célula con una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo según se reivindica en esta memoria.
Se contempla que la célula huésped sea una célula humana. Se contempla, además, que la célula esté en un sujeto. En una realización, se contempla que la célula sea una célula endotelial. En otras realizaciones, la célula puede ser uno o más de macrófagos, monocitos, células dendríticas, células de músculo liso vascular (SMC), condrocitos y miocitos cardíacos. Aún se contempla, además, que el sujeto sea humano.
La invención también se refiere a un método para tratar, mejorar o prevenir un trastorno asociado con LOX-1 en un sujeto, en el que el método incluye la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo según se reivindica en esta memoria. En un aspecto, el trastorno asociado a LOX-1 está asociado con la claudicación (p. ej., claudicación intermitente, claudicación de Rutherford de clase II/NI). En un aspecto, el trastorno asociado a LOX-1 está asociado con la angina (p. ej., angina refractaria). Se contempla que el sujeto sea humano.
Cualquiera de los anticuerpos aislados anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos puede ser un anticuerpo monoclonal o fragmentos de unión a antígeno del mismo.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos y expresiones técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención.
La expresión "proteína LOX-1" o "antígeno LOX-1" o el término "LOX-1" o "Lox1" se utilizan indistintamente, y se refiere a la proteína Receptor 1 de LDL Oxidadas Similar a Lectina (LOX-1) en diferentes especies. Por ejemplo, LOX-1 humano tiene la secuencia como se recoge en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1) y se ha descrito en informes y bibliografía previos (Nature, Vol. 386, págs.. 73-77, 1997; Genomics, Vol. 54, N° 2, págs. 191-199, 1998; Biochem. J., Vol. 339, Parte 1, Págs. 177­ 184, 1999; N° Acceso a Genbank NP 002534). Es un receptor depurador de clase E que media en la captación de oxLDL por las células vasculares y la señalización de oxLDL en las células vasculares y, como tal, es un mediador de los efectos tóxicos de oxLDL. LOX-1 se expresa en la superficie de células endoteliales vasculares y se ha implicado en la acumulación de monocitos y macrófagos en las células endoteliales vasculares.
Además, en el contexto de esta invención, el término "LOX-1" incluye mutantes del receptor de LDL oxidadas humano natural, que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la de la estructura primaria nativa (secuencia de aminoácidos) descrita en los informes antes mencionados. En esta mmeoria, la expresión "mutantes del receptor de LDL oxidadas humano natural que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos" se refiere a proteínas mutantes de este tipo.
Se ha demostrado que múltiples formas de LDL modificadas formadas in vitro y/o in vivo se unen a LOX-1. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "LDL modificadas» y "LDL oxidadas" (y "oxLDL") se utilizan indistintamente para describir lipoproteínas de baja densidad que son oxidadas por células, tales como células endoteliales vasculares, en combinación con diversos factores químicos y físicos (p. ej., calor). LDL se oxidan, por ejemplo, dentro de la pared vascular en condiciones aterogénicas para formar oxLDL. La expresión "LDL modificadas" puede abarcar lo siguiente: LDL oxidadas, LDL modificadas oxidativamente con sulfato de cobre, acetil-LDL, LDL cloradas (p. ej., LDL modificadas mediante una reacción de cloración química), LDL modificadas con mieloperoxidasa, LDL modificadas con hipoclorito, succinil-LDL y LDL modificadas con dialdehído malónico (es decir, LDL modificadas por reacción con dialdehído malónico, que se produce in vivo como consecuencia del estrés oxidativo).
El término "anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, significa un anticuerpo completo y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o una cadena sencilla del mismo. Un anticuerpo completo es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada una de las cadenas pesadas está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en esta memoria como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada una de las cadenas ligeras está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en esta memoria como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse, además, en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada una de VH y VL está compuesta por tres CDRs y cuatro FRs dispuestos desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.
La expresión "porción de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto que retiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno dado (p. ej., receptor de LDL oxidado humano (LOX-1)). Las funciones de unión a antígeno de un anticuerpo pueden realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro de la expresión porción de unión a antígeno o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente consistente en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2 , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo de dominio único (dAb) (Ward et al., 1989 Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH o un dominio VL; y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada.
Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador de péptido artificial que les permite producirse como una cadena sencilla de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, p. ej., Bird et al., 1988 Science 242: 423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-5883). Anticuerpos de cadena sencilla de este tipo incluyen una o más porciones de unión a antígeno o fragmentos de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se rastrean para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
Fragmentos de unión a antígeno también se pueden incorporar en anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, p. ej., Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126 -1136). Las porciones de anticuerpos de unión a antígeno pueden injertarse en armazones basados en polipéptidos tales como fibronectina tipo III (Fn3) (véase la Patente de EE.UU. N° 6.703.199, que describe monocuerpos polipeptídicos de fibronectina).
Los fragmentos de unión a antígeno se pueden incorporar en moléculas de cadena sencilla que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con los polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10): 1057-1062; y Patente de EE.UU. N° 5.641.870).
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en sitios antigénicos individuales. Dentro de cada uno de los sitios antigénicos, la región variable del "brazo" del anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; cuantas más interacciones, más fuerte es la afinidad. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "alta afinidad" por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (p. ej., un fragmento Fab) generalmente se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, que tiene una KD de 10'9M o menos.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos que se producen de forma natural. Aminoácidos que se producen de forma natural son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que se modifican posteriormente, p. ej., hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce de forma natural, es decir, un carbono alfa que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, p. ej., homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil sulfonio. Análogos de este tipo tienen grupos R modificados (p. ej., norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se producen de forma natural. Miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido que se produce de forma natural.
La expresión "especificidad de unión", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la capacidad de un sitio de combinación de anticuerpo individual de reaccionar con un solo determinante antigénico.
La expresión "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo de unión a LOX-1) se refiere a una reacción de unión que determina la presencia de un antígeno afín (p. ej., un LOX-1 humano o LOX-1 de cynomolgus) en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan de manera indistinta en esta memoria con la expresión "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".
La expresión "mediado por LOX-1" se refiere al hecho de que el receptor LOX-1 media en la respuesta celular tras la unión de un ligando de LOX-1, p. ej., oxLDL, a LOX-1 en la superficie celular, que luego activa la célula para aumentar la producción de determinadas moléculas pro-inflamatorias. La expresión "gen pro-inflamatorio" se refiere a un gen que codifica cualquier molécula, tal como, pero no limitado a una citoquina, una quimioquina o una molécula de adhesión celular, que juega un papel en un proceso inflamatorio. Genes "pro-inflamatorios" ejemplares incluyen, pero no se limitan a interleuquina-8 (IL-8), molécula de adhesión inte rcelular-1 (ICAM-1), molécula de adhesión de células vasculares-1 (VCAM-1) y proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1).
Un "trastorno asociado a LOX-1", "afección asociada a LOX-1", "enfermedad o afección asociada con niveles elevados de LOX-1" o expresiones similares tal como se utilizan en esta memoria, se refieren a cualquier número de afecciones o enfermedades en las que los niveles de proteína LOX-1 son aberrantemente altos y/o en los que se busca una reducción de los niveles de proteína LOX-1. Estas afecciones incluyen, pero no se limitan a trastornos cardiovasculares, disfunción de las células endoteliales, trastornos de células endoteliales, aterosclerosis, arteriosclerosis, hipertensión, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, diabetes mellitus, deficiencia de óxido nítrico, infarto de miocardio, estrés oxidativo vascular, isquemia miocárdica, isquemia-reperfusión, sepsis, nefropatía diabética, enfermedad renal, miocardiopatía, insuficiencia cardíaca, enfermedad arterial periférica, enfermedad coronaria, claudicación (p. ej., claudicación intermitente, claudicación de Rutherford Clase N/III), enfermedad arterial periférica (PAD), angina (p. ej., angina refractaria), enfermedad de las arterias coronarias (CAD) (p. ej., debido a la aterosclerosis de las arterias que alimentan el corazón), apoplejía y vasodilatación anormal dependiente del endotelio.
"Disfunción de las células endoteliales", tal como se utiliza en esta memoria, significa la incapacidad de una célula endotelial de mantener su función normal. El endotelio juega un papel fundamental en la regulación del crecimiento y el tono liso vascular, la permeabilidad vascular, la respuesta inflamatoria, la coagulación y la adhesión plaquetaria. Ejemplos no limitantes de la función de las células endoteliales incluyen mantener un tono vascular equilibrado, inhibir la trombosis, inhibir los procesos pro-inflamatorios, mantener la integridad vascular (p. ej., la ausencia de fugas de la vasculatura) y mantener un estado anti-proliferativo tanto en el endotelio como en las células del músculo liso. Afecciones comunes y factores de riesgo que predisponen a la aterosclerosis, tales como dislipidemia, hipertensión, diabetes y tabaquismo, están todos asociados con la disfunción endotelial, que fomenta el desarrollo, la progresión y complicaciones de la aterosclerosis. La disfunción endotelial generalmente se ha evaluado como una vasodilatación dependiente del endotelio alterada. Esto supone que la vasodilatación dependiente del endotelio es un marcador sustituto de otras funciones endoteliales importantes. La base de esta suposición es la observación de que el óxido nítrico derivado del endotelio, sintetizado por la NO sintasa endotelial (eNOS) a partir de L-arginina, media en la vasodilatación dependiente del endotelio y otras funciones vasculo-protectoras endoteliales. Una base de datos clínica creciente sugiere que la disfunción endotelial (vasodilatación dependiente del endotelio alterada) está estrechamente asociada con eventos cardiovasculares adversos importantes que incluyen isquemia e infarto de miocardio, síndromes coronarios agudos, claudicación e isquemia crítica de miembros, ataques isquémicos transitorios y apoplejía. La acumulación de datos experimentales también sugiere que la disponibilidad de NO derivada de eNOS alterada endotelial y endocadial no solo puede conducir a una remodelación y disfunción del ventrículo izquierdo anormal que contribuyen al desarrollo y la progresión de la insuficiencia cardíaca.
Un "trastorno de las células endoteliales", tal como se utiliza en esta memoria, es cualquier trastorno que se caracteriza por una disfunción de las células endoteliales. Ejemplos no limitantes de enfermedades o trastornos que se caracterizan por una disfunción de las células endoteliales incluyen trastornos angiogénicos tales como cánceres que requieren neovascularización para apoyar el crecimiento del tumor, enfermedades infecciosas, trastornos autoinmunes, malformaciones vasculares, síndrome de DiGeorge, HHT, hemangioma cavernoso, arteriopatía de trasplante, arteriopatía vascular. estenosis de acceso asociada con hemodiálisis, vasculitis, vasculitidis, trastornos inflamatorios vasculares, aterosclerosis, obesidad, psoriasis, verrugas, dermatitis alérgica, queloides cicatriciales, granulomas piógenos, enfermedad ampollosa, sarcoma de Kaposi, síndrome vítreo hiperplásico persistente, retinopatía del prematuro, neovascularización coroidea, degeneración macular, retinopatía diabética, neovascularización ocular, hipertensión pulmonar primaria, asma, pólipos nasales, enfermedad inflamatoria intestinal y periodontal, ascitis, adherencias peritoneales, anticoncepción, endometriosis, hemorragia uterina, quistes ováricos, hiperestimulación ovárica, artritis, artritis reumatoide, reumatismo articular crónico, sinovitis, osteoartritis, osteomielitis, formación de osteofitos, sepsis y fuga vascular. La disfunción de las células endoteliales se puede determinar utilizando ensayos conocidos en la técnica que incluyen la detección del aumento de la expresión de moléculas de adhesión endotelial o la disminución de la expresión o actividad biológica de la óxido nítrico sintasa (eNOS).
"Claudicación", tal como se utiliza en esta memoria, incluye claudicación severa y otros términos similares, y describe un impedimento de movilidad y una gran necesidad médica insatisfecha. La claudicación es una afección caracterizada por isquemia de las extremidades inferiores, que causa fatiga muscular, dolor de esfuerzo que se alivia con el reposo, movilidad limitada y calidad de vida reducida, y es causada por aterosclerosis y vasodilatación dependiente del endotelio anormal (p. ej., alterada). Su prevalencia en los EE.UU. es de 8-12 millones de pacientes. Entre los pacientes con claudicación intermitente, el 7% se someterá a una cirugía de baipás de las extremidades inferiores, el 4% requerirá amputaciones mayores y el 16% desarrollará un empeoramiento de la claudicación. Eventos cardiovasculares, tales como el infarto de miocardio y la apoplejía, ocurren en el 20% de los pacientes con claudicación severa a lo largo de 5 años. La terapia actual es quirúrgica y el tratamiento por medios menos invasivos, tales como la administración de los anticuerpos anti-LOX-1 de la invención, representaría un enorme avance terapéutico.
"Angina refractaria", tal como se utiliza en esta memoria, es una afección marcada por dolor en el pecho debido a isquemia del músculo cardíaco, generalmente debido a obstrucción o espasmo de las arterias coronarias (p. ej., por enfermedad de las arterias coronarias), con síntomas debilitantes, actividad física muy limitada y mala calidad de vida. Los 1-1,8 millones de pacientes que padecen angina refractaria en los EE.UU. experimentan un aumento de la mortalidad cardiovascular a una tasa del 10% al año; al menos 100.000 nuevos casos de angina refractaria surgen al año.
La expresión "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o intercambia, de modo que el sitio de unión a antígeno (región variable) se enlaza a una región constante de una clase diferente o alterada, función efectora y/o especie, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, p. ej., una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc ; o (b) la región variable, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o intercambia por una región variable que tiene una especificidad antigénica diferente o alterada. Por ejemplo, un anticuerpo de ratón se puede modificar reemplazando su región constante con la región constante de una inmunoglobulina humana. Debido al reemplazo con una región constante humana, el anticuerpo quimérico puede retener su especificidad en el reconocimiento del antígeno, mientras que tiene una antigenicidad reducida en seres humanos en comparación con el anticuerpo de ratón original.
La expresión "variante modificada de forma conservadora" se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en las que el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en la que se especifica una alanina mediante un codón, el codón se puede alterar en cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada una de las secuencias de ácidos nucleicos en esta memoria que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada uno de los codones de un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada una de las variaciones silenciosas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada una de las secuencias descritas.
Para las secuencias de polipéptidos, las "variantes modificadas de forma conservadora" incluyen sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de polipéptidos que dan como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Variantes de este tipo modificadas de forma conservadora son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos interespecies y alelos de la invención. Los siguientes ocho grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (c ), Metionina (M) (véase, p. ej., Creighton, Proteins (1984)). En algunas realizaciones, la expresión "modificaciones de secuencia conservativas" se utiliza para referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos.
El término "epítopo" significa un determinante de proteína capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos consisten habitualmente en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero pero no al segundo se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.
La expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en esta memoria, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto la región marco como las regiones CDR se derivan de secuencias de origen humano. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias humanas de este tipo, p. ej., secuencias de la línea germinal humana o versiones mutadas de secuencias de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo).
La expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que exhiben una única especificidad de unión que tienen regiones variables en las que tanto la región marco como la región CDR se derivan de secuencias humanas. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, p. ej., un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera condensado a una célula inmortalizada.
Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo que retiene la reactividad de un anticuerpo no humano, al tiempo que es menos inmunogénico en seres humanos. Esto se puede lograr, por ejemplo, reteniendo las regiones CDR no humanas y reemplazando las partes restantes del anticuerpo por sus homólogos humanos (es decir, la región constante, así como las porciones marco de la región variable). Véase, p. ej., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; y Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994. Otros ejemplos de tecnología de ingeniería humana incluyen, pero no se limitan a la tecnología Xoma descrita en el documento US 5.766.886.
Los términos "idéntico" o "identidad" porcentual en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad a lo largo de una región específica o, cuando no se especifica, a lo largo de toda la secuencia), cuando se compara y alinea para obtener la máxima correspondencia en una ventana de comparación, o región designada como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe a lo largo de una región que tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferiblemente a lo largo de una región que tiene 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más amino ácidos) de longitud.
Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Se pueden utilizar parámetros de programa predeterminados o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.
Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en esta memoria, incluye referencia a un segmento de uno cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en 20 a 600, habitualmente de 50 a 200, más habitualmente de 100 a 150, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de manera óptima. Métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación se puede realizar, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c, mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por alineamiento manual e inspección visual (véase, p. ej., Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)).
Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, 1977; y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coincidan o satisfagan una puntuación umbral T con valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. Se hace referencia a T como el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al.,, supra). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largos que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada una de las secuencias hasta donde se pueda aumentar la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización por residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa cae en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993).. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menos de aproximadamente 0,2, más preferiblemente menos de aproximadamente 0,01 y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 0,001.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17, 1988) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0 ), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol. 48: 444-453, 1970) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en la red mundial en gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Aparte del porcentaje de identidad de secuencia arriba indicado, otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico reacciona de forma inmunológicamente cruzada con los anticuerpos producidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, tal como se describe más adelante. Por tanto, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solo por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en condiciones rigurosas, tal como se describe más adelante. Aún otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que se pueden utilizar los mismos cebadores para amplificar la secuencia.
La expresión "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (p. ej., un anticuerpo aislado que se une específicamente a LOX-1 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de LOX-1). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a LOX-1 puede tener reactividad cruzada con otros antígenos. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otro material celular y/o productos químicos.
El término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpos (p. ej., IgM, IgE, IgG, tal como IgG1 o IgG4) que proporcionan los genes de la región constante de la cadena pesada. El isotipo también incluye versiones modificadas de una de estas clases, en las que se han realizado modificaciones para alterar la función Fc, por ejemplo, para potenciar o reducir las funciones efectoras o la unión a receptores Fc.
El término "kasoc" o "ka", tal como se utiliza en esta memoria, pretende referirse a la tasa de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "kdis" o "kd ," tal como se utiliza en esta memoria, pretende referirse a la tasa de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. El término "Kd", tal como se utiliza en esta memoria, pretende referirse a la constante de disociación, que se obtiene a partir de la relación de kd a ka (es decir, kd/ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de Kd para anticuerpos se pueden determinar utilizando métodos bien establecidos en la técnica. Métodos para determinar la Kd de un anticuerpo incluyen medir la resonancia del plasmón superficial utilizando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®, o medir la afinidad en solución mediante titulación en equilibrio de solución (SET).
Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", tal como se utilizan en esta memoria, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular.
La expresión "ácido nucleico" se utiliza en esta memoria de manera indistinta con el término "polmudeótido" y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de cadena sencilla o de doble cadena. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos de la cadena principal modificada o enlaces, que son sintéticos, se producen de forma natural y se producen de forma no natural, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia, y que se metabolizan de una manera similar a la de los nucleótidos de referencia. Ejemplos de análogos de este tipo incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, péptido-ácidos nucleicos (PNAs).
A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservativa de la misma (p. ej., sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, como se detalla más adelante, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) está sustituida con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).
La expresión "enlazado operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de polinucleótidos (p. ej., ADN). Típicamente, el término se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora de la transcripción con una secuencia transcrita. Por ejemplo, una secuencia promotora o potenciadora está operativamente enlazada a una secuencia codificante si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula huésped apropiada u otro sistema de expresión. Generalmente, secuencias promotoras reguladoras de la transcripción que están operativamente enlazadas a una secuencia transcrita son físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, actúan en cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de la transcripción, tales como los potenciadores, no necesitan ser físicamente contiguas o estar ubicadas muy próximas a las secuencias codificantes cuya transcripción potencian
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "optimizada" significa que una secuencia de nucleótidos ha sido alterada para codificar una secuencia de aminoácidos utilizando codones que son preferidos en la célula u organismo de producción, generalmente una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de Pichia, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada está diseñada para retener completamente o tanto como sea posible la secuencia de aminoácidos originalmente codificada por la secuencia de nucleótidos de partida, que también se conoce como la secuencia "precursora". Las secuencias optimizadas de esta memoria han sido modificadas para tener codones que se prefieren en células de mamífero. Sin embargo, también se prevé en esta memoria la expresión optimizada de estas secuencias en otras células eucarióticas o células procarióticas. A las secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos optimizadas también se las alude como optimizadas.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en esta memoria para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido que se produce de forma natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que se producen de forma natural y polímero de aminoácidos que se produce de forma no natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia polipeptídica particular también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma.
La expresión "anticuerpo humano recombinante", tal como se utiliza en esta memoria, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, p. ej., de un transfectoma, anticuerpos aislados de una colección de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otros medios que implican el corte y empalme de todo o una parte de un gen de inmunoglobulina humana, secuencias a otras secuencias de ADN. Anticuerpos humanos recombinantes de este tipo tienen regiones variables en las que las regiones de marco y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, anticuerpos humanos recombinantes de este tipo pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de secuencias VH y VL de la línea germinal humana y están relacionadas con ellas, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
La expresión "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped") se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que dichos términos están destinados a referirse no solo a la célula objeto particular, sino a la progenie de una célula de este tipo. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, una progenie de este tipo puede no ser, de hecho, idéntica a la célula madre, pero todavía está incluida dentro del alcance de la expresión "célula huésped" tal como se utiliza en esta memoria.
El término "sujeto" incluye animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados (p. ej.: mamíferos y no mamíferos) tales como primates no humanos (p. ej.: mono cynomolgus), ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios y reptiles. Excepto cuando se indique, los términos "paciente" o "sujeto" se utilizan indistintamente en esta memoria. Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "cyno" o "cynomolgus" se refieren al mono cynomolgus (Macaca fascicularis).
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "tratar" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno (p. ej., trastorno asociado a LOX-1) se refiere, en una realización, a mejorar la enfermedad o trastorno (es decir, ralentizar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de los síntomas clínicos de la misma). En otra realización, "tratar" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar al menos un parámetro físico que incluye aquellos que pueden no ser discernibles por el paciente. En aún otra realización, "tratar" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o trastorno, ya sea físicamente (p. ej., estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (p. ej., estabilización de un parámetro físico) o ambos. En aún otra realización, "tratar" o "tratamiento" se refiere a prevenir o retrasar el inicio o desarrollo o la progresión de la enfermedad o trastorno.
"Prevención" en lo que respecta a las indicaciones descritas en esta memoria, incluyendo, p. ej., trastorno asociado a LOX-1, significa cualquier acción que previene o ralentiza un empeoramiento de, p. ej., los parámetros de la enfermedad asociados a LOX-1 tal como se describe más adelante, en un paciente con riesgo de dicho empeoramiento.
El término "vector" pretende hacer referencia a una molécula de polinucleótido capaz de transportar otro polinucleótido al que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, tal como un vector viral adenoasociado (AAV o AAV2), en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (p. ej., vectores no episomales de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de ese modo se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados operativamente. Vectores de este tipo se denominan en esta memoria "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante se encuentran a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (p. ej., retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), que cumplen funciones equivalentes.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A-1C representan la inhibición de la unión de OxLDL a la proteína LOX-1 por los anticuerpos LOX-1 de la invención. La Figura 1A muestra OxLDL de alta unión, la Figura 1B muestra dialdehído malónico-LDL y la Figura 1C muestra LDL modificadas con hipoclorito, todo como se describe en esta memoria.
La Figura 2 representa anticuerpos LOX-1 que inhiben la unión de OxLDL marcada con di-l a células HEK293 transfectadas con LOX-1 humano.
La Figura 3 representa una curva de dosis-respuesta de la inhibición del anticuerpo LOX-1 de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducidas por oxLDL en células HEK293 transfectadas con lOX-1 humano. Las Figuras 4A-4F demuestran anticuerpos lOX-1 (anticuerpos solos o en presencia de un Fab2 reticulante) que inhiben la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducidas por oxLDL en células HEK293 transfectadas con LOX-1 humano. La Figura 4A muestra el anticuerpo FF1, la Figura 4B muestra el anticuerpo FF3, la Figura 4C muestra el anticuerpo FF4, la Figura 4D muestra el anticuerpo FF5, la Figura 4E muestra el anticuerpo FF6 y la Figura 4F muestra el hIgG1-LALA control.
La Figura 5 representa los anticuerpos LOX-1 que se unen a LOX-1 en la superficie de neutrófilos humanos. Las Figuras 6A-6B representan la determinación de la constante de disociación del anticuerpo (Kd) mediante ensayos de valoración en equilibrio de solución (SET) con proteínas APP-Avi-LOX-1 humanas o de mono cynomolgus. La Figura 6A representa datos para LOX-1 humano y la Figura 6B representa datos para LOX-1 de cyno.
Descripción detallada
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de moléculas de anticuerpos que se unen específicamente a LOX-1 e inhiben sus actividades biológicas (p. ej., anticuerpos E2E10, FF1, FF3, FF4, FF5, FF6). La invención se refiere tanto a anticuerpos en formato IgG completo como a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como fragmentos Fab de anticuerpos FF1 y FF3.
Por consiguiente, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a LOX-1 (p. ej., LOX-1 humano y LOX-1 de mono cynomolgus) según se reivindica en esta memoria, composiciones farmacéuticas, métodos de producción y métodos de uso de dichos anticuerpos y composiciones.
Proteínas LOX-1
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a LOX-1 e inhiben sus actividades biológicas, incluidas sus actividades pro-oxidativas y pro-inflamatorias. LOX-1, un receptor de LDL modificadas oxidativamente (oxLDLs), se expresa en la superficie de células vasculares (células endoteliales y células de músculo liso), neutrófilos, monocitos y macrófagos y plaquetas. Además, LOX-1 está regulado al alza en enfermedades vasculares, incluso en lesiones ateroescleróticas humanas y animales (Kataoka H, et al., Circulation 99; 3110-3117). LOX-1 también se regula positivamente en enfermedades inflamatorias/autoinmunes sistémicas (p. ej., artritis reumatoide, uveítis, degeneración macular relacionada con la edad y pre-eclampsia). Las OxLDLs están implicadas en la patogenia de la enfermedad vascular. Además de las oxLDLs, LOX-1 se une a otros ligandos que incluyen LDL acetilada, productos finales de glicación avanzada (AGEs), proteína de choque térmico 70 (HSP70), células apoptóticas, glóbulos rojos envejecidos, leucocitos, plaquetas activadas, bacterias, fosfatidilserina y proteína C reactiva (CRP).
LOX-1 es una proteína de membrana de tipo II que pertenece a la familia de las lectinas de tipo C. LOX-1 también se clasifica como un receptor depurador de clase E. LOX-1 consiste en 4 dominios: un dominio citoplásmico N-terminal corto, una región de transmembrana, un cuello de conexión y un dominio similar a lectina en el extremo C. El dominio similar a lectina C-terminal (CTLD; al que también se alude como dominio de unión a oxLDL) es el dominio de unión al ligando (Sawamura T, et al., Nature 386; 73-77; Shi X, et al., J Cell Sci 114; 1273-1282). LOX-1 humano tiene la secuencia como se recoge en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1) y se ha descrito en informes y bibliografía previos (Nature, Vol. 386, págs.. 73­ 77, 1997; Genomics, Vol. 54, N° 2, págs. 191-199, 1998; Biochem. J., Vol. 339, Parte 1, Págs. 177-184, 1999; N° Acceso a Genbank NP 002534).
La vía oxLDL/LOX-1 contribuye al estrés oxidativo, la inflamación vascular, la aterosclerosis y el flujo sanguíneo tisular alterado y el suministro de oxígeno. La activación de LOX-1 mediante la unión de ligandos de LOX-1 (p. ej., oxLDLs) da como resultado la generación de especies reactivas de oxígeno debido a la activación de la NADPH oxidasa y la activación subsiguiente de las vías de NFkB y MAP quinasa que dan como resultado una inflamación. La vía de señalización oxLDL/LOX-1 actúa como un bucle de retroalimentación positiva, ya que las especies reactivas de oxígeno inducidas por LOX-1 dan como resultado la formación de oxLDL adicional y regula al alza la expresión de LOX-1. La unión de oxLDL a LOX-1 expresada en la superficie de macrófagos también da como resultado la captación de oxLDL que contribuye a la formación de células esponjosas y aterosclerosis. Curiosamente, se cree que la inflamación vascular es crítica para la patobiología de las complicaciones trombóticas agudas de la aterosclerosis, incluyendo infarto de miocardio y apoplejía isquémica. También se ha demostrado que la activación de LOX-1 altera la función vasomotora al alterar la vasodilatación por un mecanismo que implica a la NADPH oxidasa. Se ha demostrado que la vasodilatación deteriorada se produce en pacientes con enfermedad arterial coronaria crónica y angina, y en pacientes con enfermedad arterial periférica y claudicación.
Estudios con ratones inactivados para LOX-1 y anticuerpos antagonistas de LOX-1 han demostrado que la inhibición de LOX-1 puede tener efectos cardiovasculares beneficiosos. Por ejemplo, la inactivación de LOX-1 previene la alteración de la vasorrelajación mediado por oxLDL y reduce la aterosclerosis (Mehta et al, Circulation Research 2007, 100: 1634). Además, se ha demostrado que los anticuerpos anti-LOX-1 (i) bloquean el estrés oxidativo inducido por oxLDL en células endoteliales humanas (Ou et al., J Appl Phys 2010, 108: 1745); e (ii) inhiben la producción de superóxido y restauran la expresión de eNOS, dando como resultado una biodisponibilidad del NO y vasodilatación mejoradas (Xu et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2007, 27: 871-877).
Los autores de la invención proponen que la inhibición de LOX-1, por ejemplo a través de la administración de los anticuerpos anti-LOX-1 de la invención, mejorará el flujo sanguíneo y el suministro de oxígeno al tejido isquémico, lo que resultará en un beneficio terapéutico para los pacientes con enfermedad vascular crónica, que incluye angina, claudicación e isquemia crítica de las extremidades. La inhibición de LOX-1, por ejemplo a través de la administración de los anticuerpos anti-LOX-1 de la invención, también puede ralentizar o revertir la progresión de la aterosclerosis y reducir la incidencia de sus complicaciones trombóticas agudas (p. ej., síndrome coronario agudo, angina inestable, infarto de miocardio y apoplejía isquémica).
Anticuerpos LOX-1 y Fragmentos de Unión a Antígeno
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a LOX-1. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a LOX-1 humano y de mono cynomolgus. En particular, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-LOX-1 aislado o a un fragmento del mismo, que comprende (i) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:
24, o
(ii) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:
44, como se enumera en la Tabla 1, infra.
La presente invención también proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican VH, VL, la cadena pesada de longitud completa y la cadena ligera de longitud completa de los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína LOX-1 (p. e j, LOX-1 humano y de mono cynomolgus). como se describió arriba. Secuencias de ácidos nucleicos de este tipo se pueden optimizar para la expresión en células de mamíferos (por ejemplo, la Tabla 1 muestra las secuencias de ácidos nucleicos optimizadas para la cadena pesada y la cadena ligera de los anticuerpos de la invención).
Tabla 1. E emplos e emplos de referencia de Anticuerpos LOX-1, Fabs Proteínas LOX-1
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Descripción de la Identificador de Secuencia de aminoácidos o polinucleótidos
Secuencia la Secuencia
(SEQ ID NO:)
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Descripción de la Identificador de Secuencia de aminoácidos o polinucleótidos
Secuencia la Secuencia
(SEQ ID NO:)
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Más específicamente, en determinados aspectos, la invención proporciona un anticuerpo aislado o una región de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NOs: 14 y 24; o 34 y 44, respectivamente.
En otro aspecto, la invención proporciona (i) un anticuerpo aislado que tiene: una cadena pesada de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido optimizada para la expresión en una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 16 y 36, y una cadena ligera de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido optimizada para la expresión en una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 26 y 46; o (ii) una proteína funcional que comprende una porción de unión a antígeno de la misma. Más específicamente, en determinados aspectos, la invención proporciona un anticuerpo aislado o una región de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada y una cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NOs: 14 y 24; o 34 y 44, respectivamente.
La expresión "región determinante de la complementariedad" y el término "CDR", como se utilizan en esta memoria, se refieren a las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones variables del anticuerpo que confieren especificidad antigénica y afinidad de unión. En general, hay tres CDRs en cada región variable de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres CDRs en cada región variable de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3).
Los límites precisos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada se pueden determinar fácilmente utilizando cualquiera de un cierto número de esquemas bien conocidos, incluyendo los descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeración "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeración "Chothia").
Por ejemplo, bajo Kabat, los residuos de aminoácidos de la CDR del anticuerpo FF1 en el dominio variable de la cadena pesada (Vh ) se numeran 31-35 (HCDR1), 50-66 (HCDR2) y 99-104 (HCDR3); y los residuos de aminoácidos de la CDR en el dominio variable de cadena ligera (VL) se numeran 24-34 (LCd R1), 50-55 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3). Bajo Chothia, los aminoácidos de la CDR en la VH se numeran 26-32 (HCd R1), 52-57 (HCDR2) y 99-104 (HCDR3); y los residuos de aminoácidos en la VL se numeran 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCd R2) y 91-96 (Lc DR3). Al combinar las definiciones de CDR de Kabat y Chothia, las CDRs consisten en los residuos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-66 (HCDR2) y 90-104 (HCDR3) en la Vh humana y residuos de aminoácidos 24-34 ( LCDR1), 50-55 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3) en la v L humana.
En otro aspecto, la presente invención describe anticuerpos de unión a LOX-1 que comprenden las CDR1s, CDR2s y CDR3s de cadena pesada y cadena ligera como se describen en la Tabla 1, o combinaciones de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1s de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 8, 28, 48, 68 y 88. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 9, 29, 49, 69 y 89. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 10, 30, 50, 70 y 90. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1s de VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 18, 38, 58, 78 y 98. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s de VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 19, 39, 59, 79 y 99. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s de VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 20, 40, 60, 80 y 100. Estas regiones de CDR se delinean utilizando el sistema Kabat.
Alternativamente, como se define utilizando el sistema Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948), las secuencias de aminoácidos de las CDR1s de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 11, 31, 51, 71 y 91. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 12, 32, 52, 72 y 92. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 13, 33, 53, 73 y 93. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1s de VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 21, 41,61, 81 y 101. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s de VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 22, 42, 62, 82 y 102. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s de VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 23, 43, 63, 83 y 103.
En determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden tener las secuencias de cadena pesada y ligera de Fab FF1 o FF3.
En una realización preferida, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a LOX-1 es Fab FF1 o FF3.
Como se utiliza en esta memoria, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena ligera o pesada o cadenas ligeras o pesadas de longitud completa que son "el producto de" o se "derivan de" una secuencia de línea germinal particular si se obtienen las regiones variables o cadenas de longitud completa del anticuerpo. de un sistema que utiliza genes de inmunoglobulina de línea germinal humana. Sistemas de este tipo incluyen inmunizar un ratón transgénico que lleva genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o rastrear una genoteca de inmunoglobulina humana presentada en fagos con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o se "deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana puede identificarse como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la línea germinal humana y seleccionando la inmunoglobulina de la línea germinal humana. secuencia que está más cerca en secuencia (es decir, mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano.
Un anticuerpo humano que es "el producto de" o se "deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de la línea germinal, debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas que se producen de forma natural o la introducción intencionada de mutaciones dirigidas al sitio. Sin embargo, en las regiones marco de VH o VL, un anticuerpo humano seleccionado es típicamente al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de línea germinal humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican al anticuerpo humano como humano. en comparación con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (p. ej., secuencias de la línea germinal murina). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 60%, 70%, 80%, 90% o al menos 95%, o incluso al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntico en la secuencia de aminoácidos. a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.
Típicamente, un anticuerpo humano recombinante no mostrará más de 10 diferencias de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana en las regiones marco VH o VL. En determinados casos, el anticuerpo humano puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Ejemplos de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana incluyen, pero no se limitan a los fragmentos de línea germinal de dominio variable descritos más adelante, así como DP47 y DPK9.
Anticuerpos homólogos
En aún otra realización, la presente invención describe un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias descritas en la Tabla 1, y el anticuerpo se une a una proteína LOX-1 (p. ej., LOX-1 humano y de mono cynomolgus) y conserva las propiedades funcionales deseadas de esos anticuerpos descritos en la Tabla 1.
En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de longitud completa y/o de cadena ligera de longitud completa pueden ser 50% 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias recogidas en la Tabla 1 para Fab FF1 y FF3. Un anticuerpo que tiene una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa que tiene una identidad alta (es decir, 80% o más) con las cadenas pesadas de longitud completa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 16 o 36, y cadenas ligeras de longitud completa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 26 o 46, pueden obtenerse mediante mutagénesis (p. ej., mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de este tipo, seguido de prueba del anticuerpo alterado codificado en cuanto a la función retenida utilizando los ensayos funcionales descritos en esta memoria.
En otras realizaciones, las secuencias de nucleótidos de cadena pesada de longitud completa y/o de cadena ligera de longitud completa pueden ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias recogidas en la Tabla 1 para Fab FF1 y FF3.
En otras realizaciones, las regiones variables de las secuencias de nucleótidos de la cadena pesada y/o las regiones variables de la cadena ligera pueden ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. idénticas a las secuencias recogidas en la Tabla 1 para Fab FF1 y FF3.
Tal como se utiliza en esta memoria, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias ( es decir, el % de identidad es igual al número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada uno de los huecos, que deben introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático, tal como se describe en los ejemplos no limitantes que figuran más adelante.
Adicional o alternativamente, las secuencias de proteínas de la presente invención pueden utilizarse, además, como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Por ejemplo, búsquedas de este tipo se pueden realizar utilizando el programa BLAST (versión 2.0) de Altschul, et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10.
Anticuerpos con Modificaciones Conservativas
En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención según se reivindica tiene una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, en donde una o más de estas secuencias de CDR tienen secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos descritos en esta memoria o modificaciones conservativas de los mismos, y en las que los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos de unión a LOX-1 de la invención.
En otras realizaciones, el anticuerpo de la invención está optimizado para la expresión en una célula de mamífero que tiene una secuencia de cadena pesada de longitud completa y una secuencia de cadena ligera de longitud completa, en donde una o más de estas secuencias tienen secuencias de aminoácidos específicas basadas en los anticuerpos descritos en esta memoria. o modificaciones conservativas de los mismos, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos que se unen a LOX-1 de la invención. Por consiguiente, la invención proporciona un anticuerpo aislado optimizado para la expresión en una célula de mamífero que consiste en una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa, en donde la cadena pesada de longitud completa tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOs: 16 o 36. y modificaciones conservativas de los mismos; y la cadena ligera de longitud completa tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NOs: 26 o 46, y modificaciones conservativas de las mismas; y el anticuerpo se une específicamente a LOX-1 (p. ej., LOX-1 humano y de mono cynomolgus).
Anticuerpos Diseñados y Modificados
Se puede preparar, además, un anticuerpo de la invención utilizando un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias de VH y/o VL mostradas en esta memoria como material de partida para diseñar un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas del anticuerpo de partida. Un anticuerpo puede diseñarse modificando uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir., VH y/o VL), por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones marco. Adicional o alternativamente, un anticuerpo puede diseñarse modificando residuos dentro de la región o las regiones constantes, por ejemplo, para alterar la función o funciones efectoras del anticuerpo.
Por consiguiente, una realización de la invención se refiere a anticuerpos de unión a LOX-1 aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 14 o 34, y que además comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 24 o 44.
Injerto de Dominios de Unión a Antígenos en Marcos o Armazones Alternativos
Puede emplearse una amplia diversidad de marcos o armazones de anticuerpos/inmunoglobulinas siempre que el polipéptido resultante incluya al menos una región de unión que se una específicamente a LOX-1. Marcos o armazones de este tipo incluyen los 5 idiotipos principales de inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de las mismas, e incluyen inmunoglobulinas de otras especies animales, preferiblemente que tienen aspectos humanizados. Los anticuerpos de cadena pesada sencilla, tales como los identificados en los camélidos, son de particular interés a este respecto. Los expertos en la técnica continúan descubriendo y desarrollando nuevos marcos, armazones y fragmentos.
En un aspecto, la invención pertenece a la generación de anticuerpos no basados en inmunoglobulinas utilizando armazones que no son de inmunoglobulina sobre los que se pueden injertar las CDRs de la invención. Pueden emplearse marcos y armazones no inmunoglobulina conocidos o futuros, siempre que comprendan una región de unión específica para la proteína LOX-1 diana. Los marcos o armazones no inmunoglobulina conocidos incluyen, pero no se limitan a fibronectina (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd., Cambridge, MA)., y Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), productos inmuno-farmacéuticos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicuerpos (Avidia, Inc., Mountain View, CA), Proteína A (Affibody AG, Suecia) y afilina (gamma-cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania).
Los armazones de fibronectina se basan en el dominio de fibronectina tipo III (p. ej., el décimo módulo de la fibronectina tipo III (dominio 10 Fn3)). El dominio de fibronectina tipo III tiene 7 u 8 cadenas beta que se distribuyen entre dos láminas beta, que se compactan entre sí para formar el núcleo de la proteína, y además contienen bucles (análogos a las CDRs) que conectan las cadenas beta entre sí. y están expuestos a disolventes. Hay al menos tres de bucles de este tipo en cada uno de los bordes del sándwich de láminas beta, en que el borde es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las cadenas beta (véase el documento US 6.818.418). Estos armazones basados en fibronectina no son una inmunoglobulina, aunque el pliegue general está estrechamente relacionado con el del fragmento de anticuerpo funcional más pequeño, la región variable de la cadena pesada, que comprende toda la unidad de reconocimiento de antígeno en IgG de camello y llama. Debido a esta estructura, el anticuerpo que no es inmunoglobulina imita las propiedades de unión al antígeno que son similares en naturaleza y afinidad a las de los anticuerpos. Estos armazones se pueden utilizar en una estrategia de aleatorización y transposición de bucles in vitro que es similar al proceso de maduración por afinidad de anticuerpos in vivo. Estas moléculas basadas en fibronectina se pueden utilizar como armazones en donde las regiones de bucle de la molécula se pueden reemplazar por CDRs de la invención utilizando técnicas de clonación estándar.
La tecnología de la anquirina se basa en el uso de proteínas con módulos repetidos derivados de la anquirina como armazones para portar regiones variables que se pueden utilizar para unirse a diferentes dianas. El módulo de repetición de anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos que consiste en dos hélices a antiparalelas y un giro p. La unión de las regiones variables se optimiza principalmente utilizando la presentación de ribosomas.
Los avímeros se derivan de proteínas que contienen dominio A natural, tales como LRP-1. Estos dominios se utilizan por naturaleza para interacciones proteína-proteína y en seres humanos más de 250 proteínas se basan estructuralmente en dominios A. Los avímeros consisten en un cierto número de monómeros de "dominio A" diferentes (2-10) enlazados mediante enlazadores de aminoácidos. Se pueden crear avímeros que se pueden unir al antígeno diana utilizando la metodología descrita, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE.UU. N°s 20040175756; 20050053973; 20050048512; y 20060008844.
Los ligandos de afinidad aficuerpo son proteínas pequeñas y simples compuestas de un haz de tres hélices basado en el armazón de uno de los dominios de unión a IgG de la Proteína A. La Proteína A es una proteína de superficie de la bacteria Staphylococcus aureus. Este dominio de armazón consiste en 58 aminoácidos, 13 de los cuales se distribuyen al azar para generar colecciones de aficuerpos con un gran número de variantes de ligando (Véase, p. ej., el documento US 5.831.012). Moléculas aficuerpos imitan a los anticuerpos, tienen un peso molecular de 6 kDa, en comparación con el peso molecular de anticuerpos, que es de 150 kDa. A pesar de su pequeño tamaño, el sitio de unión de las moléculas aficuerpo es similar al de un anticuerpo.
Las anticalinas son productos desarrollados por la compañía Pieris ProteoLab AG. Se derivan de lipocalinas, un grupo extendido de proteínas pequeñas y robustas que habitualmente están implicadas en el transporte o almacenamiento fisiológico de compuestos insolubles o químicamente sensibles. Varias lipocalinas naturales se producen en tejidos humanos o fluidos corporales. La arquitectura de la proteína recuerda a las inmunoglobulinas, con bucles hipervariables sobre la parte superior de un marco rígido. Sin embargo, a diferencia de los anticuerpos o sus fragmentos recombinantes, las lipocalinas están compuestas por una sola cadena polipeptídica con 160 a 180 residuos de aminoácidos, que son apenas más grandes que un solo dominio de inmunoglobulina. El conjunto de cuatro bucles, que forma el bolsillo de unión, muestra una plasticidad estructural pronunciada y tolera una diversidad de cadenas laterales. Por lo tanto, el sitio de unión se puede remodelar en un proceso patentado con el fin de reconocer moléculas diana prescritas de diferente forma con una alta afinidad y especificidad. Una proteína de la familia de las lipocalinas, la proteína de unión a bilina (BBP) de Pieris Brassicae, se ha utilizado para desarrollar anticalinas mutagenizando el conjunto de cuatro bucles. Un ejemplo de una solicitud de patente que describe anticalinas se encuentra en la Publicación PCT No. WO 199916873.
Las moléculas de afilina son pequeñas proteínas no inmunoglobulinas que están diseñadas para afinidades específicas hacia proteínas y moléculas pequeñas. Se pueden seleccionar muy rápidamente nuevas moléculas de afilina a partir de dos colecciones, cada una de las cuales se basa en una proteína de armazón de origen humano diferente. Las moléculas de afilina no muestran homología estructural alguna con las proteínas inmunoglobulina. Actualmente, se emplean dos armazones de afilina, uno de los cuales es cristalina gamma, una proteína estructural del cristalino del ojo humano y el otro es proteínas de la superfamilia "ubiquitina". Ambos armazones humanos son muy pequeños, muestran estabilidad a altas temperaturas y son casi resistentes a cambios de pH y agentes desnaturalizantes. Esta alta estabilidad se debe principalmente a la estructura de lámina beta expandida de las proteínas. En el documento WO200104144 se describen ejemplos de proteínas derivadas de cristalina gamma y en el documento WO2004106368 se describen ejemplos de proteínas "similares a ubiquitina".
Los miméticos de epítopos de proteínas (PEM) son moléculas de tamaño mediano, cíclicas, similares a péptidos (PM 1­ 2 kDa) que imitan las estructuras secundarias de las proteínas en forma de horquilla beta, la principal estructura secundaria implicada en las interacciones proteína-proteína.
La presente invención proporciona anticuerpos completamente humanos que se unen específicamente a la proteína LOX-1. En comparación con los anticuerpos quiméricos o humanizados, los anticuerpos de unión a LOX-1 humano de la invención tienen una antigenicidad más reducida cuando se administran a sujetos humanos.
Anticuerpos de camélidos
Las proteínas de anticuerpos obtenidas de miembros de la familia de los camellos y dromedarios (Camelus bactrianus y Camelus dromaderius), incluyendo los miembros del nuevo mundo, tales como especies de llamas (Lama paccos, Lama glama y Lama vicugna), se han caracterizado con respecto al tamaño, la complejidad estructural y la antigenicidad para sujetos humanos. Determinados anticuerpos IgG de esta familia de mamíferos que se encuentran en la naturaleza carecen de cadenas ligeras y, por lo tanto, son estructuralmente distintos de la estructura cuaternaria típica de cuatro cadenas que tiene dos cadenas pesadas y dos ligeras, para anticuerpos de otros animales. Véase el documento PCT/EP93/02214 (documento WO 94/04678 publicado el 3 de marzo de 1994).
Una región del anticuerpo de camélido, que es el pequeño dominio variable individual identificado como VHH, puede obtenerse mediante ingeniería genética para producir una proteína pequeña que tiene una alta afinidad por una diana, lo que da como resultado una proteína derivada de anticuerpos de bajo peso molecular conocida como un "nanocuerpo de camélido". Véase la patente de EE,UU. 5.759.808 expedida el 2 de junio de 1998; véase también Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; y Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Colecciones modificadas de anticuerpos de camélidos y fragmentos de anticuerpos están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Ablynx, Gante, Bélgica. Al igual que con otros anticuerpos de origen no humano, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de camélido se puede alterar de forma recombinante para obtener una secuencia que se asemeja más estrechamente a una secuencia humana, es decir, el nanocuerpo se puede "humanizar". Por lo tanto, la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de camélidos contra los seres humanos puede reducirse adicionalmente.
El nanocuerpo de camélido tiene un peso molecular de aproximadamente una décima parte del de una molécula de IgG humana, y la proteína tiene un diámetro físico de solo unos pocos nanómetros. Una consecuencia del pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos de camélidos de unirse a sitios antigénicos que son funcionalmente invisibles para proteínas de anticuerpos más grandes, es decir, los nanocuerpos de camélidos son útiles como reactivos para detectar antígenos que de otra manera serían crípticos, utilizando técnicas inmunológicas clásicas y como posibles agentes terapéuticos. Por lo tanto, aún otra consecuencia del tamaño pequeño es que un nanocuerpo de camélido puede inhibir como resultado de unirse a un sitio específico en un surco o hendidura estrecha de una proteína diana y, por lo tanto, puede servir en una capacidad que se asemeja más estrechamente a la función de un clásico. fármaco de bajo peso molecular que el de un anticuerpo clásico.
El bajo peso molecular y el tamaño compacto dan como resultado además nanocuerpos de camélidos sean extremadamente termoestables, estables a pH extremos y a la digestión proteolítica, y poco antigénicos. Otra consecuencia es que los nanocuerpos de camélidos se mueven fácilmente desde el sistema circulatorio a los tejidos, e incluso atraviesan la barrera hematoencefálica y pueden tratar trastornos que afectan al tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar adicionalmente el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la solicitud de patente de EE.UU. 20040161738 publicada el 19 de agosto de 2004. Estas características, combinadas con la baja antigenicidad para los seres humanos, indican un gran potencial terapéutico. Además, estas moléculas pueden expresarse completamente en células procarióticas tales como E. coli y se expresan como proteínas de fusión con bacteriófagos y son funcionales.
Por consiguiente, una característica de la presente invención es un anticuerpo o nanocuerpo de camélido que tiene una alta afinidad por LOX-1. En determinadas realizaciones de esta memoria, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se produce de forma natural en el animal camélido, es decir, se produce por parte del camélido después de la inmunización con LOX-1 o un fragmento peptídico del mismo, utilizando técnicas descritas en esta memoria para otros anticuerpos. Alternativamente, el nanocuerpo de camélido que se une a LOX-1 se modifica por ingeniería genética, es decir, se produce mediante selección, por ejemplo, de una fagoteca que exhiben proteínas de nanocuerpos de camélido mutagenizadas de manera apropiada utilizando procedimientos de cribado con LOX-1 como una diana como se describe en los ejemplos en esta memoria. Los nanocuerpos diseñados pueden personalizarse adicionalmente mediante ingeniería genética para que tengan una semivida en un sujeto receptor de 45 minutos a dos semanas. En una realización específica, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se obtiene injertando las secuencias de CDR de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos humanos de la invención en secuencias marco de anticuerpo de nanocuerpo o de dominio único, como se describe, por ejemplo, en el documento PCT/EP93/02214.
Moléculas Biespecíficas y Anticuerpos Multivalentes
En otro aspecto, la presente invención presenta moléculas biespecíficas o multiespecíficas que comprenden un anticuerpo de unión a LOX-1, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o regiones de unión a antígeno del mismo, pueden derivatizarse o enlazarse a otra molécula funcional, p. ej., otro péptido o proteína (p. ej., otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se una al menos a dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. De hecho, el anticuerpo de la invención puede derivatizarse o enlazarse a más de otra molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión diferentes y/o moléculas diana; también se pretende que dichas moléculas multi-específicas estén englobadas por la expresión "molécula biespecífica" tal como se utiliza en esta memoria. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención puede enlazarse funcionalmente (p. ej., mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de modo que resulte una molécula biespecífica.
Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para LOX-1 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo diana. Por ejemplo, el segundo epítopo diana es otro epítopo de LOX-1 diferente del primer epítopo diana.
Adicionalmente, para la invención en la que la molécula biespecífica es multi-específica, la molécula puede incluir, además, una tercera especificidad de unión, además del primer y segundo epítopo diana.
En una realización, las moléculas biespecíficas de la invención comprenden como especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluye, p. ej., un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o un Fv de cadena sencilla. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o una construcción de cadena sencilla tal como se describe en Ladner et al. Patente de EE.UU. N° 4.946.778.
Los diacuerpos son moléculas bivalentes, biespecíficas en las que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, conectados por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Los dominios VH y VL se emparejan con dominios complementarios de otra cadena, creando con ello dos sitios de unión al antígeno (véase, p. ej., Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123). Los diacuerpos se pueden producir expresando dos cadenas polipeptídicas con la estructura VHA-VLB y VHB-v La (configuración VH-VL), o VLA-VHB y VLB-VHA (configuración VL-VH) dentro de la misma célula. La mayoría de ellos se pueden expresar en forma soluble en bacterias. Los diacuerpos de cadena sencilla (scDb) se producen conectando las dos cadenas polipeptídicas formadoras de diacuerpos con un enlazador de aproximadamente 15 residuos de aminoácidos (véase Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1): 21-36). scDb puede expresarse en bacterias en forma monomérica activa soluble (véase Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun y Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21). Un diacuerpo puede fusionarse con Fc para generar un "di-diacuerpo" (véase Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65).
Otros anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas biespecíficas de la invención son anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.
Pueden prepararse moléculas biespecíficas conjugando las especificidades de unión de los constituyentes, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada una de las especificidades de unión de la molécula biespecífica puede generarse por separado y luego conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede utilizar una diversidad de agentes de acoplamiento o reticulación para la conjugación covalente. Ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-I-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase, p. ej., Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. N° 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), y Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de conjugación son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, estos pueden conjugarse mediante unión sulfhidrilo de las regiones de bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realización particular, la región de bisagra se modifica para que contenga un número impar de residuos sulfhidrilo, por ejemplo uno, antes de la conjugación.
Alternativamente, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de cadena sencilla. Métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Número 5.260.203; Patente de EE.Uu . Número 5.455.030; Patente de EE.UU. Número 4.881.175; Patente de EE.UU. Número 5.132.405; Patente de EE.UU. Número 5.091.513; Patente de EE.UU. Número 5.476.786; Patente de EE.UU. Número 5.013.653; Patente de EE.UU. Número 5.258.498; y patente de EE.UU. Número 5.482.858.
La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas se puede confirmar mediante, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (REA), análisis FACS, bioensayo (p. ej., inhibición del crecimiento) o ensayo de transferencia Western. Cada uno de estos ensayos detecta generalmente la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular empleando un reactivo marcado (p. ej., un anticuerpo) específico para el complejo de interés.
En otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos multivalentes que comprenden al menos dos porciones de unión a antígeno idénticas o diferentes de los anticuerpos de la invención que se unen a LOX-1. Las porciones de unión a antígeno pueden enlazarse mediante fusión de proteínas o enlace covalente o no covalente. Alternativamente, se han descrito métodos de enlace para las moléculas biespecíficas. Los compuestos tetravalentes pueden obtenerse, por ejemplo, reticulando anticuerpos de los anticuerpos de la invención con un anticuerpo que se une a las regiones constantes de los anticuerpos de la invención, por ejemplo, la región Fc o de bisagra.
Los dominios de trimerización se describen, por ejemplo, en la patente de Borean EP 1012 280B1. Los módulos de pentamerización se describen, por ejemplo, en el documento PCT/EP97/05897.
Anticuerpos con Semivida Prolongada
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la proteína LOX-1 que tienen una semivida prolongada in vivo.
Muchos factores pueden afectar la semivida de una proteína in vivo. Por ejemplo, la filtración renal, el metabolismo en el hígado, la degradación por enzimas proteolíticas (proteasas) y respuestas inmunogénicas (p. ej., neutralización de proteínas por anticuerpos y captación por macrófagos y células dendríticas). Puede utilizarse una diversidad de estrategias para extender la semivida de los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, mediante enlace químico con polietilenglicol (PEG), reCODE PEG, armazón de anticuerpos, ácido polisiálico (PSA), hidroxietil almidón (HES), ligandos de unión a albúmina y protectores de carbohidratos; por fusión genética a proteínas que se unen a proteínas del suero, tales como albúmina, IgG, FcRn y transferrina; mediante acoplamiento (genética o químicamente) a otros restos de unión que se unen a proteínas del suero, tales como nanocuerpos, Fabs, DARPins, avímeros, aficuerpos y anticalinas; por fusión genética con rPEG, albúmina, dominio de albúmina, proteínas de unión a albúmina y Fc; o por incorporación en nanoportadores, formulaciones de liberación lenta o dispositivos médicos.
Para prolongar la circulación sérica de anticuerpos in vivo, se pueden fijar moléculas poliméricas inertes, tales como PEG de alto peso molecular a los anticuerpos o un fragmento de los mismos con o sin un enlazador multifuncional, ya sea a través de la conjugación específica del sitio del PEG al extremo N o C de los anticuerpos o mediante grupos épsilonamino presentes en los residuos de lisina. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, se hace reaccionar típicamente con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG, bajo condiciones en las que uno o más grupos PEG se fijan al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero hidrosoluble reactivo análogo). Tal como se utiliza en esta memoria, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivatizar otras proteínas, tales como mono alcoxi- o ariloxi (C1-C10)-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Se utilizará la derivatización polimérica lineal o ramificada que dé como resultado una pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación se puede controlar estrechamente mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar la conjugación adecuada de moléculas de PEG con los anticuerpos. El PEG que no ha reaccionado puede separarse de los conjugados de anticuerpo-PEG por exclusión de tamaño o por cromatografía de intercambio iónico. Los anticuerpos derivatizados con PEG pueden testarse para determinar la actividad de unión así como la eficacia in vivo utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante inmunoensayos descritos en esta memoria. Métodos para pegilar proteínas se conocen en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, el documento EP 0 154316 de Nishimura et al. y el documento EP 0401 384 de Ishikawa et al.
Otras tecnologías de pegilación modificadas incluyen la reconstitución de la tecnología de ingeniería dirigida químicamente ortogonal (ReCODE PEG), que incorpora cadenas laterales químicamente especificadas en proteínas biosintéticas a través de un sistema reconstituido que incluye ARNt sintetasa y ARNt. Esta tecnología permite la incorporación de más de 30 nuevos aminoácidos en proteínas biosintéticas en E. coli, levaduras y células de mamífero. El ARNt incorpora un aminoácido no nativo en cualquier lugar en donde se posiciona un codón ámbar, convirtiendo el ámbar de un codón de parada en uno que señala la incorporación del aminoácido químicamente especificado.
La tecnología de pegilación recombinante (rPEG) también se puede utilizar para prolongar la semivida sérica. Esta tecnología implica fusionar genéticamente una cola de proteína no estructurada de 300-600 aminoácidos a una proteína farmacéutica existente. Debido a que el peso molecular aparente de una cadena de proteína no estructurada de este tipo es aproximadamente 15 veces mayor que su peso molecular real, la semivida en suero de la proteína aumenta grandemente. A diferencia de la PEGilación tradicional, que requiere conjugación química y repurificación, el procedimiento de fabricación se simplifica grandemente y el producto es homogéneo.
La polisialización es otra tecnología que utiliza el polímero natural ácido polisálico (PSA) para prolongar la vida activa y mejorar la estabilidad de péptidos y proteínas terapéuticos. El PSA es un polímero de ácido siálico (un azúcar). Cuando se usa para la administración de proteínas y péptidos terapéuticos, el ácido polisálico proporciona un microentorno protector en la conjugación. Esto aumenta la vida activa de la proteína terapéutica en la circulación y evita que sea reconocida por el sistema inmunológico. El polímero PSA se encuentra de forma natural en el cuerpo humano. Fue adoptado por determinadas bacterias que evolucionaron durante millones de años para cubrir sus paredes con él. Estas bacterias polisialiladas de forma natural pudieron, en virtud de la imitación molecular, frustrar el sistema de defensa del cuerpo. El PSA, la última tecnología sigilosa de la naturaleza, se puede producir fácilmente a partir de bacterias de este tipo en grandes cantidades y con características físicas predeterminadas. El PSA bacteriano es completamente no inmunogénico, incluso cuando está acoplado a proteínas, ya que es químicamente idéntico al PSA en el cuerpo humano.
Otra tecnología incluye el uso de derivados de hidroxietil almidón ("HES") enlazados a anticuerpos. HES es un polímero natural modificado derivado del almidón de maíz ceroso y puede ser metabolizado por las enzimas del cuerpo. Soluciones de HES se administran habitualmente para sustituir el volumen sanguíneo deficiente y mejorar las propiedades reológicas de la sangre. La hesilación de un anticuerpo permite la prolongación de la semivida en circulación al aumentar la estabilidad de la molécula, así como al reducir el aclaramiento renal, lo que resulta en un aumento de la actividad biológica. Variando diferentes parámetros, tales como el peso molecular de HES, se puede personalizar una amplia gama de conjugados de anticuerpos HES.
Anticuerpos que tienen una semivida incrementada in vivo también se pueden generar introduciendo una o más modificaciones de aminoácidos (es decir, sustituciones, inserciones o deleciones) en un dominio constante de IgG, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (preferiblemente un fragmento de dominio Fc o bisagra Fc). Véase, p. ej., la Publicación Internacional N° WO 98/23289; la Publicación Internacional N° WO 97/34631; y la Patente de e E.u U. N° 6.277.375.
Además, los anticuerpos pueden conjugarse con albúmina (p. ej., albúmina de suero humano; HSA) con el fin de hacer que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea más estable in vivo o tenga una semivida más larga in vivo. Las técnicas son bien conocidas en la técnica, véanse, p. ej., las Publicaciones Internacionales N°s WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y la Patente Europea N° EP 413,622. Además, en el contexto de un anticuerpo biespecífico como se describió arriba, las especificidades del anticuerpo se pueden diseñar de manera que un dominio de unión del anticuerpo se una a LOX-1 mientras que un segundo dominio de unión del anticuerpo se une a albúmina sérica, preferiblemente HSA.
Las estrategias para aumentar la semivida son especialmente útiles en nanocuerpos, aglutinantes basados en fibronectina y otros anticuerpos o proteínas para los que se desea aumentar la semivida in vivo..
Conjugados de Anticuerpos
La presente invención proporciona anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a una proteína LOX-1 fusionada de manera recombinante o conjugada químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento del mismo, preferiblemente a un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. En particular, la invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo descrito en esta memoria (>p. ej., un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab)2, un dominio VH, una CDR de VH, un v L dominio o una CDR de VL) y una proteína, polipéptido o péptido heterólogo. Se conocen en la técnica métodos para fusionar o conjugar proteínas, polipéptidos o péptidos con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. N°s 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851 y 5.112.946; las Patentes Europeas N°s EP 307,434 y EP 367,166; las Publicaciones Internacionales N°s WO 96/04388 y Wo 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; y Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341.
Pueden generarse proteínas de fusión adicionales mediante las técnicas de transposición de genes, transposición de motivos, transposición de exones y/o transposición de codones (a la que se alude colectivamente como "transposición de ADN"). La transposición de ADN se puede emplear para alterar las actividades de los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos (p. ej., anticuerpos o fragmentos de los mismos con afinidades más altas y tasas de disociación más bajas). Véanse, en general, las Patentes de EE.UU. N°s 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 y 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2): 76-82; Hansson y col., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, pueden alterarse sometiéndolos a mutagénesis aleatoria mediante PCR propensa a errores, inserción aleatoria de nucleótidos u otros métodos antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína LOX-1 puede recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tal como un péptido, para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a la etiqueta de hemaglutinina ("HA"), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37: 767), y la etiqueta "flag".
En otras realizaciones, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos están conjugados con un agente de diagnóstico o detectable. Anticuerpos de este tipo pueden ser útiles para controlar o pronosticar el inicio, desarrollo, la progresión y/o la gravedad de una enfermedad o trastorno como parte de un procedimiento de ensayo clínico tal como determinar la eficacia de una terapia particular. Un diagnóstico y una detección de este tipo se pueden realizar acoplando el anticuerpo a sustancias detectables que incluyen, pero no se limitan a diversas enzimas, tales como, pero sin limitarse a peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como, pero no limitados a estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no limitados a umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero no limitados a luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero no limitados a luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radiactivos, tales como, pero no limitados yodo (131I, 125I, 123I y 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In y 111In), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re,142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Tin; y metales emisores de positrones utilizando diversas tomografías por emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.
La presente invención abarca, además, usos de anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con un resto terapéutico. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con un resto terapéutico tal como una citotoxina, p.
ej., un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo, p. ej., emisores alfa. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células.
Además, un anticuerpo o un fragmento del mismo se puede conjugar con un resto terapéutico o resto de fármaco que modifica una respuesta biológica dada. Los restos terapéuticos o los restos de fármacos no deben interpretarse como limitados a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína, un péptido o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Proteínas de este tipo pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina del cólera o toxina diftérica; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, a-interferón, p-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno tisular, un agente apoptótico, un agente anti-angiogénico; o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfoquina.
Además, un anticuerpo se puede conjugar con restos terapéuticos tales como un ion metálico radiactivo, tal como emisores alfa, tal como 213Bi o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones de radiometales, que incluyen, pero no se limitan a 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm, a polipéptidos. En determinadas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-tetraacético (DOTA) que puede fijarse al anticuerpo mediante una molécula enlazadora. Moléculas enlazadoras de este tipo se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4 (10): 2483-90; Peterson y col., 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4): 553-7; y Zimmerman y col., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8): 943-50.
Las técnicas para conjugar restos terapéuticos con anticuerpos son bien conocidas, véase, p. ej., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs.
303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.
Los anticuerpos también pueden fijarse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno diana. Soportes sólidos de este tipo incluyen, pero no se limitan a vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno.
Métodos de Producir Anticuerpos de la Invención
Ácidos Nucleicos que Codifican los Anticuerpos
La invención proporciona moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas que codifican polipéptidos que comprenden segmentos o dominios de las cadenas de anticuerpos de unión a LOX-1 arriba descritas. Algunos de los ácidos nucleicos de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 14 o 34, y/o la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 24 o 44. En una realización específica, las moléculas de ácido nucleico son las identificadas en la Tabla 1 para FF1 y FF3. Algunas otras moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas (p. ej., al menos 65, 80%, 95% o 99%) a las secuencias de nucleótidos de las identificadas en la Tabla 1 para FF1 y FF3. Cuando se expresan a partir de vectores de expresión apropiados, los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos son capaces de exhibir capacidad de unión al antígeno LOX-1.
También se proporcionan en la invención polinucleótidos que codifican al menos una región CDR y habitualmente las tres regiones CDR de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de unión a LOX-1 arriba recogido. Algunos otros polinucleótidos codifican toda o sustancialmente toda la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo de unión a LOX-1 arriba recogido. Debido a la degeneración del código, una diversidad de secuencias de ácidos nucleicos codificará cada una de las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden codificar tanto una región variable como una región constante del anticuerpo. Algunas de las secuencias de ácido nucleico de la invención comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de cadena pesada que es sustancialmente idéntica (p. ej., al menos 80%, 90% o 99%) a la secuencia de cadena pesada recogida en SEQ ID NO: 16 o 36. Algunas otras secuencias de ácido nucleico que comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de cadena ligera que es sustancialmente idéntica (p. ej., al menos 80%, 90% o 99%) a la secuencia de cadena ligera recogida en SEQ ID NO: 26 o 46.
Las secuencias de polinucleótidos pueden producirse mediante síntesis de ADN en fase sólida de novo o mediante mutagénesis por PCR de una secuencia existente (p. ej., secuencias como se describen en los Ejemplos que figuran más adelante) que codifican un anticuerpo de unión a LOX-1 o su fragmento de unión. La síntesis química directa de ácidos nucleicos se puede realizar mediante métodos conocidos en la técnica, tales como el método del fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90; el método del fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109, 1979; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859, 1981; y el método de soporte sólido de la patente de EE.UU. n° 4.458.066. La introducción de mutaciones en una secuencia de polinucleótidos mediante PCR se puede realizar como se describe, p. ej., en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; y Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.
También se proporcionan en la invención vectores de expresión y células huéspedes para producir los anticuerpos de unión a LOX-1 arriba descritos. Se pueden emplear diversos vectores de expresión para expresar los polinucleótidos que codifican las cadenas de anticuerpos de unión a LOX-1 o fragmentos de unión. Pueden utilizarse vectores de expresión tanto basados en virus como no virales para producir los anticuerpos en una célula huésped de mamífero. Los vectores y sistemas no virales incluyen plásmidos, vectores episomales, típicamente con un casete de expresión para expresar una proteína o ARN, y cromosomas artificiales humanos (véase, p. ej., Harrington et al., Nat Genet 15: 345, 1997). Por ejemplo, vectores no virales útiles para la expresión de los polinucleótidos y polipéptidos de unión a LOX-1 en células de mamíferos (p. ej., humanas) incluyen pThioHis A, B y C, pcDNA3.1 / His, pEBVHis A, B y C, (Invitrogen, San Diego, CA), vectores MPSV y numerosos otros vectores conocidos en la técnica para expresar otras proteínas. Vectores virales útiles incluyen vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes, vectores basados en SV40, virus del papiloma, virus HBP Epstein Barr, vectores del virus vaccinia y virus Semliki Forest (SFV). Véase, Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; y Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.
La elección del vector de expresión depende de las células huéspedes previstas en las que se ha de expresar el vector. Típicamente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (p. ej., potenciadores) que están enlazadas operativamente a los polinucleótidos que codifican una cadena o fragmento de anticuerpo que se une a LOX-1. En algunas realizaciones, se emplea un promotor inducible para prevenir la expresión de secuencias insertadas excepto en condiciones de inducción. Promotores inducibles incluyen, p. ej., arabinosa, lacZ, promotor de metalotioneína o un promotor de choque térmico. Los cultivos de organismos transformados se pueden expandir en condiciones no inductoras sin sesgar la población para codificar secuencias cuyos productos de expresión son mejor tolerados por las células huéspedes. Además de los promotores, también se pueden requerir o desear otros elementos reguladores para la expresión eficaz de una cadena o fragmento de anticuerpo que se une a LOX-1. Estos elementos incluyen típicamente un codón de iniciación ATG y un sitio de unión de ribosoma adyacente u otras secuencias. Además, la eficacia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véase, p. ej., Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; y Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por ejemplo, el potenciador de SV40 o potenciador de CMV puede utilizarse para aumentar la expresión en células huéspedes de mamífero.
Los vectores de expresión también pueden proporcionar una posición de secuencia señal de secreción para formar una proteína de fusión con polipéptidos codificados por secuencias de anticuerpos de unión a LOX-1 insertadas. Más a menudo, las secuencias de anticuerpos de unión a LOX-1 insertadas se enlazan a secuencias señal antes de su inclusión en el vector. Los vectores a utilizar para recibir secuencias que codifican los dominios variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo de unión a LOX-1 a veces también codifican regiones constantes o partes de las mismas. Vectores de este tipo permiten la expresión de las regiones variables como proteínas de fusión con las regiones constantes, conduciendo con ello a la producción de anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos. Típicamente, estas regiones constantes son humanas.
Las células huéspedes para albergar y expresar las cadenas de anticuerpos que se unen a LOX-1 pueden ser procarióticas o eucarióticas. E. coli es un huésped procariótico útil para clonar y expresar los polinucleótidos de la presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para su uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriáceas, tales como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procarióticos, también se pueden hacer vectores de expresión, que típicamente contienen secuencias de control de la expresión compatibles con la célula huésped (p. ej., un origen de replicación). Además, estará presente cualquier número de una diversidad de promotores bien conocidos, tales como el sistema de promotor de lactosa, un sistema de promotor de triptófano (trp), un sistema de promotor de beta-lactamasa o un sistema de promotor del fago lambda. Los promotores controlan típicamente la expresión, opcionalmente con una secuencia de operador, y tienen secuencias de sitios de unión a ribosomas y similares, para iniciar y completar la transcripción y traducción. También se pueden emplear otros microbios, tales como levaduras, para expresar polipéptidos de unión a lOX-1 de la invención. También se pueden utilizar células de insectos en combinación con vectores de baculovirus.
En algunas realizaciones preferidas, se utilizan células huéspedes de mamífero para expresar y producir los polipéptidos de unión a LOX-1 de la presente invención. Por ejemplo, pueden ser una línea celular de hibridoma que expresa genes de inmunoglobulina endógenos (p. ej., el clon de hibridoma de mieloma 1D6.C9 tal como se describe en los Ejemplos) o una línea celular de mamífero que alberga un vector de expresión exógeno (p. ej., células de mieloma SP2 / 0 ejemplificadas más adelante). Estos incluyen cualquier célula animal o humana mortal normal o inmortal normal o anormal. Por ejemplo, se ha desarrollado un cierto número de líneas de células huéspedes adecuadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas, incluidas las líneas de células CHO, diversas líneas de células Cos, células HeLa, líneas de células de mieloma, células B transformadas e hibridomas. El uso de cultivo de células de tejido de mamíferos para expresar polipéptidos se comenta generalmente en, p. ej., Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, NY, NY, 1987. Los vectores de expresión para células huéspedes de mamíferos pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (véase, p. ej., Queen, et al., Immunol. Rev.89: 49-68, 1986), y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión de ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Estos vectores de expresión contienen habitualmente promotores derivados de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos para el tipo de célula, específicos para la etapa y/o modulables o regulables. Promotores útiles incluyen, pero no se limitan a el promotor de metalotioneína, el promotor tardío principal de adenovirus constitutivo, el promotor de MMTV inducible por dexametasona, el promotor de SV40, el promotor de MRP pollll, el promotor de MPSV constitutivo, el promotor de CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor humano inmediato-temprano de CMV), el promotor constitutivo de CMV y combinaciones de promotor-potenciador conocidas en la técnica.
Métodos para introducir vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procarióticas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación se pueden utilizar para otros huéspedes celulares. (Véase generalmente Sambrook, et al., supra). Otros métodos incluyen, p. ej., electroporación, tratamiento con fosfato de calcio, transformación mediada por liposomas, inyección y microinyección, métodos balísticos, virosomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, fusión con la proteína estructural del virus del herpes VP22 (Elliot y O'Hare, Cell 88: 223, 1997), captación de ADN potenciada por agentes y transducción ex vivo. Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, a menudo se deseará una expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable cadenas de anticuerpos de unión a LOX-1 o fragmentos de unión pueden prepararse utilizando vectores de expresión de la invención que contienen orígenes virales de replicación o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, se puede permitir que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento de células que expresan con éxito las secuencias introducidas en medios selectivos. Las células resistentes, transfectadas de forma estable se pueden hacer proliferar utilizando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo de célula.
Generación de anticuerpos monoclonales de la Invención
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se pueden producir mediante una diversidad de técnicas, incluida la metodología de anticuerpos monoclonales convencional, p. ej., la técnica de hibridación de células somáticas estándar de Kohler y Milstein, 1975 Nature 256: 495. Se pueden emplear muchas técnicas para producir anticuerpos monoclonales, p. ej., la transformación viral u oncogénica de linfocitos B.
Sistemas animales para preparar hibridomas incluyen los sistemas murino, de rata y de conejo. La producción de hibridoma en el ratón es un proceso bien establecido. Protocolos de inmunización y técnicas para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la técnica. También se conocen participantes en la fusión (p. ej., células de mieloma murino) y procesos de fusión.
Anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención se pueden preparar basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se describió arriba. El ADN que codifica inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera puede obtenerse del hibridoma murino de interés y modificarse por ingeniería genética para que contenga secuencias de inmunoglobulinas no murinas (p. ej., humanas) utilizando técnicas estándares de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas se pueden enlazar a regiones constantes humanas utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 4.816.567 expedida a Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR murinas se pueden insertar en un marco humano utilizando métodos conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., la Patente de EE.u U. N° 5225539 expedida a Winter y las Patentes de EE.UU. N°s 5530101; 5585089; 5693762 y 6180370 expedidas a Queen et al.
En una determinada realización, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra LOX-1 se pueden generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunológico humano en lugar del sistema del ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones a los que se alude en esta memoria como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se les alude colectivamente en esta memoria como "ratones Ig humanos".
El HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contiene miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (|j y y) y k humana no reorganizadas, junto con mutaciones fijadas como objetivo que inactivan los loci endógenos de las cadenas j y k (véase, p. ej., Lonberg et al., 1994 Nature 368 (6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones exhiben una expresión reducida de IgM o k de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena ligera y pesada humana introducidos experimentan cambio de clase y mutación somática para generar IgGK monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg, N. et al., 1994 supra; revisado en Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. y Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 536-546). La preparación y el uso de ratones HuMAb, y las modificaciones genómicas que llevan ratones de este tipo, se describen adicionalmente en Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; y Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851. Véanse además, las Patentes de EE.UU. N°s 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas expedidas a Lonberg y Kay; Patente de EE.UU. N° 5.545.807 expedida a Surani et al.; Publicaciones PCT N°s WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas expedidas a Lonberg y Kay; y Publicación PCT N° WO 01/14424 expedida a Korman et al.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención se pueden generar utilizando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulinas humanas en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Ratones de este tipo, a los que se alude en esta memoria como "ratones KM", se describen en detalle en la Publicación PCT WO 02/43478 expedida a Ishida et al.
Además, en la técnica están disponibles sistemas animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y pueden utilizarse para generar anticuerpos de unión a LOX-1 de la invención. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema transgénico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.). Ratones de este tipo se describen, p. ej., en las Patentes de EE.UU. N°s 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 expedidas a Kucherlapati et al.
Además, en la técnica están disponibles sistemas animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y pueden utilizarse para generar anticuerpos de unión a LOX-1 de la invención. Por ejemplo, pueden utilizarse ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada humano como un transcromosoma de cadena ligera humano, a los que se alude como "ratones TC"; ratones de este tipo se describen en Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Además, se han descrito en la técnica vacas que portan transcromosomas humanos de cadena pesada y ligera (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20: 889-894) y se pueden utilizar para generar anticuerpos de unión a LOX-1 de la invención.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar utilizando métodos de presentación en fagos para rastrear genotecas de inmunoglobulina humana. Métodos de presentación en fagos de este tipo para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica o se describen en los ejemplos que figuran más adelante. Véase, por ejemplo: las Patentes de EE.UU. N°s 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 expedidas a Ladner et al ; Patentes de EE.UU. N°s 5.427.908 y 5.580.717 expedidas a Dower et al.; Patentes de EE.UU. N°s 5.969.108 y 6.172.197 expedidas a McCafferty et al.; y Patentes de EE.UU. N°s 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 expedidas a Griffiths et al.
Anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar utilizando ratones SCID en los que se han reconstituido células inmunes humanas de manera que se pueda generar una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Ratones de este tipo se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. N° 5.476.996 y 5.698.767 expedidas a Wilson et al.
Ingeniería de marco o Fc
Los anticuerpos modificados genéticamente de la invención incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en los residuos de marco dentro de VH y/o VL, p. ej., para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente, modificaciones del marco de este tipo se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque consiste en "retromutar" uno o más residuos del marco a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener residuos del marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que se deriva el anticuerpo. Residuos de este tipo se pueden identificar comparando las secuencias del marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de las que se deriva el anticuerpo. Para devolver las secuencias de la región de marco a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas pueden "retromutarse" a la secuencia de la línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio. También se pretende que anticuerpos "retromutados" de este tipo estén incluidos en la invención.
Otro tipo de modificación del marco implica la mutación de uno o más residuos dentro de la región del marco, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar los epítopos de las células T y reducir con ello la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. A este enfoque también se le alude como "desinmunización" y se describe con más detalle en la Publicación de Patente de EE.UU. N° 20030153043 expedida a Carr et al.
Además o como alternativa a las modificaciones realizadas dentro del marco o las regiones CDR, los anticuerpos de la invención pueden diseñarse para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor Fc y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (p. ej., pueden fijarse uno o más restos químicos al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle más adelante. La numeración de residuos en la región Fc es la del índice UE de Kabat.
En una realización, la región de bisagra de CH1 se modifica de manera que el número de residuos de cisteína en la región de bisagra se altera, p. ej., aumenta o disminuye. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de EE.UU. N° 5.677.425 expedida a Bodmer et al. El número de residuos de cisteína en la región de bisagra de CH1 se modifica para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otra realización, la región de bisagra Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra Fc de manera que el anticuerpo tiene la unión de proteína A de estafilococilo (SpA) alterada con respecto a la unión de SpA del dominio de bisagra Fc nativo. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de EE.UU. N° 6.165.745 expedida a Ward et al.
En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles diversos enfoques. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de EE.UU. N° 6.277.375 expedida a Ward. Alternativamente, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de unión al receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, tal como se describe en las Patentes de EE.UU. N°s 5.869.046 y 6.121.022 expedidas a Presta et al.
En aún otras realizaciones, la región Fc se altera reemplazando al menos un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos se pueden reemplazar por un residuo de aminoácido diferente, de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero conserve la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo precursor. El ligando efector al que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con más detalle en las Patentes de EE.UU. N°s 5.624.821 y 5.648.260, ambas expedidas a Winter et al.
En otra realización, uno o más aminoácidos seleccionados de residuos de aminoácidos pueden reemplazarse por un residuo de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga la unión de C1q alterada y/o reduzca o elimine la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de EE.UU. N° 6.194.551 de Idusogie et al.
En otra realización, se alteran uno o más residuos de aminoácidos para alterar con ello la capacidad del anticuerpo DE fijar el complemento. Este enfoque se describe con más detalle en la Publicación PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.
En aún otra realización, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos. Este enfoque se describe con más detalle en la Publicación PCT WO 00/42072 de Presta. Además, se han mapeado los sitios de unión en IgG1 humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem. 276: 6591-6604).
En aún otra realización, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el "antígeno". Modificaciones de carbohidratos de este tipo se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación del marco de la región variable para eliminar con ello la glicosilación en ese sitio. Una aglicosilación de este tipo puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Un enfoque de este tipo se describe con más detalle en las Patentes de EE.UU. N°s 5.714.350 y 6.350.861 de Co et al.
Adicional o alternativamente, se puede preparar un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tenga estructuras de GlcNac bisectantes aumentadas. Se ha demostrado que patrones de glicosilación alterados de este tipo aumentan la capacidad ADCC de los anticuerpos. Modificaciones de carbohidratos de este tipo pueden lograrse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con maquinaria de glicosilación alterada. Se han descrito en la técnica células con maquinaria de glicosilación alterada y se pueden utilizar como células huésped en las que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir con ello un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 de Hang et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transferasa, de modo que los anticuerpos expresados en dicha línea celular exhiben hipofucosilación. La Publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea celular CHO variante, células Lecl3, con capacidad reducida para fijar fucosa a carbohidratos enlazados a Asn(297), lo que también da como resultado la hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277: 26733­ 26740). La Publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. describe líneas celulares diseñadas para expresar glucosiltransferasas modificadoras de glicoproteínas (p. ej., beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas por ingeniería exhiben estructuras GlcNac bisectantes aumentadas que dan como resultado una actividad ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180).
Métodos de Modificar por Ingeniería Genética Anticuerpos Alterados
Como se comentó arriba, los anticuerpos de unión a LOX-1 que tienen secuencias VH y VL o secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa mostradas en esta memoria se pueden utilizar para crear nuevos anticuerpos de unión a LOX-1 modificando secuencias de cadena pesada y/o de cadena ligera de longitud completa., secuencias VH y/o VL, o la región o regiones constantes fijadas a las mismas. Por lo tanto, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo de unión a LOX-1 de la invención se utilizan para crear anticuerpos de unión a LOX-1 estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tales como unión a LOX-1 humano y también inhibiendo una o más propiedades funcionales de LOX-1 (p. ej., inhiben la unión de LOX-1 al receptor de LOX-1, inhiben la proliferación celular dependiente de LOX-1).
Por ejemplo, una o más regiones CDR de los anticuerpos de la presente invención, o mutaciones de los mismos, se pueden combinar de manera recombinante con regiones marco conocidas y/u otras CDRs para crear anticuerpos de unión a LOX-1 adicionales, modificados por ingeniería recombinante, tal como se comentó. Arriba. Otros tipos de modificaciones incluyen las descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de modificación por ingeniería genética es una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en esta memoria, o una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo modificado por ingeniería genética, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o Vl proporcionadas en esta memoria, o una o más regiones CDR de las mismas. Más bien, la información contenida en la secuencia o secuencias se utiliza como el material de partida para crear una secuencia o secuencias de "segunda generación" derivadas de la secuencia o secuencias originales y, a continuación, se prepara la secuencia o secuencias de "segunda generación" y se expresa o expresan como una proteína.
Por consiguiente, en otra realización, la invención proporciona un método para preparar un anticuerpo de unión a LOX-1 optimizado para la expresión en una célula de mamífero que consiste en: una secuencia de anticuerpo de cadena pesada de longitud completa que tiene una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NOs: 16 o 36; y una secuencia de anticuerpo de cadena ligera de longitud completa que tiene una secuencia seleccionada del grupo de 26 o 46; alterar al menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de cadena pesada de longitud completa y/o la secuencia de anticuerpo de cadena ligera de longitud completa para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia del anticuerpo alterada como una proteína. En una realización, la alteración de la cadena pesada o ligera está en la región de marco de la cadena pesada o ligera.
La secuencia de anticuerpos alterada también se puede preparar rastreando colecciones de anticuerpos que tienen secuencias de CDR3 fijas o determinantes de unión esenciales mínimos tal como se describe en el documento US2005/0255552 y diversidad en secuencias de CDR1 y CDR2. El rastreo se puede realizar de acuerdo con cualquier tecnología de rastreo apropiada para rastrear anticuerpos de colecciones de anticuerpos tales como la tecnología de presentación en fagos.
Pueden utilizarse técnicas estándares de biología molecular para preparar y expresar la secuencia de anticuerpos alterados. El anticuerpo codificado por la o las secuencias de anticuerpos alterados es uno que retiene una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos de unión a LOX-1 descritos en esta memoria, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a la unión específica a LOX-1 humano, de cynomolgus, rata y/o ratón; y el anticuerpo inhibe la proliferación de células dependiente de LOX-1 en un ensayo de proliferación de células F36E y/o Ba/F3-LOX-1 R.
En determinadas realizaciones de los métodos de modificar por ingeniería genética anticuerpos de la invención, las mutaciones pueden introducirse de forma aleatoria o selectiva a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de anticuerpo de unión a LOX-1 y los anticuerpos de unión a LOX-1 modificados resultantes se pueden rastrear para determinar la actividad de unión. y/u otras propiedades funcionales tal como se describe en esta memoria. Se han descrito en la técnica métodos mutacionales. Por ejemplo, la Publicación PCT WO 02/092780 de Short describe métodos para crear y rastrear mutaciones de anticuerpos utilizando mutagénesis de saturación, ensamblaje de ligamiento sintético o una combinación de los mismos. Alternativamente, la publicación PCT WO 03/074679 de Lazar et al. describe métodos de uso de métodos de rastreo computacional para optimizar las propiedades fisico-químicas de los anticuerpos.
En determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos se han diseñado para eliminar los sitios de desamidación. Se sabe que la desamidación provoca cambios estructurales y funcionales en un péptido o proteína. La desamidación puede provocar una disminución de la bioactividad, así como alteraciones en la farmacocinética y antigenicidad de la proteína farmacéutica. (Anal Chem. 1 de marzo de 2005;77(5): 1432-9).
En determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos han sido modificados por ingeniería genética para aumentar pl y mejorar sus propiedades similares a fármacos. El pl de una proteína es un determinante clave de las propiedades biofísicas generales de una molécula. Se sabe que los anticuerpos que tienen pls bajos son menos solubles, menos estables y son propensos a la agregación. Además, la purificación de anticuerpos con pl bajo es un desafío y puede ser problemática, especialmente durante la ampliación para uso clínico. El aumento del pl de los anticuerpos anti-LOX-1, o Fabs, de la invención mejoró su solubilidad, permitiendo formular los anticuerpos a concentraciones más altas (> 100 mg/ml). La formulación de los anticuerpos a altas concentraciones (p. ej., > 100 mg/ml) ofrece la ventaja de poder administrar dosis más altas de los anticuerpos en los ojos de los pacientes mediante inyecciones intravítreas, lo que a su vez puede permitir una frecuencia de dosificación reducida, una ventaja significativa para el tratamiento. de enfermedades crónicas, incluyendo trastornos cardiovasculares. Los pls más altos también pueden aumentar el reciclaje mediado por FcRn de la versión IgG del anticuerpo, permitiendo así que el fármaco persista en el cuerpo durante más tiempo, requiriendo menos inyecciones. Finalmente, la estabilidad general de los anticuerpos se mejora significativamente debido a que el pl más alto da como resultado una vida útil más prolongada y una bioactividad in vivo. Preferiblemente, el pl es mayor que o igual a 8,2.
Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden evaluarse utilizando ensayos estándares disponibles en la técnica y/o descritos en esta memoria, tales como los recogidos en los Ejemplos (p. ej., ELISAs).
Usos Profilácticos y Terapéuticos
Los anticuerpos que se unen a LOX-1 como se describe en esta memoria se pueden utilizar en una concentración terapéuticamente útil para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con niveles y/o actividad de LOX-1 incrementados administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención. La presente invención describe un método para tratar trastornos cardiovasculares asociados a LOX-1 administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de los anticuerpos de la invención. La presente invención describe un método para tratar trastornos cardiovasculares asociados a LOX-1 administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de los anticuerpos de la invención.
Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar, inter alia, para tratar, prevenir y mejorar afecciones o trastornos asociados con LOX-1, que incluyen, pero no se limitan a aterosclerosis, infarto de miocardio, claudicación (p. ej., claudicación intermitente, Claudicación de Rutherford Clase II/III), enfermedad arterial periférica (PAD), angina (p. ej., angina refractaria), enfermedad arterial coronaria (CAD) (p. ej., debido a aterosclerosis de las arterias que alimentan el corazón) y apoplejía.
El tratamiento y/o la prevención de trastornos cardiovasculares, p. ej., trastornos cardiovasculares asociados a LOX-1, pueden ser determinados por un profesional de la salud utilizando medidas clínicamente relevantes de la función vascular. El tratamiento de trastornos cardiovasculares asociados a LOX-1 significa cualquier acción (p. ej., la administración de un anticuerpo anti-LOX-1 descrito en esta memoria) que da como resultado, o se contempla que resulte en la mejora o preservación de la función vascular, la anatomía vascular y/o parámetros hemodinámicos. Además, la prevención en lo que se refiere a afecciones o trastornos asociados con trastornos cardiovasculares significa cualquier acción (p. ej., la administración de un anticuerpo anti-LOX-1 descrito en esta memoria) que previene o ralentiza un empeoramiento de la función vascular y/o un parámetro de trastornos cardiovasculares, tal como se define en esta memoria, en un paciente con riesgo de dicho empeoramiento.
Como los niveles de oxLDL y LOX-1 soluble aumentan en la angina estable y los síndromes isquémicos agudos, se espera que los anticuerpos anti-LOX-1 de la invención inhiban el estrés oxidativo vascular, reduzcan la isquemia miocárdica y mejoren la angina y la tolerancia al ejercicio; dichos anticuerpos tienen el potencial de convertirse en el primer tratamiento antianginoso modificador de la enfermedad disponible.
La eficacia de dicha administración terapéutica puede medirse mediante una evaluación en serie de la frecuencia y duración de eventos isquémicos transitorios (control del ECG ambulatoria) y angina (cuestionario de angina de Seattle), y pruebas de tolerancia al ejercicio en serie con opción de formación de imágenes de perfusión. La eficacia también se puede medir mediante el uso de biomarcadores tales como oxLDL plasmática, LOX-1 soluble y biomarcadores de estrés oxidativo (F2-isoprostanos, dialdehído malónico, mieloperoxidasa).
"Claudicación", tal como se utiliza en esta memoria, incluye claudicación severa y otros términos similares, y describe un impedimento de movilidad y una gran necesidad médica insatisfecha. La claudicación es una afección caracterizada por isquemia de las extremidades inferiores, que causa fatiga muscular, dolor de esfuerzo que se alivia con el reposo, movilidad limitada y calidad de vida reducida, y es causada por aterosclerosis y vasodilatación dependiente del endotelio anormal (p. ej., alterada). Su prevalencia en los EE.UU. es de 8-12 millones de pacientes. Entre los pacientes con claudicación intermitente, el 7% se someterá a una cirugía de baipás de las extremidades inferiores, el 4% requerirá amputaciones mayores y el 16% desarrollará un empeoramiento de la claudicación. Eventos cardiovasculares, tales como el infarto de miocardio y la apoplejía, ocurren en el 20% de los pacientes con claudicación severa a lo largo de 5 años. La terapia actual es quirúrgica y el tratamiento por medios menos invasivos, tales como la administración de los anticuerpos anti-LOX-1 de la invención, representaría un enorme avance terapéutico.
La eficacia de dicha administración terapéutica puede medirse mediante una evaluación en serie de la claudicación inducida por el ejercicio (flexión plantar y cinta rodante), con criterios de valoración que incluyen el tiempo hasta el inicio del dolor, la duración del ejercicio y la distancia caminada. La eficacia también se puede medir mediante el uso de biomarcadores mecánicos tales como oxLDL plasmática y LOX-1 soluble; biomarcadores de estrés oxidativo (F2-isoprostanos, dialdehído malónico, mieloperoxidasa); cambios inducidos por el ejercicio en el flujo de las extremidades inferiores y la saturación de O2 muscular.
Otra gran necesidad médica no satisfecha para la cual los anticuerpos anti-LOX-1 de la invención serían terapéuticamente útiles es la angina refractaria. La angina reaparece en sujetos afectados a pesar del tratamiento médico óptimo (p. ej., administración de beta-bloqueantes de acción prolongada, nitratos y bloqueadores de los canales de calcio), sin opción de revascularización. Angina refractaria es una afección marcada por dolor en el pecho debido a isquemia del músculo cardíaco, generalmente debido a obstrucción o espasmo de las arterias coronarias (p. ej., por enfermedad de las arterias coronarias), con síntomas debilitantes, actividad física muy limitada y mala calidad de vida. Los 1-1,8 millones de pacientes que padecen angina refractaria en los EE.UU. experimentan un aumento de la mortalidad cardiovascular a una tasa del 10% al año; al menos 100.000 nuevos casos de angina refractaria surgen al año.
Los anticuerpos de la invención también se pueden utilizar en combinación con otros agentes para la prevención, el tratamiento o la mejora de los trastornos asociados con LOX-1. Por ejemplo, pueden usarse terapias con estatinas en combinación con los anticuerpos LOX-1 y los fragmentos de unión a antígeno de la invención para el tratamiento de pacientes con trastornos cardiovasculares.
Composiciones Farmacéuticas
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de unión a LOX-1 (fragmentos intactos o de unión) formulados junto con un soporte farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener adicionalmente uno o más de otros agentes terapéuticos que sean adecuados para tratar o prevenir, por ejemplo, trastornos cardiovasculares. Soportes farmacéuticamente aceptables potencian o estabilizan la composición, o pueden utilizarse para facilitar la preparación de la composición. Soportes farmacéuticamente aceptables incluyen disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles.
Una composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. La vía y/o el modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados. Se prefiere que la administración sea intravítrea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, o se administre proximal al sitio de la diana. El soporte farmacéuticamente aceptable debe ser adecuado para la administración intravítrea, intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (p. ej., mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, la molécula biespecífica y multiespecífica, puede recubrirse con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
La composición debería ser estéril y fluida. Se puede mantener una fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes, tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar de acuerdo con métodos bien conocidos y puestos en práctica de forma rutinaria en la técnica. Véase, p. ej., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20a ed., 2000; y Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferiblemente en condiciones GMP. Típicamente, en las composiciones farmacéuticas de la invención se emplea una dosis terapéuticamente eficaz o una dosis eficaz del anticuerpo de unión a LOX-1. Los anticuerpos de unión a LOX-1 se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el soporte farmacéutico requerido.
Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado depende de una diversidad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, la sal o la amida de las mismas, la vía de administración, el momento de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, peso, el estado, la salud general y el historial médico previo del paciente que está siendo tratado, y factores similares.
Un médico o veterinario puede iniciar dosis de los anticuerpos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado. En general, dosis efectivas de las composiciones de la presente invención para el tratamiento de trastornos cardiovasculares descritos en esta memoria varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosis de tratamiento deben ajustarse para optimizar la seguridad y la eficacia. Para la administración sistémica con un anticuerpo, la dosificación varía de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 15 mg/kg, del peso corporal del huésped. Para la administración intravítrea con un anticuerpo, la dosificación puede variar de 0,1 mg/ojo a 5 mg/ojo. Por ejemplo, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,1 mg/ml, 1.2 mg/ml, 1,3 mg/ml, 1,4 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1,6 mg/ml, 1,7 mg/ml, 1,8 mg/ml, 1,9 mg/ml, 2,0 mg/ml, 2,1 mg/ml, 2,2 mg/ml, 2.3 mg/ml, 2,4 mg/ml, 2,5 mg/ml, 2,6 mg/ml, 2,7 mg/ml, 2,8 mg/ml, 2,9 mg/ml, 3,0 mg/ml, 3,1 mg/ml, 3,2 mg/ml, 3,3 mg/ml, 3.4 mg/ml, 3,5 mg/ml, 3,6 mg/ml, 3,7 mg/ml, 3,8 mg/ml, 3,9 mg/ml, 4,0 mg/ml, 4,1 mg/ml, 4,2 mg/ml, 4,3 mg/ml, 4,4 mg/ml, 4.5 mg/ml, 4,6 mg/ml, 4,7 mg/ml, 4,8 mg/ml, 4,9 mg/ml o 5,0 mg/ml. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración sistémica una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración sistémica una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses, o según sea necesario (PRN).
El anticuerpo se administra generalmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, como se indica midiendo los niveles en sangre del anticuerpo de unión a LOX-1 en el paciente. Además, un médico puede determinar intervalos de dosificación alternativos y administrarlos mensualmente o según sea necesario para que sean eficaces. En algunos métodos de administración sistémica, la dosificación se ajusta para lograr una concentración de anticuerpos en plasma de 1 a 1000 |jg/ml y en algunos métodos de 25 a 500 jg/ml. Alternativamente, el anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizados muestran una semivida más larga que la de los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o termina la progresión de la enfermedad, y preferiblemente hasta que el paciente muestra una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A partir de entonces, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.
Ejemplos
Los siguientes Ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la invención pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención resultarán fácilmente evidentes para un experto en la técnica y están abarcadas por las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1: Preparación de LOX-1 Soluble Humano Recombinante Purificado Para Uso como Antígeno
Una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular (residuos de aminoácidos 61-273) del polipéptido LOX-1 humano con péptido señal N-terminal de CD33 humano, etiqueta de purificación (EFHR) y secuencia de biotinilación BirA (GLNDIFEAQKIEWHE) (SEQ ID NO: 144) se subclonó en el vector de expresión de células de mamífero pRS5a. El plásmido resultante, pRS5a_APP-Avi-human-sLOX-1 (61-273), se transfectó transitoriamente en células HEK293T utilizando métodos de transfección de polietilenimina (PEI) estándares. Las células se propagaron en cultivo en suspensión en medio Novartis M11V3 (Bioconcept) y la transfección se llevó a cabo a una concentración celular final de 1,4 x 106 células/ml en 5 litros de medio utilizando un Biorreactor Wave.
Cinco horas después de la transfección, se añadieron 5 litros de medio exento de suero ExCell VPRO (Sigma). Las células fueron cultivadas a 37 °C y 5% de CO2 durante 10 días. A continuación, las células se recogieron mediante centrifugación, seguido de filtración con un filtro estéril de 0,22 micras. El sobrenadante clarificado se hizo pasar sobre 20 mL de una resina de afinidad anti-APP (propiedad de Novartis) equilibrada con PBS. La columna se lavó con PBS hasta que se alcanzó la absorbancia de referencia a 280 nm. Después, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de PBS que contenían Tritón X-100 al 1% y fosfato de tri-n-butilo al 0,3%, seguido de 25 volúmenes de columna de PBS. A continuación, la proteína sLOX-1 se eluyó con citrato de sodio 50 mM, pH 3,0, y las fracciones se neutralizaron con 1/10° volumen de Tris 1 M, pH 9,0. Las fracciones relevantes se combinaron y se dializaron exhaustivamente contra PBS, luego se dividieron en partes alícuotas y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. El análisis de tamaño analítico demostró que el material proteico LOX-1 soluble purificado tenía una forma dímera > 95%, que es la forma esperada de esta proteína.
Ejemplo 2: Preparación de Células HEK293 Transfectadas con LOX-1 Humano
Para testar la especificidad de unión y la actividad funcional de anticuerpos específicos anti-LOX1, se generaron células HEK293 que sobre-expresan de forma estable LOX-1 humano. Utilizando métodos estándares de transfección de Lipofectamine 2000, se transfectaron células HEK293-6E con un plásmido de expresión de mamífero que codificaba ADNc de LOX-1 humano de longitud completa y resistencia a higromicina. Los cultivos transfectados se evaluaron para determinar la expresión en superficie de LOX-1 mediante citometría de flujo el día tres después de la transfección y luego se sometieron a selección con higromicina (200 |jg/ml) para enriquecer las células que se expresan de manera estable. Las poblaciones clonales se obtuvieron mediante dos rondas secuenciales de dilución limitante y la expresión se confirmó mediante citometría de flujo. Sólo se seleccionaron los clones que mantenían una expresión estable de LOX-1 durante más de cuatro semanas en cultivo y se utilizaron en los ensayos de caracterización de anticuerpos posteriores.
Ejemplo 3: Preparación de Anticuerpos Monoclonales
La proteína LOX-1 humana recombinante se preparó internamente como se describe en el Ejemplo 1, y se utilizó como inmunógeno para la generación de clones de hibridoma anti-LOX-1. El antígeno LOX-1 en PBS se mezcló con un volumen igual de adyuvante de Freund para potenciar la respuesta inmune en ratones Balb/c. Se utilizó un adyuvante de Freund completo (Sigma F5881) para la primera inyección y un adyuvante de Freund incompleto (Sigma F5506) para las inmunizaciones posteriores.
Las inmunizaciones de animales y la recogida de muestras se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos estándares de uso en animales aprobados por IACUC. Brevemente, se inmunizaron ratones hembra Balb/c VAF a la edad de 5-6 semanas (Charles River Laboratories) con la emulsión de antígeno de proteína LOX-1 humana y adyuvante. Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea 4 veces con aproximadamente 20 jg de proteína en 100 jL de la mezcla de antígenoadyuvante por animal. Las inyecciones se realizaron cada 2-3 semanas para desarrollar respuestas inmunes en los animales. Tres días antes de la fusión celular para la generación del hibridoma, los ratones fueron reforzados intraperitonealmente una vez más con la misma dosis de antígeno LOX-1 mezclado con adyuvante incompleto de Freund, y fueron sacrificados para la recolección del bazo en condiciones quirúrgicas esterilizadas el día de la fusión celular.
Los bazos de los ratones inmunizados se trituraron entre dos portaobjetos microscópicos esterilizados y esmerilados para prepararlos para la suspensión de células individuales en medio RPMl-1640. Las células del bazo se sedimentaron y se lavaron dos veces con medio RPMI-1640. Para que las fusiones celulares generen clones de hibridoma, los esplenocitos se mezclaron y fusionaron con células de mieloma murino P3X63Ag8.653 (Kearney J.F. et al., 1979. J. Immunol., 123: 1548-1550) utilizando polietilenglicol-1500 como fusógeno de acuerdo con protocolos de fusión estándar (Zhang C. 2012. Methods Mol. Biol. 901: 117-135). Después de las fusiones celulares y la centrifugación, las células se suspendieron en medio RPMI-1640 completo (200 mL/bazo) que contenía complemento de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma H-0262) y se sembraron en placas de fondo plano de 96 pocillos (Corning-Costar 3596) a razón de 200 jL de suspensión celular por pocillo.
Después de la incubación a 37 °C, 5% de CO2 durante 3-4 días, se retiraron 100 jL de sobrenadante de cultivo de cada uno de los pocillos de las placas y se reemplazaron por un volumen igual de medio RPMI-1640 completo que contenía complemento de hipoxantina-timidina (HT) (Sigma H-0137). Las placas continuaron incubándose en una atmósfera de de 5% de CO2 a 37°C hasta que los clones de hibridoma habían desarrollado colonias suficientemente grandes para permitir la selección de anticuerpos.
Ejemplo 4: Rastreo de Hibridomas. Subclonación y Selección
En la semana 2 después de la fusión, cuando las células de hibridoma habían crecido hasta ser medio confluentes en los pocillos de la placa y el sobrenadante había cambiado a un color naranja, se tomaron muestras de los sobrenadantes de hibridoma de las placas para el rastreo de anticuerpos mediante inmunoensayos, tales como citometría de flujo de inmunofluorescencia para antígenos de LOX-1 basados en células o ELISA para el antígeno de la proteína LOX-1. Para el rastreo primario, los sobrenadantes de hibridoma se testaron mediante citometría de flujo utilizando células 293-6E transfectadas con LOX-1 frente a células no transfectadas. Brevemente, las células 293-6E transfectadas con LOX-1 humano, o las células no transfectadas, se incubaron respectivamente con 50 jL de sobrenadante de hibridoma, seguido de marcaje con conjugado de IgG (H+L) anti-ratón de cabra con fragmento de fluoresceína AffiniPure Fab. (Jackson ImmunoResearch Laboratories), y se analizaron por citometría de flujo con Becton Dickinson FACSCalibur en un modo automático.
Mediante análisis de citometría de flujo, se identificaron y seleccionaron a partir de placas de fusión clones de hibridoma que reaccionaron con células 293-6E transfectadas con LOX-1 pero no con células no transfectadas. Los clones de hibridoma deseados se expandieron en placas T12 para su caracterización adicional. El clon de hibridoma de interés se subclonó limitando la dilución y recogiendo microscópicamente colonias individuales para lograr una población monoclonal que produzca un anticuerpo monoclonal específico para LOX-1. Los subclones de hibridoma seleccionados se expandieron en placas T12 y se congelaron para la criopreservación o se utilizaron para la producción de anticuerpos monoclonales. Los isotipos de anticuerpos monoclonales específicos derivados de clones de hibridoma se determinaron utilizando reactivos de isotipado disponibles comercialmente.
Sobre la base de los resultados del rastreo, se identificó un panel de 24 clones de hibridoma específicos de LOX-1 humano y se seleccionó a partir de la inmunización de ratones con antígeno LOX-1 humano. Uno de estos clones de hibridoma, el clon 39.1E2E10 (abreviado como E2E10, y denominado en esta mmeoria E2E10 o parental murino), produjo un anticuerpo monoclonal de IgG1 con una cadena ligera kappa y fue seleccionado como uno de los candidatos principales para la secuenciación de anticuerpos y humanización basada en sus propiedades de unión a LOX-1.
Ejemplo 5: Rastreo de Anticuerpos Monoclonales para la Inhibición de la Unión de OxLDL a LOX-1
Anticuerpos LOX-1 se purificaron a partir de sobrenadantes de hibridomas utilizando métodos estándares (p. ej., cromatografía de afinidad de Proteína A).
La proteína LOX-1 (61-273) soluble humana soluble en APP-Avi purificada, preparada como se describe en el Ejemplo 1, se biotiniló de la siguiente manera: proteína LOX-1 soluble purificada (8-10 mg) en tampón Bicine 50 mM pH 8,3 se incubó a una concentración de aproximadamente 1 mg/mL en presencia de ATP 10 mM, acetato de magnesio 10 mM, biotina 0,1 mM y biotina ligasa BirA (Avidity) a 30 °C durante 1 h y luego se colocó a 4 °C durante la noche. Después, la proteína se purificó usando una columna S200 Superdex 16/60 equilibrada con PBS. Las fracciones relevantes se agruparon y la proteína se concentró hasta una concentración de aproximadamente 1 mg/mL, se dividieron en partes alícuotas y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. El porcentaje de biotinilación se evaluó mediante mapeo de péptidos por espectrometría de masas de muestras no biotiniladas y biotiniladas. Típicamente, el rendimiento de biotinilación fue > 95% y no se detectó material no biotinilado. El análisis del tamaño analítico demostró que el material biotinilado tenía una forma dímera al 100%, que es la forma esperada de esta proteína.
La proteína LOX-1 soluble biotinilada se diluyó luego a una concentración de 2,5 |jg/mL en PBS y se añadieron 0,1 mL de esta solución a los pocillos de una placa de 96 pocillos de NeutrAvidin (número de catálogo de Pierce 15128), y la placa se incubó durante la noche. a 4 °C. La placa se lavó tres veces con PBS y luego se bloqueó añadiendo 0,3 mL por pocillo de Block Ace al 25% (número de catálogo de AbD Serotec BUF029) e incubando la placa a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación suave. La placa se lavó luego una vez con PBS. Se prepararon diluciones en serie de anticuerpos LOX-1 diluidos en BSA/PBS al 1% y se añadieron a la placa 0,1 mL de anticuerpos diluidos. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavó tres veces con PBS. A continuación, 0,1 mL de oxLDL (OxLDL de alta unión, número de catálogo de Kalen Biomedical 770212-7) se diluyeron en BSA/PBS al 1% hasta una concentración final de 2 ug/mL.
Para generar una curva estándar de oxLDL, se testaron diversas concentraciones de oxLDL en ausencia de anticuerpo LOX-1, utilizando una concentración máxima de 20 ug/mL de oxLDL. A continuación, la placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente y la placa se lavó luego tres veces con PBS. A continuación, se añadieron 0,1 mL/pocillo de anticuerpo anti-ApoB100 conjugado con HRP (The Binding Site, Inc., número de catálogo PP086) diluido 1:1000 en BSA/PBS al 1% y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. La placa se lavó 6 veces con PBS. A continuación, se añadió sustrato TMB 0,1 mL/pocillo y la placa se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se añadió solución de parada (ácido sulfúrico 2 N, 50 jL/pocillo) a cada uno de los pocillos y se midió la absorbancia óptica a 450 nm utilizando un lector de placas apropiado.
Ejemplo 6: Humanización de Anticuerpos Monoclonales
El anticuerpo monoclonal de ratón E2E10 fue Humaneered™ para acercar su secuencia de proteína a una secuencia de línea germinal humana y disminuir su inmunogenicidad. La tecnología Humaneering™ está disponible a través de KaloBios of South San Francisco. Antibody Humaneering™ genera anticuerpos humanos modificados por ingeniería genética con secuencias de la región V que tienen una alta homología con una secuencia de línea germinal humana, al tiempo que retienen la especificidad y afinidad del anticuerpo original o de referencia (Publ. de Patente de EE.UU.
2005/0255552 y 2006/0134098). El proceso identifica en primer lugar los determinantes mínimos de la especificidad de unión al antígeno (BSD) en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un Fab de referencia (típicamente secuencias dentro de la CDR3 de la cadena pesada y la CDR3 de la cadena ligera). Dado que estos BSDs de cadena pesada y ligera se mantienen en todas las colecciones construidas durante el proceso Humaneering™, cada una de las colecciones se centra en el epítopo y los anticuerpos finales, completamente Humaneered™, retienen la especificidad del epítopo del anticuerpo de ratón original.
A continuación, se generan colecciones de casetes (en las que una parte de la región variable de la cadena pesada o ligera del Fab de ratón se reemplaza por una colección de secuencias humanas). Se utiliza un sistema de secreción bacteriana para expresar miembros de la colección como fragmentos Fab de anticuerpos, y la colección se rastrea en busca de Fabs que se unan al antígeno utilizando un ensayo de unión por elevación de colonias (CLBA). Los clones positivos se caracterizan adicionalmente para identificar aquellos con la mayor afinidad. Los casetes humanos identificados que soportan la unión en el contexto de las secuencias murinas residuales se combinan luego en un rastreo de la colección final para generar regiones V completamente humanas.
Los Fabs Humaneered™ resultantes tienen secuencias del segmento V derivadas de colecciones humanas, retienen las secuencias BSD cortas identificadas dentro de las regiones CDR3 y tienen regiones del Marco 4 de la línea germinal humana. Estos Fabs se convierten en IgG completas clonando las regiones variables de las cadenas pesada y ligera en vectores de expresión de IgG. Los anticuerpos Completamente Humaneered™ generados en este proceso retienen la especificidad de unión del anticuerpo murino precursor, típicamente tienen una afinidad equivalente o mayor por el antígeno que el anticuerpo precursor y tienen regiones V con un alto grado de identidad de secuencia en comparación con los genes de anticuerpos de la línea germinal humana. a nivel de proteínas.
Las composiciones de cadena pesada y ligera de los anticuerpos FF1, FF3 de Humaneered™ LOX-1, así como los ejemplos de referencia FF4, FF5 y FF6, y su porcentaje de similitud con la secuencia de la línea germinal humana más cercana se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Composiciones de Cadena Pesada y Ligera de Anticuerpos LOX-1 y Porcentaje de similitud con la Secuencia de la Línea Germinal Humana más cercana HC = cadena pesada. LC = cadena li era
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Ejemplo 7: Inhibición del Anticuerpo LOX-1 de la Unión de OxLDL a la Proteína LOX-1
La capacidad de los anticuerpos LOX-1 de inhibir la unión de oxLDL a la proteína LOX-1 se determinó utilizando el método descrito en el Ejemplo 4. Además de la "OxLDL de alta unión" de Kalen Biomedical (número de catálogo 770212-7), que es generada por oxidación de LDL mediada por sulfato de cobre, en este ensayo se probaron otras dos formas de LDL modificadas: LDL modificadas con dialdehído malónico (número de catálogo de Academy Bio-Medical Co. 20P-MD-L105) y LDL modificadas con hipoclorito. Se prepararon LDL modificadas con hipoclorito de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se diluyeron LDL humanas (número de catálogo de Kalen Biomedical 770200-4) con PBS hasta una concentración final de 0,25 mg/mL. A continuación, se añadió hipoclorito de sodio (NaOCI, número de catálogo de JT Baker 9416-01) hasta una concentración final de 0,1 mM. La solución se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas, luego se extinguió añadiendo L-metionina hasta una concentración final de reacción añadiendo 5 |jl de metionina 100 mM por cada 200 j l de volumen total. Los datos representativos que demuestran la inhibición de la unión de LDL modificada a LOX-1 por anticuerpos LOX-1 se muestran en las Figuras 1A-1C y se describen en la Tabla 3.
Tabla 3: Inhibición de Anticuerpos LOX-1 de la Unión de OxLDL a la Proteína LOX-1 (tabla con valores de CI50).
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Ejemplo 8: Inhibición de Anticuerpos LOX-1 de la Unión de OxLDL a Células LOX-1/HEK293
Las células huLOX-1/HEK293 se mantuvieron en DMEM que contenía FBS al 10% y penicilina-estreptomicina al 1% como una monocapa adherente en matraces T que contenían 20 ml de medio de cultivo por 75 cm2de área de superficie. Las células se incubaron en una incubadora humidificada a 5% de CO2 y 37 °C, y se sub-cultivaron cada 2-3 días. Para el paso de las células, se retira el medio de cultivo y la monocapa se lava una vez con 10-20 ml de PBS precalentado. Después del lavado, se añade 1 ml de TrypLE Express precalentado y las células se incubaron a 37 °C durante 5 min. Luego se añadió medio de cultivo reciente precalentado.
Las células huLOX-1/HEK293 se resuspendieron a razón de 1x106 células/mL y se sembraron 50 |jL por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo en V (5 x104 células por pocillo). A continuación, se añadieron a las células LOX-1 o anticuerpos de control irrelevantes en medio de ensayo (DMEM FBS al 10%). Concentraciones finales típicas de anticuerpos oscilaron entre 0,006 jg/m L y 20 jg/mL. Las células se incubaron a 37 °C durante 1 hora y luego se lavaron dos veces con HBSS templado. Dil-oxLDL (LDL humana "Altamente Oxidada" marcada con dil, Kalen Biomedical, número de catálogo 770262-9; Dil es perclorato de 1,1 '-dioctadecil- 3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina) en 50 ul de medio de ensayo se añadió luego a una concentración final de 30 a 100 jg/mL. Las células se incubaron después a 37 °C durante 2 horas y luego se lavaron dos veces con tampón FACS (FBS al 2% en PBS). Luego, las células se analizaron para determinar la intensidad de la fluorescencia Di-I mediante citometría de flujo, como se representa en la Figura 2 y la Tabla 3.
Ejemplo 9: Ensayo de Producción de Especies Reactivas de Oxígeno (ROS) Inducidas por OxLDL
Anticuerpos LOX-1 o anticuerpos de control irrelevantes se incubaron a una concentración final 2x, ya sea solos o en presencia de un reticulante (Fab)2 (Fc (Fab)2 de IgG anti-humana policlonal de cabra, número de catálogo de Abcam ab98526)) en 0,05 mL de medio de ensayo (DMEM FBS al 10%) y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. Se varió la relación entre el reticulante (Fab)2 y el anticuerpo LOX-1 e incluyó relaciones 1:1 y 1:2. En experimentos de respuesta a la dosis con LOX-1 o anticuerpo de control solo (sin reticulante), se utilizaron concentraciones de anticuerpo que variaban de 0,005 jg/m L a 20 jg/mL. En experimentos que comparan anticuerpo solo con anticuerpo con reticulante se utilizaron concentraciones de anticuerpo que variaban de 0,03 jg/m L a 20 jg/mL.
Las células que expresan LOX-1 humano (huLOX1/HEK293) se disociaron utilizando TrypLE Express (Invitrogen número de catálogo 12605-010) y se lavaron una vez con PBS. Las células se resuspendieron después a razón de 2 x 106 células/mL en medio de ensayo (DMEM FBS al 10%) y se sembraron a razón de 50 jl/pocillo (1 x 105 células/pocillo) en una placa de 96 pocillos de fondo en V (Costar número de catálogo 3894). Se añadieron 50 jl/pocillo de solución de anticuerpo LOX-1 (o control) con o sin Fab de reticulación (preparado como se describió arriba) y la mezcla se incubó durante 15 min a 37 °C. Se añadió OxLDL (0,1 mL/pocillo en tampón de ensayo, "High oxLDL" de Kalen, número de catálogo 770252-7) hasta una concentración final de 25 jg/mL, y la mezcla resultante se incubó durante 100 min a 37 °C. Se diluyó H2DCFDA en medio de ensayo y se añadieron 0,1 mL/pocillo hasta una concentración final de 5-10 jM , y la mezcla se incubó durante 15 min a 37 °C. A continuación, las células se lavaron una vez con 200 jl/pocillo de HBSS que contenía calcio y magnesio, una vez con 200 jl/pocillo de tampón FACS frío (FBS al 2% en PBS), y las células se resuspendieron en 50-100 jL/pocillo de tampón FACS frío. La fluorescencia generada como resultado de la oxidación de H2DCFDA se midió utilizando un citómetro de flujo (excitación: 488 nm, emisión: 500/530 nm). Los resultados ejemplares se muestran en las Figuras 3 y 4 y en la Tabla 4.
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Los anticuerpos LOX-1 inhiben la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducidas por oxLDL en células HEK293 transfectadas con LOX-1 humano (tabla con valores de CI50), sin evidencia de actividad agonista de LOX-1
(anticuerpo solo o anticuerpo entrecruzamiento Fab2)
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Como se ve en las Figuras 4A-4F, los anticuerpos LOX-1 inhiben la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducida por oxLDL en células HEK293 transfectadas con LOX-1 humano. En ausencia de oxLDL, los anticuerpos LOX-1 (anticuerpos solos o en presencia de un Fab2 reticulante) no inducen la producción de ROS. Un anticuerpo de control de isotipo no tiene efecto sobre la producción de ROS inducida por oxLDL en células HEK293 transfectadas con LOX-1 humano.
Ejemplo 10: Anticuerpos de LOX-1 se Unen a Neutrófilos Humanos Primarios de LOX-1 Nativo
Anticuerpos LOX-1 se biotinilaron utilizando un kit de Thermo Scientific (kit de biotinilación EZ-Link Micro NHS-PEO4; número de catálogo de Thermo Scientific 21955). Los anticuerpos en tampón PBS a una concentración de 0,5-1,0 mg/mL se incubaron con un exceso molar de 50 veces de reactivo NHS-biotina a temperatura ambiente durante 60 min. A continuación, el anticuerpo biotinilado se separó del exceso de reactivo de biotinilación utilizando una columna giratoria de desalación equilibrada en PBS y se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Columna Giratoria de Desalación Zeba 7K MWCO, número de catálogo Thermo Scientific 89882). La concentración del anticuerpo biotinilado se determinó basándose en la medición de la absorbancia a 280 nm.
Los neutrófilos se aislaron de muestras de sangre obtenidas de donantes sanos utilizando métodos estándares. Brevemente, se recogió sangre entera humana en un vial que contenía EDTA. A 10 mL de la muestra de sangre se añadieron 10 mL de Tampón de Sedimentación (dextrano al 3%, cloruro de sodio al 0,9%) y la solución resultante se mezcló suavemente y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos. La capa superior que comprendía plasma rico en leucocitos se centrifugó a 1200 rpm (250-500 xg) durante 10 minutos a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió inmediatamente en 10 mL de cloruro de sodio al 0,9% a temperatura ambiente. La suspensión celular resultante se transfirió cuidadosamente a un tubo cónico de 50 mL que contenía 10 mL de Ficoll-Paque, colocando la suspensión celular en la parte superior del Ficoll-Paque, y luego el tubo se centrifugó a 1400 rpm (400 x g) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La capa superior fue la descartada. Al sedimento celular resultante se añadieron 10 mL de cloruro sódico al 0,2% enfriado con hielo y la mezcla se incubó durante exactamente 30 segundos para lisar los glóbulos rojos; se añadieron 10 mL de cloruro de sodio al 1,6% enfriado con hielo para restaurar la isotonicidad. Después, la suspensión celular se centrifugó a 1200 rpm (250-500 rpm) durante 5 minutos. A continuación, se descartó el sobrenadante y se repitió una vez más el procedimiento de lisis de glóbulos rojos. El sedimento celular resultante se resuspendió en tampón FACS (EDTA 2 mM, BSA al 1% y azida sódica al 0,2% en PBS) a una densidad celular de 2 x 106 células/mL.
La suspensión de células que contenía neutrófilos humanos recién aislados se transfirió (50 ul/pocillo) a pocillos de una placa de fondo en V de 96 pocillos (1 x 105 células/pocillo) (Costar, número de catálogo 3894). Se añadió tampón de bloqueo (suero de conejo normal al 4% diluido en tampón fAc S (EDTA 2 mM, BSA al 1% y azida sódica al 0,2% en PBS) (50 ul/pocillo) y la placa se incubó en hielo durante 30 minutos. Anticuerpo LOX-1 biotinilado (10 ul ) en tampón FACS se añadió luego a los pocillos a concentraciones finales que oscilaban entre 1 ng/ml y 5 ug/mL, y la placa se incubó en hielo durante 30 minutos. La placa se centrifugó a 1200 rpm (250-300 x g) durante 3 minutos y se descartó el sobrenadante. Las células se lavaron dos veces con 0,2 mL de tampón FACS y luego se añadieron 0,1 mL de PE-estreptavidina (número de catálogo de BD Pharmingen 554061) diluidos a razón de 1:250 en tampón FACS y la placa se incubó en hielo durante 30 minutos. La placa se centrifugó luego de nuevo, se desechó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con 0,2 mL de tampón FACS. Las células se resuspendieron después en 0,1 mL de tampón de fijación (tampón FACS con paraformaldehído al 2%) y se analizaron utilizando un instrumento FACS. Para determinar un valor de CE50 para la unión de neutrófilos por anticuerpos LOX-1, se representó gráficamente la intensidad de tinción de LOX-1 determinada por FACS frente a la concentración del anticuerpo como se muestra en la Figura 5 y la Tabla 3.
Ejemplo 11: Mapeo de Epítopos por Espectrometría de Masas de Intercambio de Hidrógeno/Deuterio
Se utilizó intercambio de hidrógeno-deuterio (HDx) en combinación con espectrometría de masas (MS) (Woods, 2001) para mapear el sitio de unión del anticuerpo E2E10 en LOX-1. En HDx, los hidrógenos de amida intercambiables de las proteínas son reemplazados por deuterio. Este proceso es sensible a la estructura/dinámica de la proteína y la accesibilidad a los disolventes y, por lo tanto, puede informar sobre la unión del ligando. La naturaleza no invasiva de HDxMS, su alta sensibilidad, su capacidad para trabajar con proteínas grandes y la alta resolución con la que se pueden mapear los sitios de unión lo distingue de otros métodos. El objetivo de estos experimentos fue la identificación del epítopo de E2E10 en LOX1.
Se realizaron experimentos automatizados de HDx/MS utilizando métodos similares a los descritos en la bibliografía (Chalmers, 2006). Se utilizó un manipulador de líquidos LEAP Technologies Pa1HTS (LEAP Technologies, Carrboro, NC) para todas las operaciones de manipulación de líquidos. El manipulador de líquidos estaba controlado por scripts de automatización escritos en LEAP Shell y estaba alojado en un recinto refrigerado mantenido a 2 °C. Se montaron una válvula de inyección de 6 vías y una estación de lavado en el riel del manipulador de líquidos y facilitaron la inyección de la muestra en el sistema cromatográfico y el lavado de la jeringa. Para la digestión en línea, se colocó una columna de enzima (pepsina inmovilizada de Poroszyme, 20 x 2,1 x 30 mm, ABI, Foster City, CA) en línea entre la válvula de inyección y un cartucho de captura. El sistema cromatográfico, que consistía en dos válvulas adicionales (15kPSI Valco, Houston, TX), un cartucho de trampa de fase inversa EXP Halo C18 de 4 |jL (Optimize Technologies Inc., Oregon City, OR) y una columna analítica (300 jm DI, Halo 2.7 jm C18, Michrom Bioresources Inc.), se alojó en un recinto refrigerado separado que se montó frente a la fuente del espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap (Thermo Scientific, San José, CA). La temperatura del recinto que aloja el sistema cromatográfico se mantuvo a 0 °C mediante enfriadores Peltier.
Para los controles no deuterados y deuterados, se diluyeron 10 jL de solución de LOX-1 soluble humana (0,73 mg/mL) con 15 jL de tampón de trietanolamina 50 mM (pH 7,8). Los complejos se prepararon mezclando 10 j l de solución de LOX-1 (0,73 mg/mL) con una cantidad equimolar de E2E10 y la cantidad apropiada de tampón de trietanolamina 50 mM (pH 7,8) para llevar el volumen total a 25 jL . Después de formar complejos, las soluciones se dejaron incubar durante 30 min. Para iniciar la reacción de intercambio, se añadieron 75 jL de tampón D2O (D2O en NaCl 150 mM, Cambridge Isotopes Laboratories) y se dejó intercambiar durante 10 min. A continuación, se redujo el pH de la mezcla con la adición de 0,25 mL de tampón de reducción (urea 8 M, tiourea 2 M, TCEP 0,25 M, pH 2,5) para reducir los enlaces disulfuro y ralentizar la tasa de intercambio, congelando eficazmente el estado de intercambio de la muestra. Después de 10 min de reducción, la mezcla se diluyó con 0,5 mL de tampón de extinción (glicina 50 mM, pH 2,5). A continuación, se inyectaron 0,5 mL de la muestra a través de una columna de digestión en línea en una trampa y se analizaron por LC-MS como se describe más adelante.
El sistema de cromatografía utiliza dos bombas de HPLC independientes para realizar la digestión en línea, atrapar los péptidos digeridos en una columna de trampa C18 y eluir los péptidos atrapados a través de una columna analítica en el espectrómetro de masas.. La bomba de "carga" (bomba Surveyor MS, Thermo Scientific, San Jose, CA), operó a un caudal de 125 jL/min (TFA al 0,05%), transfirió muestras del circuito de muestras de la válvula de inyección PAL (500 jL ) a través de la columna de pepsina y en el cartucho de trampa de fase inversa. Después de 6 min de la etapa de carga, se cambió una válvula de "carga" para permitir que el tampón (ácido fórmico al 0,25%) de la bomba de "gradiente" (Nano Acquity, Waters Corp., Milford, MA) fluyera a través de la trampa a un caudal de 20 jL/min durante un periodo de desalación de 3 min. Después de la etapa de desalación, se cambió una válvula de "desalación" para facilitar la elución de péptidos de la trampa y en la columna analítica y en la fuente de iones del espectrómetro de masas. La bomba de gradiente suministró un gradiente de 0 a 40% de B a lo largo de 20 min. seguido de 40% a 75% de B a lo largo de 5 min. El tiempo total para el gradiente fue de 30 min. Las composiciones de tampón bomba de gradiente fueron A: 99,75: 0,25% v/v (H2O:ácido fórmico) y B: 99,75: 0,25% v/v (acetonitrilo:ácido fórmico).
Los péptidos proteolíticos se secuenciaron mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Se utilizó el mismo método para la adquisición de LOX-1 no deuterado, LOX-1 deuterado y todas las muestras del complejo deuterado, aunque solo se utilizaron los datos de MS2 de la serie LOX1 no deuterado para la identificación de péptidos. Para estas adquisiciones, MS/MS se adquirieron en el LTQ y los escaneos de MS se adquirieron en el Orbitrap. Las adquisiciones en Orbitrap se realizaron con una resolución de 60.000 en el intervalo m/z de 400-2000. Los parámetros del instrumento utilizados para todos los experimentos incluyeron una tensión de pulverización de 3,5 kV, un tiempo máximo de inyección de 1000 ms, una diana LTQ AGC para MS de 50.000 iones y una diana FTMS AGC para MS de 1.000.000 de iones. Para iniciar el procesamiento de datos, los archivos.RAW de Orbitrap se convirtieron en archivos.mzXML (Pedrioli 2004) utilizando un programa interno (RawXtract). Posteriormente, los archivos.mzXML se convirtieron en archivos.mzBIN y se buscaron adquisiciones de MS en tándem utilizando SEQUEST (ThermoElectron). Los resultados de SEQUEST se filtraron utilizando DTASelect (Tabb 2002). Utilizando las identificaciones de la secuencia de péptidos, se utilizó un programa escrito interno (Deutoronomy) para extraer automáticamente cromatogramas para cada uno de los iones de la secuencia identificado y generar espectros promedio a lo largo de un intervalo m/z especificado y una ventana de tiempo de retención. A continuación, los espectros promedio se suavizaron y centroidizaron para determinar la incorporación promedio de deuterio. Después del procesamiento automatizado inicial, la calidad y la centroidización de cada uno de los espectros promedio se validaron o corrigieron manualmente utilizando un visor de datos interactivo integrado en Deutoronomy.
El experimento de mapeo HDxMS identificó tres regiones de LOX1 que estaban significativamente protegidas. Se observó una mayor protección para el péptido F228RVRGAVSQTYPSGTCAYI246 (SEQ ID NO.:3). También se observó una protección menor de los péptidos N100ELKEMIETL109 y S207RRNPSYPWLWE218 (SEQ ID No .: 4 y 5, respectivamente). Las regiones protegidas se mapearon en una estructura cristalina del dominio similar a lectina C-terminal de LOX-1 (CTLD) soluble humano obtenido del banco de datos de proteínas (1YPQ). Una de las regiones protegidas, N100ELKEMIETL109 (SEQ ID NO.: 4), no está presente en la estructura cristalina de Lo X-1 CTLD. El péptido F228RVRGAVSQTYPSGTCAYI246 (SEQ ID NO.: 3) se mapea en la cara de la molécula LOX-1 implicada en la unión del ligando mediante estudios publicados de mutagénesis dirigida al sitio (Ohki et al. (2005) Structure, 13: 905-917). Por lo tanto, los resultados indican que E2E10 probablemente actúa como un inhibidor competitivo de la unión del ligando LOX-1 a LOX-1. Dado que es muy poco probable que el proceso humanizado utilizado para convertir E2E10 en las variantes humanizadas FF1, FF3, FF4, FF5 y FF6 cambie la especificidad del epítopo del anticuerpo (véase el Ejemplo 6), estos resultados también identifican el sitio de unión primario de FF1, FF3, f F4, Ff 5 y FF6 en LOX-1.
El cambio en la incorporación de deuterio de péptidos derivados de LOX-1 debido a la unión de E2E10 a LOX-1 se muestra en la Tabla 5.
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Ejemplo 12: Preparación de LOX-1 Soluble en Mono Cvnomolgus Recombinante Purificado Para Uso en Ensayos de Unión de Anticuerpos LOX-1
Para determinar las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de LOX-1 de mono cynomolgus, se extrajeron ARN totales de órganos obtenidos de 3 monos individuales: 3 órganos de un individuo de Zyagen/GW y 12 órganos de 2 individuos de Covance, Inc. Los ARNs totales se utilizaron a continuación para la amplificación por PCR, utilizando cebadores de la región no traducida que se diseñaron de acuerdo con bases de datos públicas (Uniprot, NCBI). Se utilizaron métodos de secuenciación estándares para determinar las secuencias de ácido nucleico de los ARNms de LOX-1 amplificados. Dentro del dominio extracelular de LOX-1 de mono cynomolgus (correspondiente a los aminoácidos 61-273), las secuencias de aminoácidos de LOX-1 de cynomolgus derivadas de los 3 monos individuales eran idénticas.
Una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular (residuos de aminoácidos 61-273) del polipéptido LOX-1 de mono cynomolgus N-terminal de CD33 humano, etiqueta de purificación (EFHR) y secuencia de biotinilación BirA (GLNDIFEAQKIEWHE) (SEQ ID NO: 144) se subclonó en el vector de expresión de células de mamífero pRS5a. La expresión y purificación de lOx -1 soluble en mono cynomolgus se llevó a cabo utilizando los mismos métodos descritos para LOX-1 soluble humano en el Ejemplo 1. La secuencia de aminoácidos de LOX-1 de mono cynomolgus soluble en APP-Avi madura (61-273) se muestra en la Tabla 6. Para algunos experimentos, se biotiniló la proteína LOX-1 soluble de mono cynomolgus utilizando el mismo método descrito para LOX-1 soluble humano en el Ejemplo 5.
Tabla 6
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Ejemplo 12: Determinación de la Constante de Disociación de Anticuerpos mediante el Ensayo de Unión Biacore
Para la unión del anticuerpo E2E10 de LOX-1 murino a LOX-1 humano y de mono cynomolgus se cebó un Biacore T200 con tampón de desarrollo filtrado y reciente (1x HBS-EP (número de catálogo de GE BR-1006-60)). Se preparó un chip CM5 (número de catálogo de GE BR-1005-30) utilizando un kit de captura de anticuerpos de ratón (número de catálogo de GE BR-1008-38) y un kit de acoplamiento de amina (número de catálogo de GE BR-1000-50). Brevemente, se activó un nuevo chip con EDC/NHS a 10 ul/min durante 420 s. Se inmovilizó anticuerpo IgG anti-ratón a 30 ^g/ml en acetato 10 mM pH 5,0 a 10 ^l/min durante 420 s. La superficie del chip se desactivó con una solución de etanolamina 1 M (10 ul/min durante 420 s) y luego se acondicionó tres veces con glicina-HCl 10 mM, pH 1,5 (número de catálogo de GE BR-1003-54) a 60 ul/min durante 30 s.
Se programó una ejecución de método para medir la cinética de la unión de LOX-1 soluble humano o de mono cynomolgus al anticuerpo anti-LOX-1. Se ejecutaron 5 ciclos de inicio de la siguiente manera: 1) tampón de desarrollo durante 30 s a 60 ul/min, 2) tampón de desarrollo durante 350 s con disociación de 350 s a 60 ul/min, lavado extra con tampón de regeneración (glicina-HCl pH 1,5, P20 al 0,05% (número de catálogo de GE BR-1000-54)), 3) Tampón de regeneración durante 60 s a 60 ul/min, 4) Tampón de regeneración durante 35 s a 60 ul/min, lavado extra con tampón de desarrollo e incluye un control de transferencia.
Para los ciclos de muestra, 1) Se capturó mAb Ms-anti-Hu LOX-1 en la celda de flujo 2, 3 o 4 durante una cantidad de tiempo predeterminada que permitió la captura de aproximadamente 20 UR a 10 ul/min. La celda de flujo 1 se utilizó como referencia, 2) tampón de desarrollo durante 30 s a 60 ul/min, 3) LOX-1 soluble humano o LOX-1 soluble de mono cynomolgus diluido en tampón de desarrollo a diversas concentraciones (con al menos dos muestras duplicadas y múltiples blancos de tampón durante 350 s a 60 ul/min, con 750 s o 3000 s de tiempo de disociación), 4) tampón de regeneración durante 60 s a 60 ul/min, 5) tampón de desarrollo durante 35 s a 60 ul/min, lavado extra con tampón de desarrollo e incluyendo un control de transferencia. Los datos se analizaron utilizando blancos de tampones, blanco de referencia y un modelo de unión 1:1 para el ajuste de curvas con el fin de determinar las constantes de velocidad de asociación y disociación (ka y kd) y las constantes de unión de equilibrio (KD) (véanse los resultados para E2E10 en las Tablas 7- 8).
Las mediciones de resonancia de plasmón de superficie que cuantifican la interacción de anticuerpos LOX-1 humanizados con LOX-1 humano o de mono cynomolgus se realizaron con el biosensor óptico BIAcore T200 en un chip CM5. Se revistió anti-hlgG (gamma) de cabra (Invitrogen H10500) a 3000 UR en el chip CM5 en tampón acetato, pH 4,0. El tampón de desarrollo utilizado fue PBS, pH 7,4 (filtrado, desgasificado). Los anticuerpos de prueba se cargaron en celdas de flujo individuales a una concentración de 1 ug/mL a un caudal de 10 uL/min. El número objetivo de captura de IgG estaba entre 20-30 UR, en tampón HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, P20 al 0,05%). Se diluyó LOX-1 soluble humano o de mono cynomolgus a una concentración de 33 nM en tampón HBS-EP y luego se diluyó en serie (1:3) hasta una concentración de 0,137 nM. Esto representa seis concentraciones diferentes de LOX-1 humano o de mono cynomolgus. El antígeno se introdujo en celdas de flujo individuales a un caudal de 30 uL/min. Los parámetros para el tiempo de asociación se establecieron en 700 segundos y el tiempo de disociación se estableció en 5.400 segundos. Los datos se analizaron utilizando blancos de tampones, blanco de referencia y un modelo de unión 1:1 para el ajuste de curvas con el fin de determinar las constantes de velocidad de asociación y disociación (ka y kd) y las constantes de unión de equilibrio (KD) (véanse los resultados para FF1, FF3, FF4, FF5 y f F6 en las Tablas 7- 8).
Tabla 7
Constantes de Disociación (Kd) de la Unión de los Anticuerpos de LOX-1 a LOX-1 Soluble Humano Determinadas Mediante Ensayos de Unión Cinética de Biacore
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Tabla 8
Constantes de Disociación (KD) de la Unión de los Anticuerpos de LOX-1 a LOX-1 Soluble de Mono Cynomolgus Determinadas Mediante Ensayos de Unión Cinética de Biacore
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Ejemplo 13: Determinación de la Constante de Disociación de Anticuerpos Mediante el Ensayo de Valoración de Equilibrio en Solución (SET)
Se utilizó el siguiente protocolo SET para determinar el valor de KD para la unión de E2E10 biotinilada a LOX-1 soluble humano. Se revistió una placa MSD de 96 pocillos (placa de unión estándar, número de catálogo MSD L15XA-3) con 50 uL 0,25 ug/mL de LOX-1 soluble humano en PBS mediante incubación durante la noche a 4 °C. Las muestras de la fase en solución se prepararon por titulación de LOX-1 soluble humano en diluyente SET (PBS, BSA al 0,5%, Tween-20 al 0,1%, Triton X-100 al 0,1%) en una placa de 96 pocillos con fondo en V de polipropileno. Esta serie de diluciones se combinó 1:1 (100 jL en total) con E2E10 biotinilado diluido en diluyente SET, y las muestras se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con agitación.
La placa MSD revestida se lavó tres veces con tampón de lavado (PBS, Tween-20 al 0,05%) utilizando un lavador de placas y luego se invirtió y se secó en un Kimwipe para eliminar el líquido residual. A continuación, la placa se bloqueó con 200 |jL/pocillo de tampón de bloqueo SET (PBS, BSA al 2%, Tween-20 al 0,1%, Triton X-100 al 0,1%) y se incubó durante 1 h con agitación suave. La placa se lavó una vez. Se añadieron a la placa 25 jL/pocillo de la muestra de unión en equilibrio de fase en solución, por duplicado, y se incubó durante 30 min con agitación. La placa se lavó tres veces. Se añadieron a la placa 25 jL/pocillo de estreptavidina SULFO-TAG (número de catálogo de MSD R32AD-1) diluido 1:500 en diluyente SET y se incubó durante 1 h con agitación suave. La placa se lavó tres veces. Se añadieron 100 jL de Tampón de Lectura T (número de catálogo MSD R92TC-1) a la placa y se leyó en un aparato MSD SECTOR Imager 6000. Los valores de KD se determinaron ajustando los datos a la siguiente ecuación:
Y= (Bmax/(CAb/2)) *((CAb/2)-((((((CAg+CAb) KD)/2)-((((((CAg+CAb) KD) h2)/4)-
(CAg*CAb))h0.5))A2)/(2*CAb))),
en que Bmax es la señal cuando no hay proteína LOX-1 presente en solución, CAb es la concentración constante de anticuerpo LOX-1 en solución, CAg es la concentración de LOX-1 soluble en solución y KD es la constante de unión de equilibrio.
Para los anticuerpos LOX-1 humanizados FF1, FF3, FF4, FF5 y FF6, se utilizó el siguiente protocolo de ensayo de titulación de equilibrio en solución (SET) para determinar los valores de Kd. Los ensayos se realizaron en una placa de polipropileno de 96 pocillos (Thermo Scientific, n° de Catálogo AB-1127) como sigue. Se mezcló una concentración constante de anticuerpo LOX-1 (1 pM) con diferentes concentraciones de proteína LOX-1 humana no biotinilada o de mono cynomolgus (dilución en serie de 3 veces que varía de 1 nM a 0,017 pM) en tampón SET (PBS, pH 7,4 sin CaCl2 o MgCl2, Gibco, n° de catálogo P7949; albúmina de suero bovino al 0,5% p/v, libre de ácidos grasos, Calbiochem, n° de catálogo 26575; y Tween-20 al 0,02% v/v, Sigma, n° de catálogo. P7949). El volumen de reacción final fue de 80 jL . La placa se selló utilizando una película adhesiva (VWR, n° de catálogo 60941-062) y se incubó a 22 °C durante 14 horas con agitación constante (300 rpm).
Durante el mismo período, se bloqueó una placa MSD recubierta con estreptavidina de 384 pocillos (Meso Scale Discovery, n° de catálogo L21SA) incubando la placa con 50 jL de tampón de bloqueo (PBS, pH 7,4, albúmina de suero bovino al 5% p/v). por pocilio durante la noche a 4 °C. A continuación, la placa MSD bloqueada se lavó 3 veces con tampón de lavado (PBS, pH 7,4 y Tween-20 al 0,05% v/v) utilizando un lavador de placas (BioTek). Después del lavado, la proteína LOX-1 soluble biotinilada humana o de mono cynomolgus (25 pM, 15 |jL por pocillo) se inmovilizó en la superficie mediante incubación a 22 °C durante una hora con agitación constante (600 rpm). A continuación, la placa se lavó 3 veces como se describió anteriormente. En algunos experimentos, se utilizó proteína LOX-1 humana soluble no biotinilada (R&D systems, n° de catálogo 1798-LX-050); en este caso, la proteína LOX-1 se inmovilizó mediante incubación durante la noche a una concentración de 1 nM en una placa MSD estándar (MSD, n° de catálogo L21XA). Las reacciones de unión en equilibrio (15 ^L por pocillo) se aplicaron luego a la placa MSD con LOX-1 inmovilizado y se incubaron durante 30 min. El material no unido se eliminó lavando la placa y el anticuerpo capturado se detectó añadiendo 15 ^L por pocillo de una dilución 1: 500 de IgG anti-humana de cabra etiquetada con Sulfo (Meso Scale Discovery, n° de catálogo R3AJ-1). A continuación, la placa se incubó durante una hora con agitación constante (600 rpm). La placa se lavó 3 veces, y luego se añadieron 15 ^L/pocillo de tampón de lectura T 1X MSD (Meso Scale Discovery, n° de catálogo R92TC-2) y la placa se reveló utilizando un aparato Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery). Los datos se transfirieron a Excel para su análisis y se trazaron usando GraphPad Prism v5. Los valores de Kd se determinaron ajustando los datos a la siguiente ecuación:
Y= (Bmax/(CAb/2)) *((CAb/2)-((((((CAg+CAb) KD)/2)-((((((CAg+CAb) KD) h2)/4)-
(CAg*CAb))h0.5))A2)/(2*CAb))),
en que Bmax es la señal cuando no hay proteína LOX-1 presente en solución, CAb es la concentración constante de anticuerpo LOX-1 en solución, CAg es la concentración de LOX-1 soluble en solución y KD es la constante de unión de equilibrio. Los resultados para FF1, FF3, FF4, FF5, FF6 y E2E10 se muestran en la Tabla 9 y la Figura 6).
Tabla 9
Constantes de Disociación de Anticuerpos LOX-1 (KD) Determinación Mediante Ensayos de Valoración de Equilibrio en Solución (SET)
Figure imgf000057_0001
Equivalentes
Se considera que la memoria descriptiva escrita anterior es suficiente para permitir a un experto en la técnica poner en práctica la invención. La descripción y los ejemplos anteriores detallan determinadas realizaciones preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los autores de la invención. La invención debe interpretarse de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-LOX-1 aislado o un fragmento del mismo, que comprende
(i) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 24, o
(ii) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44.
2. El anticuerpo aislado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende
(i) una cadena pesada de SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 26, o
(ii) una cadena pesada de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 46.
3. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 y un soporte farmacéuticamente aceptable.
4. El anticuerpo aislado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 para uso en el tratamiento de un trastorno asociado a LOX-1 en un sujeto, seleccionado de aterosclerosis, infarto de miocardio, claudicación, enfermedad arterial periférica, angina, enfermedad de las arterias coronarias, apoplejía, isquemia crítica de miembros y síndrome coronario agudo.
5. El anticuerpo aislado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la claudicación se selecciona de una o más de claudicación intermitente y claudicación de Rutherford Clase II/IN.
6. El anticuerpo aislado o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la angina es angina refractaria.
7. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo anti-LOX-1 aislado o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.
8. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 7, en donde
(i) la región variable de cadena pesada está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 15 y la región variable de cadena ligera está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 25, o (ii) la región variable de cadena pesada está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 35 y la región variable de cadena ligera está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 45.
9. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en donde
(i) la cadena pesada está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17 y la cadena ligera está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 27, o
(ii) la cadena pesada está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 37 y la cadena ligera está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 47.
10. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
11. Una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 o el vector de acuerdo con la reivindicación 10.
12. Un método para producir un anticuerpo o fragmento del mismo, que se une específicamente a LOX-1 humano, que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 en condiciones adecuadas para expresar el anticuerpo o fragmento del mismo.
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