ES2957214T3 - Composiciones y métodos para anticuerpos contra la BMP6 - Google Patents

Composiciones y métodos para anticuerpos contra la BMP6 Download PDF

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William Dietrich
Nathalie George
Dong Liu
Asher Schachter
Aditi Soni
Jing Zhou
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Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos contra BMP6 humana y a composiciones y métodos de uso de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para anticuerpos contra la BMP6
Campo de la invención
SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica prioridad frente al documento de EE.UU. con n.° de serie 62/094.716, presentado el 19 de diciembre de 2014, y al documento de EE.UU. con n.° de serie 62/181.803, presentado el 19 de junio de 2015.
LISTA DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene una Lista de secuencias que ha sido presentada electrónicamente en formato ASCII y que se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 16 de diciembre de 2015, se denomina PAT056599-WO-PCT_SL.txt y tiene un tamaño de 68.301 bytes.
INTRODUCCIÓN
La presente invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión al antígeno de los mismos contra la BMP6 humana y a composiciones y métodos de uso de los mismos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La anemia es prevalente en los pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC) y se asocia a una menor calidad de vida y a un mayor riesgo de resultados adversos, que incluyen enfermedades cardiovasculares y muerte. Varios modos de tratamiento de la anemia en pacientes con IRC implican el uso de agentes estimulantes de la eritropoyesis (AEE), hierro suplementario por vía oral e intravenosa y transfusiones de sangre. Sin embargo, muchos pacientes no responden adecuadamente a estos tratamientos o requieren dosis más altas de AEE y/o hierro. Las dosis elevadas de hierro también pueden causar toxicidad asociada a la generación de radicales de oxígeno y reacciones alérgicas. Estos tratamientos pueden carecer de eficacia porque no abordan completamente la causa subyacente de la anemia, es decir, el deterioro de la absorción del hierro y de la movilización del hierro desde las reservas corporales.
Los intentos de tratar la resistencia a la eritropoyetina se realizan actualmente mediante la coadministración de altas dosis de hierro por vía parenteral. Sin embargo, la mayor parte del hierro de los preparados intravenosos es procesado en primer lugar por los macrófagos, y su utilización para la eritropoyesis depende de la exportación de hierro mediada por la ferroportina.
En muchos pacientes con anemia, la exportación de hierro mediada por la ferroportina está suprimida por unos altos niveles de hepcidina. Pruebas adicionales sugieren que el aumento de los niveles de hepcidina se correlaciona con una mala reactividad a los AEE en hemodiálisis. Por lo tanto, los agentes reductores de la hepcidina pueden ser una estrategia eficaz para mejorar la anemia resistente a los AEE en esta población de pacientes y en otras formas de anemia de las enfermedades crónicas (AEC) caracterizada por la restricción de hierro.
Por lo tanto, los métodos que disminuyen los niveles circulantes de hepcidina deberían mejorar la absorción de hierro, facilitar la liberación del hierro fijado y estimular la eritropoyesis en la anemia resistente a los AEE presente en los pacientes con insuficiencia renal crónica. El documento WO 2010/056981 menciona métodos y composiciones para regular la homeostasis del hierro mediante la modulación de la BMP6.
A pesar de las opciones terapéuticas actuales para tratar las enfermedades y trastornos asociados a la anemia, sigue existiendo la necesidad de composiciones mejoradas para el tratamiento de la anemia que sean eficaces y bien toleradas.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a la BMP6 humana y que comprende: una secuencia VH de la SEQ ID NO: 75; y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 85. En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende dicho anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno. En aspecto adicional, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica dicho anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno. En otro aspecto adicional más, la invención proporciona un vector que comprende el polinucleótido. En otro aspecto, la invención proporciona una célula hospedadora que comprende el vector o el polinucleótido. En otro aspecto, la invención proporciona el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o la composición para usar como un medicamento, por ejemplo, para usar en el tratamiento de la anemia en un paciente.
Estos aspectos de la invención y otras realizaciones se definen en las reivindicaciones adjuntas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La información técnica recogida a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención, que está definida por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para ubicar la invención en sí en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.
La presente invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a la BMP6 humana y que comprende: una secuencia VH de la SEQ ID NO: 75; y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 85. Aquí se describen moléculas aisladas de unión a la BMP6 (por ejemplo, anticuerpos de unión a la BMP6 o fragmentos de unión al antígeno de los mismos), composiciones farmacéuticas que comprenden dichas moléculas, métodos de fabricación de dichas moléculas y composiciones, y métodos de uso de las mismas para reducir los niveles de hepcidina y para tratar la anemia.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo contra la BMP6 que comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR de cualquiera de los anticuerpos de la Tabla 1.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo contra la BMP6 que comprende las 6 CDR del Anticuerpo 3, como se describe en la tabla 1.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo contra la BMP6 que comprende las 6 CDR del Anticuerpo 5, como se describe en la tabla 1.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo contra la BMP6 que comprende las 6 CDR del Anticuerpo 6, como se describe en la tabla 1.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo contra la BMP6 que comprende las 6 CDR del Anticuerpo 7, como se describe en la tabla 1.
En un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende:
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 9, 10 y 11, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 19, 20 y 21, respectivamente.
En un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende:
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 12, 13 y 14, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 22, 23 y 24, respectivamente.
En un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende:
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 29, 30 y 31, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 39, 40 y 41, respectivamente.
En un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende:
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 32, 33 y 34, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 42, 43 y 44, respectivamente.
En un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende:
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 49, 50 y 51, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 59, 60 y 61, respectivamente.
En un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende:
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 52 53 y 54 respectivamente y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 62, 63 y 6
En un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende:
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 69, 70 y 71, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID No : 79, 80 y 81, respectivamente, o
En un aspecto de la presente divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende:
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 72, 73 y 74, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID No : 82, 83 y 84, respectivamente.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana y comprende:
Una secuencia VH (dominio variable de la cadena pesada) de la SEQ ID NO: 15;
Una secuencia VH de la SEQ ID NO: 35; o
Una secuencia VH de la SEQ ID NO: 55.
En el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de la invención, hay una secuencia VH de la SEQ ID NO: 75; y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 85.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana comprende una secuencia VH que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, pero menos de un 100 % de identidad de secuencia con una de las secuencias VH descritas anteriormente.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende:
Una secuencia VL (dominio variable de la cadena ligera) de la SEQ ID NO: 25;
Una secuencia VL de la SEQ ID NO: 45; o
Una secuencia VL de la SEQ ID NO: 65.
En el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de la invención, hay una secuencia VH de la SEQ ID NO: 75; y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 85.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana comprende una secuencia VL que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, pero menos de un 100 % de identidad de secuencia con una de las secuencias VL descritas anteriormente.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende:
Una secuencia VH de la SEQ ID NO: 15; y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 25;
Una secuencia VH de la secuencia de la SEQ ID NO: 35; y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 45; o Una secuencia VH de la secuencia de la SEQ ID NO: 55; y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 65.
El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de la invención comprende:
una secuencia VH de la secuencia de la SEQ ID NO: 75; y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 85.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana comprende una secuencia VH que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con una de las secuencias VH descritas anteriormente, y comprende una secuencia VL al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con una de las secuencias VL descritas anteriormente. La VH y la VL pueden derivar del mismo anticuerpo indicado en la Tabla 1. En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende:
Una secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17;
Una secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 37;
Una secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 57.
En el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de la invención, puede haber una secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 77.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana comprende una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, pero menos de un 100 % de identidad de secuencia con una de las secuencias de la cadena pesada descritas anteriormente.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende:
Una secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 27;
Una secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 47; o
Una secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 67.
En el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de la invención, puede haber una secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 87.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana comprende una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, pero menos de un 100 % de identidad de secuencia con una de las secuencias de la cadena ligera descritas anteriormente.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 humana y comprende una cadena pesada y una cadena ligera en donde:
Una secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17; y una secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 27;
Una secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 37; y una secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 47; o
Una secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 57; y una secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 67.
En el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de la invención, puede haber una secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 77 y una secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 87.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana comprende una secuencia de la cadena pesada que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99% de identidad de secuencia, pero menos del 100% de identidad de secuencia con una de las secuencias de la cadena pesada descritas anteriormente, y comprende una secuencia de la cadena ligera que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, pero menos del 100 % de identidad de secuencia con una de las secuencias de la cadena ligera descritas anteriormente. La cadena pesada y la cadena ligera pueden derivar del mismo anticuerpo indicado en la Tabla 1.
En un caso, un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente a la BMP6 en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión nte de la complementariedad (CDR) que tiene al menos un 90 %, 95 %, 97 %, 98%o al menos un 99%de identidad de secuencia con una cualquiera o más de:
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 9, 10 y 11, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las Se Q ID NO: 19, 20 y 21, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 12, 13 y 14, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 22, 23 y 24, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 29, 30 y 31, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las Se Q ID NO: 39, 40 y 41, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 32, 33 y 34, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las Se Q ID NO: 42, 43 y 44, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 49, 50 y 51, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las S<e>Q ID NO: 59, 60 y 61, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 52, 53 y 54, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las S<e>Q ID NO: 62, 63 y 64, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 69, 70 y 71, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las Se Q ID NO: 79, 80 y 81, respectivamente; o
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 72, 73 y 74, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las Se Q ID NO: 82, 83 y 84, respectivamente.
En un caso, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente a la BMP6 y comprende al menos una secuencia determinante de la complementariedad (CDR) idéntica a una cualquiera o más de:
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 9, 10 y 11, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las Se Q ID NO: 19, 20 y 21, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 12, 13 y 14, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 22, 23 y 24, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 29, 30 y 31, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las S<e>Q ID NO: 39, 40 y 41, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 32, 33 y 34, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las S<e>Q ID NO: 42, 43 y 44, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 49, 50 y 51, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las S<e>Q ID NO: 59, 60 y 61, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 52, 53 y 54, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las S<e>Q ID NO: 62, 63 y 64, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 69, 70 y 71, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las S<e>Q ID NO: 79, 80 y 81, respectivamente; o
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 72, 73 y 74, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las S<e>Q ID NO: 82, 83 y 84, respectivamente.
En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unen específicamente a la BMP6, en donde dichos anticuerpos comprenden al menos una secuencia CDR de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en:
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 12, 13 y 14;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 29, 30 y 31;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 32 33 y 34;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 49, 50 y 51;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 52, 53 y 54;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 69, 70 y 71;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 72, 73 y 74, respectivamente; y
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 9, 10 y 11.
En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unen específicamente a la BMP6, en donde dichos anticuerpos comprenden al menos una secuencia CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en:
las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 19, 20 y 21, respectivamente; las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 22, 23 y 24, respectivamente; las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 39, 40 y 41, respectivamente; las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 42, 43 y 44, respectivamente; las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 59, 60 y 61, respectivamente; las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 62, 63 y 64, respectivamente; las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 79, 80 y 81, respectivamente; y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 82, 83 y 84, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo es monoclonal.
En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unen específicamente a la BMP6, en donde dicho anticuerpo tiene una constante de afinidad (K<a>) de al menos aproximadamente 1 x 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1 o 1011 M-1. En un caso, la presente divulgación proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la BMP6, en donde dicho anticuerpo tiene una constante de afinidad (K<a>) de al menos 1 x 107 m-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1 o 1011 M-1.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente a la BMP6, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 con una Kd de no más de aproximadamente 1 nM o no más de aproximadamente 0,1 nM. En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente a la BMP6, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 con una Kd de no más de 1 nM o no más de 0,1 nM. En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente a la BMP6, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a la BMP6 con una Kd ≤ 1 nM o ≤ 0,1 nM. La Kd puede medirse con Biacore.
En una realización de la presente invención, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente a la BMP6, e inhibe la actividad de la BMP6.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente a la BMP6, y compite de forma cruzada (bloqueo cruzado) con un anticuerpo descrito en la siguiente Tabla 1. En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unen al mismo epítopo de la BMP6, compiten de forma cruzada con un anticuerpo descrito en la siguiente Tabla 1.
En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos tienen una afinidad al menos aproximadamente 100, 500 o 1000 veces mayor por la BMP6 humana que por cualquiera de: la BMP2 humana, la BMP5 humana o la BMP7 humana. En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos tienen una afinidad al menos 100, 500 o 1000 veces mayor por la BMP6 humana que por cualquiera de: la BMP2 humana, la BMP5 humana o la BMP7 humana. La especificidad para la BMP6 puede medirse mediante un ELISA.
En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos tienen una afinidad al menos aproximadamente 100, 500 o 1000 veces mayor por la BMP6 humana que por la BMP2 humana. En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos tienen una afinidad al menos 100, 500 o 1000 veces mayor por la BMP6 humana que por la BMP2 humana La especificidad para la BMP6 puede medirse mediante un ELISA.
En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos tienen una afinidad al menos aproximadamente 100, 500 o 1000 veces mayor por la BMP6 humana que por la BMP5 humana. En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos tienen una afinidad al menos 100, 500 o 1000 veces mayor por la BMP6 humana que por la BMP5 humana. La especificidad para la BMP6 puede medirse mediante un ELISA.
En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos tienen una afinidad al menos aproximadamente 100, 500 o 1000 veces mayor por la BMP6 humana que por la BMP7 humana. En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos tienen una afinidad al menos 100, 500 o 1000 veces mayor por la BMP6 humana que por la BMP7 humana. La especificidad para la BMP6 puede medirse mediante un ELISA.
En un caso, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo no tiene unión detectable a la BMP2 o la BMP5 humanas (por ejemplo, en un ELISA).
En un caso, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo no tiene actividad detectable contra la BMP2 humana (por ejemplo, en un ELISA).
En un caso, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo no tiene actividad detectable contra la BMP5 humana (por ejemplo, en un ELISA).
En un caso, los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención que se unen específicamente a la BMP6 son anticuerpos monoclonales aislados. En un caso, los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención que se unen específicamente a la BMP6 son anticuerpos monoclonales humanos aislados. En un caso, los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención que se unen específicamente a la BMP6 son anticuerpos monoclonales humanizados. En una realización, los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención que se unen específicamente a la BMP6 son anticuerpos quiméricos aislados. En una realización, los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención comprenden una región constante de la cadena pesada humana y una región constante de la cadena ligera humana.
En una realización de la presente invención, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la BMP6 es un anticuerpo de cadena única.
En una realización de la presente invención, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la BMP6 es un fragmento Fab.
En una realización de la presente invención, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la BMP6 es un scFv.
En una realización, los anticuerpos de la invención son una IgM o una IgG. En una realización de la presente invención, la IgG es una IgG1, una IgG2, una IgG3 o una IgG4. En una realización, la IgG es una IgG1.
En un caso, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos comprenden una región marco en la que se han sustituido aminoácidos en la región marco del anticuerpo a partir de las respectivas secuencias humanas de la estirpe germinal de VH o de VL.
En una realización de la presente invención, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo es un componente de un inmunoconjugado. En una realización, el inmunoconjugado puede comprender el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo y cualquiera de los siguientes, como ejemplos no limitantes: una enzima, una toxina, una hormona, un factor de crecimiento o un fármaco.
En una realización de la presente invención, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo tiene alterada la función efectora a través de una mutación de la región Fc.
En un caso, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea de forma cruzada un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo aislado indicado en la Tabla 1.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo inhibe la expresión de la hepcidina inducida por la BMP6 en hepatocitos (por ejemplo, estirpes celulares hepáticas y/o hepatocitos humanos primariosin vitro).En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo inhibe la expresión de la hepcidina inducida por la BMP6 en hepatocitos (por ejemplo, estirpes celulares hepáticas y/o hepatocitos humanos primariosin vitro)al menos aproximadamente en un 50 %. Por ejemplo el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo inhibe la expresión de la hepcidina inducida po 60, un 70, un 80, un 90 o un 100 %. La expresión de la hepcidina puede medirse, como ejemplos no limitantes, midiendo la cantidad de ARNm de hepcidina o los niveles de la proteína. En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo inhibe la expresión de la hepcidina inducida por la BMP6 en hepatocitos (por ejemplo, estirpes celulares hepáticas y/o hepatocitos humanos primariosin vitro)en al menos un 50 %. Por ejemplo, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo inhibe la expresión de la hepcidina inducida por la BMP6 en los hepatocitos en al menos un 50, un 60, un 70, un 80, un 90 o un 100 %. La expresión de la hepcidina puede medirse, como ejemplos no limitantes, midiendo la cantidad de ARNm de hepcidina o los niveles de la proteína.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo reduce la actividad de la BMP6 humanain vitro.En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo reduce la actividad de la BMP6 humanain vitro,medida en un ensayo del gen indicador HEP3B-BRE-Luc.
En un caso, un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a la BMP6, puede unirse a un epítopo de la BMP6 humana que comprende la secuencia QTLVHLMNPEy V p KP (SEQ ID NO: 92, o los aminoácidos 88 a 102 de la SEQ ID NO: 89). En un caso, un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a la BMP6, puede unirse a un epítopo de la BMP6 humana que consiste en la secuencia QTLVHLMNPEYVPKP (SEQ ID NO: 92, o los aminoácidos 88 a 102 de la SEQ ID NO: 89). En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo tiene una afinidad al menos aproximadamente 100 veces mayor por un epítopo de la BMP6 humana que consiste en la secuencia QTLVHLMNPEYVPKP (SEQ ID NO: 92, o los aminoácidos 88 a 102 de la SEQ ID NO: 89) que a (a) un epítopo de la BMP7 humana que consiste en la secuencia QTLVHFINPETVPKP (SEQ ID NO: 93, o los aminoácidos 88 a 102 de la SEQ ID NO: 90) o (b) un epítopo de la BMP5 humana que consiste en la secuencia QTLVHLMFPDHVPKP (SEQ ID NO: 94, o los aminoácidos 87 a 101 de la SEQ ID NO: 91). En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo tiene una afinidad al menos 100 veces mayor por un epítopo de la BMP6 humana que consiste en la secuencia QTLVHLMNPEYVPKP (SEQ ID NO: 92, o los aminoácidos 88 a 102 de la SEQ ID NO: 89) que a (a) un epítopo de la BMP7 humana que consiste en la secuencia QTLVHFINPETVPKP (SEQ ID NO: 93, o los aminoácidos 88 a 102 de la SEQ ID NO: 90) o (b) un epítopo de la BMP5 humana que consiste en la secuencia QTLVHLMFPDHVPKP (SEQ ID NO: 94, o los aminoácidos 87 a 101 de la SEQ ID NO: 91). Dicho anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede comprender, como ejemplo no limitante: (a) las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 69, 70 y 71, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 79, 80 y 81, respectivamente o (b) las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 72, 73 y 74, respectivamente, y las secuencias LCDR1, L<c>DR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 82, 83 y 84, respectivamente. En la presente invención, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo comprende la secuencia VH de la SEQ ID NO: 75; y la secuencia VL de la SEQ ID NO: 85. La afinidad puede medirse con Biacore.
En un caso, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo tiene una afinidad al menos aproximadamente 500 veces mayor por un epítopo de la BMP6 humana que consiste en la secuencia QTLVHLMNPEYVPKP (SEQ ID NO: 92, o los aminoácidos 88 a 102 de la SEQ ID NO: 89) que a (a) un epítopo de la BMP7 humana que consiste en la secuencia QTLVHFINPETVPKP (SEQ ID NO: 93, o los aminoácidos 88 a 102 de la SEQ ID NO: 90) o (b) un epítopo de la BMP5 humana que consiste en la secuencia QTLVHLMFPDHVPKP (SEQ ID NO: 94, o los aminoácidos 87 a 101 de la SEQ ID NO: 91). Dicho anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede comprender, como ejemplos no limitantes: (a) las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 69, 70 y 71, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 79, 80 y 81, respectivamente o (b) las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 72, 73 y 74, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 82, 83 y 84, respectivamente. En la presente invención, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo comprende la secuencia VH de la SEQ ID NO: 75; y la secuencia VL de la SEQ ID NO: 85. La afinidad puede medirse con Biacore.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en las reivindicaciones.
En una realización, la composición comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización, la composición comprende además un agente terapéutico adicional.
En una realización de la presente invención, el agente terapéutico adicional reduce la actividad de la BMP6.
En una realización de la presente invención, el agente terapéutico adicional es un ARNip, un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo o una molécula pequeña.
En una realización de la presente invención, el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en: agente estimulante de la eritropoyesis (AEE) y hierro (por ejemplo, hierro dietético suplementario o hierro intravenoso).
En una realización de la presente invención, el agente terapéutico adicional es un agente estimulante de la eritropoyesis (AEE), por ejemplo, EPO.
En una realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención puede administrarse a un paciente que lo necesite junto con un método o procedimiento terapéutico, tal como se describe en el presente documento o se conoce en la técnica. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en la Tabla 1 puede administrarse antes, después o coincidiendo con un método o procedimiento.
En una realización, el método o procedimiento terapéutico es una transfusión de sangre. En una realización, el método o procedimiento terapéutico es la diálisis. En una realización, el método o procedimiento terapéutico consiste en la administración de un AEE, por ejemplo, EPO. En una realización, el método o procedimiento terapéutico es la administración de hierro, por ejemplo, hierro intravenoso. En una realización, el método o procedimiento terapéutico consiste en la administración de un AEE, por ejemplo, EPO, y la administración de hierro, por ejemplo, hierro intravenoso. En una realización, el método o procedimiento terapéutico es una combinación de cualquiera de los anteriores.
En otro aspecto, la presente invención incluye un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno como se define en las reivindicaciones. En un caso, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico que codifica un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en la Tabla 1 que comprende una cualquiera o más de:
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 9, 10 y 11, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las S<e>Q ID NO: 19, 20 y 21, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 12, 13 y 14, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 22, 23 y 24, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 29, 30 y 31, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las Se Q ID NO: 39, 40 y 41, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 32, 33 y 34, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las S<e>Q ID NO: 42, 43 y 44, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 49, 50 y 51, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las Se Q ID NO: 59, 60 y 61, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 52, 53 y 54, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las Se Q ID NO: 62, 63 y 64, respectivamente;
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 69, 70 y 71, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las S<e>Q ID NO: 79, 80 y 81, respectivamente; o
las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 72, 73 y 74, respectivamente, y las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las S<e>Q ID NO: 82, 83 y 84, respectivamente.
En un caso, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en la Tabla 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17;
la secuencia VH de la SEQ ID NO: 15;
la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 27;
la secuencia VL de la SEQ ID NO: 25;
la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 37;
la secuencia VH de la SEQ ID NO: 35;
la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 47;
la secuencia VL de la SEQ ID NO: 45;
la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 57;
la secuencia VH de la SEQ ID NO: 55
la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 67;
la secuencia VL de la SEQ ID NO: 65;
la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 77;
la secuencia VH de la SEQ ID NO: 75;
la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 87; y
la secuencia VL de la SEQ ID NO: 85.
En un caso, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en la Tabla 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17;
la secuencia VH de la SEQ ID NO: 15;
la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 27;
la secuencia VL de la SEQ ID NO: 25;
la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 37;
la secuencia VH de la SEQ ID NO: 35;
la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 47;
la secuencia VL de la SEQ ID NO: 45;
la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 57;
la secuencia VH de la SEQ ID NO: 55;
la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 67;
la secuencia VL de la SEQ ID NO: 65;
la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 77;
la secuencia VH de la SEQ ID NO: 75;
la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 87; y
la secuencia VL de la SEQ ID NO: 85.
En un caso, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en la Tabla 1, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
La secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 18;
la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 38;
la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 58;
la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 78;
La secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 28;
la secuencia de la cadena ligera de la
la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 68;
la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 88;
la secuencia VH de la SEQ ID NO: 16;
la secuencia VH de la SEQ ID NO: 36;
la secuencia VH de la SEQ ID NO: 56;
la secuencia VH de la SEQ ID NO: 76;
la secuencia VL de la SEQ ID NO: 26;
la secuencia VL de la SEQ ID NO: 46;
la secuencia VL de la SEQ ID NO: 66; y
la secuencia VL de la SEQ ID NO: 86.
En otro aspecto, la presente invención también proporciona un vector que comprende el polinucleótido de la invención.
En otro aspecto, la presente invención también proporciona una célula hospedadora que comprende un polinucleótido de la invención. En una realización, la célula hospedadora es una célula de ovario de hámster chino (CHO). En una realización de la presente invención, las células hospedadoras aisladas comprenden un vector que comprende dichos ácidos nucleicos o polinucleótidos.
En una realización, la presente invención proporciona una célula hospedadora aislada que comprende (1) un segmento de ácido nucleico recombinante que codifica una cadena pesada de los anticuerpos de la invención, y (2) un segundo segmento de ácido nucleico recombinante que codifica una cadena ligera de los anticuerpos de la invención; en donde dichos segmentos de ADN están respectivamente unidos operativamente a un primer y un segundo promotor, y son susceptibles de ser expresados en dicha célula hospedadora. En otra realización de la presente invención, las células hospedadoras aisladas comprenden un segmento de ADN recombinante que codifica una cadena pesada y una cadena ligera de los anticuerpos de la invención, respectivamente, en donde dicho segmento de ADN está unido operativamente a un promotor, y es susceptible de ser expresado en dichas células hospedadoras. En una realización, las células hospedadoras son estirpes celulares de mamíferos no humanos. En una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
La presente divulgación proporciona el uso de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo contra la BMP6, un polinucleótido, un vector o una célula hospedadora, como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento. La presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en las reivindicaciones para usar como un medicamento. La presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en las reivindicaciones para usar en una terapia. La presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en las reivindicaciones para usar en el tratamiento de la anemia, por ejemplo, la anemia de las enfermedades crónicas. En una realización, la enfermedad crónica es una insuficiencia renal crónica. En una realización, la enfermedad crónica es cáncer. En una realización, la enfermedad crónica es inflamación. En algunas realizaciones, el paciente con anemia ha sido o está siendo tratado con un agente estimulante de la eritropoyesis (AEE), por ejemplo, eritropoyetina (EPO).
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de utilización de los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, y composiciones que comprenden dichos anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, como se describen en el presente documento. En un aspecto, la divulgación proporciona un método para reducir la actividad o el nivel de Hepcidina en un paciente que lo necesite, método que comprende la etapa de administrar al paciente un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo contra la BMP6 como se describe en el presente documento. La actividad o el nivel de Hepicidina puede reducirse al menos en un 50 %. El paciente puede tener anemia. La anemia puede ser anemia de enfermedad crónica (AEC), por ejemplo, anemia de insuficiencia renal crónica (IRC), anemia de cáncer o anemia de inflamación. La anemia puede ser una anemia resistente a los agentes estimulantes de la eritropoyesis (AEE) o una anemia por restricción de hierro.
La presente divulgación proporciona un método para tratar la anemia en un paciente que lo necesite, método que comprende la etapa de administrar al paciente un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la anemia es anemia de enfermedad crónica (AEC), por ejemplo, anemia de insuficiencia renal crónica (IRC), anemia de cáncer o anemia de inflamación En una realización la anemia es una anemia resistente a los agentes estimulan En algunas realizaciones, el paciente está siendo o ha sido tratado con un agente estimulante de la eritropoyesis (AEE), por ejemplo, eritropoyetina (EPO). En algunas realizaciones, la anemia es una anemia hiposensible a la EPO. En algunas realizaciones, la anemia es una anemia por restricción de hierro. En algunas realizaciones, el paciente es un paciente en hemodiálisis crónica.
En otro caso, la presente divulgación proporciona un método para inhibir la BMP6 en un paciente que lo necesite, en donde el método comprende la etapa de administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo. El paciente puede tener anemia. La anemia puede ser anemia de enfermedad crónica (AEC), por ejemplo, anemia de insuficiencia renal crónica (IRC), anemia de cáncer o anemia de inflamación. La anemia puede ser una anemia resistente a los agentes estimulantes de la eritropoyesis (AEE) o una anemia por restricción de hierro. El paciente puede estar siendo o haber sido tratado con un agente estimulante de la eritropoyesis (AEE), por ejemplo, eritropoyetina (EPO). La anemia puede ser una anemia hiposensible a la EPO. La anemia puede ser una anemia por restricción de hierro. El paciente puede ser un paciente en hemodiálisis crónica.
La presente divulgación también proporciona un método para reducir la actividad de la BMP6 en una célula, que comprende la etapa de poner en contacto la célula con un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
La presente divulgación proporciona además un método para aumentar los niveles séricos de hierro, la saturación de transferrina (TSAT), el contenido de hemoglobina reticulocitaria (CHr), el recuento de reticulocitos, el recuento de glóbulos rojos, la hemoglobina y/o el hematocrito en un paciente que lo necesite, que comprende la etapa de administrar al paciente una cantidad eficaz del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno del mismo.
La presente divulgación proporciona además un método para aumentar o mantener el nivel de hemoglobina en un paciente, método que comprende administrar al paciente un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en el presente documento. El paciente puede tener anemia.
La anemia puede ser anemia de enfermedad crónica (AEC), por ejemplo, anemia de insuficiencia renal crónica (IRC), anemia de cáncer o anemia de inflamación. La anemia puede ser una anemia resistente a los agentes estimulantes de la eritropoyesis (AEE) o una anemia por restricción de hierro. El paciente puede estar siendo o haber sido tratado con un agente estimulante de la eritropoyesis (AEE), por ejemplo, eritropoyetina (EPO). La anemia puede ser una anemia hiposensible a la EPO. La anemia puede ser una anemia por restricción de hierro. El paciente puede ser un paciente en hemodiálisis crónica. El método puede comprender además la reducción de la dosis requerida de hierro del paciente, la reducción de la dosis requerida de EPO del paciente o la reducción tanto de la dosis requerida de hierro del paciente como de la dosis requerida de EPO del paciente, con respecto a dicha dosis requerida de EPO y/o dosis requerida de hierro en ausencia de tratamiento con el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el nivel de hemoglobina se aumenta o se mantiene a un nivel de al menos aproximadamente 10,0, al menos aproximadamente 11,0 o al menos aproximadamente 12,0 g/dl. En algunas realizaciones, el nivel de hemoglobina se aumenta o se mantiene a un nivel de al menos 10,0, al menos 11,0 o al menos 12,0 g/dl.
En cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, la etapa de administrar al paciente un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en el presente documento comprende la etapa de administrar al paciente una composición que incluya el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en el presente documento.
En cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo puede administrarse a una dosis de 0,001 a 0,1 mg/kg, por ejemplo, a una dosis de 0,001 mg/kg, 0,0016 mg/kg, 0,0025 mg/kg, 0,0040 mg/kg, 0,0063 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,016 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,040 mg/kg, 0,063 mg/kg o 0,1 mg/kg. En cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo puede administrarse a una dosis de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,1 mg/kg, por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 0,001 mg/kg, aproximadamente 0,0016 mg/kg, aproximadamente 0,0025 mg/kg, aproximadamente 0,0040 mg/kg, aproximadamente 0,0063 mg/kg, aproximadamente 0,01 mg/kg, aproximadamente 0,016 mg/kg, aproximadamente 0,025 mg/kg, aproximadamente 0,040 mg/kg, aproximadamente 0,063 mg/kg o aproximadamente 0,1 mg/kg.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo se administra por vía subcutánea. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo se administra mediante infusión durante un periodo de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo contra la BMP6 que comprende una CDR indicada en la Tabla 1. La presente divulgación proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo contra la BMP6 indicada en la Tabla 1. La presente divulgación proporciona un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo contra la BMP6 que comprende una CDR indicada en la Tabla 1. En un caso se aísla un polinucleótido o un ácido nucleico En un caso se aísla el anticuerpo o el fragmento de unión al a
DEFINICIONES
Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que los comprendidos habitualmente por los expertos en la materia a la pertenece esta invención.
"BMP6", como se utiliza en el presente documento, significa la proteína Proteína Morfogenética Ósea 6 (BMP6) o un gen o un ácido nucleico que codifique la BMP6. Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759-62; Sauermann et al. 1993 J. Neurosci. Res. 33: 142-7; NCBI Gene ID: 654. La BMP6 también se conoce como: BMP-6; VGR; VGR1; ID externos: OMIM: 112266 MGI: 88182; HomoloGene: 1300; Tarjetas Genéticas: Gen de la BMP6. Ortólogos: Especie: Ser humano: Entrez: 654; Ensembl: ENSG00000153162; UniProt: P22004; RefSeq (ARNm): NM_001718; RefSeq (proteína): NP_001709; Ubicación (UCSC): Cr 6: 7,73-7,88 Mb; Especie: Ratón: Entrez: 12161; Ensembl: ENSMUSG00000039004; UniProt: P20722; RefSeq (ARNm): NM_007556; RefSeq (proteína): NP_031582; Ubicación (UCSC): Cr 13: 38,35-38,5 Mb. Como se describe en el presente documento, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une a la BMP6 se une a la proteína la BMP6.
"BMP2", como se utiliza en el presente documento, significa la proteína Proteína Morfogenética Ósea 2 (BMP2) o un gen o un ácido nucleico que codifique la BMP2. La BMP2 también se conoce como: BDA2; y BMP2A; ID externos OMIM: 112261 MGI: 88177 HomoloGene: 926 GeneCards: Gen de la BMP2. Especie: Ser humano; Entrez: 650; Ensembl: ENSG00000125845; UniProt: P12643; RefSeq (ARNm): NM_001200; RefSeq (proteína): NP_001191; Ubicación (UCSC): Cr 20: 6,75-6,76 Mb. Especie: Ratón; Entrez: 12156; Ensembl: ENSMUSG00000027358; UniProt: P21274; RefSeq (ARNm): NM_007553; RefSeq (proteína): NP_031579; Ubicación (UCSC): Cr 2: 133,55-133,56 Mb. Como se describe en el presente documento, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une a la BMP2 se une a la proteína la BMP2.
"BMP5", como se utiliza en el presente documento, significa la proteína Proteína Morfogenética Ósea 5 (BMP5) o un gen o un ácido nucleico que codifique la BMP5. La BMP5 también se conoce como: MGC34244; ID externos OM<i>M: 112265 MGI: 88181 HomoloGene: 22412 GeneCards: Gen de la BMP5. Especie: Ser humano; Entrez: 653; Ensembl: ENSG00000112175; UniProt: P22003; RefSeq (ARNm): NM_021073; RefSeq (proteína): NP_066551; Ubicación (UCSC): Cr 6: 55,62-55,74 Mb. Especie: Ratón; Entrez: 12160; Ensembl: ENSMUSG00000032179; UniProt: P49003; RefSeq (ARNm): NM_007555; RefSeq (proteína): NP 031581; Ubicación (UCSC): Cr 9: 75,78-75,9 Mb. Como se describe en el presente documento, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une a la BMP5 se une a la proteína la BMP5.
"BMP7", como se utiliza en el presente documento, significa la proteína Proteína Morfogenética Ósea 7 (BMP7) o un gen o un ácido nucleico que codifique la BMP7. La BMP7 también se conoce como: proteína osteogénica-1; OP-1; ID externos OMIM: 112267 MGI: 103302 HomoloGene: 20410 GeneCards: Gen de la b Mp 7. Especie: Ser humano; Entrez: 655; Ensembl: ENSG00000101144; UniProt: P18075; RefSeq (ARNm): NM_001719; RefSeq (proteína): NP_001710; Ubicación (UCSC): Cr 20: 55,74-55,84 Mb. Especie: Ratón; Entrez: 12162; Ensembl: ENSMUSG00000008999; UniProt: P23359; RefSeq (ARNm): NM 007557; RefSeq (proteína): NP_031583; Ubicación (UCSC): Cr 2: 172,87-172,94 Mb. Como se describe en el presente documento, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une a la BMP7 se une a la proteína la BMP7.
"Hepcidina" significa el gen Hepcidina o la proteína Hepcidina, una hormona peptídica. La hepcidina también se conoce como: HAMP (proteína o péptido antimicrobiano hepcidina); HEPC; HFE2B; LEAP1 (LEAP-1); PLTR; OMIM: 606464; HomoloGene: 81623; Tarjetas Genéticas: Gen Ha Mp ; Entrez 57817; Ensembl ENSG00000105697; UniProt P81172; RefSeq (ARNm) NM_021175; RefSeq (proteína) NP_066998; Ubicación (UCSC) Cr 19: 35,77-35,78 Mb. Krause et al. FEBS Lett. 480: 147-150; y Pigeon et al. 2001 J. Biol. Chem. 276: 7811-9. Véase también: Ganz 2003 Blood 102: 783-8; Roy et al. 2005 Curr. Opin. Hemat. 12: 107-111; Fleming et al. 2006 Semin. Liver Dix. 25: 411-9; Park et al. 2001 J. Biol. Chem. 276: 7806-10; Majore et al. 2002 Haematologica 87: 221-2; Kluver et al. 2002 J. Pept. Res. 59: 241-8; Hunter et al.
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36: 40-45.
"Anemia", como se utiliza en el presente documento, significa una disminución del número de glóbulos rojos, o una disminución de la cantidad de hemoglobina o de hierro en la sangre, con una disminución de la capacidad de la sangre para transportar oxígeno.
La anemia puede diagnosticarse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, como ejemplo no limitante, en hombres tomando como base una hemoglobina inferior a aproximadamente de 130 a 140 g/l (de 13 a 14 g/dl) y en mujeres, inferior a aproximadamente de 120 a 130 g/l (de 12 a 13 g/dl). Janz et at 2013 Emerg. Med. Pract. 15: 1-15; y Smith 2010 Am. J. Man. Care 16 Suμl. S59-66.
Como se utilizan en el presente documento, las expresiones "anticuerpo contra la BMP6", "anticuerpo contra la BMP6 humana", "anticuerpo de unión a la BMP6", "anticuerpo antagonista de la BMP6" y similares (y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos) incluyen anticuerpos (y fragmentos de unión al antígeno los mismos) que se unen a la proteína BMP6.
Las expresiones "anticuerpo", "fragmento de unión al antígeno del mismo", "porción de unión al antígeno" y similares, como se utilizan en el presente documento, incluyen anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión al antígeno (es decir, "porción de unión al antígeno") o cadenas únicas de los mismos. Un "anticuerpo" natural es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por puentes de disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2y CH3. Cada una de las cadenas ligeras está compuesta por una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse a su vez en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amínico al extremo carboxílico en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluyendo varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema clásico del complemento.
Las expresiones "fragmento de unión al antígeno", "fragmento de unión al antígeno del mismo", "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo, y similares, como se utilizan en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno dado (por ejemplo, la BMP6). Las funciones de unión al antígeno de un anticuerpo pueden ser realizadas por fragmentos de un anticuerpo intacto. Algunos ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro de la expresión "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F (ab)<2>, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la región de bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo de dominio único (dAb) (Ward et al., 1989 Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH; y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada.
Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes distintos, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un conector peptídico artificial que permite se fabricación como una única cadena de proteínas en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al., 1988 Science 242: 423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena única incluyen una o más "porciones de unión al antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se criban para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
Las porciones de unión al antígeno también se pueden incorporar en anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Las porciones de unión al antígeno de los anticuerpos pueden injertarse en armazones basados en polipéptidos tales como la fibronectina tipo III (Fn3) (véase la Patente de EE.UU. n.° 6.703.199, que describe monocuerpos polipeptídicos de fibronectina).
Las porciones de unión al antígeno se pueden incorporar en moléculas de cadena única que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con los polipéptidos de la cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión al antígeno (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8 (10): 1057-1062; y la Patente de EE.UU. n.° 5.641.870).
Como se utiliza en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de la interacción entre el anticuerpo y el antígeno en sitios antigénicos individuales. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del "brazo" del anticuerpo interactúa mediante fuerzas débiles no covalentes con el antígeno en numerosos sitios; cuantas más interacciones, más fuerte es la afinidad.
Como se utiliza en el presente documento, el término "avidez" se refiere a una medida informativa de la estabilidad o fortaleza global del complejo de antígeno-anticuerpo. Está controlado por tres factores principales: afinidad por el epítopo del anticuerpo; la valencia tanto del antígeno como del anticuerpo; y la disposición estructural de las partes que interactúan. En última instancia, estos factores definen la especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de que el anticuerpo particular se una a un epítopo concreto del antígeno.
El término "aminoácido" se refiere a los aminoácidos naturales y sintéticos así como a los análogos de aminoácidos y a los miméticos de aminoácidos que funcionan es son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gammacarboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono alfa que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfonio de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de una manera similar a un aminoácido natural.
La expresión "especificidad de unión", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la capacidad de un sitio de combinación de anticuerpo individual de reaccionar con solamente un determinante antigénico. El sitio de combinación del anticuerpo está situado en la porción Fab de la molécula y se construye a partir de las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera. La afinidad de unión de un anticuerpo es la fuerza de la reacción entre un determinante antigénico único y un sitio de combinación único en el anticuerpo. Es la suma de las fuerzas de atracción y repulsión que operan entre el determinante antigénico y el sitio de combinación del anticuerpo.
Unión específica entre dos entidades significa una unión con una constante de equilibrio (KA o K<a>) de al menos 1 x 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010M-1 o 1011 M-1. La expresión "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo de unión a la BMP6) se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de un antígeno análogo (por ejemplo, una proteína BMP6 humana) en una población heterogénea de proteínas y otras sustancias biológicas. Además de la constante de equilibrio (KA) indicada anteriormente, un anticuerpo de unión a la BMP6 de la invención también tiene normalmente una constante de velocidad de disociación (Kd o KD o K<d>) de aproximadamente 1 x 10<-2>s-1, 1 x 10-3 s-1, o inferior, y se une a la BMP6 con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad de unión a un antígeno no específico (por ejemplo, la BMP2, la BMP5 o la BMP7). Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan en el presente documento indistintamente con la expresión "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".
Unión específica entre dos entidades significa una unión con una constante de equilibrio (KA) (konz/koff) de al menos 102M-1, al menos 5 x 102M-1, al menos 103M-1, al menos 5 x 103M-4, al menos 104M-1, al menos 5 x 104M-1, al menos 105M-1, al menos 5 x 105M-1, al menos 106M-1, al menos 5 x 106M-1, al menos 107M-1, al menos 5 x 107M-1, al menos 108M-1, al menos 5 x 108M-1, al menos 109M-1, al menos 5 x 109M-1, al menos 1010M-1, al menos 5 x 1010M-1, al menos 1011M-1, al menos 5 x 1011M-1, al menos 1012M-1, al menos 5 x 1012M-1, al menos 1013M-1, al menos 5 x 1013 M-1, al menos 1014M-1, al menos 5 x 1014M-1, al menos 1015M-1, o al menos 5 x 1015M-1.
La expresión "anticuerpo quimérico" (o fragmento de unión al antígeno del mismo) es una molécula de anticuerpo (o fragmento de unión al antígeno del mismo) en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, sustituye o intercambia de modo que el sitio de unión al antígeno (región variable) se une a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o a una molécula totalmente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, una toxina, una hormona, un factor de crecimiento, un fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una parte de la misma, se altera, sustituye o intercambia con una región variable que tenga una especificidad antigénica diferente o alterada. Por ejemplo, un anticuerpo de ratón puede modificarse sustituyendo su región constante por la región constante de una inmunoglobulina humana. Debido al remplazo con una región constante humana, el anticuerpo quimérico puede conservar su especificidad en el reconocimiento del antígeno mientras tiene una antigenicidad reducida en seres humanos en comparación con el anticuerpo de ratón original.
La expresión "variante modificada conservativamente" se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, variantes modificadas conservativamente se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Así, en cada posición donde una alanina está especificada por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácido nucleico del presente documento que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina y TGG, que normalmente es el único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada una de las variaciones silenciosas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada una de las secuencias descritas.
Para las secuencias polipeptídicas, las "variantes modificadas conservativamente" incluyen sustituciones, supresiones o adiciones individuales a una secuencia polipeptídica que dan como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica Dichas variantes modificadas conservativamente se suman y no excluyen las variantes polimórficas, los hom
Los ocho grupos siguientes contienen aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (<i>), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). En un caso, la expresión "modificaciones conservativas de la secuencia" se utiliza para referirse a las modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos.
El término "bloquea", como se utiliza en el presente documento, se refiere a detener o evitar una interacción o un proceso, por ejemplo, detener la señalización dependiente del ligando o independiente del ligando.
El término "reconocer", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que encuentra e interactúa con (por ejemplo, se une a) su epítopo conformacional.
Las expresiones "bloqueo cruzado", "de bloqueo cruzado", "competir", "competencia cruzada" y las expresiones relacionadas se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a la capacidad de un anticuerpo u otro agente de unión de interferir con la unión de otros anticuerpos o agentes de unión a la BMP6 en un ensayo convencional de unión competitiva.
La capacidad o la magnitud con la que un anticuerpo u otro agente de unión es capaz de interferir con la unión de otro anticuerpo o molécula de unión a la BMP6, y por tanto si puede decirse que ejerce un bloqueo cruzado, puede determinarse utilizando ensayos convencionales de unión por competición. Un ensayo adecuado implica el uso de la tecnología Biacore (por ejemplo, utilizando el instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suecia)), que puede medir la magnitud de las interacciones utilizando la tecnología de resonancia de plasmón superficial. Otro ensayo para medir el bloqueo cruzado utiliza una estrategia basada en un ELISA.
El término "neutraliza" significa que un anticuerpo, al unirse a su objetivo, reduce la actividad, el nivel o la estabilidad del objetivo; por ejemplo, un anticuerpo contra la BMP6, tras unirse a la BMP6 neutraliza la BMP6 reduciendo al menos parcialmente una actividad, un nivel o una estabilidad de la BMP6, tal como la señalización o su papel en los niveles de hepcidina y la anemia.
El término "epítopo" significa un determinante proteico capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos consisten habitualmente en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero pero no al último se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.
El término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o de interactuar de otro modo con una molécula. Los determinantes epitópicos consisten generalmente en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, la BMP6 o cadenas laterales de hidratos de carbono o azúcares, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser "lineal" o "conformacional".
La expresión "epítopo lineal" se refiere a un epítopo en el que todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula con la que interactúa (tal como un anticuerpo) se producen linealmente a lo largo de la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína (continua).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10-8 M o menos, 10-9 M o menos o 10-10 M o 10-11 M o menos para un antígeno objetivo, por ejemplo, la BMP6. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, la unión de "alta afinidad" para un isotipo de IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10-7 M o menos o 10-8 M o menos.
La expresión "anticuerpo humano" (o fragmento de unión al antígeno del mismo), como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos (y fragmentos de unión al antígeno de los mismos) que tengan regiones variables en las que tanto la región marco como las regiones CDR deriven de secuencias de origen humano. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también deriva de dichas secuencias humanas, por ejemplo, secuencias de la estirpe germinal humana, o versiones mutadas de secuencias de la estirpe germinal humana. Los anticuerpos humanos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o dirigidain vitroo por mutación somáticain vivo).
Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" (o fragmento de unión al antígeno del mismo), como se utilizan en el presente documento, se refieren a polipéptidos, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos biespecíficos, etc. que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a o derivan de, la misma fuente genética. Este tér de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular.
La expresión "anticuerpo monoclonal humano" (o fragmento de unión al antígeno del mismo) se refiere a anticuerpos (y fragmentos de unión al antígeno de los mismos) que presentan una única especificidad de unión y que tienen regiones variables en las que tanto la región marco como las regiones CDR derivan de secuencias humanas. En un caso, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera fusionado con una célula inmortalizada.
La expresión "anticuerpo humano recombinante" (o fragmento de unión al antígeno del mismo), como se utiliza en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos (y fragmentos de unión al antígeno de los mismos) que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir del mismo, anticuerpos aislados a partir de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma, anticuerpos aislados a partir de una colección recombinante y combinatoria de anticuerpos humanos, y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de la totalidad o una porción de secuencias de un gen de una inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones marco y las regiones CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana. En un caso, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesisin vitro(o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de Ig humanas, a una mutagénesis somáticain vivo)y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de, y relacionadas con, las secuencias VH y VL de la estirpe germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la estirpe germinal de anticuerpos humanosin vivo.
Un anticuerpo "humanizado" (o fragmento de unión al antígeno del mismo), como se utiliza en el presente documento, es un anticuerpo (o fragmento de unión al antígeno del mismo) que conserva la reactividad de un anticuerpo no humano siendo menos inmunógeno en seres humanos. Esto puede conseguirse, por ejemplo, conservando las regiones CDR no humanas y remplazando las partes restantes del anticuerpo por sus equivalentes humanos (es decir, la región constante, así como las porciones de las regiones marco de la región variable). Véase, por ejemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 81: 6851-6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44: 65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28: 489-498, 1991; y Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994. Otros ejemplos de tecnología de genomanipulación humana incluyen, pero no se limitan a, la tecnología Xoma divulgada en la Patente de EE.UU. n.° 5.766.886.
Las expresiones "idéntico" o "identidad" en porcentaje en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, un 60 % de identidad, opcionalmente un 65 %, un 70 %, un 75 % un, 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, o un 99 % de identidad en una región especificada, o, cuando no se especifica, en toda la secuencia), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada como medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias, o por alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferentemente en una región que tiene de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud. Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene al menos 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferentemente en una región que tiene de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.
Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Pueden usarse los parámetros por defecto del programa o pueden indicarse parámetros alternativos. Después, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, tomando como base los parámetros del programa.
Una "ventana de comparación", como se utiliza en el presente documento, incluye referencia a un segmento de uno cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en de 20 a 600, habitualmente de 50 a 200, más habitualmente de 100 a 150, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de manera óptima. Se conocen bien en la técnica métodos de alineación de secuencias para comparación. La alineación óptima de secuencias para comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch J Mol Biol 48: 443, 1970, mediante el método de búsqueda d 44, 1988, mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ed. ringbou, 2003)).
Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, 1977; y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990, respectivamente. El programa informático para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar, en primer lugar, las parejas de secuencias con alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al.,supra).Estos resultados positivos iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que las contengan. Los resultados positivos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en todo lo que pueda aumentar la puntuación acumulada de alineación. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización para restos que no coinciden; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La prolongación de los resultados positivos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación acumulada de alineación desciende en la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la puntuación acumulada llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos de puntuación negativa; o se alcanza el final de alguna secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST<n>(para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (N) de 11, una expectativa (E) o 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valores predeterminados una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915, 1989) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5873-5787, 1993). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma mínima (P (N)), que ofrece una indicación de la probabilidad de que se produzca una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma mínima en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también puede determinarse mediante el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17, 1988) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de restos ponderados PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol. 48: 444-453, 1970) que se ha incorporado al programa GAP del paquete informático GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de separación de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Aparte del porcentaje de identidad de secuencia señalado anteriormente, otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta reactividad inmunológica cruzada con los anticuerpos creados contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por lo tanto, un polipéptido normalmente es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos polipéptidos difieren solamente por sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se describe a continuación. Otra indicación más de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que pueden usarse los mismos cebadores para amplificar la secuencia.
La expresión "anticuerpo aislado" (o fragmento de unión al antígeno del mismo), como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo (o fragmento de unión al antígeno del mismo) que está sustancialmente exento de otros anticuerpos que tengan especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a la BMP6 está sustancialmente exento de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de la BMP6). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otro material celular y/o sustancias químicas.
El término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgE, IgG, tal como IgG1 o IgG4) proporcionada por los genes de la región constante de la cadena pesada. El isotipo también incluye versiones modificadas de una de estas clases, donde se han realizado modificaciones en la función Fc por ejemplo para potenciar o reducir las funciones efectoras o la unión a los receptores Fc.
El término "Kassoc" o "Ka" o "KA" o "K<a>", como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a la tasa de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "Kdis" o "Kd", como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. En una realización, el término "K<d>", como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación, que se obtiene a partir de la relación entre Kd y Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de K<d>de los anticuerpos pueden determinarse mediante métodos bien establecidos en la técnica. Un método para determinar la K<d>de un anticuerpo es la utilización de la resonancia de plasmón superficial, o la utilización de un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®.
Las expresiones "anticuerpo monoclonal" (o fragmento de unión al antígeno del mismo) o "composición de anticuerpo monoclonal (o fragmento de unión al antígeno del mismo)", como se utilizan en el presente documento, se refieren a una preparación de una molécula de anticuerpo (o fragmento de unión al antígeno del mismo) de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular.
La expresión "ácido nucleico" se usa en el presente documento indistintamente con el término "polinucleótido" y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. La expresión engloba ácidos nucleicos que contienen análogos nucleotídicos conocidos o restos de la cadena principal o enlaces modificados, que son sintéticos, naturales y no naturales, que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Algunos ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotiatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, ribonucleótidos 2-O-metílicos, ácidos péptido-nucleicos (PNA).
A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular también engloba de forma implícita variantes modificadas conservativamente de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, como se detalla a continuación, las sustituciones por codones degenerados pueden conseguirse generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o de todos) se sustituye por restos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608, 1985; y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98, 1994).
La expresión "unido operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de polinucleótidos (por ejemplo, ADN). Normalmente se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora de la transcripción con una secuencia transcrita. Por ejemplo, una secuencia promotora o potenciadora está unida operativamente a una secuencia codificante si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula hospedadora apropiada u otro sistema de expresión. Generalmente, las secuencias reguladoras de la transcripción promotoras que están unidas operativamente a una secuencia transcrita están físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, son de acción cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de la transcripción, tales como las potenciadoras, no necesitan estar físicamente contiguas o ubicadas muy próximas a las secuencias codificantes cuya transcripción potencian.
Como se usa en el presente documento, el término "optimizada" significa que una secuencia de nucleótidos se ha alterado para que codifique una secuencia de aminoácidos usando codones que se prefieren en la célula u organismo de producción, en general una célula eucariota, por ejemplo, una célula dePichia,una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada está genomanipulada para retener completamente o tanto como sea posible la secuencia de aminoácidos originalmente codificada por la secuencia de nucleótidos de partida, que también se conoce como la secuencia "precursora". Las secuencias optimizadas del presente documento han sido genomanipuladas para tener codones que se prefieren en células de mamífero. Sin embargo, también se prevé en el presente documento la expresión optimizada de estas secuencias en otras células eucariotas o células procariotas. A las secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos optimizadas también se les denomina optimizadas.
Las expresiones "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Las expresiones se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido que se produce de forma natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que se producen de forma natural y polímeros de aminoácidos que se produce de forma no natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia polipeptídica particular también engloba implícitamente variantes modificadas conservativamente de la misma.
La expresión "anticuerpo humano recombinante" (o fragmento de unión al antígeno del mismo), como se utiliza en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos (y fragmentos de unión al antígeno de los mismos) que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir del mismo, anticuerpos aislados a partir de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma anticuerpos aislados a partir de una colección recombinante y combinatoria de anticuerpos humanos, y anticu dio que implique el corte y empalme de la totalidad o una porción de secuencias de un gen de una inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones marco y las regiones CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana. En un caso, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a una mutagénesisin vitro(o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de Ig humanas, a un mutagénesis somáticain vivo)y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de, y relacionadas con,las secuencias VH y VL de la estirpe germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la estirpe germinal de anticuerpos humanosin vivo.
La expresión "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora") se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que se pretende que dichas expresiones se refieran no solamente a la célula objeto particular, sino también a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula precursora, pero todavía está incluida dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora" como se utiliza en el presente documento.
El término "sujeto" incluye seres humanos y animales no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, gallinas, anfibios y reptiles. Excepto cuando se indique otra cosa, los términos "paciente" o "sujeto" se usan en el presente documento indistintamente.
El término "tratar" incluye la administración de composiciones o anticuerpos para prevenir o retrasar la aparición de los síntomas, complicaciones o indicios bioquímicos de una enfermedad (por ejemplo, anemia), aliviando los síntomas o deteniendo o inhibiendo el desarrollo ulterior de la enfermedad, afección o trastorno. El tratamiento puede ser profiláctico (para impedir o retrasar la aparición de la enfermedad o impedir la manifestación de los síntomas clínicos o subclínicos de la misma) o terapéutico de supresión o alivio de los síntomas tras la manifestación de la enfermedad.
El término "vector" pretende referirse a una molécula de polinucleótido capaz de transportar otro polinucleótido al que ha sido unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN en el genoma vírico. Determinados vectores tienen capacidad de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, los vectores no episómicos de mamífero) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora al introducirse en la célula hospedadora y, por tanto, se replican junto con el genoma hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma más habitualmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como los vectores víricos (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.
El término "hematocrito", como se utiliza en el presente documento, también se conoce como volumen celular empaquetado (PCV) o fracción de volumen eritrocitario (EVF) y es el volumen (%) de glóbulos rojos en la sangre. Normalmente es de aproximadamente un 45 % para los hombres y de aproximadamente un 50 % para las mujeres. Se considera parte integrante de los resultados del hemograma completo de una persona, junto con la concentración de hemoglobina, el recuento de glóbulos blancos y el recuento de plaquetas. En una realización, la anemia se refiere a un hematocrito anormalmente bajo, a diferencia de la policitemia, que es un hematocrito anormalmente alto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Fig. 1A muestra la inhibición de la actividad de la BMP por los anticuerpos antagonistas 5, 6 y 7 en el ensayo del gen indicador. Se muestra la actividad contra BMP2, BMP5, BMP6 y BMP7. La Fig. 1B muestra un ensayo de unión de ELISA que ensaya la unión del Anticuerpo 7 a la BMP6 humana, la BMP7 humana, la BMP5 humana, la BMP6 de ratón, hBaffR, BSA y Neu. En esta figura y en varias otras figuras, y en otras partes de la memoria descriptiva, Ac 5 = Anticuerpo 5; Ac 6 = Anticuerpo 6; y Ac 7 = Anticuerpo 7.
La Fig. 2 muestra los perfiles farmacodinámicos del estudio PK de triaje de dosis única en ratas. Se utilizaron los anticuerpos 5, 6 y 7. Los niveles séricos de hepcidina y hierro se midieron 1 h, 6 h, 1, 2, 4, 8, 16 días después de la dosis (10 mg/kg, IV).
La Fig. 3 muestra los efectos dependientes de la dosis de un anticuerpo contra la BMP6 en los biomarcadores séricos del metabolismo del hierro. Parte superior: Concentración sérica de hIgG a lo largo del tiempo tras una única inyección intravenosa del Anticuerpo 6 a las dosis indicadas Parte inferior: El panel izquierdo es el análisis cuantitativo de la concentración sérica de hepcidina tras una única inyección de Anticuerpo 6 o de IgG humana de control, mientras que el panel derecho es la concentración sérica de hierro.
La Fig. 4 muestra el tratamiento terapéutico del anticuerpo contra la BMP6 en un modelo de ratón de anemia de inflamación resistente a los AEE. Parte superior: Esquema experimental del modelo de anemia de inflamación resistente a los AEE inducida por BA. Parte inferior: Parámetros de eritropoyesis 13 días después del tratamiento con BA. HGB: hemoglobina; HCT: hematocrito; RETA: recuento de reticulocitos; RET-HE: Equivalente de hemoglobina reticulocitaria. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 frente a BA+EPO+hIgG1.
La Fig. 5 muestra el cartografiado lineal de epítopos por HDxMS (intercambio de hidrógeno/deuterio acoplado a espectrometría de masas). Se muestra el epítopo de la BMP6 unido por el Anticuerpo 7 (restos 88-102 de la BMP6 humana (QTLVHLMNPEYVPKP (SEQ ID NO: 92))). Mediante HDxMS se descubrió que el Anticuerpo 676, una versión humanizada de un anticuerpo contra la BMP6 disponible en el mercado, se unía a un epítopo consistente en los restos 23-35 de la BMP6 humana (VSSASDYNSSELK (SEQ ID NO: 95)).
La Fig. 6 muestra el protocolo de la Parte 1 del programa clínico de investigación de la seguridad y la eficacia de los anticuerpos contra la BMP6.
La Fig. 7 muestra el árbol de decisión de ajuste de dosis para el programa clínico de investigación de la seguridad y la eficacia de los anticuerpos contra la BMP6.
La Fig. 8 muestra el protocolo de la Parte 2 del programa clínico de investigación de la seguridad y la eficacia de los anticuerpos contra la BMP6.
La Fig. 9 muestra los perfiles farmacocinéticos de una dosis única del Anticuerpo 7 en ratas macho.
La Fig. 10 muestra los efectos dependientes de la dosis del Anticuerpo 7 en los biomarcadores séricos del metabolismo del hierro en ratas. Se muestra el análisis cuantitativo de la concentración sérica de hepcidina tras una única inyección de Anticuerpo 7 o de control (vehículo) a la dosis indicada. El panel izquierdo muestra una vista ampliada de los efectos en las primeras 24 horas tras la administración.
La Fig. 11 muestra los efectos dependientes del Anticuerpo 7 sobre el hierro sérico en ratas. Se muestra el análisis cuantitativo de la concentración sérica de hierro tras una única inyección de Anticuerpo 7 o de control (vehículo) a la dosis indicada. El panel izquierdo muestra una vista ampliada de los efectos en las primeras 24 horas tras la administración.
La Fig. 12 muestra el perfil de concentración-tiempo de la inyección intravenosa de dosis única del Anticuerpo 7 (3 mg/kg) en macacos. Se representa gráficamente la concentración total del Anticuerpo 7 (tanto libre como unido a la BMP6).
La Fig. 13 muestra la hepcidina sérica y la concentración de Fe en macacos macho tras una única inyección intravenosa del Anticuerpo 7 a una dosis de 3 mg/kg. Se muestran los datos de tres monos diferentes, junto con la media.
DESCRIPCIÓN DETALLADA ADICIONAL
La presente divulgación proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la proteína BMP6, y composiciones farmacéuticas, métodos de producción y métodos de uso de dichos anticuerpos y composiciones.
ANTICUERPOS CONTRA LA BMP6 Y FRAGMENTOS DE UNIÓN AL ANTÍGENO DE LOS MISMOS
La presente invención proporciona anticuerpos aislados y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que se unen a la BMP6 humana y que comprenden: una secuencia VH de la SEQ ID NO: 75; y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 85.
La BMP6, un ligando del factor de crecimiento secretado de la familia BMP, ha sido identificada como un regulador endógeno crítico de la expresión hepática de la hormona del metabolismo del hierro, la hepcidina. Sin quedar ligada a ninguna teoría en particular, esta divulgación sugiere que se espera que un anticuerpo antagonista de la BMP6 como terapia reductora de la hepcidina beneficie a los pacientes con anemia por restricción de hierro al superar la resistencia al agente estimulante de la eritropoyesis (AEE), que aumenta sustancialmente la morbilidad de una enfermedad subyacente y suele ser un factor predictivo de un resultado adverso.
Algunos ejemplos de dichos anticuerpos anti-BMP6 humana son los Anticuerpos 3, 5, 6 y 7, cuyas secuencias se indican en la Tabla 1.
Los Anticuerpos 5, 6 y 7 se unen, todos, con gran afinidad a la BMP6 humana, con alta selectividad sobre la BMP7 humana, la BMP5 humana y la BMP2 humana (véase la Fig. 1A). Todos estos anticuerpos muestran también una disminución de la hepcidina sérica y un aumento del hierro sérico en las ratas (véase la Fig. 2).
Para aportar más pruebas de que dirigirse a esta vía puede conferir una mejora de los criterios de valoración funcionales, ensayamos la capacidad de los anticuerpos específicos contra la BMP6, los Anticuerpos 5 a 7, para modular los biomarcadores séricos del metabolismo del hierro en ratones y ratas normales, y para revertir la anemia resistente a los AEE en un modelo de ratón de anemia de inflamación. Descubrimos que una única inyección de anticuerpo contra la BMP6 a los animales provocaba un aumento sostenido de los niveles séricos de hierro, acompañado de una potente supresión de la hepcidina circulante. Además, el tratamiento terapéutico de los ratones sometidos a una anemia inducida por inflamación mejoró significativamente los parámetros eritropoyéticos en respuesta al tratamiento simultáneo con eritropoyetina.
En esta divulgación, la inhibición de la señalización de la BMP6 en un modelo de ratón de anemia de inflamación mejoró sustancialmente los parámetros de los glóbulos rojos dependientes del hierro.
Los anticuerpos antagonistas de la BMP6 divulgados en el presente documento representan un enfoque terapéutico novedoso para mejorar de forma segura la anemia con hiposensibilidad a la eritropoyetina. Sin quedar ligada a ninguna teoría en particular, esta divulgación sugiere que esto puede ocurrir a través de la movilización y la disponibilidad de las reservas de hierro a la demanda del compartimento eritroide.
En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen con una afinidad 100, 500 o 1000 veces mayor a la proteína BMP6 humana, que a cualquiera de: las proteínas BMP5 humana o BMP7 humana. La especificidad contra la BMP6 sin unirse a la BMP7 es importante, ya que la inactivación de la BMP6 no es mortal para los ratones. Sin embargo, los ratones con la BMP7 inactivada mueren tras nacer con defectos renales, oculares y óseos. Las inactivaciones individuales de cualquiera de los genes no alteran la cardiogénesis, pero una inactivación doble de la BMP6 y la BMP7 demostró tener varios defectos y retrasos en el corazón; los embriones murieron por insuficiencia cardiaca. La BMP7 es importante para impedir la progresión de la cardiopatía crónica asociada a la fibrosis. Por lo tanto, la reactividad cruzada de un anticuerpo anti-BMP6 con BMP7 no es deseable. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento son específicos para BMP6 sobre BMP7; véase, por ejemplo, la Tabla 4A. La Fig. 1B también muestra pruebas de la especificidad de unión a la BMP6 humana sobre las proteínas BMP2, BMP5 y BMP7 humanas. Por el contrario, un anticuerpo contra la BMP6 disponible comercialmente en R&D Systems, por ejemplo, resultó tener una fuerte reactividad cruzada con la BMP7 en un ensayo de gen indicador, e inhibir tanto la BMP6 como la BMP7.
Los anticuerpos de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos monoclonales humanos, aislados como se describe, en los Ejemplos (véase la Sección 6, a continuación).
Algunos ejemplos de dichos anticuerpos anti-BMP6 humana son los Anticuerpos 3, 5, 6 y 7, cuyas secuencias se indican en la Tabla 1.
El anticuerpo madurado 7 deriva de la eliminación de la retromutación a las secuencias de la estirpe germinal/PTM de NOV0442_VL(YGQ), que deriva del resultado positivo de la IgG precursora NOV0442 (VH3_3-15, Vll_le). El Anticuerpo 7 se une con alta afinidad a la BMP6 humana en un ensayo de unión de ELISA, con una selectividad sobre la BMP7 humana de más de 500 veces (es decir, una afinidad por la BMP6 humana más de 500 veces mayor que por la BMP7 humana). Este anticuerpo tampoco tiene actividad detectable frente a la BMP2 o la BMP5 humanas. El péptido BMP6 reconocido por la IgG precursora NOV0442 y el Anticuerpo 7 se muestra en la Fig. 5. El péptido comprende los aminoácidos QTLVHLMNPEYVPKP (SEQ ID NO: 92) de la BMP6 humana. A diferencia de la IgG NOV0442 y el Anticuerpo 7, el mAb507 humanizado (R&D Systems) se une a la secuencia VSSASDYNSSELK (SEQ ID NO: 95) de la BMP6 humana. Por lo tanto, el epítopo reconocido por la IgG NOV0442 y el Anticuerpo 7 representa un nuevo epítopo de la BMP6. El Anticuerpo 7 también inhibe la unión de la BMP6 a los receptoresin vitro.La unión de la BMP6 a BMPR1A se inhibe al máximo en un 59 %; la unión a BMPR1B se inhibe al máximo en un 85 %; y la unión a RGM-c se inhibe al máximo en un 72 %. Un único tratamiento de 10 mg/kg en ratas produjo una supresión sostenida de la hepcidina circulante. La dosis mínima eficaz estimada en ratones es inferior o igual a 0,1 mg/kg. El hierro sérico también mostró un aumento, y la hepcidina mostró un descenso tras una dosis única del Anticuerpo en monos de 3 mg/kg. En ratones, en donde se utilizó el antígeno deBrucella abortuspara simular la anemia, el efecto del tratamiento con el Anticuerpo 7 (2 mg/kg) es coherente con una respuesta eritropoyética clínicamente significativa a la terapia crónica con EPO, con un aumento gradual de la hemoglobina de >2,0 g/dl desde la situación inicial.
En el Anticuerpo 7 se eliminó un posible sitio de modificación postraduccional mediante una mutación N51Q dentro de LCDR2 para aumentar la homogeneidad posterior del producto. El anticuerpo derivado de la región marco VH3/lambdal se genomanipuló para que coincidiera con la secuencia de la estirpe germinal humana más cercana: en VH mediante una mutación V40A, en VL mediante mutaciones D1Q, I2S y la introducción de los aminoácidos Y49 y G50 para reparar la región marco, en la que faltaban inicialmente estos 2 restos
Este trabajo dio como resultado el Anticuerpo 7 (= NOV0958 = NOV0806_VH[V40A]_VL[D1Q, I2S, Y49, G50, N51Q]).
Todos los Anticuerpos 3, 5, 6 y 7 muestran una alta especificidad para la proteína BMP6 humana en comparación con las proteínas BMP2, BMP5 o BMP7 humanas. Se prevé que el epítopo de todos estos anticuerpos sea el mismo, ya que todos derivan de un único Fab precursor antes de la maduración por afinidad. El Anticuerpo 3, por ejemplo, comparte el mismo clon Fab con ambos anticuerpos 5 y 7 antes de la maduración por afinidad de HCDR2. El Anticuerpo 5 deriva de NOV0442 (VH3_3-15, VIl_le) ^ NOV0442_VL(YGQ) ^(maduración por afinidad de HCDR2) ^ Anticuerpo 5. El Anticuerpo 3 deriva de NOV0442 (VH3_3-15,VIl_le) ^ NOV0442_VL(YGS) ^ (maduración por afinidad de HCDR2) ^ Anticuerpo 3. En los Ejemplos se proporcionan detalles adicionales sobre la generación de los anticuerpos descritos en el presente documento.
La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la BMP6 (por ejemplo, la proteína BMP6 humana), comprendiendo dichos anticuerpos un dominio VH indicado en la Tabla 1. La presente divulgación también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la proteína BMP6, comprendiendo dichos anticuerpos una CDR de VH que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR de VH indicadas en la Tabla 1. En particular, la divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la proteína BMP6, comprendiendo dichos anticuerpos (o alternativamente, consistiendo en) una, dos, tres, cuatro, cinco o más CDR de VH que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR de VH indicadas en la Tabla 1.
La divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la BMP6, comprendiendo (o alternativamente, consistiendo en) dichos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos una secuencia de aminoácidos VH indicada en la Tabla 1, en donde no se han mutado más de aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia de la región marco (por ejemplo, una secuencia que no es una CDR) (en donde una mutación es, como varios ejemplos no limitantes, una adición, una sustitución o una deleción). La divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la BMP6, comprendiendo (o alternativamente, consistiendo en) dichos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos una secuencia de aminoácidos VH indicada en la Tabla 1, en donde no se han mutado más de 10 aminoácidos en una secuencia de la región marco (por ejemplo, una secuencia que no es una CDR) (en donde una mutación es, como varios ejemplos no limitantes, una adición, una sustitución o una deleción).
La divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la BMP6, comprendiendo (o alternativamente, consistiendo en) dichos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos una secuencia de aminoácidos VH indicada en la Tabla 1, en donde no se han mutado más de aproximadamente 20 aminoácidos en una secuencia de la región marco (por ejemplo, una secuencia que no es una CDR) (en donde una mutación es, como varios ejemplos no limitantes, una adición, una sustitución o una deleción). La divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la BMP6, comprendiendo (o alternativamente, consistiendo en) dichos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos una secuencia de aminoácidos VH indicada en la Tabla 1, en donde no se han mutado más de 20 aminoácidos en una secuencia de la región marco (por ejemplo, una secuencia que no es una CDR) (en donde una mutación es, como varios ejemplos no limitantes, una adición, una sustitución o una deleción).
La divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la BMP6, comprendiendo (o alternativamente, consistiendo en) dichos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos una secuencia de aminoácidos VL indicada en la Tabla 1, en donde no se han mutado más de aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia de la región marco (por ejemplo, una secuencia que no es una CDR) (en donde una mutación es, como varios ejemplos no limitantes, una adición, una sustitución o una deleción). La divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la BMP6, comprendiendo (o alternativamente, consistiendo en) dichos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos una secuencia de aminoácidos VL indicada en la Tabla 1, en donde no se han mutado más de 10 aminoácidos en una secuencia de la región marco (por ejemplo, una secuencia que no es una CDR) (en donde una mutación es, como varios ejemplos no limitantes, una adición, una sustitución o una deleción).
La divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la BMP6, comprendiendo (o alternativamente, consistiendo en) dichos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos una secuencia de aminoácidos VL indicada en la Tabla 1, en donde no se han mutado más de aproximadamente 20 aminoácidos en una secuencia de la región marco (por ejemplo, una secuencia que no es una CDR) (en donde una mutación es, como varios ejemplos no limitantes, una adición, una sustitución o una deleción). La divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la BMP6, comprendiendo (o alternativamente, consistiendo en) dichos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos una secuencia de aminoácidos VL indicada en la Tabla 1, en donde no se han mutado más de 20 aminoácidos en una secuencia de la región marco (por ejemplo, una secuencia que no es una CDR) (en donde una mutación es, como varios ejemplos no limitantes, una adición, una sustitución o una deleción).
La presente divulgación proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la proteína BMP6, comprend os un dominio VL indicado en la Tabla 1. La presente divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la proteína BMP6, comprendiendo dichos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos una CDR de VL que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR de VL indicadas en la Tabla 1. En particular, la divulgación proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la proteína BMP6, comprendiendo (o alternativamente, consistiendo en) dichos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos una, dos, tres o más CDR de VL que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR de VL indicadas en la Tabla 1.
Otros anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la divulgación incluyen aminoácidos que han sido mutados, pero que tienen al menos un 60, un 70, un 80, un 90 o un 95 por ciento de identidad en las regiones CDR con las regiones CDR representadas en las secuencias descritas en la Tabla 1. En un caso, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en donde no se han mutado más de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos en las regiones<c>D<r>en comparación con las regiones CDR representadas en la secuencia descrita en la Tabla 1.
La presente divulgación también proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican VH, VL, la cadena pesada completa y la cadena ligera completa de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la proteína BMP6. Dichas secuencias de ácidos nucleicos pueden optimizarse para su expresión en células de mamífero (por ejemplo, la Tabla 1 muestra ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos para la cadena pesada y la cadena ligera de los anticuerpos 3, 5, 6 y 7).
TABLA 1. Eemplos de anticuerpos contra la BMP6
Otros anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la divulgación incluyen aquellos en donde los aminoácidos o los ácidos nucleicos que codifican los aminoácidos han sido mutados, pero tienen al menos un 60 un 70, un 80, un 90 o un 95 por ciento de identidad con las secuencias descritas en la Tabla 1. En un caso, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en donde no se han mutado más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en las regiones variables en comparación con las regiones variables representadas en la secuencia descrita en la Tabla 1, conservando sustancialmente la misma actividad terapéutica.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a la BMP6 humana y que comprende: las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 9, 10 y 11, respectivamente, y las secuencias Lc Dr 1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 19, 20 y 21, respectivamente.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a la BMP6 humana y que comprende: las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 12, 13 y 14, respectivamente, y las secuencias L<c>D<r>1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 22, 23 y 24, respectivamente.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a la BMP6 humana y que comprende: las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 29, 30 y 31, respectivamente, y las secuencias Lc Dr 1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 39, 40 y 41, respectivamente.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a la BMP6 humana y que comprende: las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 32, 33 y 34, respectivamente, y las secuencias Lc Dr 1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 42, 43 y 44, respectivamente.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a la BMP6 humana y que comprende: las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 49, 50 y 51, respectivamente, y las secuencias Lc Dr 1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 59, 60 y 61, respectivamente.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a la BMP6 humana y que comprende: las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 52, 53 y 54, respectivamente, y las secuencias L<c>D<r>1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 62, 63 y 64, respectivamente.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a la BMP6 humana y que comprende: las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 69, 70 y 71, respectivamente, y las secuencias Lc Dr 1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 79, 80 y 81, respectivamente.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a la BMP6 humana y que comprende: las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 72, 73 y 74, respectivamente, y las secuencias L<c>D<r>1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 82, 83 y 84, respectivamente.
Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a la BMP6, las secuencias de VH, VL, la cadena ligera completa y la cadena pesada completa (las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos) pueden "mezclarse y emparejarse" para crear otros anticuerpos de unión a la BMP6 y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la divulgación. Dichos anticuerpos de unión a la BMP6 "mezclados y emparejados" pueden ensayarse utilizando los ensayos de unión conocidos en la técnica (por ejemplo, ELISA y otros ensayos descritos en la sección de Ejemplos). Cuando se mezclan y emparejan estas cadenas, una secuencia VH de un emparejamiento VH/VL particular debe reemplazarse por una secuencia VH estructuralmente similar. Asimismo, una secuencia de la cadena pesada completa de un emparejamiento particular de la cadena pesada completa/cadena ligera completa debería reemplazarse por una secuencia de la cadena pesada completa estructuralmente similar. Asimismo, una secuencia VL de un emparejamiento VH/VL particular debería reemplazarse por una secuencia VL estructuralmente similar. Asimismo, una secuencia de la cadena ligera completa de un emparejamiento particular de la cadena pesada completa/cadena ligera completa debería reemplazarse por una secuencia de la cadena ligera completa estructuralmente similar.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos de unión a la BMP6 que comprenden las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera, como se describe en la Tabla 1, o combinaciones de las mismas. Las regiones CDR se definen utilizando el sistema Kabat (Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicación n.° 91-3242) o utilizando el sistema Chothia [Chothia et al. 1987 J. Mol. Biol. 196: 901-917; y Al-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 927-948].
Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a la BMP6 y que la especificidad de unión al antígeno la proporcionan principalmente las regiones CDR1, 2 y 3, las secuencias CDR1, 2 y 3 de VH y CDR1, 2 y 3 de VL pueden "mezclarse y emparejarse" (es decir, las CDR de diferentes anticuerpos pueden mezclarse y emparejarse, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR1,2 y 3 de VH y una CDR12 y 3 de VL para crear otras moléculas de unión a la BMP6 de la divulgación. Dichos anticuerpos de unión os ensayos de unión conocidos en la técnica y los descritos en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA). Cuando las secuencias CDR de VH se mezclan y emparejan, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VH particular debería reemplazarse por una secuencia CDR estructuralmente similar. Asimismo, cuando las secuencias CDR de VL se mezclan y emparejan, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VL particular debería reemplazarse por una secuencia o secuencias CDR de estructura similar. Resultará fácilmente evidente para los expertos habituales en la materia que se pueden crear nuevas secuencias VH y VL mutando una o más secuencias de la región CDR de VH y/o de VL con secuencias estructuralmente similares de las secuencias CDR mostradas en el presente documento para los anticuerpos monoclonales de la presente divulgación.
En consecuencia, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una región de unión al antígeno del mismo que comprende una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 29, 49, 69, 12, 32, 52, 72 o 9; una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 30, 50, 70, 13, 33, 53 o 73; una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 11,31, 51,71, 14, 34, 54 o 74; una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 19, 39, 59, 79, 22, 42, 62 u 82; una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 20, 40, 60, 80, 23, 43, 63 u 83; y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 21, 41, 61, 81, 24, 44, 64 u 84; en donde el anticuerpo se une específicamente a la BMP6.
En un caso, un anticuerpo que se une específicamente a la BMP6 es un anticuerpo que se describe en la Tabla 1.
Como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo humano comprende regiones variables de la cadena pesada o ligera o cadenas pesadas o ligeras completas que son "producto de" o "derivan de" una secuencia de estirpe germinal particular si las regiones variables o las cadenas completas del anticuerpo se obtienen a partir de un sistema que utiliza genes de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana. Dichos sistemas incluyen inmunizar un ratón transgénico que porta genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o cribar una biblioteca de inmunoglobulinas humanas expresadas en fagos con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana puede identificarse como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la estirpe germinal humana y seleccionando la secuencia de la inmunoglobulina de la estirpe germinal humana que es la más cercana en secuencia (es decir, mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de la estirpe germinal, debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas que se producen de forma natural o a la introducción intencionada de mutaciones dirigidas. Sin embargo, en las regiones marco conservadas de VH o VL, un anticuerpo humano seleccionado es normalmente al menos un 90 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana, y contiene restos de aminoácidos que identifican al anticuerpo humano como humano en comparación con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la estirpe germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la estirpe germinal murina). En determinados casos, un anticuerpo humano puede ser al menos un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o al menos un 95 %, o incluso al menos un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la estirpe germinal. Normalmente, un anticuerpo humano recombinante no mostrará más de 10 diferencias de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana en las regiones marco conservadas de VH o VL. En determinados casos, el anticuerpo humano puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la estirpe germinal.
MIEMBROS DE LA FAMILIA DE LA BMP Y LA HEPCIDINA
En una realización, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo que se une específicamente a la BMP6 es un anticuerpo. El anticuerpo o el fragmento de unión del mismo comprende una secuencia Vh de la SEQ ID NO: 75 y una secuencia VL de la Se Q ID NO: 85.
En una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión del mismo se une específicamente a la BMP6 pero no a otras proteínas BMP (tales como la Bm P2, la BMP5 o la BMP7).
La BMP6, un ligando del factor de crecimiento secretado de la familia BMP, es un homodímero unido por disulfuro de 30 kDa en su forma activa madura. La proteína es un miembro de la superfamilia del TGF-beta. Las proteínas morfogenéticas óseas son conocidas por su capacidad para inducir el crecimiento del hueso y el cartílago. La BMP6 es capaz de inducir todos los marcadores osteogénicos en las células madre mesenquimatosas.
Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) son una familia de moléculas de señalización secretadas que pueden inducir un crecimiento óseo ectópico. Las BMP forman Fbeta). Las BMP se identificaron originalmente por la capacidad del extracto de hueso desmineralizado para inducir la osteogénesis endocondralin vivoen un sitio extraesquelético. Tomando como base su expresión temprana en la embriogénesis, la BMP codificada por este gen tiene un papel propuesto en el desarrollo temprano. Además, el hecho de que esta BMP esté estrechamente relacionada con la BMP5 y la BMP7 ha llevado a especular sobre una posible actividad inductora ósea. Se ha identificado una función adicional de la BMP6, como se describe en Nature Genetics April; 41 [4]: 386-8.
Los ratones con la BMP6 inactivada son viables y fértiles, y muestran un desarrollo normal de hueso y de cartílago.
La BMP6 es el regulador clave de la hepcidina, el pequeño péptido secretado por el hígado que es el principal regulador del metabolismo del hierro en los mamíferos. La hepcidina controla tanto la cantidad de hierro alimentario absorbido en el duodeno como el hierro liberado por las células reticuloendoteliales. La hepcidina es regulada al alza por diversos estímulos, que incluyen la inflamación y la sobrecarga de hierro, y a la baja por la anemia, la hipoxia y la deficiencia de hierro.
Sin quedar ligada a ninguna teoría en particular, esta divulgación sugiere que se espera que un anticuerpo antagonista de la BMP6 como terapia reductora de la hepcidina beneficie a los pacientes con anemia por restricción de hierro al superar la resistencia al agente estimulante de la eritropoyesis (AEE), que aumenta sustancialmente la morbilidad de una enfermedad subyacente y suele ser un factor predictivo de un resultado adverso. A través de su interacción con los receptores BMPRi y BMPR2, induce la dimerización de los receptores y la transcripción de la hepcidina. La BMP6 también se une al correceptor HJV en los hepatocitos y las células musculares.
Así, se sabe que la BMP6 aumenta la expresión de la hepcidina. Se sabe que la hepcidina es una hormona clave implicada en la homeostasis del hierro. Los niveles elevados de hepcidina se asocian a una eritropoyesis restringida por el hierro en la AEC.
El documento WO 2010/056981 divulgó que la administración a ratones de un anticuerpo contra la BMP6 disminuía la hepcidina y aumentaba el hierro.
La BMP6 se describe con más detalle en la técnica, por ejemplo: Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759-62; Sauermann et al. 1993 J. Neurosci. Res. 33: 142; Celeste et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 9843; Schluesener et al. 1995 Atherosclerosis 113: 153; Gitelman et al. 1994 J. Cell Biol. 126: 1595; Barnes et al. 1997 W. J. Urol. 13: 337; y Hamdy et al. 1997 Cancer Res. 57: 4427.
La BMP2, al igual que otras proteínas morfogenéticas óseas, desempeña un papel importante en el desarrollo del hueso y el cartílago. Está implicada en la víahedgehog,en la vía de señalización del TGF-beta y en la interacción entra la citocina y el receptor de citocinas. También está implicada en la diferenciación de las células cardiacas y en la transición de epitelial a mesenquimatosa. La BMP2 tiene muchas funciones esenciales, como señalaron Kishimoto et al. 1997 Dev.
124: 4457; Ma et al. 2005 Dev. 132: 5601; Wang et al. Bone 48: 524; y Rosen 2009 Cyt. Growth Fact. Rev. 20: 475. Por lo tanto, es preferible que un anticuerpo contra la BMP6 no se una a la BMP2.
La BMP2 se describe con más detalle en, entre otros: Sampath et al. 1990 J. Biol. Chem. 265: 13198; Chen et al. 2004 Growth Factors 22: 233; Marie et al. 2002 Histol. Histopath. 17: 877; Nickel et al. 2001 J. Bone Joint Surg. 83-A Sup. 1: S7-14; Kirsch et al. 2000 FEBS Lett. 468: 215; Kirsch et al. 2000 EMBO J. 19: 3314; Gilboa et al. 2000 Mol. Biol. Cell 11: 1023.
La BMP5 también es miembro de la superfamilia del TGF-beta. Al igual que otras BMP, es conocida por su capacidad para inducir el desarrollo óseo y cartilaginoso. La BMP5 se expresa en la malla trabecular y la cabeza del nervio óptico, y puede tener un papel en el desarrollo y la función normales. También se expresa en pulmón e hígado.
En la técnica se conoce información adicional sobre la BMP5, por ejemplo, Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759; Beck et al. 2003 BMCNeurosci. 2: 12; Celeste et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 9843; y Sakaue et al. 1996 Biochem. Biophys. Res. Comm. 221: 768.
La BMP7 también es miembro de la superfamilia del TGF-beta. Al igual que otros miembros de la familia de proteínas BMP, desempeña un papel clave en la transformación de las células mesenquimatosas en hueso y cartílago. Induce la fosforilación de SMAD1 y SMADS, que a su vez inducen la transcripción de numerosos genes osteogénicos.
Como ya se ha señalado anteriormente, los ratones con la BMP6 inactivada son viables y fértiles, y muestran un desarrollo normal de hueso y cartílago. Sin embargo, los ratones con la BMP7 inactivada mueren tras nacer con defectos renales, oculares y óseos. Las inactivaciones individuales de cualquiera de los genes no alteran la cardiogénesis, pero una inactivación doble de la BMP6 y la BMP7 demostró tener varios defectos y retrasos en el corazón; los embriones murieron por insuficiencia cardiaca. La BMP7 es importante para impedir la progresión de la cardiopatía crónica asociada a la fibrosis. Por lo tanto, la reactividad cruzada de un anticuerpo anti-BMP6 con BMP7 no es deseable
En la técnica se proporciona información adicional relacionada con la BMP7, por ejemplo, Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759; Clien et al. 2004 Growth Factors 22: 233; Itoh et al. 2001 EMBO J. 20: 4132; Zeisberg et al. 2003 Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285: F1060; Kallui et al. 2009 J. Clin. Invest. 119: 1420; y Wang et al. 2001 J. Am. Soc. Neph. 12: 2392.
La hepcidina es una hormona peptídica también conocida como RAMP (proteína o péptido antimicrobiano de la hepcidina).
Un reciente acontecimiento de duplicación génica en la evolución del ratón ha dado lugar a la presencia de dos genes similares de hepcidina en ratones, Hepcidinl y Hepcidin2. Ilyin et al. 2003 FEBS Lett. 542: 22-26. La hepcidina2 de ratón carece de varios restos conservados que se encuentran en las hepcidinas de los mamíferos. Lou et al. 2004 Blood 103: 2816-2821.
El producto génico de la hepcidina interviene en el mantenimiento de la homeostasis del hierro y es necesario para la regulación del almacenamiento de hierro en los macrófagos y para la absorción intestinal de hierro. Estos péptidos presentan actividad antimicrobiana.
La preproteína (o preprohormona o preprohepcidina) (84 aa) y la proproteína (o prohormona o prohepcidina) (60 aa) se procesan en péptidos maduros de 20, 22 y 25 aminoácidos. El péptido de 25 aa es secretado principalmente por el hígado y se considera el "regulador maestro" del metabolismo del hierro. Los metabolitos de 20 y 22 aa existen en la orina. La región N-terminal de la hepcidina es necesaria para su función; la deleción de los 5 aminoácidos N-terminales provoca la pérdida de la función.
Los péptidos activos de la hepcidina son ricos en cisteínas, que forman enlaces intramoleculares que estabilizan sus estructuras de lámina beta.
La hepcidina se sintetiza principalmente en el hígado, encontrándose cantidades menores en otros tejidos. Bekri et al.
2006 Gastroent. 131: 788-96.
El péptido hepcidina de 25 aa es secretado principalmente por el hígado y se considera el "regulador maestro" del metabolismo del hierro. La hepcidina inhibe el transporte de hierro al unirse al canal de exportación de hierro ferroportina, que se encuentra en la superficie basolateral de los enterocitos intestinales y en la membrana plasmática de las células reticuloendoteliales (macrófagos). Al inhibir la ferroportina, la hepcidina impide que los enterocitos del intestino secreten hierro hacia el sistema porta hepático, reduciendo así funcionalmente la absorción de hierro. La liberación de hierro desde los macrófagos también se ve impedida por la inhibición de la ferroportina; por lo tanto, la hepcidina mantiene la homeostasis del hierro. La actividad de la hepcidina también es parcialmente responsable del secuestro de hierro que se observa en la anemia de inflamación crónica, tal como la enfermedad inflamatoria intestinal, la insuficiencia cardiaca crónica, los carcinomas, la artritis reumatoide y la insuficiencia renal.
Las mutaciones en el gen de la hepcidina causan la hemocromatosis tipo 2B, también conocida como hemocromatosis juvenil, una enfermedad causada por una sobrecarga grave de hierro que provoca miocardiopatía, cirrosis e insuficiencia endocrina. La mayoría de los casos de hemocromatosis juvenil se deben a mutaciones en la hemojuvelina, un regulador de la producción de hepcidina.
Los ratones genomanipulados para que sobreexpresen la hepcidina mueren poco después de nacer con una grave deficiencia de hierro, lo que sugiere un papel fundamental y no redundante en la regulación del hierro. La primera prueba que relacionó la hepcidina con la anemia de inflamación se produjo cuando los investigadores examinaron los tejidos de dos pacientes con tumores hepáticos que presentaban una anemia microcítica grave que no respondía a los suplementos de hierro. El tejido tumoral producía hepcidina en exceso y la extirpación quirúrgica de los tumores curó la anemia.
Hay muchas enfermedades en donde la incapacidad para absorber adecuadamente el hierro contribuye a la deficiencia de hierro y a la anemia ferropénica. El tratamiento dependerá de los niveles de hepcidina, ya que el tratamiento oral será probablemente ineficaz si la hepcidina está bloqueando la absorción entérica.
En una realización, la administración del anticuerpo del fragmento de unión del mismo a la BMP6 reduce la actividad y/o el nivel de hepcidina y, por tanto, es útil en un tratamiento para la anemia. En un caso, la divulgación se refiere a un método para reducir la actividad o el nivel de hepcidina en un paciente que lo necesite, método que comprende la etapa de administrar al paciente un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo contra la BMP6. En una realización, la actividad o el nivel de hepcidina se reduce al menos en un 50 %.
Los inhibidores de la hepcidina, tales como los anticuerpos contra la BMP6, pueden utilizarse para tratar una enfermedad relacionada con la hepcidina. Esto incluye cualquier enfermedad asociada con la hepcidina y/o con una mutación y/o con una sobreexpresión de una hepcidina natural y/o mutante, y/o enfermedades en donde la progresión de la enfermedad se ve favorecida, o el pronóstico empeorado, por la presencia de hepcidina y/o de una mutación y/o de una sobreexpresión de la hepcidina natural y/o mutante, y/o por una eliminación renal reducida de hepcidina a través de la orina. Algunos ejemplos no limitantes de enfermedades relacionadas con la hepcidina incluyen: anemia eritropoyesis deficiente en hierro, hipoferremia, absorción deficiente de hierro ali is, diabetes y múltiples trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la ataxia de Friedrich, insuficiencia cardiaca, insuficiencia renal crónica, síndrome cardiorrenal-anémico, infección, pérdida de sangre, hemólisis, deficiencia de vitamina B12 o folato, hiperparatiroidismo, hemoglobinopatías y neoplasias malignas, cáncer, SIDA, cirugía, retraso del crecimiento y/o alopecia. En una realización, el sujeto es un paciente en diálisis. En una realización, la enfermedad relacionada con la hepcidina es la anemia y el sujeto es un paciente en diálisis. La prevalencia de la anemia resistente al hierro y a los AEE es elevada en la población en hemodiálisis crónica.
La anemia incluye, entre otras, la anemia de enfermedad crónica (AEC), la anemia de insuficiencia renal crónica (IRC), la anemia de cáncer, la anemia resistente a los agentes estimulantes de la eritropoyesis (AEE) y/o la anemia por restricción de hierro.
La anemia de IRC es una complicación frecuente y precoz de la insuficiencia renal crónica. La anemia de cáncer está causada por neoplasias hematológicas y algunos tumores sólidos. Como se define en el presente documento, este término también incluye la anemia inducida por la quimioterapia, que es la anemia causada por agentes quimioterapéuticos. La anemia en las insuficiencias renales crónicas puede empeorar la neuropatía diabética, la enfermedad cardiovascular, la retinopatía y otros problemas. La anemia relacionada con cáncer está asociada a un mayor riesgo de muerte.
Algunas enfermedades crónicas tales como cáncer, las enfermedades renales y los trastornos autoinmunitarios pueden provocar anemia. Las citocinas inflamatorias hiperactivas pueden provocar una desregulación de la homeostasis del hierro, una reducción de la eritropoyesis y una disminución de la vida útil de los glóbulos rojos. Algunos tratamientos para la anemia incluyen la administración de un AEE, eritropoyetina, hierro (como suplemento dietético) o una transfusión de sangre.
La hepcidina es una hormona clave implicada en la homeostasis del hierro. Los niveles elevados de hepcidina se han asociado a una eritropoyesis restringida por el hierro en la AEC. Se sabe que la BMP6 aumenta la expresión de la hepcidina.
A continuación se describen varios tipos de anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos contra la BMP6.
ANTICUERPOS HOMÓLOGOS
En otro caso más, la presente divulgación proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende secuencias de aminoácidos homólogas a las secuencias descritas en la Tabla 1, y dicho anticuerpo se une a la BMP6, y conserva las propiedades funcionales deseadas de dichos anticuerpos descritos en la Tabla 1.
Por ejemplo, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado (o un fragmento funcional de unión al antígeno del mismo) que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16; 36; 56; o 76; la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26; 46; 66; u 86; el anticuerpo se une específicamente a la proteína BMP6, y el anticuerpo puede inhibir la lisis de glóbulos rojos en un ensayo hemolítico, en donde un ensayo hemolítico es conocido en la técnica. En un ejemplo específico, dichos anticuerpos tienen un valor de la CI<50>en un ensayo hemolítico de 20-200 μM cuando se utiliza suero humano empobrecido en BMP6 que se reconstituye con 100 μM de BMP6 humana.
En un caso, las secuencias de aminoácidos de VH y/o de VL pueden ser un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idénticas a las secuencias expuestas en la Tabla 1. En un caso, las secuencias de aminoácidos de VH y/o de VL pueden ser idénticas excepto por una sustitución de aminoácido en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones de aminoácidos. Se puede obtener un anticuerpo con regiones VH y VL que tengan una identidad alta (es decir, un 80 % o más) con las regiones VH y VL de los descritos en la Tabla 1 mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida o mediada por PCR) de moléculas de ácidos nucleicos que codifiquen las SEQ ID NO: 16; 36; 56; o 76; y 26; 46; 66; u 86 respectivamente, seguido del ensayo del anticuerpo alterado codificado para la función conservada utilizando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.
En un caso, las secuencias de aminoácidos completas de la cadena pesada y/o de la cadena ligera pueden ser un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idénticas a las secuencias expuestas en la Tabla 1. Un anticuerpo que tenga una cadena pesada completa y una cadena ligera completa que tengan una identidad alta (es decir, del 80 % o superior) con las cadenas pesadas completas de cualquiera de las SEQ ID NO: 18; 38; 58; o 78 y las cadenas ligeras completas de cualquiera de las SEQ ID NO: 28; 48; 68 u 88 respectivamente, puede obtenerse mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida o mediada por PCR) de moléculas de ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos, respectivamente, seguida del ensayo del anticuerpo alterado codificado para la función conservada utilizando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.
En un caso, las secuencias de nucleótidos completas de la cadena pesada y/o de la cadena ligera pueden ser un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idénticas a las secuencias expuestas en la Tabla 1.
En un caso, las regiones variables de las secuencias de nucleótidos de la cadena pesada y/o de la cadena ligera pueden ser un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idénticas a las secuencias expuestas en la Tabla 1.
Como se utiliza en el presente documento, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, el % de identidad es igual al número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada uno de los huecos, que deben introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes que figuran más adelante.
Adicional o alternativamente, las secuencias de proteínas de la presente invención pueden utilizarse, además, como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Por ejemplo, búsquedas de este tipo se pueden realizar utilizando el programa BLAST (versión 2.0) de Altschul, et al., 1990 J. Mol. Biol. 215: 403-10.
Anticuerpos con modificaciones conservativas
En un caso, un anticuerpo de la divulgación tiene una región variable de la cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de la cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en donde una o más de estas secuencias CDR tienen secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos descritos en el presente documento o en modificaciones conservativas de los mismos, y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos de unión a la BMP6 y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la divulgación. En consecuencia, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o un fragmento funcional de unión al antígeno del mismo, que consiste en una región variable de la cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de la cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en donde: una CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 29, 49, 69, 12, 32, 52, 72, o 9 o variantes conservativas de la misma; una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 30, 50, 70, 13, 33, 53, o 73 o variantes conservativas de la misma; una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 11, 31, 51, 71, 14, 34, 54 o 74 o variantes conservativas de la misma; una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 19, 39, 59, 79, 22, 42, 62 u 82 o variantes conservativas de la misma; una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 20, 40, 60, 80, 23, 43, 63 u 83 o variantes conservativas de la misma; y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 21, 41, 61, 81, 24, 44, 64 u 84 o variantes conservativas de la misma; el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une específicamente a la BMP6 e inhibe la lisis de los glóbulos rojos en un ensayo hemolítico.
En una realización, un anticuerpo de la invención optimizado para su expresión en una célula de mamífero tiene una secuencia de la cadena pesada completa y una secuencia de la cadena ligera completa, en donde una o más de estas secuencias tienen secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos descritos en el presente documento o en modificaciones conservativas de los mismos, y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos de unión a la BMP6 y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención. En consecuencia, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado optimizado para su expresión en una célula de mamífero que consiste en una cadena pesada completa y una cadena ligera completa en donde: la cadena pesada completa tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de las SEQ ID NO: 18; 38; 58; o 78, y modificaciones conservativas de las mismas; y la cadena ligera completa tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de las SEQ ID NO: 28; 48; 68 u 88, y modificaciones conservativas de las mismas; el anticuerpo se une específicamente a la BMP6; y el anticuerpo inhibe la lisis de los glóbulos rojos en un ensayo hemolítico como se describe en el presente documento. En una realización específica, dichos anticuerpos tienen un valor de la CI<50>en un ensayo hemolítico de 20-200 μM cuando se utiliza suero humano empobrecido en BMP6 que se reconstituye con 100 μM de BMP6 humana.
ANTICUERPOS QUE SE UNEN AL MISMO EPÍTOPO
La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos de unión a la BMP6 indicados en la Tabla 1. El epítopo unido por el Anticuerpo 7 se muestra en la Fig. 5. Por lo tanto, se pueden identificar anticuerpos adicionales tomando como base su capacidad de competencia cruzada (por ejemplo de inhibir competitivamente la unión de una forma estad al antígeno de los mismos de la divulgación en ensayos de unión a la BMP6. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente divulgación a la proteína BMP6 demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con ese anticuerpo por la unión a la BMP6; dicho anticuerpo puede, según una teoría no limitante, unirse al mismo epítopo o a uno relacionado (por ejemplo, uno estructuralmente similar o espacialmente próximo) en la BMP6 que el anticuerpo contra el que compite. En cierto caso, el anticuerpo que se une al mismo epítopo de la BMP6 que los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente divulgación es un anticuerpo monoclonal humano. Dichos anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse y aislarse como se describe en el presente documento.
Una vez que se determina un epítopo deseado en un antígeno, es posible generar anticuerpos para ese epítopo, por ejemplo, usando las técnicas descritas en la presente divulgación. Alternativamente, durante el proceso de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos puede dilucidar información sobre epítopos deseables. A partir de esta información, es posible después cribar competitivamente anticuerpos que se unan al mismo epítopo. Un método para lograr esto es realizar estudios de competencia cruzada para encontrar anticuerpos que se unan de manera competitiva entre sí, por ejemplo, los anticuerpos compiten por unirse al antígeno. En la Solicitud de Patente Internacional n.° WO 2003/48731 se describe un procedimiento de alto rendimiento para anticuerpos de "agrupación" basado en su competencia cruzada. Como apreciará un experto en la materia, prácticamente cualquier cosa a la que un anticuerpo pueda unirse específicamente podría ser un epítopo. Un epítopo puede comprender aquellos restos a los que se une el anticuerpo.
Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno objetivo particular reconocerán preferentemente un epítopo en el antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.
Las regiones de un polipéptido dado que incluyen un epítopo pueden identificarse utilizando cualquiera de las diversas técnicas de cartografiado de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epítopos lineales se pueden determinar, por ejemplo, sintetizando simultáneamente un gran número de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a partes de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos todavía están fijados a los soportes. Dichas técnicas son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n° 4.708.871; Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 8: 3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82: 78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23: 709 715. De forma similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de los aminoácidos de la BMP6 tal como, por ejemplo, mediante intercambio de hidrógeno/deuterio, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols,supra.Las regiones antigénicas de las proteínas también se pueden identificar utilizando gráficos convencionales de antigenicidad e hidropatía, tales como aquellos calculados utilizando, por ejemplo, el programa informático Omiga versión 1.0 disponible en Oxford Molecular Group. Este programa informático emplea el método de Hopp/Woods, Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 78: 3824-3828; para determinar perfiles de antigenicidad, y la técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al., (1982) J.Mol. Biol. 157: 105-132; para gráficos de hidropatía.
Anticuerpos genomanipulados y modificados
Un anticuerpo de la divulgación se puede preparar además utilizando un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL mostradas en el presente documento como material de partida para genomanipular un anticuerpo modificado, donde dicho anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas respecto al anticuerpo de partida. Un anticuerpo puede genomanipularse modificando uno o más restos dentro de una o de ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones marco. Adicional o alternativamente, un anticuerpo puede genomanipularse modificando restos dentro de la o las regiones constantes, por ejemplo para alterar la o las funciones efectoras del anticuerpo.
Un tipo de genomanipulación de la región variable que puede realizarse es el injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con antígenos objetivo predominantemente a través de restos de aminoácidos que están ubicados en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Dado que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones antígeno-anticuerpo, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos específicos naturales mediante la construcción de vectores de expresión que incluyan secuencias CDR del anticuerpo específico natural injertadas en secuencias de regiones marco de un anticuerpo diferente con propiedades distintas (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332: 323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321: 522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., EE.UU. 86: 10029-10033; la Patente de EE.UU. n.° 5.225.539 expedida a Winter, y las Patentes de EE.UU. n.os 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 a Queen et al.)
Dichas secuencias de regiones marco pueden obtenerse de bases de datos de ADN públicas o de referencias publicadas que incluyan secuencias genéticas de anticuerpos germinales Por ejemplo en la base de datos de secuencias de la estirpe germinal humana "VBase" (disponible rar secuencias de ADN auténticas de genes de regiones variables de cadenas pesadas y ligeras humanas, así como en Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de los NIH n° 91-32-42; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227: 776-798; y Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24: 827-836.
Un ejemplo de secuencias de regiones marco para usar en los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la divulgación son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias de las regiones marco utilizadas por anticuerpos seleccionados y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la divulgación, por ejemplo, secuencias consenso y/o secuencias de regiones marco utilizadas por los anticuerpos monoclonales de la divulgación. Las secuencias CDR1,2 y 3 de VH, y las secuencias CDR1,2 y 3 de VL, pueden injertarse en regiones marco que tengan una secuencia idéntica a la que se encuentra en el gen de la inmunoglobulina de la estirpe germinal del que deriva la secuencia de la región marco, o las secuencias CDR pueden injertarse en regiones marco que contengan una o más mutaciones en comparación con las secuencias de la estirpe germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que en ciertos casos es beneficioso mutar restos dentro de las regiones marco para mantener o mejorar la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las Patente de EE.UU. n.os 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 a Queen et al.).
Otro tipo de modificación de la región variable es mutar restos de aminoácidos dentro de las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de VH y/o de VL, para mejorar así una o más propiedades de unión (por ejemplo, la afinidad) del anticuerpo de interés, lo que se conoce como "maduración por afinidad". La mutagénesis dirigida o la mutagénesis mediada por PCR puede realizarse para introducir la mutación o mutaciones, y el efecto sobre la unión del anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, puede evaluarse en ensayosin vitrooin vivocomo se describe en el presente documento y se proporciona en los Ejemplos. Se pueden introducir modificaciones conservativas (como las comentadas anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. Además, normalmente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco restos dentro de una región CDR.
INJERTO DE DOMINIOS DE UNIÓN AL ANTÍGENO EN REGIONES MARCO O ARMAZONES ALTERNATIVOS
Puede emplearse una amplia variedad de regiones marco o armazones de anticuerpos/inmunoglobulinas siempre que el polipéptido resultante incluya al menos una región de unión que se una específicamente a la BMP6. Dichas regiones marco o armazones incluyen los 5 idiotipos principales de las inmunoglobulinas humanas, fragmentos de unión al antígeno de las mismas, e incluyen inmunoglobulinas de otras especies animales, preferentemente con aspectos humanizados. Los anticuerpos simples de cadena pesada, tales como los identificados en los camélidos, son de especial interés en este sentido. Los expertos en la materia siguen descubriendo y desarrollando nuevas regiones marco, estructuras y fragmentos.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un método para generar anticuerpos no inmunoglobulínicos utilizando armazones no inmunoglobulínicos en los que se pueden injertar las CDR de la divulgación. Pueden emplearse regiones marco y armazones no inmunoglobulínicos conocidos o futuros, siempre que comprendan una región de unión específica para la proteína BMP6 objetivo. Las regiones marco o los armazones no inmunoglobulínicos conocidos incluyen, pero no se limitan a, fibronectina (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, Mass.), anquirina (Molecular Partners AG, Zúrich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd., Cambridge, Mass., y Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), pequeños inmunofármacos modulares (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, Wash.), maxicuerpos (Avidia, Inc., Mountain View, Calif.), proteína A (Affibody AG, Suecia) y afilina (gamma-cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania).
Los armazones de fibronectina se basan en el dominio de fibronectina de tipo III (por ejemplo, el décimo módulo de la fibronectina de tipo III (dominio 10 Fn3)). El dominio de fibronectina de tipo III tiene 7 u 8 cadenas beta que se distribuyen entre dos láminas beta, que se compactan entre sí para formar el núcleo de la proteína, y además contienen bucles (análogos a las CDR) que conectan las cadenas beta entre sí. y están expuestos a disolventes. Hay al menos tres bucles de este tipo en cada borde del sándwich de láminas beta, donde el borde es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las hebras beta (véase la Patente de EE.UU. n.° 6.818.418). Estos armazones a base de fibronectina no son una inmunoglobulina, aunque el pliegue general está estrechamente relacionado con el del fragmento funcional más pequeño del anticuerpo, la región variable de la cadena pesada, que comprende toda la unidad de reconocimiento del antígeno en la IgG de camello y llama. Debido a esta estructura, el anticuerpo no inmunoglobulínico imita las propiedades de unión al antígeno, que son similares en naturaleza y afinidad para esos anticuerpos. Estos armazones se pueden utilizar en una estrategia de aleatorización de bucle y entremezclado aleatorioin vitroque es similar al proceso de maduración por afinidad de anticuerposin vivo.Estas moléculas a base de fibronectina se pueden utilizar como armazones, donde las regiones de bucle de la molécula se pueden reemplazar por las CDR de la divulgación utilizando las técnicas de clonación convencionales.
La tecnología de la anquirina se basa en el uso de proteínas con módulos de repetición derivados de la anquirina como armazones para portar regiones variables que pueden utilizarse para la unión a diferentes objetivos. El módulo de repetición de anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos consistente en dos hélices alfa antiparalelas y un giro beta. La unión de las regiones variables se optimiza en la mayoría de los casos utilizando la expresión en ribosomas Los avímeros derivan de proteínas que contienen un dominio A natural, tales como la LRP-1. Estos dominios se usan, por su naturaleza, para interacciones proteína-proteína, y en seres humanos más de 250 proteínas se basan estructuralmente en dominios A. Los avímeros consisten en varios monómeros de "dominio A" diferentes (2-10) unidos a través de conectores de aminoácidos. Pueden crearse avímeros que se pueden unir al antígeno objetivo utilizando la metodología descrita, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 20040175756; 20050053973; 20050048512; y 20060008844.
Los ligandos de afinidad de aficuerpos son proteínas pequeñas y sencillas compuestas por un haz de tres hélices basado en el armazón de uno de los dominios de unión a IgG de la Proteína A. La Proteína A es una proteína de superficie de la bacteriaStaphylococcus aureus.Este dominio de armazón consta de 58 aminoácidos, 13 de los cuales están aleatorizados para generar colecciones de aficuerpos con un gran número de variantes de ligando (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n.° 5.831.012). Las moléculas de aficuerpos imitan a los anticuerpos, tienen un peso molecular de 6 kDa, frente al peso molecular de los anticuerpos, que es de 150 kDa. A pesar de su pequeño tamaño, el sitio de unión de las moléculas de aficuerpos es similar al de un anticuerpo.
Las anticalinas son productos desarrollados por la empresa Pieris ProteoLab AG. Derivan de las lipocalinas, un grupo extenso de proteínas pequeñas y robustas que habitualmente están implicadas en el transporte o almacenamiento fisiológico de compuestos químicamente sensibles o insolubles. Varias lipocalinas naturales se encuentran en tejidos humanos o líquidos corporales. La arquitectura de la proteína recuerda a las inmunoglobulinas, con bucles hipervariables en la parte superior de una región marco rígida. Sin embargo, a diferencia de los anticuerpos o sus fragmentos recombinantes, las lipocalinas están compuestas por una única cadena polipeptídica con 160 a 180 restos de aminoácidos, que son ligeramente más grandes que un único dominio de inmunoglobulina. El conjunto de cuatro bucles, que constituye el bolsillo de unión, muestra una plasticidad estructural pronunciada y tolera una diversidad de cadenas laterales. Por lo tanto, el sitio de unión puede remodelarse en un proceso patentado para que reconozca moléculas objetivo indicadas de diferente forma con alta afinidad y especificidad. Una proteína de la familia de las lipocalinas, la proteína de unión a bilina (BBP) dePieris brassicaese ha utilizado para desarrollar anticalinas mutagenizando el conjunto de cuatro bucles. Un ejemplo de una solicitud de patente que describe anticalinas se encuentra en la Publicación PCT n.° WO 199916873.
Las moléculas de afilina son pequeñas proteínas no inmunoglobulínicas que están diseñadas para afinidades específicas hacia proteínas y moléculas pequeñas. Pueden seleccionarse muy rápidamente nuevas moléculas de afilina a partir de dos colecciones, cada una de las cuales se basa en una proteína de armazón de origen humano diferente. Las moléculas de afilina no muestran homología estructural alguna con las proteínas de inmunoglobulina. Actualmente, se emplean dos armazones de afilina, uno de los cuales es gamma cristalina, una proteína estructural del cristalino del ojo humano, y el otro es de proteínas de la superfamilia de la "ubiquitina". Ambos armazones humanos son muy pequeños, muestran estabilidad a altas temperaturas y son casi resistentes a cambios de pH y a los agentes desnaturalizantes. Esta alta estabilidad se debe principalmente a la estructura en lámina beta expandida de las proteínas. En el documento WO200104144 se describen ejemplos de proteínas derivadas de gamma cristalina, y en el documento WO2004106368 se describen ejemplos de proteínas "similares a la ubiquitina".
Los miméticos de epítopos de proteínas (PEM) son moléculas de tamaño medio, cíclicas, similares a los péptidos (PM de 1-2 kDa) que imitan las estructuras secundarias en horquilla beta de las proteínas, la principal estructura secundaria implicada en las interacciones proteína-proteína.
Los anticuerpos de unión a la BMP6 humana pueden generarse mediante métodos que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la tecnología de humanización utilizada para convertir anticuerpos no humanos en anticuerpos humanos genomanipulados. La Publicación de Patente de EE.UU. n° 20050008625 describe un métodoin vivopara sustituir una región variable de un anticuerpo no humano por una región variable humana en un anticuerpo manteniendo las mismas características de unión o proporcionando unas mejores en relación con las del anticuerpo no humano. El método se basa en el reemplazo guiado por epítopo de regiones variables de un anticuerpo de referencia no humano con un anticuerpo totalmente humano. El anticuerpo humano resultante generalmente no está relacionado estructuralmente con el anticuerpo no humano de referencia, pero se une al mismo epítopo en el mismo antígeno que el anticuerpo de referencia. En resumen, el enfoque de sustitución de la complementariedad guiada por epítopo en serie se hace posible estableciendo una competición en células entre un "competidor" y una colección de diversos híbridos del anticuerpo de referencia ("anticuerpos de prueba") por unirse a cantidades limitadas de antígeno en presencia de un sistema indicador que responde a la unión del anticuerpo de prueba al antígeno. El competidor puede ser el anticuerpo de referencia o un derivado del mismo, tal como un fragmento Fv monocatenario. El competidor también puede ser un ligando natural o artificial del antígeno que se une al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia. Los únicos requisitos del competidor son que se una al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y que compita con el anticuerpo de referencia por la unión al antígeno. Los anticuerpos de prueba tienen una región V de unión al antígeno en común del anticuerpo de referencia no humano, y la otra región V elegida al azar de una fuente diversa tal como una colección de repertorio de anticuerpos humanos. La región V común del anticuerpo de referencia sirve como guía, colocando los anticuerpos de prueba en el mismo epítopo en el antígeno y en la misma orientación, de modo que la selección esté sesgada hacia la mayor fidelidad de unión del antígeno al anticuerpo de referencia.
Se pueden usar muchos tipos de sistemas indicadores para detectar las interacciones deseadas entre los anticuerpos de prueba y el antígeno. Por ejemplo, pueden unirse fragmentos indicadores complementarios al antígeno y al anticuerpo de prueba, respectivamente, de modo que la activación del indicador por complementación de fragmentos se produce únicamente cuando el anticuerpo de prueba se une al antígeno. Cuando las fusiones de anticuerpo de prueba- y antígenofragmento indicador se coexpresan con un competidor, la activación del indicador se vuelve dependiente de la capacidad del anticuerpo de prueba para competir con el competidor, que es proporcional a la afinidad del anticuerpo de prueba por el antígeno. Otros sistemas indicadores que pueden utilizarse incluyen el reactivador de un sistema de reactivación indicador autoinhibido (RAIR) como se divulga en la solicitud de patente de EE.UU. Ser. n.° 10/208.730 (Publicación n.° 20030198971), o el sistema de activación competitivo divulgado en la solicitud de patente de EE.UU. Ser. n.° 10/076.845 (Publicación n.° 20030157579).
Con el sistema de reemplazo de complementariedad guiado por epítopos en serie, se realiza una selección para identificar las células que expresen un único anticuerpo de prueba junto con los componentes competidor, antígeno e indicador. En estas células, cada anticuerpo de prueba compite uno a uno con el competidor por la unión a una cantidad limitante de antígeno. La actividad del indicador es proporcional a la cantidad de antígeno unido al anticuerpo de prueba, que a su vez es proporcional a la afinidad del anticuerpo de prueba por el antígeno y la estabilidad del anticuerpo de prueba. Los anticuerpos de prueba se seleccionan inicialmente en función de su actividad con respecto a la del anticuerpo de referencia cuando se expresan como el anticuerpo de prueba. El resultado de la primera ronda de selección es un conjunto de anticuerpos "híbridos", cada uno de los cuales está compuesto por la misma región V no humana del anticuerpo de referencia y una región V humana de la colección, y cada uno de los cuales se une al mismo epítopo del antígeno que el anticuerpo de referencia. Uno de los anticuerpos híbridos más seleccionados en la primera ronda tendrá una afinidad por el antígeno comparable o superior a la del anticuerpo de referencia.
En la segunda etapa de reemplazo de la región V, las regiones V humanas seleccionadas en la primera etapa se usan como guía para la selección de reemplazos humanos para la región V restante del anticuerpo de referencia no humano con una colección diversa de regiones V humanas afines. Los anticuerpos híbridos seleccionados en la primera ronda también se pueden usar como competidores para la segunda ronda de selección. El resultado de la segunda ronda de selección es un conjunto de anticuerpos totalmente humanos que difieren estructuralmente del anticuerpo de referencia, pero que compiten con el anticuerpo de referencia por la unión al mismo antígeno. Algunos de los anticuerpos humanos seleccionados se unen al mismo epítopo en el mismo antígeno que el anticuerpo de referencia. Entre estos anticuerpos humanos seleccionados, uno o más se unen al mismo epítopo con una afinidad que es similar o superior a la del anticuerpo de referencia.
Utilizando uno de los anticuerpos de ratón o quiméricos de unión a la BMP6 descritos anteriormente como anticuerpo de referencia, este método puede emplearse fácilmente para generar anticuerpos humanos que se unan a la BMP6 humana con la misma especificidad de unión y una afinidad de unión igual o mejor. Además, dichos anticuerpos humanos de unión a la BMP6 también pueden obtenerse comercialmente en empresas que producen habitualmente anticuerpos humanos, por ejemplo, KaloBios, Inc. (Mountain View, Calif.).
ANTICUERPOS DE CAMÉLIDOS
Las proteínas de anticuerpos obtenidas de miembros de la familia de los camellos y dromedarios (Camelus bactrianusyCamelus dromaderius),incluyendo los miembros del nuevo mundo, tales como especies de llamas (Lama paceos, Lama glamayLama vicugna),se han caracterizado con respecto al tamaño, la complejidad estructural y la antigenicidad para sujetos humanos. Ciertos anticuerpos IgG de esta familia de mamíferos como se encuentran en la naturaleza carecen de cadenas ligeras y, por lo tanto, son estructuralmente distintos de la estructura cuaternaria típica de cuatro cadenas que tiene dos cadenas pesadas y dos ligeras, para los anticuerpos de otros animales. Véase el documento PCT/EP93/02214 (documento WO 94/04678 publicado el 3 de marzo de 1994).
Una región del anticuerpo camélido, que es el pequeño dominio variable único identificado como VHH, puede obtenerse mediante genomanipulación para producir una pequeña proteína que tenga una alta afinidad por una objetivo, lo que da lugar a una proteína derivada del anticuerpo de bajo peso molecular conocida como "nanocuerpo camélido". Véase la Patente de EE.UU. n.° 5.759.808, publicada el 2 de junio de 1998; véase también Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440 448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; y Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Las colecciones de anticuerpos de camélidos y fragmentos de anticuerpos genomanipulados están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Ablynx, Glient, Bélgica. Al igual que con otros anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de origen no humano, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de camélido puede alterarse recombinantemente para obtener una secuencia que se parezca más a una secuencia humana, es decir, el nanocuerpo puede "humanizarse". Por lo tanto, la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de camélidos para los seres humanos puede reducirse aún más.
El nanocuerpo de camélido tiene un peso molecular de aproximadamente una décima parte del de una molécula de IgG humana, y la proteína tiene un diámetro físico de únicamente unos pocos nanómetros Una consecuencia del pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos nte invisibles para las proteínas de anticuerpos más grandes, es decir, los nanocuerpos de camélidos son útiles como reactivos para detectar antígenos que de otro modo serían crípticos mediante las técnicas inmunológicas clásicas, y como posibles agentes terapéuticos. Por lo tanto, otra consecuencia más del pequeño tamaño es que un nanocuerpo de camélido puede inhibir como resultado de la unión a un sitio específico en una ranura o hendidura estrecha de una proteína objetivo, y por tanto puede servir en una capacidad que se asemeja más a la función de un fármaco clásico de bajo peso molecular que a la de un anticuerpo clásico.
El bajo peso molecular y el tamaño compacto provocan además que los nanocuerpos de camélido sean extremadamente termoestables, estables a pH extremo y a una digestión proteolítica, y poco antigénicos. Otra consecuencia es que los nanocuerpos de camélido se mueven fácilmente desde el sistema circulatorio a los tejidos, e incluso atraviesan la barrera hematoencefálica y pueden tratar trastornos que afectan al tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar adicionalmente el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la solicitud de patente de EE.UU.
20040161738 publicada el 19 de agosto de 2004. Estas características, combinadas con la baja antigenicidad para el ser humano, indican un gran potencial terapéutico. Además, estas moléculas pueden expresarse completamente en células procariotas tales comoE. coli,y se expresan como proteínas de fusión con bacteriófagos, y son funcionales.
En consecuencia, una característica de la presente divulgación es un anticuerpo o nanocuerpo de camélido que tiene una alta afinidad por la BMP6. En un caso del presente documento, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se produce de forma natural en el animal camélido, es decir, es producido por el camélido tras la inmunización con BMP6 o un fragmento peptídico de la misma, utilizando las técnicas descritas en el presente documento para otros anticuerpos. Alternativamente, el nanocuerpo de camélido de unión a la BMP6 es genotecnológico, es decir, se produce por selección, por ejemplo, a partir de una colección de fagos que expresan proteínas de nanocuerpos de camélido apropiadamente mutagenizadas mediante procedimientos de selección con la BMP6 como objetivo, como se describe en los ejemplos del presente documento. Los nanocuerpos genomanipulados pueden además personalizarse mediante genomanipulación para que tengan una semivida en un sujeto receptor de entre 45 minutos y dos semanas. En una realización específica, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se obtiene injertando las secuencias CDR de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos humanos de la invención en secuencias de la región marco del anticuerpo o del nanocuerpo o de dominio único, como se describe, por ejemplo, en el documento PCT/EP93/02214.
MOLÉCULAS BIESPECÍFICAS Y ANTICUERPOS MULTIVALENTES
En otro aspecto, la presente invención presenta moléculas biespecíficas o multiespecíficas que comprenden un anticuerpo de unión a la BMP6, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o las regiones de unión al antígeno del mismo, puede derivatizarse o unirse a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se una al menos a dos sitios de unión o moléculas objetivo diferentes. El anticuerpo de la invención puede, de hecho, derivatizarse o unirse a más de otra molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión y/o moléculas objetivo diferentes; dichas moléculas multiespecíficas también pretenden estar englobadas en la expresión "molécula biespecífica" como se utiliza en el presente documento. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención puede unirse funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a otra o más moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un péptido o un mimético de unión, de forma que resulte una molécula biespecífica.
En consecuencia, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para BMP6 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo objetivo. Por ejemplo, el segundo epítopo objetivo es otro epítopo de la BMP6 diferente del primer epítopo objetivo.
Adicionalmente, para la invención en la que la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir, además, una tercera especificidad de unión, además del primer y segundo epítopo objetivo.
En un caso, las moléculas biespecíficas descritas en el presente documento comprenden como especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, por ejemplo, Fab, Fab', F (ab')2, Fv o Fv de cadena única. El anticuerpo también puede ser un dímero de la cadena ligera o de la cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo, tal como un Fv o una construcción de la cadena única, como se describe en Ladner et al. Patente de EE.UU. n.° 4.946.778.
Los diacuerpos son moléculas bivalentes y biespecíficas en las que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, conectada por un conector demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Los dominios VH y VL se emparejan con dominios complementarios de otra cadena, creando así dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 6444-6448; Poijal: et al., 1994 Structure 2: 1121-1123). Los diacuerpos pueden producirse expresando dos cadenas polipeptídicas con la estructura VHA-VLB y VHB-VLA (configuración VH-VL) o VLA-V<h>B y VLB-<v>H<a>(configuración VL-VH) dentro de la misma célula. La mayoría de ellos puede expresarse en forma soluble en bacterias. Los diacuerpos de cadena única (scDb) se producen conectando las dos cadenas polipeptídicas que forman los diacuerpos con un conector de aproximadamente 15 restos de aminoácidos (v 28 30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1): 21-36). Los scDb pueden expresarse en bacterias en una forma monómera soluble y activa (véase Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1): 21-36; Pluckthun y Pack, 1997 Immunotechnology, 3 (2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9 (7): 617-21). Un diacuerpo puede fusionarse con un Fc para generar un "di-diacuerpo" (véase Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279 (4): 2856-65).
Otros anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas biespecíficas de la invención son anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.
Las moléculas biespecíficas de la presente invención pueden prepararse conjugando las especificidades de unión constituyentes, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica puede generarse por separado y conjugarse a continuación entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede utilizar una diversidad de agentes de acoplamiento o reticulación para la conjugación covalente. Algunos ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-5-acetiltioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y 4-(N-maleimidometil)ciclohaxan-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véanse, por ejemplo, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82: 8648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. n.° 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229: 81-83) y Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, Ill.).
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, pueden conjugarse mediante una unión de sulfhidrilo de las regiones de bisagra carboxiterminales de las dos cadenas pesadas. En una realización particular, la región de bisagra se modifica para que contenga un número impar de restos de sulfhidrilo, por ejemplo uno, antes de la conjugación.
Alternativamente, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula hospedadora. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión mAb X mAb, mAb X Fab, Fab X F (ab')2o ligando X Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de cadena única que comprenda un anticuerpo de cadena única y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de cadena única que comprenda dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas monocatenarias. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n.° 5.260.203; la Patente de EE.<u>U. n.° 5.455.030; la Patente de EE.UU. n.° 4.881.175; la Patente de EE.UU. n.° 5.132.405; la Patente de EE.UU. n.° 5.091.513; la Patente de EE.UU. n.° 5.476.786; la Patente de EE.UU. n.° 5.013.653; la Patente de EE.UU. n.° 5.258.498; y la Patente de EE.UU. n.° 5.482.858.
La unión de las moléculas biespecíficas a sus objetivos específicos se puede confirmar, por ejemplo, mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), un radioinmunoensayo (REA), un análisis por FACS, un bioensayo (por ejemplo, de inhibición del crecimiento) o un ensayo de inmunoelectrotransferencia. Cada uno de estos ensayos detecta, en general, la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de especial interés empleando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés.
En otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos multivalentes que comprenden al menos dos porciones de unión al antígeno idénticas o diferentes de los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención que se unen a la BMP6. Las porciones de unión al antígeno pueden estar unidas entre sí mediante fusión de proteínas o un enlace covalente o no covalente. Alternativamente, se han descrito métodos de unión para las moléculas biespecíficas. Los compuestos tetravalentes pueden obtenerse, por ejemplo, reticulando los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención con un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno que se una a las regiones constantes de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención, por ejemplo, la región Fc o bisagra.
Los dominios de trimerización se describen, por ejemplo, en la patente de Borean EP 1 012 280B1. Los módulos pentamerizantes se describen, por ejemplo, en el documento PCT/EP97/05897.
ANTICUERPOS CON UNA SEMIVIDA PROLONGADA
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la BMP6 y que tienen una semivida prolongadain vivo.
Muchos factores pueden afectar a la semivida de una proteínain vivo.Por ejemplo, la filtración renal, el metabolismo hepático, la degradación por enzimas proteolíticas (proteasas) y las respuestas inmunógenas (por ejemplo, la neutralización de proteínas por anticuerpos y la captación por macrófagos y células dentríticas). Se pueden utilizar diversas estrategias para prolongar la semivida de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente invención. Por ejemplo, mediante enlace químico con polietilenglicol (PEG), reCODE PEG, armazón de anticuerpos, ácido polisiálico (PSA), hidroxietilalmidón (HES) ligandos de unión a albúmina y protectores de hidratos de carbono; por fusión genética a proteínas que se na; mediante acoplamiento (genética o químicamente) a otras fracciones de unión que se unen a proteínas séricas, tales como nanocuerpos, Fab, DARPin, avímeros, aficuerpos y anticalinas; por fusión genética con rPEG, albúmina, dominio de albúmina, proteínas de unión a albúmina y Fc; o por incorporación en nanoportadores, formulaciones de liberación lenta o dispositivos médicos.
Para prolongar la circulación sérica de los anticuerposin vivo,se pueden unir moléculas poliméricas inertes, tales como PEG de alto peso molecular, a los anticuerpos o a un fragmento de los mismos con o sin un conector multifuncional, ya sea mediante una conjugación específica del PEG al extremo amínico o carboxílico de los anticuerpos o a través de grupos épsilon-amino presentes en los restos de lisina. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno del mismo, se hace reaccionar normalmente con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o un derivado aldehído de PEG, en unas condiciones en las que uno o más grupos de PEG se unan al anticuerpo o al fragmento de anticuerpo. La pegilación puede llevarse a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de PEG (o un polímero reactivo hidrosoluble análogo). Como se utiliza en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende englobar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivatizar otras proteínas, tales como mono (C1-C10) alcaloxi- o ariloxipolietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En una realización, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Se utilizará una derivatización polimérica lineal o ramificada que produzca una pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación puede controlarse estrechamente mediante una SDS-PAGE y una espectrometría de masas, para garantizar una conjugación apropiada de las moléculas de PEG con los anticuerpos. El PEG sin reaccionar puede separarse de los conjugados de anticuerpo-PEG por cromatografía de exclusión por tamaños o de intercambio iónico. Los anticuerpos derivatizados con PEG pueden someterse a pruebas de actividad de unión, así como de eficaciain vivo,mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante los inmunoensayos descritos en el presente documento. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la técnica y pueden aplicarse a los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0154316 de Nishimura et al. y EP 0401 384 de Ishikawa et al.
Otras tecnologías de pegilación modificadas incluyen la reconstitución de la tecnología de genomanipulación dirigida químicamente ortogonal (ReCODE PEG), que incorpora cadenas laterales químicamente especificadas en proteínas biosintéticas a través de un sistema reconstituido que incluye ARNt sintetasa y ARNt. Esta tecnología permite incorporar más de 30 nuevos aminoácidos a proteínas biosintéticas en células deE. coli,de levadura y de mamífero. El ARNt incorpora un aminoácido normativo en cualquier lugar en el que se sitúe un codón ámbar, convirtiendo el ámbar de un codón finalizador a uno que señala la incorporación del aminoácido químicamente especificado.
También se puede usar la tecnología de pegilación recombinante (rPEG) para prolongar la semivida sérica. Esta tecnología implica fusionar genéticamente una cola de proteína no estructurada de 300-600 aminoácidos a una proteína farmacéutica existente. Dado que el peso molecular aparente de dicha cadena proteica no estructurada es unas 15 veces mayor que su peso molecular real, la semivida sérica de la proteína aumenta considerablemente. A diferencia de la PEGilación tradicional, que requiere una conjugación química y una repurificación, el proceso de elaboración se simplifica enormemente y el producto es homogéneo.
La polisialización es otra tecnología, que usa el polímero natural ácido polisiálico (PSA) para prolongar la vida activa y mejorar la estabilidad de péptidos y proteínas terapéuticos. El PSA es un polímero de ácido siálico (un azúcar). Cuando se usa para la administración de proteínas y péptidos terapéuticos, el ácido polisiálico proporciona un microentorno protector en la conjugación. Esto aumenta la vida activa de la proteína terapéutica en la circulación y evita que sea reconocida por el sistema inmunitario. El polímero de PSA se encuentra de forma natural en el cuerpo humano. Fue adoptado por ciertas bacterias que evolucionaron durante millones de años para recubrir sus paredes con él. Estas bacterias polisialiladas de forma natural podían entonces, debido al mimetismo molecular, frustrar el sistema de defensa del organismo. El PSA, la tecnología encubierta definitiva de la naturaleza, puede producirse fácilmente a partir de dichas bacterias en grandes cantidades y con unas características físicas predeterminadas. El PSA bacteriano es completamente no inmunógeno, incluso cuando se acopla a proteínas, ya que es químicamente idéntico al PSA del cuerpo humano.
Otra tecnología incluye el uso de derivados de hidroxietilalmidón ("HES") unidos a anticuerpos. El HES es un polímero natural modificado derivado del almidón de maíz ceroso y puede ser metabolizado por las enzimas del organismo. Habitualmente se administran soluciones de HES para sustituir un volumen de sangre insuficiente y para mejorar las propiedades reológicas de la sangre. La hesilación de un anticuerpo posibilita la prolongación de la semivida en circulación aumentando la estabilidad de la molécula, así como reduciendo el aclaramiento renal, provocando una actividad biológica aumentada. Variando diferentes parámetros, tales como el peso molecular de HES, puede personalizarse una amplia gama de conjugados de HES y anticuerpo.
Los anticuerpos que tienen una semivida aumentadain vivotambién pueden generarse introduciendo una o más modificaciones de aminoácidos (es decir, sustituciones, inserciones o deleciones) en un dominio constante de IgG o en un fragmento de unión a FeRn del mismo (preferentemente un fragmento de dominio Fc o Fc de bisagra). Véanse, por ejemplo, la Publicación Internacional n° WO 98/23289; la publicación internacional n° WO 97/34631; y la Patente de EE.UU. n.° 6.277.375.
Además, los anticuerpos pueden conjugarse con albúmina para que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo sea más establein vivoo tenga una semivida más largain vivo.Las técnicas son bien conocidas en la técnica, véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales n.° WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y la Patente Europea n.° EP 413.622.
Las estrategias para aumentar la semivida son especialmente útiles en nanocuerpos, fijadores basados en fibronectina y otros anticuerpos o proteínas para los que se desea una mayor semividain vivo.
CONJUGADOS DE ANTICUERPOS
La presente invención proporciona anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen específicamente a la BMP6 fusionados recombinantemente o conjugados químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) a una proteína o un polipéptido heterólogo (o un fragmento de unión al antígeno de los mismos, preferentemente a un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. En particular, la invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab)<2>, un dominio VH, una CDR de VH, un dominio VL o una CDR de VL) y una proteína, un polipéptido o un péptido heterólogo. Los métodos para fusionar o conjugar proteínas, polipéptidos o péptidos con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de E<e>.UU. n.os 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851 y 5.112.946; las Patentes Europeas n.os. EP 307.434 y EP 367.166; las Publicaciones Internacionales n.osWO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154: 5590-5600; y Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 11337-11341.
Se pueden generar proteínas de fusión adicionales a través de las técnicas de entremezclado de genes, entremezclado de motivos, entremezclado de exones y/o entremezclado de codones (denominadas en conjunto "entremezclado de ADN"). El entremezclado de ADN puede emplearse para alterar las actividades de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos con unas afinidades más altas y unas velocidades de disociación más bajas). Véanse, en general, las Patentes de EE.UU. n.os 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 y 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2): 76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287: 265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2): 308-313.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos, o los anticuerpos codificados y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos, pueden alterarse sometiéndolos a una mutagénesis aleatoria mediante una PCR propensa a errores, una inserción aleatoria de nucleótidos u otros métodos antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifica un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la BMP6 puede recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
Además, los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tales como un péptido, para facilitar la purificación. En una realización, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina (SEQ ID NO: 96), tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 821-824, por ejemplo, la hexahistidina (SEQ ID NO: 96) proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hemaglutinina ("HA"), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., 1984, Cell 37: 767), y la etiqueta "flag".
En una realización, los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente invención, fragmentos de unión al antígeno de los mismos conjugados con un agente de diagnóstico o detectable. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para controlar o pronosticar la aparición, el desarrollo, la progresión y/o la gravedad de una enfermedad o un trastorno como parte de un procedimiento de análisis clínico, tal como para determinar la eficacia de una terapia en particular. Dicho diagnóstico y detección pueden llevarse a cabo acoplando el anticuerpo a sustancias detectables que incluyen, pero no se limitan a, diversas enzimas, tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como, pero no se limitan a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no se limitan a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero no se limitan a, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero no se limitan a, luciferasa, luciferina y ecuorina; materiales radiactivos, tales como, pero no se limitan a, yodo (131I, 125I, 123I y 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In y 111 In), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga) paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Tin; y metales emisores de positrones mediante diversas tomografías por emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.
La presente invención engloba además usos médicos de anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos conjugados con un resto terapéutico. Un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede conjugarse con un resto terapéutico tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo, por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células.
Además, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede conjugarse con un resto terapéutico o un resto de fármaco que modifique una respuesta biológica dada. Los restos terapéuticos o restos de fármacos no deben interpretarse como limitados a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína, un péptido o un polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina colérica o toxina diftérica; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón alfa, interferón beta, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador tisular del plasminógeno, un agente apoptótico, un agente antiangiogénico; o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina.
Además, un anticuerpo puede conjugarse con restos terapéuticos tales como un ion metálico radiactivo, tales como emisores alfa tales como 213Bi, o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos, que incluyen, pero no se limitan a, 131In, 131Lu, 131Y, 131Ho, 131Sm, con polipéptidos. En una realización, el quelante macrocíclico es el ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,N',N",N"'-tetraacético (DOTA) que puede ser fijado al anticuerpo a través de una molécula conectora. Dichas moléculas conectoras son comúnmente conocidas en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4 (10): 2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4): 553-7; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26 (8): 943-50.
Las técnicas para conjugar restos terapéuticos con anticuerpos son bien conocidas; véase, por ejemplo, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985) y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58.
Los anticuerpos también pueden fijarse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o la purificación del antígeno objetivo. Dichos soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.
MÉTODOS DE PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS
Ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos
La invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos sustancialmente purificadas que codifican polipéptidos que comprenden segmentos o dominios de las cadenas de anticuerpos de unión a la BMP6 de la invención.
Algunos de los ácidos nucleicos de la divulgación comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 16; 36; 56; o 76, y/o la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 26; 46; 66; u 86. En un caso, las moléculas de ácidos nucleicos son las identificadas en la Tabla 1. Algunas otras moléculas de ácidos nucleicos de la divulgación comprenden secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos un 65, un 80 %, un 95 % o un 99 %) a las secuencias de nucleótidos de los identificados en la Tabla 1. Cuando se expresan a partir de vectores de expresión apropiados, los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos son capaces de presentar capacidad de unión al antígeno BMP6.
También se proporcionan en la divulgación polinucleótidos que codifican al menos una región CDR y normalmente las tres regiones<c>D<r>de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de unión a la BMP6 expuesto en la Tabla 1. Algunos otros polinucleótidos codifican toda o sustancialmente toda la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o de la cadena ligera del anticuerpo de unión a la BMP6 expuesto en la Tabla 1. Debido a la degeneración del código, varias secuencias de ácidos nucleicos codificarán cada una de las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas.
Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden codificar tanto una región variable como una región constante del anticuerpo. Algunas de las secuencias de ácidos nucleicos de la divulgación comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de la región variable de la cadena pesada madura que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos en un 80 %, un 90 % o un 99 %) a la secuencia de la región variable de la cadena pesada madura expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 16; 36; 56; u 76. Algunas otras secuencias de ácidos nucleicos que comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de región variable de la cadena ligera madura que es sustancialmente idéntica (por ejemplo al menos el 80 %, 90%o 99 %) a la secuencia de región variable de la cadena ligera madura expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 26; 46; 66; u 86.
Las secuencias de polinucleótidos se pueden producir por síntesis de ADN en fase sólidade novoo por mutagénesis por PCR de una secuencia existente (por ejemplo, secuencias como se describen en los siguientes Ejemplos) que codifique un anticuerpo de unión a la BMP6 o su fragmento de unión. La síntesis química directa de ácidos nucleicos se puede realizar mediante métodos conocidos en la técnica, tales como el método del fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90; el método del fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109, 1979; el método del dietilfosforoamidito de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859, 1981; y el método de soporte sólido de la patente de EE.UU. n.° 4.458.066. La introducción de mutaciones en una secuencia de polinucleótidos por PCR se puede realizar como se describe, por ejemplo, en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19: 967, 1991; y Eckert et al., PCR Methods and Applications 1: 17, 1991.
También se proporcionan en la invención vectores de expresión y células hospedadoras para producir los anticuerpos de unión a la b Mp6 de la invención. Pueden emplearse diversos vectores de expresión para expresar los polinucleótidos que codifican las cadenas de anticuerpos de unión a la BMP6 o los fragmentos de unión. Pueden utilizarse vectores de expresión tanto víricos como no víricos para producir los anticuerpos en una célula hospedadora de mamífero. Los vectores y sistemas no víricos incluyen plásmidos, vectores episomales, normalmente con un casete de expresión para expresar una proteína o un ARN, y cromosomas humanos artificiales (véase, por ejemplo, Harrington et al., Nat Genet.
15: 345, 1997). Por ejemplo, algunos vectores no víricos útiles para la expresión de los polinucleótidos y polipéptidos de unión a la BMP6 en células de mamífero (por ejemplo, humanas) incluyen pThioHis A, B y C, pcDNA3.I/His, pEBVHis A, B & C, (Invitrogen, San Diego, Calif.), vectores MPSv y otros numerosos vectores conocidos en la técnica para expresar otras proteínas. Algunos vectores víricos útiles incluyen los vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus, vectores basados en SV40, papilomavirus, virus de Epstein Barr HBP, vectores de virus de la variolovacuna y virus del bosque Semliki (SFV). Véase, Brent et al.,supra;Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49: 807, 1995; y Rosenfeld et al., Cell 68: 143, 1992.
La elección del vector de expresión depende de las células hospedadoras previstas en las que se vaya a expresar el vector. Normalmente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (por ejemplo, potenciadores) que están unidos operativamente a los polinucleótidos que codifican un fragmento de unión al antígeno de la cadena del anticuerpo de unión a la BMP6. En una realización, se emplea un promotor inducible para prevenir la expresión de secuencias insertadas, excepto en condiciones de inducción. Algunos promotores inducibles incluyen, por ejemplo, arabinosa, lacZ, promotor de metalotioneína o promotor de choque térmico. Se pueden expandir cultivos de organismos transformados en condiciones no inductoras sin sesgar la población para codificar secuencias, cuyos productos de expresión son mejor tolerados por las células hospedadoras. Además de los promotores, también pueden ser necesarios o deseados otros elementos reguladores para la expresión eficaz de un fragmento de unión al antígeno de la cadena del anticuerpo de unión a la BMP6. Estos elementos incluyen normalmente un codón de inicio ATG y un sitio de unión al ribosoma adyacente u otras secuencias. Además, la eficacia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véase, por ejemplo, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125, 1994; y Bittner et al., Meth. Enzymol., 153: 516, 1987). Por ejemplo, puede utilizarse el potenciador SV40 o el potenciador CMV para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamífero.
Los vectores de expresión también pueden proporcionar una posición de la secuencia de la señal de secreción para formar una proteína de fusión con polipéptidos codificados por secuencias insertadas del anticuerpo de unión a la<b>MP6. Más a menudo, las secuencias insertadas del anticuerpo de unión a la BMP6 están unidas a una secuencia de señalización antes de su inclusión en el vector. Los vectores que se utilizarán para recibir las secuencias que codifican los dominios variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo de unión a la BMP6 a veces también codifican regiones constantes o partes de las mismas. Dichos vectores permiten la expresión de las regiones variables como proteínas de fusión con las regiones constantes, conduciendo así a la producción de anticuerpos intactos y de fragmentos de unión al antígeno de los mismos. Normalmente, dichas regiones constantes son humanas.
Las células hospedadoras para albergar y expresar las cadenas del anticuerpo de unión a la BMP6 pueden ser procariotas o eucariotas.E. colies un hospedador procariota útil para clonar y expresar los polinucleótidos de la presente invención. Otros hospedadores microbianos adecuados para usar incluyen bacilos, tales comoBacillus subtilis,y otras enterobacterias, tales comoSalmonella, Serratiay varias especies dePseudomonas.En estos hospedadores procariotas también se pueden producir vectores de expresión, que normalmente contienen secuencias de control de la expresión compatibles con la célula hospedadora (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estará presente cualquier número de una diversidad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de betalactamasa o un sistema promotor del fago lambda. Los promotores controlan normalmente la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen secuencias de sitios de unión a ribosomas y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción. También pueden emplearse otros microbios, tales como una levadura, para expresar los polipéptidos de unión a la BMP6 de la invención. También pueden utilizarse células de insecto en combinación con vectores de baculovirus
En una realización, se utilizan células hospedadoras de mamífero para expresar y producir los polipéptidos de unión a la BMP6 de la presente invención. Por ejemplo, pueden ser una estirpe celular de hibridoma que exprese genes de inmunoglobulina endógenos (por ejemplo, el clon de hibridoma de mieloma 1D6.C9 como se describe en los Ejemplos) o una estirpe celular de mamífero portadora de un vector de expresión exógeno (por ejemplo, las células de mieloma SP2/0 ejemplificadas más adelante). Éstas incluyen cualquier célula humana o animal mortal normal o inmortal normal o anormal. Por ejemplo, se han desarrollado varias estirpes celulares hospedadoras adecuadas, capaces de secretar inmunoglobulinas intactas, que incluyen las estirpes celulares CHO, diversas estirpes celulares Cos, células HeLa, estirpes celulares de mieloma, linfocitos B transformados e hibridomas. El uso de un cultivo de células tisulares de mamífero para expresar polipéptidos se analiza, en general, por ejemplo, en Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, NY, NY, 1987. Los vectores de expresión para células hospedadoras de mamíferos pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (véase, por ejemplo, Queen, et al., Immunol. Rev. 89: 49-68, 1986) y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Estos vectores de expresión contienen habitualmente promotores derivados de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Los promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos del tipo celular, específicos de la fase y/o modulables o regulables. Algunos promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, el promotor de metalotioneína, el promotor tardío principal de adenovirus constitutivo, el promotor de MMTV inducible por dexametasona, el promotor de SV40, el promotor de MRP poIIII, el promotor de MPSV constitutivo, el promotor de CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor humano inmediato-temprano de CMV), el promotor constitutivo del CMV y las combinaciones de promotor-potenciador conocidas en la técnica.
Los métodos para introducir vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés varían dependiendo del tipo de hospedador celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación se pueden utilizar para otros hospedadores celulares. (Véase, en general, Sambrook, et al.,supra).Otros métodos incluyen, por ejemplo, electroporación, tratamiento con fosfato cálcico, transformación mediada por liposomas, inyección y microinyección, métodos balísticos, virosomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión:ácido nucleico, ADN puro, viriones artificiales, fusión con la proteína estructural VP22 del herpesvirus (Elliot y O'Hare, Cell 88: 223, 1997), captación de ADN potenciada por agentes y transducciónex vivo.Para la producción a largo plazo y de alto rendimiento de proteínas recombinantes, a menudo se deseará una expresión estable. Por ejemplo, pueden prepararse estirpes celulares que expresen de forma estable cadenas o fragmentos de unión de anticuerpos de unión a la BMP6 utilizando vectores de expresión de la invención que contengan orígenes víricos de replicación o elementos de expresión endógenos y un gen marcador de selección. Tras la introducción del vector, se puede dejar que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de pasarlas a un medio selectivo. El propósito del marcador de selección es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento de células que expresan satisfactoriamente las secuencias introducidas en medios selectivos. Las células resistentes, transfectadas de forma estable, se pueden hacer proliferar utilizando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo celular.
GENERACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
Los anticuerpos monoclonales (AcMc) pueden producirse mediante diversas técnicas, incluyendo la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, 1975 Nature 256: 495. Se pueden emplear muchas técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, una transformación vírica u oncogénica de linfocitos B.
Un sistema animal para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento bien establecido. Los protocolos de inmunización y las técnicas para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la técnica. También se conocen compañeros de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y procedimientos de fusión.
Los anticuerpos quiméricos o humanizados y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente invención pueden prepararse tomando como base la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se ha descrito anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de la cadena pesada y ligera puede obtenerse a partir del hibridoma murino de interés y genomanipularse para que contenga secuencias de inmunoglobulinas no murinas (por ejemplo, humanas) mediante técnicas convencionales de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas se pueden unir a regiones constantes humanas utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n.° 4.816.567 expedida a Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR murinas se pueden insertar en una región marco humana utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n.° 5.225.539 expedida a Winter, y las Patentes de EE.UU. n.° 5.530.101; 5,585,089; 5.693.762 y 6180370 expedida a Queen et al.
En cierta realización, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra la BMP6 se pueden generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que porten partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones denominados en el presente documento ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y en conjunto se denominan en el presente documento "ratones de Ig humana".
El ratón HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene minilocus de genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina humana de la cadena pesada (mu y gamma) y ligera kappa no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los locus endógenos de las cadenas mu y kappa (véase, por ejemplo, Lonberg, et al., 1994 Nature 368 (6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones presentan una expresión reducida de IgM o K de ratón y, en respuesta a la inmunización, los transgenes de la cadena pesada y ligera humanos introducidos experimentan un cambio de clase y una mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG-kappa humanos de alta afinidad (Lonberg, N. et al., 1994supra;revisado en Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. y Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546). La preparación y el uso de ratones HuMAb, y las modificaciones genómicas portadas por este tipo de ratones se describen adicionalmente en Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94: 3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; y Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851.
Véanse, además, las Patentes de EE.UU. n.os 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas expedidas a Lonberg y Kay; la Patente de EE.UU. n.° 5.545.807 expedida a Surani et al.; las Publicaciones PCT n.os WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas expedidas a Lonberg y Kay; y la Publicación PCT n.° WO 01/14424 expedida a Korman et al.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención pueden generarse usando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulinas humanas en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que lleva un transgén de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Dichos ratones, a los que se denomina en el presente documento "ratones KM", se describen en detalle en la Publicación PCT WO 02/43478 expedida a Ishida et al.
Aún más, los sistemas alternativos de animales transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humanos están disponibles en la técnica y pueden utilizarse para crear los anticuerpos de unión a la BMP6 y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención. Por ejemplo, puede utilizarse un sistema transgénico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.). Dichos ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. n.os 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 expedidas a Kucherlapati et al.
Además, en la técnica hay disponibles sistemas animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humanos y pueden utilizarse para crear los anticuerpos de unión a la BMP6 de la invención. Por ejemplo, pueden utilizarse ratones que portan tanto un transcromosoma de la cadena pesada humana como un transcromosoma de la cadena ligera humana, denominados "ratones TC"; dichos ratones se describen en Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97: 722-727. Además, se han descrito en la técnica vacas portadoras de transcromosomas humanos de la cadena pesada y ligera (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20: 889-894) y pueden utilizarse para crear los anticuerpos de unión a la BMP6 de la invención.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también pueden prepararse utilizando métodos de expresión en fagos para el cribado de colecciones de genes de inmunoglobulinas humanas. Dichos métodos de expresión en fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica o se describen en los siguientes ejemplos. Véanse, por ejemplo: las Patentes de EE.UU. n.os 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 expedidas a Ladner et al; las Patentes de EE.Uu . n.os 5.427.908 y 5.580.717 expedidas a Dower et al; las Patentes de e E.UU. n.os 5.969.108 y 6.172.197 expedidas a McCafferty et al; y las Patentes de EE.UU. n.os 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 expedidas a Griffiths et al.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también pueden prepararse utilizando ratones SCID en los que se hayan reconstituido células inmunitarias humanas de forma que pueda generarse una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Dichos ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de e E.UU. n.os 5.476.996 y 5.698.767 expedidas a Wilson et al.
REGIÓN MARCO O GENOMANIPULACIÓN DE Fc
Los anticuerpos genomanipulados y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la divulgación incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en los restos de la región marco dentro de VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, dichas modificaciones de la región marco se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque consiste en "retromutar" uno o más restos de la región marco a la secuencia de la estirpe germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener restos de la región marco que difieren de la secuencia de la estirpe germinal de la que deriva el anticuerpo. Dichos restos pueden identificarse comparando las secuencias de la región marco del anticuerpo con las secuencias de la estirpe germinal de las que d su configuración de la estirpe germinal, las mutaciones somáticas pueden "retromutarse" a la secuencia de la estirpe germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida. Se pretende que dichos anticuerpos "retromutados" también estén englobados por la divulgación.
Otro tipo de modificación de la región marco implica la mutación de uno o más restos dentro de la región marco, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar los epítopos de los linfocitos T y reducir así la potencial inmunogenicidad del anticuerpo. Este enfoque también se denomina "desinmunización" y se describe con más detalle en la Publicación de Patente de EE.UU. n° 20030153043 de Carr et al.
Los anticuerpos de la invención pueden genomanipularse para que incluya modificaciones dentro de la región Fc, normalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida sérica, la fijación al complemento, la unión al receptor Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (por ejemplo, pueden fijarse uno o más restos químicos al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle más adelante. La numeración de restos en la región Fc es la del índice UE de Kabat.
En una realización, la región de bisagra de CH1 se modifica de manera que el número de restos de cisteína en la región de bisagra se altera, por ejemplo, aumenta o disminuye. Esta estrategia se describe adicionalmente en la Patente de EE. UU. n.° 5.677.425 de Bodmer et al. El número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otra realización, la región bisagra Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra Fc de tal manera que el anticuerpo tiene la unión de proteína A estafilocócica (SpA) alterada con respecto a la unión de SpA del dominio de bisagra Fc nativo. Esta estrategia se describe con más detalle en la Patente de EE. UU. n.° 6.165.745 de Ward et al.
En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles varios enfoques. Por ejemplo, pueden introducirse una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de EE.UU. n.° 6.277.375 expedida a Ward. Alternativamente, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH1 o CL para que contenga una epítopo de unión al receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de EE. UU. n.os 5.869.046 y 6.121.022 de Presta et al.
En una realización, la región Fc se altera sustituyendo al menos un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, puede sustituirse uno o más aminoácidos por un resto de aminoácido diferente de forma que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero conserve la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo precursor. El ligando efector al que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente Cl del complemento. Esta estrategia se describe con más detalle en la Patente de EE. UU. n.os 5.624.821 y 5.648.260 ambos de Winter et al.
En otra realización, uno o más aminoácidos seleccionados de los restos de aminoácidos pueden sustituirse por un resto de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga alterada la unión a C1q y/o reducida o anulada la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Esta estrategia se describe con más detalle en la Patente de EE. UU. n.° 6.194.551 de Idusogie et al.
En otra realización, se alteran uno o más restos de aminoácidos para alterar así la capacidad del anticuerpo de fijarse al complemento. Este enfoque se describe adicionalmente en la Publicación PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.
En otra realización más, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fc-gamma modificando uno o más aminoácidos. Este enfoque se describe con más detalle en la Publicación PCT WO 00/42072 de Presta. Además, se han cartografiado los sitios de unión en la IgG1 humana para Fc-gamma RI, Fc-gamma RII, Fc-gamma RIII y FcRn y se han descrito variantes con una unión mejorada (véase Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276: 6591 6604).
En otra realización más, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación puede alterarse para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el "antígeno". Dichas modificaciones de hidratos de carbono pueden lograrse, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, pueden realizarse una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de la región marco de la región variable para eliminar así la glicosilación en ese sitio. Dicha aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dicha estrategia se describe con más detalle en las Patentes de EE UU nos 5714350 y 6.350.861 de Co et al.
Adicional o alternativamente, se puede fabricar un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de restos de fucosilo, o un anticuerpo que tenga estructuras GlcNac bisectantes aumentadas. Se ha demostrado que dichos patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de hidratos de carbono pueden lograrse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedadora con la maquinaria de glicosilación alterada. Las células con la maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en la técnica, y pueden utilizarse como células hospedadoras en las que expresar los anticuerpos recombinantes de la invención para producir así un anticuerpo con la glicosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 de Hang et al. describe una estirpe celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fiicosil transferasa, de forma que los anticuerpos expresados en dicha estirpe celular presentan hipofucosilación. La publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una variante de la estirpe celular CHO, las células LecI3, con una capacidad reducida para unir fucosa a los hidratos de carbono unidos a la Asn (297), lo que también da como resultado la hipofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). La publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. describe estirpes celulares genomanipuladas para que expresen glicosiltransferasas modificadoras de glicoproteínas (por ejemplo, beta (1,4)—N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de modo que los anticuerpos expresados en las estirpes celulares genomanipuladas presenten unas estructuras GlcNac bisectantes aumentadas que dan como resultado una mayor actividad Ad CC de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180).
MÉTODOS DE GENOMANIPULACIÓN DE ANTICUERPOS ALTERADOS
Como se ha comentado anteriormente, los anticuerpos de unión a la BMP6 que tienen secuencias VH y VL o secuencias de la cadena pesada y ligera completas mostradas en el presente documento pueden utilizarse para crear nuevos anticuerpos de unión a la BMP6 modificando las secuencias de la cadena pesada y/o ligera completas, las secuencias VH y/o VL o la región o regiones constantes unidas a las mismas. Por tanto, en otro aspecto de la divulgación, las características estructurales del anticuerpo de unión a la BMP6 de la invención se utilizan para crear anticuerpos de unión a la BMP6 estructuralmente relacionados que conservan al menos una propiedad funcional de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención, tales como la unión a la BMP6 humana, y también la inhibición de una o más propiedades funcionales de la BMP6 (por ejemplo, inhibir la lisis de glóbulos rojos en un ensayo hemolítico).
Por ejemplo, pueden combinarse una o más regiones CDR de los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente invención, o mutaciones de los mismos, recombinantemente con regiones marco conocidas y/u otras CDR para crear anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos adicionales genomanipulados que se unan a la BMP6, como se ha comentado anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de genomanipulación es una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en el presente documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo genomanipulado no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como proteína) un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en el presente documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Más bien, la información contenida en la secuencia o secuencias se utiliza como material de partida para crear una secuencia o secuencias de "segunda generación" derivadas de la secuencia o secuencias originales y, a continuación, la secuencia o secuencias de "segunda generación" se preparan y se expresan como una proteína.
La secuencia de anticuerpo alterada también puede prepararse mediante el cribado de colecciones de anticuerpos que tengan secuencias CDR3 fijas o determinantes de unión esenciales mínimos, como se describe en el documento US20050255552, y diversidad en las secuencias CDR1 y CDR2. El cribado se puede realizar de acuerdo con cualquier tecnología de cribado apropiada para cribar anticuerpos de colecciones de anticuerpos, tal como la tecnología de expresión en fagos.
Pueden usarse técnicas convencionales de biología molecular para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada. El anticuerpo codificado por la secuencia o secuencias de anticuerpo alteradas es aquel que conserva una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos de unión a la BMP6 descritos en el presente documento, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a, la unión específica a la proteína BMP6 humana; y el anticuerpo inhibe la lisis de glóbulos rojos en un ensayo hemolítico.
Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden evaluarse utilizando ensayos convencionales disponibles en la técnica y/o descritos en el presente documento, tales como aquellos expuestos en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA).
En un caso de los métodos de genomanipulación de anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la divulgación, las mutaciones pueden introducirse de forma aleatoria o selectiva a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de anticuerpos de unión a la BMP6, y los anticuerpos de unión a la BMP6 modificados resultantes pueden cribarse para determinar la actividad de unión y/u otras propiedades funcionales como se describe en el presente documento. Los métodos mutacionales se han descrito en la técnica Por ejemplo la Publicación PCT WO 02/092780 de Short describe métodos para crear y rastre ón, ensamblaje de ligadura sintético o una combinación de los mismos. Alternativamente, la publicación PCT WO 03/074679 de Lazar et al. describe métodos de uso de métodos de cribado informatizados para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.
CARACTERIZACIÓN DE LOS ANTICUERPOS
Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención pueden caracterizarse mediante diversos ensayos funcionales. Por ejemplo, pueden caracterizarse por su capacidad para inhibir la BMP6.
La capacidad de un anticuerpo para unirse a la BMP6 se puede detectar marcando directamente el anticuerpo de interés, 0 el anticuerpo puede no marcarse y detectarse la unión indirectamente utilizando diversos formatos de ensayo sándwich conocidos en la técnica.
En un caso, los anticuerpos de unión a la BMP6 y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la divulgación bloquean o compiten con la unión de un anticuerpo de unión a la BMP6 de referencia al polipéptido BMP6. Éstos pueden ser los anticuerpos de unión a la BMP6 completamente humanos descritos anteriormente. También pueden ser otros anticuerpos de unión a la BMP6 de ratón, quiméricos o humanizados que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia. La capacidad de bloquear o competir con la unión del anticuerpo de referencia indica que el anticuerpo de unión a la BMP6 sometido a prueba se une al mismo epítopo o a uno similar al definido por el anticuerpo de referencia, o a un epítopo que está lo suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de unión a la BMP6 de referencia. Es especialmente probable que dichos anticuerpos compartan las propiedades ventajosas identificadas para el anticuerpo de referencia. La capacidad de bloquear o competir con el anticuerpo de referencia puede determinarse, por ejemplo, mediante un ensayo de unión competitiva. Con un ensayo de unión competitiva se analiza la capacidad del anticuerpo sometido a prueba para inhibir la unión específica del anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como el polipéptido BMP6. Un anticuerpo de prueba compite con el anticuerpo de referencia por la unión específica al antígeno si un exceso del anticuerpo de prueba inhibe sustancialmente la unión del anticuerpo de referencia. La inhibición sustancial significa que el anticuerpo de prueba reduce la unión específica del anticuerpo de referencia normalmente en al menos un 10 %, un 25 %, un 50 %, un 75 % o un 90 %.
Hay una serie de ensayos de unión competitiva conocidos que pueden utilizarse para evaluar la competencia de un anticuerpo con un anticuerpo de referencia por la unión a una proteína particular, en este caso, la BMP6. Éstos incluyen, por ejemplo, radioinmunoanálisis (RIA) directo o indirecto en fase sólida, enzimoinmunoanálisis (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición en sándwich (véase Stalili et al., Methods in Enzymology 9: 242-253, 1983); EIA directo de biotina-avidina en fase sólida (véase Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614-3619, 1986); ensayo de marcaje directo en fase sólida, ensayo en sándwich de marcaje directo en fase sólida (véase Harlow & Lane,supra);RIA de marcaje directo en fase sólida utilizando la etiqueta 1-125 (véase Morel et al., Molec. Immunol. 25: 7-15, 1988); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung et al., Virology 176: 546-552, 1990); y RIA de marcaje directo (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32: 77-82, 1990). Normalmente, dicho ensayo implica el uso de un antígeno purificado unido a una superficie sólida o células portadoras de cualquiera de éstos, un anticuerpo de prueba de unión a la BMP6 sin marcar y un anticuerpo de referencia marcado. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o a las células en presencia del anticuerpo de prueba. Habitualmente, el anticuerpo de prueba está presente en exceso. Los anticuerpos identificados mediante el ensayo competitivo (anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo al que está unido el anticuerpo de referencia para que se produzca un impedimento estérico.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales de unión a la BMP6 seleccionados se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo puede biotinilarse utilizando reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, reactivos de Pierce, Rockford, Ill.). Los estudios de competencia que utilizan anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados se pueden realizar utilizando placas de ELISA recubiertas con el polipéptido BMP6. La unión del AcMc biotinilado puede detectarse con una sonda de estreptavidina-fosfatasa alcalina. Para determinar el isotipo de un anticuerpo de unión a la BMP6 purificado, se pueden realizar ELISA de isotipo. Por ejemplo, los pocillos de las placas de microtitulación pueden recubrirse con 1 μg/ml de anti-IgG humana durante toda la noche a 4 °C. Tras bloquear con BSA al 1 %, las placas se hacen reaccionar con 1 μg/ml o menos del anticuerpo monoclonal de unión a la BMP6 o controles de isotipo purificados, a la temperatura ambiente durante una o dos horas. A continuación, los pocillos pueden hacerse reaccionar con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específicas para la IgG1 humana o la IgM humana. A continuación, las placas se eluyen y se analizan para poder determinar el isotipo del anticuerpo purificado.
Para demostrar la unión de los anticuerpos monoclonales de unión a la BMP6 a las células vivas que expresan el polipéptido BMP6, puede utilizarse una citometría de flujo. En resumen, las estirpes celulares que expresan la BMP6 (cultivadas en condiciones de crecimiento convencionales) pueden mezclarse con varias concentraciones de anticuerpo de unión a la BMP6 en PBS que contenga un 0,1 % de BSA y un 10 % de suero bovino fetal, e incubarse a 37 °C durante 1 hora. Tras el lavado, las células se hacen reaccionar con anticuerpo anti-IgG humana marcado con fluoresceína en las mismas condiciones que la tinción del anticuerpo primario Las muestras se pueden analizar con el instrumento FACScan utilizando propiedades de dispersión de la luz y yo alternativo que utiliza microscopía de fluorescencia (además o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las células pueden teñirse exactamente como se describió anteriormente y examinarse mediante microscopia de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero puede tener una sensibilidad disminuida dependiendo de la densidad del antígeno.
Los anticuerpos de unión a la BMP6 y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención pueden someterse a pruebas adicionales de reactividad con el polipéptido BMP6 o el fragmento antigénico mediante una inmunoelectrotransferencia. En resumen, se pueden preparar polipéptidos BMP6 purificados o proteínas de fusión o extractos celulares de las células que expresan BMP6 y someter a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con suero bovino fetal al 10 % y se sondean con los anticuerpos monoclonales que se han de probar. La unión de IgG humana puede detectarse utilizando fosfatasa alcalina anti-IgG humana y desarrollarse con tabletas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).
También se describen ejemplos de ensayos funcionales en la siguiente sección de Ejemplos.
USOS PROFILÁCTICOS Y TERAPÉUTICOS
La presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con una actividad de la BMP6 aumentada mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención. En un caso específico, la presente divulgación proporciona un método para tratar la anemia mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención. La presente invención proporciona un anticuerpo, un fragmento de unión al antígeno o una composición como se define en las reivindicaciones adjuntas para usar como un medicamento.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención pueden utilizarse, entre otras cosas, para prevenir la progresión de la anemia. También pueden utilizarse en combinación con otras terapias para el tratamiento de pacientes con anemia.
En un caso, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad o un trastorno relacionado con la BMP6 mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención. Algunos ejemplos de enfermedades o trastornos conocidos relacionados con la BMP6 incluyen: anemia, incluyendo, como ejemplos no limitantes: anemia de enfermedad crónica (AEC), anemia de (por ejemplo, asociada a) insuficiencia renal crónica (IRC), anemia de cáncer, anemia de inflamación, anemia resistente a los agentes estimulantes de la eritropoyesis (AEE) (por ejemplo, la anemia resistente a la eritropoyetina (EPO), la anemia hiporreactiva a los AEE (por ejemplo, la anemia hiporreactiva a la EPO), la anemia ferropénica funcional y/o la anemia por restricción de hierro.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad o un trastorno relacionado con la BMP6 mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención, en donde dicha enfermedad o trastorno es anemia. En una realización, la anemia es anemia de enfermedad crónica. En una realización, la enfermedad crónica es insuficiencia renal crónica. En una realización, la enfermedad crónica es cáncer. En una realización, la enfermedad crónica es inflamación. En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia resistente a los AEE (por ejemplo, a la EPO). En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia hiporreactiva a los AEE (por ejemplo, a la EPO). En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia por restricción de hierro. En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto es un sujeto en hemodiálisis crónica (HD). En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto tiene insuficiencia renal, por ejemplo, una insuficiencia renal terminal.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad o un trastorno relacionado con la BMP6 mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de un anticuerpo y los fragmentos de unión al antígeno del mismo de la invención, en donde dicha enfermedad o trastorno es anemia ferropénica funcional. En una realización, el sujeto es un paciente en hemodiálisis crónica tratado con AEE (por ejemplo, EPO). En una realización, el sujeto es un paciente en hemodiálisis crónica tratado con AEE (por ejemplo, EPO) con insuficiencia renal crónica.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona métodos para tratar la anemia mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo de la presente invención. En un caso específico, la presente divulgación proporciona métodos para tratar la anemia mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo de la presente invención. En una realización, la anemia es una anemia de insuficiencia renal crónica. En una realización, la anemia es una anemia resistente a los AEE (por ejemplo a la EPO) En una realización la anemia es una anemia hiporreactiva a los AEE (por ejemplo, a la EPO ro.
En una realización, la anemia es una anemia asociada a una enfermedad renal, por ejemplo, insuficiencia renal crónica. En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto es un sujeto en hemodiálisis crónica (HD). En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto tiene insuficiencia renal, por ejemplo, una insuficiencia renal terminal.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad o un trastorno relacionado con la BMP6 mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo de la presente invención, en donde dicha enfermedad o trastorno es una anemia ferropénica funcional. En una realización, el sujeto es un paciente en hemodiálisis crónica tratado con AEE (por ejemplo, EPO). En una realización, el sujeto es un paciente en hemodiálisis crónica tratado con AEE (por ejemplo, EPO) con insuficiencia renal crónica.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona métodos para tratar la anemia.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona un método para reducir las necesidades de administración de AEE (por ejemplo, EPO) a un sujeto mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención. En una realización, la anemia es anemia de enfermedad crónica. En una realización, la enfermedad crónica es insuficiencia renal crónica. En una realización, la enfermedad crónica es cáncer. En una realización, la enfermedad crónica es inflamación. En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia resistente a los AEE (por ejemplo, a la EPO). En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia hiporreactiva a los AEE (por ejemplo, a la EPO). En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia por restricción de hierro. En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto es un sujeto en hemodiálisis crónica (HD). En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto tiene insuficiencia renal, por ejemplo, una insuficiencia renal terminal.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona métodos para reducir las necesidades de administración de AEE (por ejemplo, EPO) a un sujeto mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, en donde dicho sujeto tiene anemia ferropénica funcional. En una realización, el sujeto es un paciente en hemodiálisis crónica tratado con AEE (por ejemplo, EPO). En una realización, el sujeto es un paciente en hemodiálisis crónica tratado con AEE (por ejemplo, EPO) con insuficiencia renal crónica.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona un método para reducir las necesidades de administración de AEE (por ejemplo, EPO) a un sujeto mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo de la presente invención. En una realización, el sujeto tiene anemia. En una realización, la anemia es anemia de enfermedad crónica. En una realización, la enfermedad crónica es insuficiencia renal crónica. En una realización, la enfermedad crónica es cáncer. En una realización, la enfermedad crónica es inflamación. En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia resistente a los AEE (por ejemplo, a la EPO). En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia hiporreactiva a los AEE (por ejemplo, a la EPO). En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia por restricción de hierro. En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto es un sujeto en hemodiálisis crónica (HD). En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto tiene insuficiencia renal, por ejemplo, una insuficiencia renal terminal.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona métodos para reducir las necesidades de administración de AEE (por ejemplo, EPO) a un sujeto mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo de la presente invención, en donde dicho sujeto tiene anemia ferropénica funcional. En una realización, el sujeto es un paciente en hemodiálisis crónica tratado con AEE (por ejemplo, EPO). En una realización, el sujeto es un paciente en hemodiálisis crónica tratado con AEE (por ejemplo, EPO) con insuficiencia renal crónica.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona un método para reducir las necesidades de administración de hierro (por ejemplo, hierro intravenoso) a un sujeto mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención. En una realización, el sujeto tiene anemia. En una realización, la anemia es anemia de enfermedad crónica. En una realización, la enfermedad crónica es insuficiencia renal crónica. En una realización, la enfermedad crónica es cáncer. En una realización, la enfermedad crónica es inflamación. En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia resistente a los AEE (por ejemplo, a la EPO). En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia hiporreactiva a los AEE (por ejemplo, a la EPO). En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia por restricción de hierro. En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto es un sujeto en hemodiálisis crónica (HD). En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto tiene insuficiencia renal, por ejemplo, una insuficiencia renal terminal.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona métodos para reducir las necesidades de administración de hierro (por ejemplo, hierro intravenoso) a un sujeto mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención, en donde dicho sujeto tiene anemia ferropénica funcional. En una realización, el sujeto es un paciente en hemodiálisis crónica tratado con AEE (por ejemplo, EPO). En una realización, el sujeto es un paciente en hemodiálisis crónica tratado con AEE (por ejemplo,<e>P<o>) con insuficiencia renal crónica.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona un método para reducir las necesidades de administración de hierro (por ejemplo, hierro intravenoso) a un sujeto mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo de la presente invención. En una realización, el sujeto tiene anemia. En una realización, la anemia es anemia de enfermedad crónica. En una realización, la enfermedad crónica es insuficiencia renal crónica. En una realización, la enfermedad crónica es cáncer. En una realización, la enfermedad crónica es inflamación. En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia resistente a los AEE (por ejemplo, a la EPO). En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia hiporreactiva a los AEE (por ejemplo, a la EPO). En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia por restricción de hierro. En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto es un sujeto en hemodiálisis crónica (HD). En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto tiene insuficiencia renal, por ejemplo, una insuficiencia renal terminal.
En un caso específico, la presente divulgación proporciona métodos para reducir las necesidades de administración de hierro (por ejemplo, hierro intravenoso) a un sujeto mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo de la presente invención, en donde dicho sujeto tiene anemia ferropénica funcional. En una realización, el sujeto es un paciente en hemodiálisis crónica tratado con AEE (por ejemplo, EPO). En una realización, el sujeto es un paciente en hemodiálisis crónica tratado con AEE (por ejemplo, EPO) con insuficiencia renal crónica.
En un caso específico, la divulgación proporciona un método para reducir las necesidades de administración de hierro (por ejemplo, hierro intravenoso) a un sujeto y reducir las necesidades de administración de AEE (por ejemplo, EPO) a un sujeto, que comprende la administración del anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención o una composición que comprende dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno. En una realización, la anemia es anemia de enfermedad crónica. En una realización, la enfermedad crónica es insuficiencia renal crónica. En una realización, la enfermedad crónica es cáncer. En una realización, el sujeto tiene anemia. En una realización, la enfermedad crónica es inflamación. En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia resistente a los AEE (por ejemplo, a la EPO). En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia hiporreactiva a los AEE (por ejemplo, a la EPO). En una realización, la anemia (por ejemplo, la anemia de enfermedad crónica) es una anemia por restricción de hierro. En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto es un sujeto en hemodiálisis crónica (HD). En algunas realizaciones, incluyendo en cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto tiene insuficiencia renal, por ejemplo, una insuficiencia renal terminal.
En un caso, la presente divulgación proporciona métodos para movilizar el hierro fijado mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención.
En un caso, la presente divulgación proporciona métodos para movilizar el hierro fijado mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una composición que comprende un anticuerpo de la presente invención.
En un caso, la presente divulgación proporciona un método para mejorar (por ejemplo, aumentar) el nivel de hemoglobina en un sujeto con anemia, reduciendo al mismo tiempo la necesidad de administración de eritropoyetina y/o de hierro (por ejemplo, hierro intravenoso), comprendiendo dicho método la administración a un sujeto que lo necesite de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención. En una realización, la anemia es una anemia asociada a una enfermedad crónica. En una realización, la mejora del nivel de hemoglobina comprende mejorar el nivel hasta un nivel especificado por una directriz de práctica clínica, por ejemplo, Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., suμl. 2012; 2: 279-335.
En una realización, la mejora del nivel de hemoglobina comprende mejorar el nivel de hemoglobina hasta al menos aproximadamente 11,0 g/dl, por ejemplo, hasta entre aproximadamente 11,0 g/dl y aproximadamente 12,5 g/dl. En una realización, la mejora del nivel de hemoglobina comprende mejorar el nivel de hemoglobina hasta al menos 11,0 g/dl, por ejemplo, hasta entre 11,0 g/dl y 12,5 g/dl.
En un caso, la presente divulgación proporciona un método para mejorar (por ejemplo, aumentar) el nivel de hemoglobina en un sujeto con anemia, reduciendo al mismo tiempo la necesidad de administración de eritropoyetina y/o de hierro (por ejemplo, hierro intravenoso), comprendiendo dicho método la administración a un sujeto que lo necesite de una composición que comprende un anticuerpo de la invención En una realización la anemia es una anemia asociada a una enfermedad crónica. En una realización, la me vel especificado por una directriz de práctica clínica, por ejemplo, Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., suμl. 2012; 2: 279-335. En una realización, la mejora del nivel de hemoglobina comprende mejorar el nivel de hemoglobina hasta al menos aproximadamente 11,0 g/dl, por ejemplo, hasta entre aproximadamente 11,0 g/dl y aproximadamente 12,5 g/dl. En una realización, la mejora del nivel de hemoglobina comprende mejorar el nivel de hemoglobina hasta al menos 11,0 g/dl, por ejemplo, hasta entre 11,0 g/dl y 12,5 g/dl.
En un caso, la presente divulgación proporciona un método para mantener el nivel de hemoglobina en un sujeto con anemia, reduciendo al mismo tiempo la necesidad de administración de eritropoyetina y/o de hierro (por ejemplo, hierro intravenoso), comprendiendo dicho método la administración a un sujeto que lo necesite de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención. En una realización, la anemia es una anemia asociada a una enfermedad crónica. En una realización, la mejora del nivel de hemoglobina comprende mejorar el nivel hasta un nivel especificado por una directriz de práctica clínica, por ejemplo, Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., suμl. 2012; 2: 279-335. En una realización, la mejora del nivel de hemoglobina comprende mejorar el nivel de hemoglobina hasta al menos aproximadamente 11,0 g/dl, por ejemplo, hasta entre aproximadamente 11,0 g/dl y aproximadamente 12,5 g/dl. En una realización, la mejora del nivel de hemoglobina comprende mejorar el nivel de hemoglobina hasta al menos 11,0 g/dl, por ejemplo, hasta entre 11,0 g/dl y 12,5 g/dl.
En un caso, la presente divulgación proporciona un método para mantener el nivel de hemoglobina en un sujeto con anemia, reduciendo al mismo tiempo la necesidad de administración de eritropoyetina y/o de hierro (por ejemplo, hierro intravenoso), comprendiendo dicho método la administración a un sujeto que lo necesite de una composición que comprende un anticuerpo de la invención. En una realización, la anemia es una anemia asociada a una enfermedad crónica. En una realización, la mejora del nivel de hemoglobina comprende mejorar el nivel hasta un nivel especificado por una directriz de práctica clínica, por ejemplo, Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., suμl. 2012; 2: 279-335. En una realización, la mejora del nivel de hemoglobina comprende mejorar el nivel de hemoglobina hasta al menos aproximadamente 11,0 g/dl, por ejemplo, hasta entre aproximadamente 11,0 g/dl y aproximadamente 12,5 g/dl. En una realización, la mejora del nivel de hemoglobina comprende mejorar el nivel de hemoglobina hasta al menos 11,0 g/dl, por ejemplo, hasta entre 11,0 g/dl y 12,5 g/dl.
En una realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención puede administrarse a un paciente que lo necesite junto con un método o procedimiento terapéutico, tal como se describe en el presente documento o se conoce en la técnica. Dicho método o procedimiento incluye, como ejemplos no limitantes: la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un AEE (por ejemplo, EPO), eritropoyetina o hierro, y una transfusión de sangre. El tratamiento se continúa normalmente a intervalos durante un periodo de una semana, un mes, tres meses, seis meses o un año. En algunos pacientes, el tratamiento se administra durante el resto de su vida.
Cuando los agentes terapéuticos de la presente invención se administran junto con otro agente, los dos pueden administrarse secuencialmente en cualquier orden o simultáneamente. En algunos aspectos, un anticuerpo de la presente invención se administra a un sujeto que también está recibiendo terapia con un segundo agente o método (por ejemplo, AEE, eritropoyetina, hierro, transfusión de sangre). En otros aspectos, la molécula de unión se administra junto con tratamientos quirúrgicos.
Algunos agentes adecuados para el tratamiento combinado con anticuerpos de unión a la BMP6 incluyen agentes conocidos en la técnica que inhiben o reducen la expresión, el nivel, la estabilidad y/o la actividad de la BMP6. Dichos agentes incluyen anticuerpos, ARNip y moléculas pequeñas contra la BMP6.
En la técnica se conocen diversos anticuerpos contra la BMP6 que incluyen, entre otros, los descritos en:
Andriopoulos et al. 2009 Nat. Genet. 41: 482-487;
Arndt et al. 2010 Gastroent. 138: 372-382;
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Zhang et al. 2006 Neurosci. 138: 47-53;
la Patente de EE.UU. n.° 8.795.665; y
el documento WO 2010/056981;
En la técnica se conocen otros anticuerpos contra la BMP6; muchos están disponibles comercialmente. En la técnica se conocen varios ARNip contra la BMP6 que incluyen, entre otros, los descritos en:
Hc et al. 2003 Cell. Signal. 25: 1372-1378;
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Yang et al. 2009 Int. J. Bioch. Cell Biol. 41: 853-861.
Se conocen inhibidores adicionales de la BMP6. Cualquiera de ellos puede utilizarse en combinación con cualquier anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo divulgado en el presente documento.
Un régimen de politerapia puede ser aditivo o puede producir resultados sinérgicos (por ejemplo, reducciones de la actividad de la BMP6 superiores a las esperadas para el uso combinado de los dos agentes). En una realización, la presente invención proporciona una politerapia para prevenir y/o tratar la anemia u otra enfermedad relacionada con la BMP6 como se ha descrito anteriormente con el anticuerpo de unión a la BMP6 de la invención y un agente o un método antianémico, tal como AEE, eritropoyetina, hierro o transfusión de sangre.
USOS DIAGNÓSTICOS
En un aspecto, la divulgación engloba ensayos diagnósticos para determinar la expresión de la BMP6 y/o de ácidos nucleicos, así como la función de la BMP6, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido) o de un individuo que padece una enfermedad o un trastorno, o está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la anemia.
Los ensayos diagnósticos, tales como los ensayos competitivos, se basan en la capacidad de un análogo marcado (el "indicador") para competir con el analito de la muestra de prueba por un número limitado de sitios de unión en un compañero de unión común. El compañero de unión generalmente se insolubiliza antes o después de la competencia y después el indicador y el analito unidos al compañero de unión se separan del indicador y el analito no unidos. Esta separación se logra por decantación (cuando el compañero de unión se preinsolubilizó) o por centrifugación (cuando el compañero de unión se precipitó después de la reacción competitiva). La cantidad de analito de la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de indicador unido medido por la cantidad de sustancia marcadora. Se preparan curvas de dosis-respuesta con cantidades conocidas de analito y se comparan con los resultados de la prueba para determinar cuantitativamente la cantidad de analito presente en la muestra de prueba. Estos ensayos se denominan sistemas ELISA cuando se utilizan enzimas como marcadores detectables. En un ensayo de esta forma, la unión competitiva entre anticuerpos y anticuerpos de unión a la BMP6 da como resultado que la<b>MP6 unida, preferentemente los epítopos de la BMP6 de la divulgación, es una medida de los anticuerpos de la muestra de suero, más particularmente, de los anticuerpos neutralizantes de la muestra de suero.
Una ventaja significativa del ensayo es que se miden directamente los anticuerpos neutralizantes (es decir, aquellos que interfieren con la unión de la BMP6, específicamente, los epítopos). Un ensayo de este tipo, particularmente en forma de una prueba ELISA, tiene considerables aplicaciones en el entorno clínico y en el hemocribado rutinario.
En el diagnóstico clínico o el seguimiento de pacientes con trastornos asociados a la anemia, la detección de proteínas BMP6 en comparación con los niveles en una muestra biológica correspondiente de un sujeto normal es indicativa de un paciente con trastornos asociados a la anemia.
El diagnóstico o la obtención de imágenesin vivose describen en el documento US2006/0067935. En resumen, estos métodos comprenden generalmente la administración o la introducción en un paciente de una cantidad diagnósticamente eficaz de la molécula de unión a la BMP6 que está unida operativamente a un marcador o etiqueta detectable mediante métodos no invasivos. Al conjugado anticuerpo-marcador se le deja un tiempo suficiente para localizar y unirse a la BMP6. A continuación, se expone al paciente a un dispositivo de detección para identificar el marcador detectable, formando así una imagen de la ubicación de las moléculas de unión a la BMP6 en el tejido de un paciente. La presencia del anticuerpo de unión a la BMP6 o de un fragmento de unión al antígeno del mismo se detecta determinando si un anticuerpo-marcador se une a un componente del tejido. La detección de un nivel aumentado en las proteínas BMP6 o en una combinación de proteínas en comparación con un individuo normal sin anemia es indicativa de una predisposición para y/o en un conjunto de trastornos asociados a la anemia. Estos aspectos de la divulgación también pueden utilizarse en métodos de obtención de imágenes de tejidos y en métodos combinados de diagnóstico y tratamiento.
La divulgación también se refiere al campo de la medicina predictiva en el que se utilizan ensayos diagnósticos, ensayos pronósticos, farmacogenómica y ensayos clínicos de seguimiento con fines pronósticos (predictivos) para tratar así a un individuo de forma profiláctica.
La divulgación también proporciona ensayos pronósticos (o predictivos) para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la desregulación de la actividad de la vía de la BMP6. Por ejemplo, pueden ensayarse las mutaciones en el gen de la BMP6 en una muestra biológica. Dichos ensayos pueden utilizarse con fines pronósticos o predictivos para, de este modo, tratar profilácticamente a un individuo antes de la aparición de un trastorno caracterizado por, o asociado a, la BMP6, la expresión o la actividad del ácido nucleico.
Otro aspecto de la divulgación proporciona métodos para determinar la expresión del ácido nucleico de la BMP6 o la actividad de la BMP6 en un individuo para, de este modo seleccionar los agentes terapéuticos o profilácticos apropiados para ese individuo (lo que se denomina en el p la selección de agentes (por ejemplo, fármacos) para el tratamiento terapéutico o profiláctico de un individuo tomando como base el genotipo del individuo (por ejemplo, el genotipo del individuo analizado para determinar la capacidad del individuo para responder a un agente en particular).
Otro aspecto más de la divulgación proporciona un método para controlar la influencia de los agentes (por ejemplo, fármacos) en la expresión o la actividad de la BMP6 en ensayos clínicos.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo de unión a la BMP6 o un fragmento de unión del mismo formulado junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener además uno o más de otros agentes terapéuticos que son adecuados para tratar o prevenir una enfermedad asociada a la BMP6 (por ejemplo, anemia). Los portadores farmacéuticos mejoran o estabilizan la composición, o facilitan la preparación de la composición. Algunos portadores farmacéuticamente aceptables incluyen disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles.
Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse mediante diversos métodos conocidos en la técnica. La vía y/o el modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados. La administración puede ser intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, o administrarse cerca del sitio del objetivo. El portador farmacéuticamente aceptable debe ser adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, medular o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, molécula biespecífica y multiespecífica, puede estar recubierto por un material para proteger el compuesto frente a la acción de ácidos y otras condiciones naturales que podrían desactivar el compuesto.
La composición debe ser estéril y fluida. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, el mantenimiento del tamaño de las partículas requerido en el caso de la dispersión, y el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro sódico. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse de acuerdo con métodos bien conocidos y puestos en práctica de forma rutinaria en la técnica. Véanse, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20a ed., 2000; y Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferentemente en condiciones de GMP. Normalmente se emplea una dosis terapéuticamente eficaz o una dosis eficaz del anticuerpo de unión a la BMP6 en las composiciones farmacéuticas de la invención. Los anticuerpos de unión a la BMP6 se formulan en formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Las pautas posológicas se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una única inyección intravenosa rápida, varias dosis divididas en horas extraordinarias, o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de unidades de dosificación, como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente aisladas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido.
Los niveles reales de dosificación de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado depende de diversos factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o del éster, la sal o la amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, el estado, la salud general y los antecedentes médicos previos del paciente tratado, y factores similares.
Un médico o un veterinario puede iniciar las dosis de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención empleados en la composición farmacéutica a unos niveles inferiores a los necesarios para lograr el efecto terapéutico deseado, y aumentar gradualmente la dosis hasta conseguir el efecto deseado. En general, las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de un trastorno inflamatorio alérgico descrito en el presente documento varían dependiendo de muchos factores diferentes, que incluyen los medios de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o animal otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. L la eficacia. Para la administración sistémica de un anticuerpo, la dosis varía entre aproximadamente 0,0001 y 100 mg/kg, y más habitualmente entre 0,01 y 15 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Un ejemplo de régimen de tratamiento implica la administración sistémica una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Para la administración intravítrea de un anticuerpo, la dosis varía en el intervalo de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 10 mg. Un ejemplo de régimen de tratamiento implica la administración sistémica una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses.
El anticuerpo se administra habitualmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosis individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, según indique la medición de los niveles sanguíneos del anticuerpo de unión a la BMP6 en el paciente. En algunos métodos de administración sistémica, la dosis se ajusta para alcanzar una concentración plasmática de anticuerpo de 1-1000 μg/ml, y en algunos métodos de 25 500 μg/ml. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizados muestran una semivida más larga que la de los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En las aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo periodo de tiempo. Algunos pacientes siguen recibiendo el tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, en ocasiones se requiere una dosificación relativamente elevada a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine, y preferentemente hasta que el paciente muestre una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de ello, puede administrarse al paciente un régimen profiláctico.
En una realización específica, la composición que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención se administra a una dosis (anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo) de entre 0,001 mg/kg y 0,1 mg/kg. En una realización específica, la composición que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención se administra a una dosis de entre aproximadamente 0,001 mg/kg y aproximadamente 0,1 mg/kg. En una realización específica, la composición que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención se administra a una dosis de 0,001 mg/kg, 0,0016 mg/kg, 0,0025 mg/kg, 0,0040 mg/kg, 0,0063 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,016 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,040 mg/kg, 0,063 mg/kg o 0,1 mg/kg. En una realización específica, la composición que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención se administra a una dosis de aproximadamente 0,001 mg/kg, aproximadamente 0,0016 mg/kg, aproximadamente 0,0025 mg/kg, aproximadamente 0,0040 mg/kg, aproximadamente 0,0063 mg/kg, aproximadamente 0,01 mg/kg, aproximadamente 0,016 mg/kg, aproximadamente 0,025 mg/kg, aproximadamente 0,040 mg/kg, aproximadamente 0,063 mg/kg o aproximadamente 0,1 mg/kg. En una realización, la composición que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención se administra, incluyendo, por ejemplo, a cualquiera de las dosis indicadas anteriormente, por vía intravenosa. En algunas realizaciones, la administración intravenosa es una infusión intravenosa. En algunas realizaciones, la infusión tiene lugar durante 30-60 minutos. En algunas realizaciones, la infusión tiene lugar durante aproximadamente 30-60 minutos.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la invención, pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia y están englobadas por las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLO 1
Los Ejemplos describen, entre otros, los Anticuerpos 3, 5, 6 y 7.
Esto describe la relación entre éstos los anticuerpos precursores:
Todos los clones son anticuerpos IgG1 humano
Lista de abreviaturas
Compendio
En este trabajo hemos identificado con éxito anticuerpos específicos anti-BMP6 humana mediante la aplicación de expresión en fagos utilizando una colección de expresión en fagos humana.
Introducción
La anemia es prevalente en los pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC) y se asocia a una menor calidad de vida y a un mayor riesgo de resultados adversos, que incluyen enfermedades cardiovasculares y muerte.
Uno de los objetivos de los anticuerpos contra la BMP6 es como terapia reductora de la hepcidina para beneficiar a los pacientes con anemia por restricción de hierro, aumentando simultáneamente la hemoglobina y reduciendo al mismo tiempo las necesidades de agentes estimulantes de la eritropoyesis, tales como la eritropoyetina y el hierro intravenoso. Por lo tanto, los agentes reductores de la hepcidina pueden ser una estrategia eficaz para mejorar la anemia hiporreactiva a los AEE en esta población de pacientes y en otras formas de anemia de las enfermedades crónicas (AEC) caracterizada por la restricción de hierro.
Un objetivo general del proyecto es identificar y desarrollar anticuerpos contra la BMP6 que sean capaces de reducir el nivel de hepcidina y, por tanto, beneficiar a los pacientes con anemia por restricción de hierro reduciendo la necesidad de un agente estimulante de la eritropoyesis (AEE). En este trabajo, aplicamos la expresión en fagos para identificar un fijador específico de la BMP6.
Los anticuerpos contra la BMP6 preferidos cumplen la mayoría o todos los criterios indicados a continuación:
Las constantes de disociación (valores de KD) de los fragmentos Fab de la BMP6 humana son inferiores a 1 nM.
Los valores de KD del antígeno BMP6 de macaco no son más de 5 veces inferiores a los del BMP6 humano.
Los valores de KD del antígeno BMP6 de ratón no son más de 5 veces inferiores a los del BMP6 humano.
Selectividad por la BMP6 humana sobre la BMP5 humana y la BMP7 humana con más de 100 veces de diferencia. Capacidad para unirse y neutralizar la actividad de señalización de la BMP6 en un ensayo del gen indicador HEP3B-BRE-Luc. Las células HEP3B transfectadas de forma estable con el gen indicador BRE2-luc2 se indujeron con proteínas hBMP (R&D) y se trataron con anticuerpos anti-BMP6. El ensayo BrightGlo se realizó 24 horas después del tratamiento.
Capacidad para inhibir la expresión de hepcidina inducida por la BMP6 en estirpes celulares hepáticas y hepatocitos humanos primarios.
Riesgo de desarrollabilidad entre bajo y moderado. Un formato de anticuerpo final es la IgG1 humana.
Los anticuerpos se generaron utilizando una colección de expresión en fagos disponible en el mercado como se ha descrito anteriormente (Knappik et al. 2000 J. Mol. Biol. 296: 57-86, Prassler et al. 2011 J. Mol. Biol. 413: 261-278) y emplea tecnología para expresar el Fab en la superficie del fago (Rothe et al. 2008 J. Mol. Biol. 376: 1182-1200). Las selecciones y los cribados mediante ELISA iniciales se realizaron con hBMP6 de R&D Systems. El cribado mediante ELISA de los resultados positivos de la unión a proteínas dio como resultado la identificación de fijadores específicos de la hBMP6. Los fragmentos Fab del anticuerpo se caracterizaron además por su reactividad cruzada entre especies con el homólogo de la BMP6 de ratón, y se determinaron sus afinidades de unión a la BMP6 humana. También se comprobó la especificidad de los Fab utilizando las proteínas hBMP2, hBMP5 y hBMP7 en un ELISA. También se evaluó la actividad específica de la BMP6 de los Fab en un ensayo de genes indicadores.
Tomando como base esta caracterización inicial, se convirtieron varios clones al formato de IgG1 humana y se caracterizaron utilizando los mismos ensayos de unión, especificidad y actividad. El resultado de esta caracterización funcional en combinación con los perfiles resultantes de la evaluación de la desarrollabilidad condujo a la selección de 3 clones para su maduración por afinidad (NOV0429, NOV0441 y NOV0442).
Los clones fueron aleatorizados dentro de su LCDR3 o su HCDR2, produciendo 2 nuevas colecciones de Fab por clon precursor. Se realizaron selecciones en fase sólida utilizando hBMP6 de Peprotech, así como selecciones en fase líquida utilizando hBMP6 biotinilada aleatoria de Peprotech. El cribado MSD-SET de lisados de Fab deE. colicombinado con un ELISA de especificidad de las proteínas hBMP5 y hBMP7 dio como resultado la identificación de fijadores específicos de la hBMP6 con una afinidad mejorada en comparación con los clones precursores. A continuación, estos derivados mejorados se convirtieron en un formato de IgG1 humana y se caracterizaron adicionalmente con un ELISA y un RGA para evaluar su actividad específica de la hBMP6
Se seleccionaron 18 clones de anticuerpos maduros con las propiedades deseadas y buenos perfiles de desarrollabilidad para su genomanipulación (eliminación de posibles sitios de PTM y de retromutación a las secuencias de la estirpe germinal). Las 28 variantes resultantes se produjeron como hIgG1 en expresión a microescala y se caracterizaron como se ha descrito previamente.
El resultado de esta caracterización funcional en combinación con los perfiles resultantes de la evaluación de la desarrollabilidad condujo a la selección de los candidatos prototipo.
Cribado mediante ELISA en antígeno recubierto directamente
Utilizando el cribado mediante ELISA se identificaron clones Fab individuales a partir de los resultados de la selección para la unión al antígeno objetivo. Los fragmentos Fab se ensayaron utilizando lisados en bruto deE. colique contenían Fab (véase la Sección 2.3.3).
El cribado primario se realizó utilizando placas Maxisorp de 384 pocillos recubiertas durante la noche a 4 °C con hBMP6_RD a una concentración de 1,5 μg/ml en tampón de citrato 50 mM a pH 4,7.
El cribado secundario de los resultados positivos primarios se realizó utilizando placas Maxisorp de 96 pocillos recubiertas con hBMP6_RD (1,5 μg/ml en tampón de citrato 50 mM a pH 4,7), así como placas Maxisorb de 96 pocillos recubiertas con hBMP7 (3 μg/ml en tampón de citrato 50 mM a pH 4,7) para comprobar la especificidad.
Tras el lavado, las placas se bloquearon durante 2 h con leche desnatada al 5 % en PBS. Se añadieron lisados deE. colique contenían Fab y se permitió la unión durante 2 h a la TA. Para detectar los fragmentos Fab unidos, las placas se lavaron 5 veces con TBS<t>y se añadió el anticuerpo AP-anti F(ab')2humano a una dilución de 1/5000. Tras 2 h de incubación a la TA, las placas se lavaron 5 veces con TBST y se añadió el sustrato AttoPhos de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las placas se leyeron en un lector de ELISA 10 minutos después de añadir el sustrato.
Cribado por SET tras la maduración por afinidad
La clasificación por afinidad se realizó en principio como se describe a continuación. Para la clasificación de los fijadores madurados mediante una valoración del equilibrio de la solución basada en los principios descritos por (Haenel et al., 2005), se equilibró durante la noche una cantidad constante de extracto de BEL diluido con diferentes concentraciones de antígeno.
A continuación, la mezcla se transfirió a placas MSD que habían sido previamente recubiertas con antígeno y, tras la incubación y el lavado, se añadió un anticuerpo de detección marcado con MSD-Sulfo-etiqueta adecuado.
Posteriormente, se cuantificó la concentración de Fab no unido mediante una detección por ECL utilizando el aparato Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EE.UU.).
Los resultados se procesaron con el programa informático XLfit (IDBS), aplicando el modelo de ajuste correspondiente (Sección 2.6.2.2) para estimar las afinidades e identificar así los clones más mejorados en la maduración por afinidad.
Ensayos in vitro
Evaluación de la selectividad y la reactividad cruzada mediante ELISA
Para determinar la reactividad cruzada entre especies de los anticuerpos anti-BMP6, las proteínas BMP6 recombinantes humanas y de ratón se unieron a una placa y la capacidad de los anticuerpos para unirse a las proteínas recombinantes se determinó mediante un ELISA. Para evaluar la selectividad, también se evaluó la unión a los homólogos más cercanos, la BMP5 y la BMP7 humanas.
Se recubrieron placas de ELISA con los reactivos de antígeno por inmovilización directa a 3-5 μg/ml durante la noche a 4 °C. La hBMP6 (Peprotech) se diluyó en Tris 50 mM a pH 8,0 para el recubrimiento. La hBMP6, la mBMP6 y la hBMP5 (R&D Systems) se diluyeron en tampón de citrato 50 mM a pH 4,7. La hBMP7 (Peprotech) se diluyó en tampón de citrato 50 mM a pH 4,7. Como antígeno no relacionado, se recubrió con hDKKl-His a 5 μg/ml en PBS.
Al día siguiente, se desecharon las soluciones de antígeno y las placas se lavaron tres veces con 100 μl de TBST. Cada pocillo se bloqueó posteriormente con 100 μl de leche al 5 % en TBST durante 2 h a la TA. En los experimentos posteriores, el bloqueo se realizó con 100 μl de tampón de bloqueo Superblock.
Tras lavar las placas tres veces con 100 μl de TBST, cada antígeno se incubó con 40 μl de muestras de Fab o IgG purificadas a una concentración de 1 μM y 0,2 μM, respectivamente (en tampón de PBST).
Después de 2 h de incubación a la temperatura ambiente, las placas se lavaron de nuevo tres veces y los Fab/IgG unidos se detectaron añadiendo 40 j l de una dilución 1:5000 de anticuerpo secundario F(ab2) anti-IgG humana conjugado con AP. Después de 1 h a la TA, la señal se eluyó añadiendo 40 j l de sustrato AttoPhos de acuerdo con el protocolo del fabricante, y las placas se analizaron inmediatamente utilizando una longitud de onda de excitación de 430 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm con un lector de placas de ELISA.
Evaluación de la afinidad
Curvas de unión del ELISA
Se recubrieron placas de ELISA con el antígeno hBMP6 (Peprotech) por inmovilización directa a 1,5 jg/m l en tampón de Tris 50 mM a pH 8,0 y se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se desechó la solución de antígeno y se lavaron las placas tres veces con 100 j l de TBST. A continuación, cada pocillo se bloqueó con 100 j l de leche al 5 % en TBST durante 2 h a la TA. En los experimentos posteriores, el bloqueo se realizó con 100 j l de tampón de bloqueo Superblock.
Después de lavar las placas tres veces con 100 j l de TBST, se incubó el antígeno con 30 j l de muestras de Fab purificado o IgG en diluciones sucesivas, empezando de 1 jM a 0,03 nM en PBST para los Fab, de 0,5 jM a 0,01 nM en PBST para las IgG.
Después de 2 h de incubación a la temperatura ambiente, las placas se lavaron de nuevo tres veces y los Fab/IgG unidos se detectaron añadiendo 30 j l de una dilución 1:5000 de anticuerpo secundario F(ab2) anti-IgG humana conjugado con AP. Después de 1 h a la TA, la señal se eluyó añadiendo 30 j l de sustrato AttoPhos de acuerdo con el protocolo del fabricante, y las placas se analizaron inmediatamente utilizando una longitud de onda de excitación de 430 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm con un lector de placas de ELISA.
Método de valoración del equilibrio de la solución (SET) para la determinación de la K<d>utilizando el Sector Imager 6000 (MSD)
La determinación de la afinidad en solución se realizó básicamente como se describe en la bibliografía (Friquet et al., 1985). Para mejorar la sensibilidad y la precisión del método de SET, se transfirió del ELISA clásico a la tecnología basada en la ECL (Haenel et al., 2005).
El anticuerpo específico de cabra anti-fragmento (Fab)2de la IgG a 1 mg/ml se marcó con MSDSulfo-TAG™ NHS-Ester (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los experimentos se llevaron a cabo en placas de microtitulación de polipropileno y PBS que contenían un 0,5 % (p/v) de BSA y un 0,02 % (v/v) de Tween20 como tampón de ensayo. El antígeno no marcado se diluyó en una serie 2n, comenzando con una concentración al menos 10 veces superior a la KD esperada. Se utilizaron pocillos sin antígeno para determinar los valores de la Bmáx; se utilizaron pocillos que contenían únicamente tampón de ensayo para determinar el fondo. Tras añadir la cantidad adecuada de fijador (concentración de anticuerpo similar o inferior a la KD esperada, volumen final de 60 jl), la mezcla se incubó durante toda la noche a la TA.
Las placas MSD se recubrieron con antígeno (30 j l por pocillo). Tras lavar la placa con PBS que contenía un 0,05 % (v/v) de Tween20, las muestras equilibradas se transfirieron a esas placas (30 j l por pocillo) y se incubaron durante 20 min. Tras el lavado, se añadieron 30 j l por pocillo del anticuerpo de detección marcado con MSD-Sulfo-etiqueta (anti-(Fab)2humano, dilución final normalmente a 1:2000) a la placa MSD, y se incubaron durante 30 min a la TA en un agitador Eppendorf (700 rpm).
Tras lavar la placa MSD y añadir 30 jl/pocillo de tampón de lectura MSD T con tensioactivo, se detectaron las señales de electroquimioluminiscencia con un Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EE.UU.).
Los datos se evaluaron con el programa informático XLfit (IDBS) aplicando modelos de ajuste personalizados. Para la determinación de la K<d>de las moléculas de Fab se utilizó el siguiente modelo de ajuste (de acuerdo con (Haenel et al., 2005), modificado de acuerdo con (Abraham et al., 1996)):
[Fab]t: concentración de Fab total aplicada
x: concentración total de antígeno solu
Bmáx: señal máxima de Fab sin antígeno
Kd: afinidad
Para la determinación de la K<d>de las moléculas de IgG se utilizó el siguiente modelo de ajuste para IgG (modificado de acuerdo con (Pieliler et al., 1997)):
[IgG]: concentración total de IgG aplicada
x: concentración total de antígeno soluble aplicado (sitios de unión)
Bmáx: señal máxima de IgG sin antígeno
Kd: afinidad
Ajustes experimentales:
La determinación de la Kd de los Fab se realizó básicamente como sigue: Las placas MSD se recubrieron durante la noche a 4 °C con 10 μl por pocillo de hBMP6 a 1-3 μg/ml en tampón de Tris 10 mM a pH 8. Posteriormente, las placas se bloquearon durante 1 h con PBS que contenía un 5% de BSA. El antígeno hBMP6 se utilizó para la valoración de los fragmentos Fab libres. La solución madre de antígeno se diluyó previamente a 1:40 en tampón de Tris 10 mM a pH 8,0 hasta 475 nM antes de ajustar con tampón de ensayo hasta la concentración inicial prevista para la valoración.
Medición cinética del octeto ForteBio
Las evaluaciones de la afinidad mediante la determinación de los parámetros cinéticos se realizaron a través de la tecnología de interferometría de biocapa.
Las muestras de Fab purificado se midieron utilizando biosensores de inmersión y lectura de estreptavidina. La placa se colocó en un instrumento Octet QK (ForteBio) y se dejó equilibrar a 25 °C en la cámara termostática. El experimento se inició colocando los sensores en los pocillos que contenían 15 μg/ml de antígeno hBMP6 biotinilado durante 600 s. A continuación, los sensores se colocaron en los pocillos que contenían 0, 200, 400, 800, 1600 nM de muestra de Fab purificado. Se utilizó una concentración de Fab de 0 nM para la determinación del fondo. La asociación y la disociación del Fab se registraron, cada una, midiendo el cambio en el grosor de la capa (en nanómetros, nm) con el tiempo durante 800 s cada una, todo ello bajo control informático. Los datos se procesaron automáticamente utilizando el programa informático de usuario Octet versión 3.0.
Medición cinética con Biacore
Las mediciones se realizaron utilizando las muestras de Fab e IgG purificadas y los antígenos humanos BMP6 y BMP7.
Categorización de epítopos mediante ELISA
Se realizó una categorización de epítopos mediante un ELISA competitivo para clasificar los anticuerpos en grupos con epítopos idénticos o significativamente solapados, es decir, anticuerpos capaces de inhibir la unión de los demás.
Se recubrió una placa Maxisorp de 384 pocillos con 20 μl de IgG anti-BMP6 66 nM en PBS. La placa se incubó durante la noche a 4 °C. Tras lavar dos veces con TBST, la placa se bloqueó con 100 μl por pocillo de tampón de bloqueo Superblock durante 2,5 h a la TA, a continuación se lavó dos veces con TBST.
Durante el bloqueo de la placa, se premezcló hBMP6 de Peprotech a 66 nM en PBST con Fab anti-BMP6 purificados (marcados con Flag-His) a 300 nM en PBST en tubos Eppendorf (se mencionan las concentraciones finales en la mezcla).
Tras 2 h de incubación a la TA, se añadieron 20 |jl de la premezcla de hBMP6/Fab a los pocilios recubiertos con IgG anti-BMP6 bloqueadas, de acuerdo con la disposición de la placa, y se incubaron durante un máximo de 20 min a la TA. La placa se lavó cuatro veces con TBST y a la placa se añadió el conjugado de anticuerpo anti-His6-POD ("His6" divulgado como la SEQ ID NO: 96) diluido a 1/1000 en PBST. Tras 1 h de incubación a la TA, la placa se lavó 5 veces con TBST. Se añadió una solución de sustrato de ELISA quimioluminiscente a cada pocillo y se leyó la luminiscencia sin tiempo de incubación utilizando un lector de placas Tecan.
Potencia in vitro en el ensayo de genes indicadores (RGA)
Los clones de anticuerpos se ensayaron en el ensayo del gen indicador (RGA) como fragmentos Fab purificados y/o muestras de IgG.
En resumen, la estirpe celular de hepatoma HEP3B se transfectó de forma estable con el vector lentivírico pGL4-BRE2-Luc2, que contenía un elemento BRE sensible a las BMP en el promotor que dirige la luciferasa de luciérnaga. Se utilizaron las proteínas BMP de R&D systems para inducir la señalización. El ensayo BrightGlo se realizó 24 horas después del tratamiento.
Evaluación de la actividad inespecífica
Progen UNIchip® AV-VAR EP contiene 384 proteínas extracelulares o secretoras purificadas expresadas como proteínas de fusión con una etiqueta de His aminoterminal enE. coli.
Tras la incubación con anticuerpos anti-hBMP6 a 5 jg/ml, los anticuerpos unidos se detectan utilizando un anticuerpo F(ab')2de cabra específico del fragmento F(ab')2-anti hlgG conjugado con DyLight649.
Señal del control interno de hlgG fijada en el 100 %; la actividad inespecífica se normaliza con respecto a la hlgG; un resultado positivo se considera positivo cuando la señal es igual o superior al 4 % (el valor de corte corresponde a m+3 medido sobre el fondo).
Eficacia in vivo en un modelo de ratón
Los anticuerpos purificados Anticuerpo 5, Anticuerpo 6 y Anticuerpo 7 se ensayaron en un modelo de ratón con anemia resistente a los AEE.
Resultados
Caracterización de los anticuerpos anti-BMP6
Evaluación de la especificidad de las IgG genomanipuladas
Las 28 IgG anti-hBMP6 genomanipuladas (retromutadas a las secuencias de la estirpe germinal y eliminando los PTM) se produjeron a microescala y se ensayaron en un ELISA de especificidad a una concentración de 0,2 jM .
Las variantes genomanipuladas que conservaron una reactividad cruzada limitada a otras proteínas BMP y una fuerte afinidad por la hBMP6 en comparación con el clon madurado no genomanipulado fueron seleccionadas para una caracterización adicional.
• Todas las variantes de IgG genomanipuladas NOV0429 mostraron una unión inespecífica muy aumentada a la BSA.
• Las variantes de IgG genomanipuladas NOV0441 mostraron una reactividad cruzada ligeramente aumentada frente a la hBMP5 en comparación con sus precursores maduros.
• Las variantes de IgG genomanipuladas NOV0442 conservaron su reactividad cruzada limitada frente a la hBMP7 y a la hBMP5.
Tabla0.ELISA de especificidad de clones de anticuerpos de IgG;los destacados en gris son los 3 anticuerpos prototipo
Actividad en el ensayo de genes indicadores (RGA)
Los 28 IgG anti-hBMP6 producidas a microescala (retromutadas a las secuencias de la estirpe germinal y eliminando los PTM) se ensayaron como se ha descrito anteriormente. Los resultados se resumen en la Tabla 3.
• Las variantes de IgG genomanipuladas NOV0429 mostraron una actividad frente a la BMP6 mejorada de 3 a 5 veces, pero a cambio ganaron actividad agonista con todas las demás BMP.
• Las variantes de IgG genomanipuladas NOV0441 adquirieron cierta reactividad cruzada con las otras tres BMP.
• Las variantes de IgG genomanipuladas NOV0442 mostraron una actividad frente a la BMP mejorada, pero también mostraron cierta inhibición del sistema inducido por BMP7 a la concentración más alta de 25 μg/ml. Tabla 3. Actividad de los clones de anticuerpos de IgG genomanipulados en RGA;los valores de la 050 están en [pg/ml]. Se seleccionaron los anticuerpos NOV0951, NOV0954 Y NOV0958 como anticuerpos prototipo.
Evaluación de la desarrollabilidad S-DAS 3
Tras la retromutación a las secuencias de la estirpe germinal y la eliminación de los PTM, se sometieron 23 variantes genomanipuladas anti-hBMP6 de 18 clones maduros a una tercera evaluación de desarrollabilidad.
Se descubrió que los anticuerpos tenían unos perfiles de desarrollabilidad de riesgo favorables, excepto 2 clones que mostraron un alto riesgo debido a un alto nivel de agregación (NOV0942, un derivado HCDR2 de NOV0429; NOV0944, un derivado LCDR3 de NOV044 1).
Otros 2 clones fueron etiquetados con un perfil de riesgo medio debido a su bajo título de productividad (NOV0957 y NOV0960, derivados HCDR2 del anticuerpo precursor NOV0442).
Tabla 4. Compendio de la S-DAS 3 de anticuerpos anti-BMP6(23 hlgG l genomanipuladas); se seleccionaron los anticuerpos NOV0951, NOV0954 Y NOV0958 como anticuerpos prototipo.
Motivos PM esenciales
sí Motivos de PTM recomendados para ser eliminados(NG, NS.DG, N-Glyc, Cys, H-N30X)
riesgo globalpara la desarrollabilidad debido a las propiedades fisicoquímicas
bajo riesgo bajo
moderado riesgo moderado
alto recomendación de alto riesgo: no continuar con este candidato; este candidato no cumple los criterios de la DAS
agregados
bajo el contenido de monómeros de la IgG es de al menos el 95 %
moderado el contenido de monómeros de la IgG está entre el 90 y el 95 %
alto el contenido de monómeros de la IgG está por debajo del 95 %; este candidato no cumple los criterios de la DAS (>90 %)
productividad
bajo la productividad de IgG en sistemas de expresión transitoria es de al menos 10 mg/ml
moderado la productividad de IgG en sistemas de expresión transitoria es de entre 5 y 10 mg/ml
alto la productividad de IgG en sistemas de expresión transitoria es inferior a 10 mg/ml; este candidato no cumple los criterios de la DAS (>5 mg/ml)
Pl
>8,2
<8,2; indica un cierto riesgo; podrían surgir problemas de agregaoión/formulación
Tm (pH 7,4)
>68 °C
<68 °C, indica un cierto riesgo para la estabilidad; podrían surgir problemas de agregación/formulación
Hidrofobia
> 0,8 M (NH4)2S04
< 0,8 M (NHí ^SO í indica un cierto riesgo para la agregación/formulación, podrían surgir problemas de alta viscosidad, precipitación
Evaluación de la actividad inespecífica
Los 3 candidatos prototipo NOV0951, NOV0954 y NOV0958 se ensayaron como hIgGl purificadas para evaluar la unión inespecífica en un Protagen UNIchip recubierto con 384 proteínas extracelulares o secretoras purificadas como se ha descrito anteriormente. Todos ellos mostraron una baja actividad inespecífica (≤10 resultados positivos), lo que puede considerarse no problemático.
Tabla 5. Visión general de los resultados del chip proteico para los 3 anticuerpos prototipo
C ódigo 1006 1007 1013
de b a r ra s
A nticuerpo Ac 5 Ac 6 Ac 7
Selección de los anticuerpos prototipo y de segunda generación
Tomando como base los datos de unión a proteínas, los datos de actividad y de especificidad del RGA, así como de la evaluación de desarrollabilidad, se decidió seleccionar a los candidatos genomanipulados NOV0951, NOV0954, NOV0958 como anticuerpos prototipo. Además, todos ellos mostraron una ventana superior de especificidad para la hBMP6 en comparación con el anticuerpo Anticuerpo 676. Los candidatos genomanipulados NOV0961, NOV0943, NOV0945 se consideraron anticuerpos de segunda generación. La Tabla 6 recapitula el árbol genealógico de los candidatos finales. Tabla 6. Árbol enealó ico de los anticuerpos anti-hBMP6 prototipo de se unda eneración seleccionados
Conclusión y debate
Uno de los objetivos de este proyecto era revelar anticuerpos inhibidores de la señalización de la BMP6 y, por tanto, adecuados para el tratamiento de la anemia de f d d ó i
Por lo tanto, se aplicaron 3 estrategias de selección diferentes basadas en proteínas. Los resultados positivos de los ELISA primarios se obtuvieron principalmente a partir de grupos de selección en fase sólida, pero tras el ensayo de actividad RGA se demostró que 12 anticuerpos inhibían la señalización de la hBMP6. Hubo 3 clones de anticuerpos (NOV0429, NOV0441 y NOV0442) derivados del subcódigo de selección 2023.5 que mostraron una actividad específica frente a la BMP6 y buenas propiedades de desarrollabilidad, por lo que fueron seleccionados para la maduración por afinidad.
Se generaron 2 colecciones para cada clon de anticuerpo, con LCDR3 o HCDR2 aleatorizadas. Se aplicaron 3 estrategias diferentes de selección de la maduración. Tras el cribado por SET, el ELISA de especificidad y la secuenciación, se averiguó que 18 clones de anticuerpos madurados inhibían específicamente la señalización de la BMP6 en el RGA, y se seleccionaron para su genomanipulación.
Los clones maduros procedentes de la familia de NOV0442 fueron sometidos a la eliminación de un sitio potencial de desamidación en la LCDR2, a la reparación de la región marco y a la retromutación a las secuencias de la estirpe germinal. Esto dio como resultado los anticuerpos NOV0951, NOV0954, NOV0958 y NOV0961, que demostraron tener unas propiedades de unión similares a las de sus respectivos precursores maduros no mutantes.
Los clones madurados procedentes de la familia de NOV0441 fueron sometidos a una retromutación a las secuencias de la estirpe germinal, lo que dio como resultado los anticuerpos NOV0943, NOV0945 y NOV0946, que demostraron tener una reactividad cruzada aumentada frente a la BMP5 en comparación con sus respectivos precursores maduros no mutantes.
Tomando como base su capacidad para inhibir la señalización de la BMP6 con una reactividad cruzada limitada con otras proteínas BMP y su perfil de desarrollabilidad favorable, se produjeron NOV0951, NOV0954 y NOV0958 en mayores cantidades y se administraron para seguir evaluando su utilidad como fármaco terapéutico para la anemia resistente a la EPO (por restricción de hierro). Se utilizó un modelo de ratón con anemia resistente a los AEE para determinar su eficaciain vivo.
Los 3 anticuerpos prototipo NOV0951, NOV0954 y NOV0958 se sometieron a una evaluación final de desarrollabilidad. La idoneidadin vivode los 3 anticuerpos prototipo se evaluó determinando sus perfiles farmacocinéticos en ratas.
La Tabla 7 resume las propiedades de los candidatos prototipo finales que cumplían los requisitos de los anticuerpos definidos al inicio del proyecto.
Tabla 7. Propiedades de los anticuerpos prototipo anti-hBMP6 seleccionados
EJEMPLO 2 - Actividad in vitro e in vivo, y PK/PD de los anticuerpos anti-BMP6
Materiales
Los compuestos de ensayo eran los Anticuerpos 5, 6 y 7 (Tabla 8), a una concentración de ~8 mg/ml en tampón de citrato 50 mM, a pH 7,0, NaCl 150 mM y diluidos en PBS antes de la administración a los animales. Se utilizaron ratones macho C56BL/6 o ratas Sprague Dawley (Tabla 9).
Tabla 8. Propiedades de los anticuerpos antagonistas de la BMP6
Tabla 9. Características de los animales
Para los ensayos del gen indicador de BMP, se construyó un vector lentivírico que contenía el elemento BRE de respuesta a BMP en el promotor [Korchynskyi et al. 2002. J. Biol. Chem.277: 4882-91] que dirige la luciferasa de luciérnaga derivada de pGL4-BRE2-Luc2. El vector lentivírico se utilizó para transfectar de forma estable la estirpe celular de hepatoma HEP3B. La estirpe celular se mantuvo en EMEM con un 10 % de suero bovino fetal, un 1 % de penicilina/estreptomicina y 5 μg/ml de blasticidina. Las proteínas BMP humanas recombinantes se adquirieron en R&D Systems.
El antígeno del ensayo del anillo deBrucella abortus(cepa 1119-3) en frascos de 60 ml se adquirió en el U.S. Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, National Veterinary Services Laboratories, Ames, lowa. El antígeno del ensayo del anillo de la brucelosis contiene una suspensión de células muertas y teñidas deB. abortus,cepa 1119-3, en tampón fenolizado. La concentración de cada frasco de 60 ml es de aproximadamente 109 partículas/ml. Se lava una solución madre de 5 * 109 y se prepara de la siguiente manera. En primer lugar, se sacan los frascos de 60 ml del frigorífico y se mezclan completamente. A continuación, se transfieren 500 ml de BA a un frasco de centrífuga de 500 ml. A continuación, se centrifugan a 10000 rpm durante 15 minutos en una ultracentrífuga. Se retira el sobrenadante y se resuspende en 100 ml de PBS, obteniéndose una solución madre de 5 * 109 partículas/ml, que se alicuotó y se congeló a -80 °C.
Condiciones de mantenimiento de los animales
Los animales se alojaron socialmente en jaulas de fondo sólido con microaisladores durante los periodos de aclimatación y de estudio. Los animales se mantuvieron bajo un ciclo de luz convencional como sigue: 12 horas de oscuridad, 12 horas de luz (luces encendidas: 6:30 AM, luces apagadas: 6:30 PM) con una temperatura ambiente de 21-23 °C y una humedad de 30-70 %. Durante los periodos de aclimatación y de estudio, los animales tuvieron acceso a dietas para roedores y agua a voluntad (ad lib).
Condiciones experimentales
Determinación de la actividad de los anticuerpos en el ensayo del gen indicador de BMP
En un ensayo típico, se sembraron 0,6 * 104 células BRE-Luc2 HEP3B en placas de 384 pocillos en 25 μl de medio de cultivo básico, excepto porque el suero se redujo al 2 %. Al día siguiente se añadieron los anticuerpos diluidos en PBS, seguido de la adición de la BMP6 a una concentración final de 10 ng/ml. El volumen se llevó hasta 50 μl con medio EMEM sin nada de suero, con lo que la concentración final de suero fue del 1 %. Como contraensayo,se realizó en paralelo la activación con BMP2/4/7. El ensayo BrighGlo (Promega) se realizó 24 horas después de la adición de anticuerpos de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un lector de placas Envision (PerkinElmer). Los datos se calcularon como porcentaje de inhibición para cada anticuerpo en comparación con la activación completa del indicador por un anticuerpo de control.
Estudio farmacocinético de dosis única de anticuerpos en rata
El estudio de triaje PK en ratas no pretende determinar los parámetros PK clásicos con una certeza estadística definida, sino proporcionar una estimación de la semivida sérica del anticuerpo de ensayo. Se inyectó una única dosis intravenosa del anticuerpo a 3 animales.
Para el estudio PK/PD de dosis-respuesta en ratones, los animales se dividieron en 2 cohortes separadas de igual número. Cada cohorte incluye ratones tratados tanto con vehículo como con compuesto. Una cohorte se sometió a análisis los días 2, 4, mientras que la segunda cohorte se analizó los días 6, 8 después de la inyección de anticuerpos. La razón de la separación de cohortes es reducir la necesidad de extracciones de sangre sucesivas para que el impacto en los parámetros del hierro sérico sea mínimo. Los grupos de animales se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10. Diseño, asi nación de animales dosis de los artículos de ensa o
Establecimiento de la anemia de inflamación en ratones y tratamiento terapéutico
Se preparan 5 * 108 partículas de BA para inyección de la siguiente manera (ejemplo para 10 ratones). La concentración inicial debe ser de 2,5 * 109 partículas/ml, ya que se inyectarán 200 μl/ratón. Diluir la solución madre 2 veces utilizando PBS. Por ejemplo, 10 ratones por 0,200 μl = 2 ml 20 % de exceso = 2,2 ml de 2,5 * 109 partículas/ml necesarias. 1.1 ml de caldo BA 1,1 ml de PBS. Se demostró que la administración de BA de 1 a 8 días antes del tratamiento con AEE provocaba una respuesta atenuada en la HGB de 6 a 7 días después.
Se inyectó BA (3 * 108 partículas/ratón) a ratones C57BL/6 y se midieron los niveles séricos de IL6 5 horas después mediante un ELISA (KMC0061, Life Technologies) para determinar la respuesta inflamatoria. Se excluyeron del estudio los animales con una concentración de IL6 inferior al intervalo de confianza del 95 % de la media de todos los animales tratados con BA, lo que dio como resultado menos de 5-6 ratones en algunos grupos. Este proceso de exclusión se llevó a cabo para disminuir la posibilidad de resultados falsos positivos producidos por la inclusión de animales que no presentaban una inflamación suficiente para atenuar la respuesta a los AEE. Tras el proceso de exclusión, se inyectaron a los ratones por vía intravenosa los anticuerpos indicados el día 6, y se administró EPO (100 g/kg de darbepoetina alfa subcutánea, Amgen) a 100 mg/kg el día 7 en relación con el tratamiento de la BA. La respuesta al tratamiento con los AEE y los anticuerpos se midió 6 días después.
Análisis de farmacocinética, farmacodinámica y criterios de valoración de la eficacia
Para los estudios PK/PD de ratón y rata, se recogieron muestras séricas en los puntos temporales indicados después de la inyección de anticuerpos. Se utilizaron alícuotas de los sueros para determinar la concentración de anticuerpos circulantes mediante un sistema automatizado de inmunoensayo de alto rendimiento (Gyros) con anti-IgG humana biotinilada como anticuerpo primario de captura. Se utilizó una segunda alícuota de suero de cada muestra para el ensayo cuantitativo colorimétrico del hierro (Quntichrom, DIFE-250, Bioassay Systems). Se procesó una tercera alícuota para la cuantificación por CL-EM del péptido hepcidina-25 de rata o de ratón, siguiendo un procedimiento modificado descrito anteriormente. Li et al. 2009. J. Pharm. Tox. Meth. 59: 171-80.
Para el estudio de la anemia inducida por BA y el tratamiento con anticuerpos, se realizó una última extracción de sangre en tubos BD Microtainer recubiertos de EDTA en el momento de la terminación mediante punción cardíaca. La sangre completa se utilizó para un los análisis de hemograma completo en un analizador hematológico XT-2000iV. Los criterios de valoración de la eficacia incluyen HGB, HCT, RETA y RET-HE.
Análisis estadísticos
Se realizó un análisis unifactorial de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba de Bonferronia posteriori paraanalizar las diferencias entre grupos (considerándose significativa una p<0,05) en los parámetros hematológicos. Los datos se presentan como las medias ± EEM.
Resultados
Actividad biológica de los anticuerpos antagonistas de la BMP6 en ensayos transcripcionales celulares dependientes de BMP
Los tres anticuerpos antagonistas de la BMP65, 6 y 7 inhiben totalmente la bioactividad de la actividad indicadora de la BMP inducida por la BMP6 humana recombinante (BRE-luc) en la estirpe celular de hepatoma humano Hep3B (CI50 = 0,4 nM frente a 0,3 nM de rhBMP6) y, por tanto, son activos en una relación molar Ag/AcMc de 1:1 o mejor. Los anticuerpos mostraron una buena selectividad sobre las proteínas relacionadas de la familia BMP, incluyendo las BMP2, 5 y 7, con una ventana de 500 veces o más. Véase la Fig. 1.
Resumen de los perfiles farmacocinéticos y farmacodinámicos de los anticuerpos antagonistas de la BMP6 en ratas
Se realizó un estudio farmacocinético de triaje de dosis única en ratas Sprague Dawley para los anticuerpos contra las BMP65, 6 y 7, mediante inyección intravenosa por catéter en vena yugular a 10 mg/kg de peso corporal. La comparación de la relación concentración-tiempo del anticuerpo total (en particular, t-i/<2>, MRT) en suero de los tres anticuerpos con un perfil convencional sugirió unas características coherentes con una IgG humana típica (véanse la Fig. 2 y la Tabla 11). No hay pruebas de una disposición del fármaco mediada por el objetivo. A esta dosis, todos los anticuerpos contra la BMP6 suprimieron la hepcidina sérica por debajo de los niveles de detección el día 1 después de la inyección. La fuerte supresión sostenida de la expresión de hepcidina seguía siendo evidente el día 16, lo que sugiere una larga duración de la actividad. En consecuencia, se observó un pico transitorio de aumento de la concentración de hierro circulante el día 2 después de la inyección de anticuerpos, y los niveles siguen siendo elevados el día 16.
La concentración sérica de anticuerpos se midió en horas extraordinarias tras una única inyección de anticuerpos. Las muestras se recogieron 1 h, 6 h, 1,2, 4, 8, 16, 28 días después de la dosis (10 mg/kg, intravenosa).
Tabla 11. Parámetros clave en el estudio PK de tria e de dosis única en ratas
Asimismo, se midió la concentración sérica total del Anticuerpo 7 (tanto libre como unido a la BMP6) en ratas y macacos tras una única inyección intravenosa del Anticuerpo 7 (en ratas, a unas dosis de 10, 3, 1, 0,3, 0,1 y 0,03 mg/kg; en mono a 3 mg/kg) a las horas indicadas mediante un ELISA con un LIDC de 46 ng/ml (línea de puntos) en ratas y un LIDC de 0,2 |jg/ml (línea de puntos) en mono. Los resultados se muestran en las Figs. 9 (rata) y 12 (mono).
Respuesta dependiente de la dosis en los parámetros de hierro sérico tras el tratamiento con anticuerpos contra la BMP6 en ratones y macacos
Para definir aún más la respuesta dependiente de la dosis del metabolismo del hierro al tratamiento con anticuerpos contra la BMP6, a ratones C57BL/6 sin tratamiento previo se les inyectaron dosis crecientes del Anticuerpo 6, que variaban entre 0,02 y 0,5 mg/kg, según se indica. Se eligió el Anticuerpo 6 como representante de los 3 anticuerpos ya que comparten una región marco, un perfil PK en roedores y unas actividadesin vitrosimilares. Una dosis única de 0,5 o 0,1 mg/kg suprimió significativamente la hepcidina sérica y, en consecuencia, aumentó la concentración sérica de hierro 2 días después del tratamiento. Sin embargo, únicamente con 0,5 mg/kg se observó un fuerte efecto sostenido sobre el metabolismo del hierro hasta 8 días después de la inyección. Véase la Fig. 3. Estos resultados sugieren que puede lograrse fácilmente una neutralización del objetivo saturable y dependiente de la dosis utilizando potentes anticuerpos antagonistas de la BMP6.
Véase la Fig. 3, Efectos dependientes de la dosis de un anticuerpo contra la BMP6 sobre los biomarcadores séricos del metabolismo del hierro Parte superior: Concentración sérica de hIgG a lo largo del tiempo tras una única inyección intravenosa del Anticuerpo 6 a las dosis indicadas. Parte inferior: El panel izquierdo es el análisis cuantitativo de la concentración sérica de hepcidina tras una única inyección de Anticuerpo 6 o de IgG humana de control, mientras que el panel derecho es la concentración sérica de hierro.
Se realizaron experimentos similares con el Anticuerpo 7. Se ensayó la supresión dependiente de la dosis y del tiempo de la hepcidina sérica circulante por parte del Anticuerpo 7 en ratas Sprague-Dawley macho. Se recogieron muestras séricas 0,25, 1,2, 6 h y 1, 2, 4, 7 y 14 días tras la administración de una dosis única del Anticuerpo 7 mediante inyección intravenosa a una dosis que variaba entre 0,03 mg/kg y 10 mg/kg. Los niveles séricos de hepcidina se midieron mediante una CL/EM con un LIDC = 9 ng/ml. En los mismos animales, también se midieron los niveles séricos de hierro. Los resultados se presentan en la Fig. 11.
Estos resultados indican que los anticuerpos anti-BMP6 de la presente invención son capaces de provocar un aumento del hierro sérico dependiente de la dosis. Los efectos fueron robustos y persistieron durante al menos 2 semanas tras la administración del anticuerpo.
Los efectos sobre los parámetros del hierro sérico en respuesta al anticuerpo anti-BMP6 también se ensayaron en el macaco. Se administró a macacos macho una única inyección intravenosa del Anticuerpo 7 a una dosis de 3 mg/kg. Los días indicados después de la inyección, se recogieron muestras séricas y se analizaron para determinar la concentración total de hierro sérico (Fe) y de hepcidina. Los resultados se muestran en la Fig. 13. Se presentan los datos de 3 animales individuales (representados gráficamente frente a los niveles iniciales previos a la dosis). Los valores medios se indican con la línea "x". Se observó un aumento del hierro sérico y una supresión de la hepcidina sérica 24 h después de la administración del anticuerpo, y los efectos se mantuvieron (en relación con los niveles previos a la dosis) hasta el final del estudio de 28 días. Estos resultados indican que los anticuerpos contra la BMP6 de la invención inducen potentemente la expresión de hepcidina y reducen la concentración de hierro circulante en primates no humanos.
Efecto de los anticuerpos contra la BMP6 sobre los parámetros de los glóbulos rojos en la anemia resistente a los AEE e inducida por la inflamación en ratones
Se realizaron experimentos para evaluar la utilidad terapéutica de los anticuerpos anti-BMP6 en un modelo de ratón de anemia de inflamación. Véase la Fig. 4. Los ratones tratados con antígeno deBrucella abortus(BA) desarrollaron anemia 6 días después. Los animales anémicos se trataron con anti-BMP6 más anticuerpos de eritropoyetina recombinante (EPO) iniciados con un día de diferencia, y el efecto de la terapia de anticuerpos sobre la progresión de la anemia se controló en el día 13 en relación con BA. Los valores de HGB y de HCT disminuyeron entre el inicio del tratamiento y el día 13, lo que fue resistente al tratamiento con EPO sola. El tratamiento combinado con anticuerpo contra la BMP6 y EPO restauró eficazmente la respuesta a la EPO y elevó significativamente los niveles de HGB y de HCT. Este efecto se asoció a una estimulación concomitante de la actividad de la eritropoyetina, reflejada por el aumento persistente del RETA, así como al restablecimiento del contenido de hemoglobina de los reticulocitos, lo que sugiere una corrección de la síntesis del hemo debida a la deficiencia funcional de hierro en el compartimento de eritropoyesis.
Véase la Fig. 4, tratamiento terapéutico del anticuerpo contra la BMP6 en un modelo de ratón de anemia de inflamación resistente a los AEE. Parte superior: Esquema experimental del modelo de anemia de inflamación resistente a los AEE inducida por BA. Parte inferior: Parámetros de eritropoyesis 13 días después del tratamiento con BA. HGB: hemoglobina; HCT: hematocrito; RETA: recuento de reticulocitos;<r>ET-HE: Equivalente de hemoglobina reticulocitaria.
* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 frente a BA+EPO+lilgGl
EJEMPLO 3 - Plan clínico para el ensayo de anticuerpos contra la BMP6 en seres humanos
Plan de ensayos clínicos:Evaluación de la terapia con anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a la BMP6 humana.
Los pacientes con insuficiencia renal terminal (IRT) producen poca o ninguna eritropoyetina (EPO) y generalmente requieren la administración periódica de EPO exógena e infusiones intravenosas (IV) de hierro para permitir la síntesis de Hgb inducida por la EPO. Hasta un tercio de los pacientes en hemodiálisis crónica (HD) no responden adecuadamente a la EPO, debido principalmente a la fijación intracelular de hierro. La hepcidina es eliminada principalmente por el riñón, pero la eliminación mediante diálisis es insuficiente. Por lo tanto, los pacientes en HD crónica tienden a tener unos niveles de hepcidina significativamente elevados, que bloquean la movilización del hierro para la eritropoyesis. La terapia con hierro intravenoso deja de ser eficaz o recomendable una vez que las reservas corporales de hierro alcanzan un nivel crítico (indicado por unos niveles elevados de ferritina sérica). Las directrices actuales desaconsejan administrar hierro intravenoso a los pacientes anémicos en diálisis con unos niveles elevados de ferritina, y por tanto, estos pacientes pueden recibir dosis aún más elevadas de EPO, con el riesgo potencial asociado de anemia hiporreactiva a la EPO (Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group 2012). La anemia hiporreactiva a la EPO conlleva un riesgo significativamente mayor de mortalidad general relacionada tanto con la anemia como con una mayor dosis de EPO en pacientes en hemodiálisis (Kilpatrick et al 2008, Lopez-Gomez et al 2008, Fukuma et al 2012) y en diálisis peritoneal (Suttorp et al 2013). Los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a la BMP6 humana de la presente divulgación pueden beneficiar a los pacientes con insuficiencia renal crónica con anemia por restricción de hierro al mejorar los niveles de hemoglobina (Hgb) y reducir simultáneamente las necesidades de EPO y de administración de hierro intravenoso. Un menor índice de resistencia a la EPO (relación entre la dosis de EPO y el nivel de Hgb) se correlaciona con un menor rie
En resumen, el objetivo de la terapia que utiliza los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a la BMP6 humana de la presente divulgación es movilizar el hierro fijado, lo que puede reducir a continuación las necesidades de EPO y de dosis de hierro y mejorar los niveles de Hgb, todo lo cual se espera que mejore los resultados de los pacientes. Es un primer ensayo en seres humanos con una sola dosis de terapia con anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a la BMP6 humana. Este estudio evaluará la seguridad, la tolerabilidad, la farmacocinética, la farmacodinámica y la eficacia en una población de pacientes en hemodiálisis crónica. El propósito de este estudio es evaluar si la terapia con anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a la BMP6 humana justifica un desarrollo clínico posterior en la anemia asociada a la insuficiencia renal crónica.
Plan de investigación
Diseño del estudio
Es un primer ensayo en seres humanos, en dos partes, con una sola dosis, no confirmatorio, de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana para evaluar la seguridad la tolerabilidad, la PK, la PD y la eficacia en una población de pacientes en hemodiálisis crónica. La Parte 1 es un primer ensayo en seres humanos, con una sola dosis, sin ocultación, de determinación de la dosis. La Parte 2 es un ensayo aleatorizado, con ocultación doble, controlado con placebo y con una sola dosis que comparará dos niveles de dosis de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la b MP6 humana.
Las evaluaciones de seguridad incluirán exploraciones físicas, ECG, constantes vitales, evaluaciones de laboratorio clínico convencionales (hematología, bioquímica sanguínea, índices de hierro sérico), seguimiento de acontecimientos adversos y de acontecimientos adversos graves.
Parte 1
Los objetivos de la Parte 1 son (a) evaluar la seguridad, la PK, la PD y la tolerabilidad de la dosis única, y (b) determinar la PAD mínima de un anticuerpo aislado o de un fragmento de unión al antígeno del mismo que se una a la BMP6 humana, definida como la dosis más baja ensayada en la Parte 1 que produzca un aumento de la Hgb (mediana del cambio respecto a la situación inicial ~ 0,5 g/dl) 29 días después de la dosis.
Durante la Parte 1 tendrá lugar una visita de selección en la que se determinará la elegibilidad del paciente para ser admitido en el estudio (Figura 6). Los pacientes aptos serán admitidos en el centro del estudio y reevaluados en cuanto a los criterios de elegibilidad durante la visita inicial. Todos los resultados de la evaluación de seguridad en la situación inicial deben estar disponibles y ser revisados antes de la administración.
La Figura 6 ofrece una visión general del diseño del estudio para la Parte 1. Se pedirá a los pacientes que lleguen al centro del estudio el Día 1, justo después de su visita rutinaria de diálisis. A continuación, los pacientes recibirán una infusión de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana (la dosis exacta dependerá de la cohorte). Si es posible, la administración debe realizarse preferentemente en un día de diálisis anterior a dos días interdiálisis (por ejemplo, viernes o sábado), y tendrá lugar después de la sesión de diálisis de ese día. Sin embargo, si no es posible, la administración puede realizarse en un día de diálisis que no preceda a dos días interdiálisis. Tras la administración, los dos primeros pacientes de la Parte 1 se quedarán en su domicilio durante al menos 48 horas para realizar evaluaciones de seguridad y de PK/PD. Los pacientes volverán al centro del estudio los Días 4 y 6 para las evaluaciones de PK/PD, y después semanalmente durante un total de 29 días para las evaluaciones PK, y un total de 12 semanas para la evaluación de la seguridad, con una visita de final del estudio aproximadamente el Día 85. Las visitas del estudio, incluyendo todas las pruebas de laboratorio distintas de las evaluaciones PK posteriores a la diálisis, deben tener lugar antes de la visita de diálisis programada del paciente.
La Parte 1 se iniciará con una dosis que se prevé que no será farmacológicamente activa. La dosis se ajustará para cada cohorte posterior de la Parte 1, tomando como base el cambio mediano de la Hgb de cada cohorte tras una dosis única de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana, y el nivel de saturación de transferrina (TSAT), como se comenta en la sección de Consideraciones estadísticas y se muestra en la Figura 7. El objetivo de este árbol de decisiones es identificar la dosis mínima viable que induzca la movilización del hierro (según lo indicado por los niveles de saturación de transferrina (TSAT) > 50 % observados en al menos 4 pacientes de la cohorte de 6 pacientes una semana después de la dosis) y aumente la Hgb. Si se moviliza el hierro pero la Hgb no aumenta al menos en 0,5 g/dl 29 días después de la dosis, se analizarán a continuación los datos clínicos para evaluar posibles factores de confusión (por ejemplo, pérdida de sangre debida a una extracción de sangre excesiva no relacionada con el estudio). Los investigadores correspondientes y el representante o representantes del Patrocinador revisarán los acontecimientos adversos de cada cohorte y evaluarán estos acontecimientos en el contexto de (a) los problemas médicos conocidos asociados a la insuficiencia renal crónica y (b) los hallazgos toxicológicos no clínicos. Las cohortes posteriores no recibirán ninguna dosis hasta que los Investigadores y el Patrocinador indiquen que es seguro continuar
La Figura 7 proporciona el algoritmo para el ajuste de las dosis en la Parte 1. Los análisis de sangre, incluyendo las mediciones de Hgb, se realizarán antes de la diálisis. La dosis inicial será de 0,01 mg/kg. En la Parte 1, los pacientes serán asignados a una de hasta 6 cohortes de dosis sin ocultación de hasta 6 pacientes cada una. La PAD mínima de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana, como se ha definido anteriormente, será el grupo de menor dosis seleccionado para la Parte 2. La dosis para cada cohorte posterior puede ajustarse al alza o a la baja, como se muestra en la Figura 7. Si la dosis más baja viable (0,001 mg/kg) produce un aumento mediano de la Hgb > 0,5 g/dl, será la PAD mínima y la dosis más baja seleccionada para la Parte 2 y la siguiente dosis más alta evaluada en la Parte 1 será el grupo de mayor dosis para la Parte 2. Si la dosis más alta (0,1 mg/kg) evaluada en la Parte 1 es la PAD mínima, se continuará en la Parte 2 con 2 grupos solamente: placebo y PAD mínima. En caso de que se necesiten cohortes de dosis adicionales en la Parte 1, estas cohortes se añadirán como se describe en el presente documento.
Cada cohorte de la Parte 1 incluirá 6 pacientes. Los 2 primeros pacientes de la primera cohorte de la Parte 1 recibirán las dosis con un intervalo mínimo de 7 días. La programación de las dosis posteriores a los pacientes de la cohorte de la Parte 1 se realizará según sea viable para el calendario y los recursos de apoyo del centro respectivo. Se realizará un seguimiento de todos los pacientes de la Parte 1 durante 12 semanas después de la dosis.
Parte 2
Los objetivos de la Parte 2 son (a) evaluar la seguridad, la PK, la PD y la tolerabilidad y (b) determinar la eficacia tomando como base los cambios en la Hgb en respuesta a una dosis única de un anticuerpo que se une a la BMP6 humana frente a placebo. La Parte 2 incluirá hasta tres grupos: Hasta dos grupos con dosis Ac y un grupo con placebo (Figura 8). Los dos grupos con dosis Ac derivarán de los datos generados en la Parte 1. La Parte 2 incluirá aproximadamente 60 pacientes con una aleatorización de 1:1:1 a los tres grupos. Si, en la Parte 1, la PAD mínima es también la dosis más alta (0,1 mg/kg) evaluada, entonces la Parte 2 tendrá únicamente dos grupos: PAD mínima y placebo. En este caso, 40 pacientes serán aleatorizados a los dos grupos con una relación de aleatorización de 1:1. El tamaño de la muestra de la Parte 2 puede ajustarse tomando como base la variabilidad del cambio desde la situación inicial de la Hgb en la Parte 1.
La Figura 8 proporciona el diseño del estudio de la Parte 2. Durante la Parte 2 tendrá lugar una visita de selección en la que se determinará la elegibilidad del paciente para ser admitido en el estudio. Los pacientes elegibles serán reevaluados según los criterios de elegibilidad durante la visita inicial. Todos los resultados de la evaluación de seguridad en la situación inicial deben estar disponibles y ser revisados antes de la administración.
Se pedirá a los pacientes que lleguen al centro del estudio el Día 1, justo después de su visita rutinaria de diálisis. A continuación, los pacientes recibirán una infusión de Ac o de placebo, según determine la asignación aleatoria. Si es posible, la administración debe realizarse preferentemente en un día de diálisis anterior a dos días interdiálisis (por ejemplo, viernes o sábado), y tendrá lugar después de la sesión de diálisis de ese día. Sin embargo, si no es posible, la administración puede realizarse en un día de diálisis que no preceda a dos días interdiálisis. Los pacientes volverán al centro del estudio los Días 4 y 6, y después semanalmente para las evaluaciones de seguimiento. Durante las visitas de seguimiento, los pacientes se someterán a evaluaciones rutinarias de seguridad, y también se recogerán datos PK a los 85 días. Las visitas del estudio pueden tener lugar después de la visita de diálisis programada del paciente, con el fin de ajustarse al horario de diálisis del paciente. Se realizará un seguimiento de todos los pacientes de la Parte 2 durante 12 semanas después de la dosis de Ac (o de placebo).
Gestión de la dosis de EPO (ambas Partes)
Los ajustes individuales de la dosis de EPO durante ambas Partes se gestionarán según el protocolo de normas asistenciales de cada centro de diálisis. Los protocolos de los centros se revisarán como parte de la evaluación de los centros y se comprobará que cumplen las directrices de las normas asistenciales (KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012). Los pacientes que alcancen un nivel de Hgb > 13 g/dl en cualquier momento durante el estudio podrán ser tratados con una sangría terapéutica, a discreción del investigador, además de las directrices específicas del centro para la gestión de los valores de Hgb por encima de los niveles objetivo.
Gestión del hierro intravenoso (ambas Partes)
Los pacientes que reciban dosis de carga de hierro intravenoso (100 mg/semana) quedarán excluidos del estudio. Los pacientes que reciben hierro intravenoso de mantenimiento semanal (<100 mg/semana) pueden ser incluidos en este estudio. La dosis semanal de hierro intravenoso de mantenimiento se realizará al inicio de la semana 1 de administración del Ac. Los índices de hierro se controlarán durante la primera semana tras la administración del Ac, y la terapia con hierro de rescate y la administración de hierro intravenoso de mantenimiento seguirán las directrices de las normas asistenciales según el protocolo de la unidad de hemodiálisis gestora. Los protocolos de los centros se revisarán como parte de la evaluación de los centros y se comprobará que cumplen las directrices de las normas asistenciales (KDlGo Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012).
Justificación del diseño del estudio
Justificación del diseño del estudio en dos partes
La justificación de las dos partes en la misma población de pacientes es para identificar la PAD mínima de forma segura y eficaz, con el objetivo de minimizar el número de pacientes y de cohortes expuestos a dosis potencialmente subterapéuticas. La Parte 2 evaluará la eficacia de la<p>A<d>mínima, y un nivel de dosis por encima de la PAD mínima (según lo determinado en la Parte 1), en comparación con un grupo con placebo.
La Parte 1 está diseñada para evaluar la seguridad, la tolerabilidad, la PK/PD de la dosis única, así como la PAD mínima de Ac en un estudio sin ocultación. La PAD mínima se determinará tomando como base el cambio mediano en la Hgb de cada cohorte de dosis 29 días tras la administración del Ac. El fundamento de los criterios de determinación de la PAD es que las respuestas clínicamente significativas a la EPO pueden requerir hasta 4 semanas tras un cambio de dosis de EPO. Si el Ac moviliza el hierro en la población objetivo, entonces eso puede permitir que la dosis actual de EPO del paciente ejerza un efecto eritropoyético más robusto. Los intervalos de Hgb de 29 días indicados en los criterios de determinación de la PAD se basan en unas tasas clínicamente significativas y seguras de aumento de la Hgb en respuesta a una dosis de EPO (~ 0,5 g/dl a lo largo de 29 días). La justificación de la búsqueda de la PAD mínima en lugar de un efecto máximo es que una respuesta de Hgb demasiado robusta es un riesgo para la seguridad en esta población de pacientes, como reflejan los intervalos objetivo de Hgb en las actuales directrices de las normas asistenciales (Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIG<o>) Anemia Work Group 2012). Los objetivos de las evaluaciones de seguridad y de tolerabilidad de la Parte 1 son (a) identificar señales de seguridad, y (b) fundamentar las decisiones de ajuste de dosis, asegurando que las dosis seleccionadas para la Parte 2 (PAD mínima 1 dosis mayor) sean adecuadas para una evaluación posterior tanto de la seguridad como de la eficacia en relación con el placebo. Aunque la Parte 1 no tiene potencia suficiente para permitir una evaluación imparcial de la seguridad, el grupo con placebo y los tamaños de muestra más grandes de la Parte 2 permitirán una evaluación imparcial de la seguridad con la PAD mínima y una dosis mayor. Además de la seguridad, la tolerabilidad y la PK/PD, la Parte 2 está diseñada para evaluar la eficacia frente a placebo en un estudio con ocultación doble. La evaluación de la eficacia se basará principalmente en la Hgb, con el índice de resistencia a la EPO (IRE = dosis semanal de EPO ajustada al peso dividida por la Hgb) como criterio de valoración secundario clave. El IRE proporciona una medida cuantitativa de la cantidad de EPO necesaria para alcanzar un valor dado de Hgb y, por lo tanto, aporta información clínicamente importante, además de la Hgb por sí sola.
Justificación del FIH con pacientes en diálisis
Este primer ensayo en seres humanos (FIH) se llevará a cabo con pacientes en hemodiálisis crónica (HD) y no con voluntarios sanos (HV). Es probable que la evaluación de la seguridad, la tolerabilidad y la respuesta PK/PD al Ac anti-BMP6 humana en los HV no sea trasladable a los pacientes en HD crónica por varias razones:
A diferencia de los HV, los pacientes en HD crónica con anemia, ferritina sérica elevada y TSAT baja tienen unas reservas intracelulares de hierro acumuladas de forma crónica. Por lo tanto, la seguridad, la tolerabilidad y los efectos farmacológicos relacionados con la movilización del hierro en respuesta a dosis bajas del Ac se evalúan de forma más adecuada en pacientes en HD crónica. En los HV con una función renal normal, la hepcidina (de la que la BMP6 es un regulador clave) es filtrada por el riñón y se excreta eficazmente en la orina, lo que conduce a unos niveles circulantes bajos. Por el contrario, la hepcidina es filtrada de forma menos eficiente y temporal por la diálisis, lo que da lugar a unos niveles circulantes más elevados en pacientes en HD crónica (Zaritsky et al 2010). Además, los riñones normales ajustarán los niveles endógenos de EPO de forma dinámica y puede que no sea evidente un cambio en la Hgb en respuesta al Ac. Por lo tanto, la seguridad y la tolerabilidad relacionadas con la modulación de la hepcidina por la vía de la BMP6 y el efecto del Ac sobre la Hgb se evalúan de forma más adecuada en pacientes en HD crónica.
Justificación de la población de pacientes objetivo
Este estudio está diseñado para evaluar un Ac anti-BMP6 humana en el contexto de una anemia hiporreactiva a la EPO y por restricción de hierro. Las directrices clínicas establecidas (KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012) definen la hiporreactividad a la EPO como la necesidad de dos aumentos de la dosis de EPO, hasta un 50 % por encima de la dosis estable, para mantener una concentración de Hgb estable. Los criterios de elegibilidad propuestos están diseñados para seleccionar a los pacientes en HD crónica estable con anemia y unos indicadores clínicos de restricción de hierro: ferritina aumentada y TSAT baja (TSAT = hierro sérico / capacidad total de fijación de hierro; la TSAT se correlaciona muy estrechamente con el hierro sérico). Además, los ajustes en las dosis de EPO y de hierro intravenoso se ceñirán a los estrictos objetivos de normas asistenciales para la Hgb, la TSAT y la ferritina. Este diseño reduce el riesgo de sobrepasar los objetivos deseados de Hgb, ya que los cambios en el hierro y los parámetros hematológicos seguirán gestionándose según las normas asistenciales. Además, se excluirá a los pacientes que reciban dosis de carga de hierro intravenoso 1 semana antes de la situación inicial. Los pacientes que reciben hierro intravenoso de mantenimiento pueden ser incluidos (si se cumplen todos los demás criterios de elegibilidad). La justificación para la inclusión de estos pacientes es que las normas asistenciales de EE.UU. dictan que la Hgb y la TSAT se mantengan dentro de unos límites estrechos y, por lo tanto, la retirada total de la terapia de hierro de mantenimiento con el fin de cumplir unos criterios de elegibilidad de TSAT más bajos pondría a los pacientes en riesgo de una TSAT por debajo del 25 %, lo que har as normas asistenciales. Sin embargo, a los pacientes elegibles que reciban hierro intravenoso de mantenimiento se les suspenderá la dosis semanal de hierro intravenoso al principio de la semana de la administración del Ac, y la terapia de hierro intravenoso de mantenimiento se reanudará únicamente según determine el protocolo de normas asistenciales del centro, tomando como base los índices de hierro controlados.
Justificación de dosis/régimen, duración del tratamiento
Justificación de la dosis inicial
La dosis inicial máxima recomendada (MRSD) se calculó a partir del nivel sin efecto adverso (NOAEL) de los estudios toxicológicos GLP de 13 semanas (14 dosis) realizados en ratas y macacos. Los animales recibieron dosis semanales en inyección intravenosa rápida de 0,1, 1, 10 y 100mg/kg. Los grupos de dosis de 1 y 100mg/kg (únicamente) fueron seguidos posteriormente durante 16 semanas en ratas o 24 semanas en macacos tras la última dosis de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana. La MRSD se estimó calculando en primer lugar la dosis humana equivalente (HED) para el NOAEL a partir de estos estudios (0,1 mg/kg) (un enfoque considerado apropiado para fármacos con un peso molecular > 100 kDa) y aplicando posteriormente un factor de seguridad de 10 para tener en cuenta las diferencias entre las especies no clínicas y los pacientes, tales como la cantidad de hierro almacenado y la demanda para la eritropoyesis. Los parámetros PK para las especies no clínicas se dedujeron a partir de los datos toxicocinéticos (TK) recogidos durante los estudios toxicológicos que permiten solicitar el IND. A continuación, se estimaron los parámetros PK correspondientes en los pacientes mediante escalado alométrico, y estos parámetros se utilizaron para predecir la concentración libre de un anticuerpo aislado o de un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana en función del tiempo en los pacientes para una dosis dada. La comparación de los datos TK de los estudios toxicológicos con el modelo basado en una PK de Ac en pacientes indicó que se predijo que una dosis 10 veces inferior al NOAEL/HED produciría un margen (mínimo) de 10 veces tomando como base la concentración de Ac.
Los niveles máximos de hierro sérico observados en respuesta al Ac en los estudios con animales pueden subestimar la respuesta humana prevista al Ac, ya que los pacientes en HD a los que se ha administrado una terapia de hierro intravenoso tienen probablemente mayores reservas tisulares de hierro que los animales sanos. Sin embargo, a diferencia de los animales sanos no anémicos, se espera que los pacientes en HD utilicen el hierro sérico liberado para la eritropoyesis; por lo tanto, los modelos animales pueden sobrestimar la duración de la elevación del hierro. La patología hepática observada en los estudios de 13 semanas no se observó en los estudios de 4 semanas, lo que sugiere que las toxicidades se deben a la exposición acumulada al hierro sérico más que a una respuesta a la liberación aguda de hierro.
Para tener en cuenta las diferencias previstas en el hierro almacenado entre las especies no clínicas y los pacientes, también se predijo la MRSD tomando como base un análisis basado en modelos de las concentraciones séricas de hierro. La exposición acumulada al hierro sérico que dio lugar a los hallazgos toxicológicos se representó como un área bajo la curva de hierro (AUC de Fe). En este enfoque, el AUC de Fe calculado para la dosis NOAEL (0,1 mg/kg) se consideró adecuadamente segura. A continuación, se predijo el AUC de Fe en la MRSD propuesto en pacientes y se comparó con el AUC de Fe en especies no clínicas en el No a El . Dado que la exposición al hierro sérico predicha por el modelo en la MRSD en pacientes fue > 10 veces menor que la del NO<a>E<l>en especies no clínicas, se consideró adecuado disminuir el NOAEL/HED en un factor de seguridad de 10 para la estimación de una MRSD. Por lo tanto, la MRSD propuesta es de 0,01 mg/kg.
Justificación del ajuste de la dosis
Para este estudio, la dosis máxima de ensayo (xmáx) será la HED correspondiente al NOAEL en cada uno de los 2 estudios toxicológicos que permiten solicitar el IND: 0,1 mg/kg. La dosis mínima viable de ensayo (xmín) es la dosis más baja técnicamente viable basada en estudios de compatibilidad: 0,001 mg/kg. La MRSD (x0) se evaluará de acuerdo con los criterios de seguridad, la TSAT y la Hgb (Figura 7). Si x0 da lugar a un cambio mediano en la Hgb < 0,5 g/dl en relación con la dosis previa, la selección de x (Figura 7) se guiará por la extrapolación lineal en una escala logarítmica neperiana (en previsión de una relación dosis-respuesta sigmoidal) entre x0 y xmáx. Las dosis provisionales para este aumento escalonado de la dosis se proporcionan más arriba. Estas dosis provisionales podrán ajustarse tomando como base la revisión de los datos durante el análisis intermedio informal entre cada cohorte. Este enfoque continuará hasta que se identifique la PAD mínima o se alcance la xmáx. Si la xmáx da lugar a un cambio mediano en la Hgb < 0,5 g/dl, se evaluará la seguridad de esta dosis y se decidirá si se modifica el protocolo para añadir cohortes adicionales con dosis que superen la xmáx, tomando como base los datos de seguridad, PK y PD. Si la dosis más alta ensayada en la Parte 1 da como resultado un aumento mediano de la Hgb < 0,5 g/dl, no aumenta la TSAT por encima del 50 % y esa dosis está por debajo de xmáx, el protocolo puede modificarse para añadir cohortes adicionales.
Si en lugar de x0 se produce un cambio mediano en la Hgb > 0,5 g/dl en relación con la dosis previa, la dosis para la siguiente cohorte se ajustará a xmín. Si xmín también da lugar a un cambio mediano en la Hgb > 0,5 g/dl, xmín se considerará la PAD mínima, y xmín y x0 se evaluarán en la Parte 2. Si xmín da lugar a un cambio mediano en la Hgb < 0,5 g/dl y la TSAT ≤ 50 % (Figura 7), las dosis se aumentarán por extrapolación lineal dentro del intervalo (xmín x0) en la escala logarítmica neperiana hasta que se iden s).
Las dosis provisionales dentro del intervalo (xmín, x0) se proporcionan más arriba. Estas dosis provisionales podrán ajustarse tomando como base la revisión de los datos durante el análisis intermedio informal entre cada cohorte. La PAD mínima se definirá como la dosis más baja ensayada que dé lugar a un cambio mediano en la Hgb > 0,5 g/dl con respecto a la dosis previa.
El Ac se administrará en infusión intravenosa de dosis única para garantizar una exposición al hierro sérico (AUC de Fe) inferior a la asociada a hallazgos adversos en estudios toxicológicos no clínicos. La solución de Ac se infundirá inmediatamente después de la sesión de hemodiálisis del Día 1 para minimizar el posible impacto de la diálisis en la PK o en la biodisponibilidad del hierro inmediatamente después de la dosis. No se espera que los aproximadamente 30 minutos adicionales de infusión de la dosis después de la diálisis (únicamente el día de la dosis) supongan ningún riesgo o molestia importante para los pacientes.
Justificación de la elección del comparador
El placebo se emplea como comparador en la Parte 2 para permitir una evaluación imparcial de los resultados clínicos.
Propósito y cronología de los análisis intermedios/adaptaciones del diseño
En la Parte 1, después de que cada cohorte de 6 pacientes finalice la evaluación posterior a la dosis de la semana 4, se realizará un análisis provisional informal para tomar la decisión de ajuste de la dosis para la siguiente cohorte. Los marcadores de seguridad y PD serán revisados por todos los miembros del equipo de ajuste de la dosis, incluyendo los Investigadores correspondientes y el o los representantes del Patrocinador. Se activarán nuevas cohortes únicamente si se confirman la seguridad y la tolerabilidad, y si se cumplen las condiciones PD como se describe en la Figura 7. Habrá hasta 5 análisis intermedios informales en la Parte 1. Está previsto realizar un análisis intermedio formal después de que todos los pacientes de la última cohorte de la Parte 1 finalicen la evaluación posterior a la dosis de la semana 4, para evaluar los efectos clínicos de las dosis investigadas. y potencialmente activar estudios no clínicos adicionales, y puede fundamentar estudios clínicos posteriores Se incluirán la temperatura corporal, la presión arterial, la frecuencia del pulso, la evaluación del ECG, la bioquímica sanguínea, los índices hematológicos de hierro, el índice de resistencia a la EPO y los acontecimientos adversos recogidos hasta el Día 29 de la última cohorte realizada en la Parte 1.
Para la Parte 2 se seleccionará la PAD mínima y una dosis un nivel superior a la PAD mínima. Si la dosis más baja posible ensayada induce un aumento de la Hgb > 0,5 g/dl, se seleccionarán las dos dosis más bajas ensayadas para la Parte 2.
Riesgos y beneficios
El beneficio potencial para los pacientes que participen en este estudio puede incluir la reducción de las necesidades de EPO y de hierro intravenoso, y la mejora de los niveles de Hgb durante el tiempo que dure el tratamiento y durante algún tiempo más.
El riesgo para los pacientes de este ensayo se reducirá al mínimo mediante el cumplimiento de los criterios de elegibilidad, y un estrecho seguimiento clínico de todos los pacientes (y la estancia en su domicilio de los dos primeros pacientes de la Parte 1) durante las primeras 48 horas tras la administración del Ac.
Los riesgos potenciales asociados a la movilización de hierro incluyen (a) la redistribución del hierro a tejidos y órganos tales como el bazo, el hígado, el corazón, el páncreas y la hipófisis, y (b) un pequeño aumento de la susceptibilidad a las infecciones bacterianas, sobre todo en pacientes con catéteres vasculares permanentes. Varios de los criterios de elegibilidad reducen el riesgo de complicaciones. Puede observarse un aumento de los niveles de las pruebas de función hepática en asociación con la redistribución del hierro. La función hepática se controlará en paralelo con los parámetros hematológicos y el hierro. Si se sobrepasan los objetivos de Hgb de las normas asistenciales se puede producir policitemia. Puede llevarse a cabo una gestión de la Hgb, la terapia con EPO y la terapia con hierro
Los pacientes en HD a los que se ha administrado una terapia de hierro intravenoso pueden tener unas reservas tisulares de hierro superiores a las de los animales sanos; por lo tanto, los niveles máximos de hierro sérico observados en pacientes tratados con un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana pueden superar los observados en los estudios con animales. Sin embargo, a diferencia de los animales sanos, se espera que los pacientes en HD utilicen el hierro sérico liberado para la eritropoyesis; por lo tanto, los modelos animales pueden sobrestimar la duración de la elevación del hierro. Se prevé que la exposición al Ac predicha por el modelo (por ejemplo, Cmáx, AUC) en la MRSD sea 10 veces menor que la observada con el NOAEL en estudios no clínicos. No se espera que esta exposición dé lugar a unos niveles de exposición al hierro sérico (AUC) asociados con la elevación de las transaminasas hepáticas y la necrosis unicelular hepática observada en estudios preclínicos. El aumento escalonado de la dosis de Ac hasta el NOAEL se producirá tras las evaluaciones de seguridad descritas. Es probable que la experiencia clínica con pacientes con sobrecarga crónica de hierro, así como con los que reciben hierro parenteral, no prediga necesariamente los efectos que pueden producirse por aumentos agudos del hierro intracelular inducidos por el Ac. Por lo tanto, el riesgo potencial de toxicidad aguda por hierro inducida por el Ac es probablemente bajo La toxicidad aguda por hierro puede afectar al corazón, al h da por hierro pueden incluir defectos de la conducción cardiaca, transaminasas hepáticas elevadas e intolerancia a la glucosa/hiperglucemia. La toxicidad aguda grave por hierro también puede incluir acidosis metabólica, anomalías electrolíticas y manifestaciones neurológicas. En caso de que se produzca una toxicidad aguda por hierro, los pacientes pueden ser tratados de urgencia con una terapia de quelación del hierro, tal como deferoxamina, combinada con hemodiálisis. Está previsto extraer un máximo de 134 ml (Parte 1) y 172 ml (Parte 2) de sangre durante un periodo de 115 días, de cada paciente como parte del estudio. A esto se añadirían muestras adicionales para el seguimiento de cualquier hallazgo de seguridad. Esto no se considera un riesgo para esta población.
Hasta la fecha no se han realizado estudios de reprotoxicidad con los anticuerpos anti-BMP6 humana. Los efectos potenciales sobre los órganos reproductores masculinos o femeninos se han evaluado mediante un cuidadoso examen histopatológico convencional de los ovarios y los testículos y de los órganos reproductores secundarios en el estudio de toxicidad de 13 semanas en macacos. No se observaron efectos relacionados con el tratamiento. Los ratones con el gen de la BMP6 inactivado mostraron un retraso en la osificación del esternón y una sobrecarga de hierro (Meynard et al 2009).
La hemodiálisis crónica está asociada a una importante morbilidad y mortalidad fetal y materna. En un estudio de cohortes retrospectivo en el que se comparó a mujeres en hemodiálisis crónica (267 nacimientos) con mujeres que recibieron un trasplante renal (264 nacimientos), las mujeres en hemodiálisis mostraron unas tasas más altas de desprendimiento de placenta, transfusión de sangre, bebés pequeños para la edad gestacional, muertes fetales y muertes maternas (Saliem et al 2015). Por lo tanto, las mujeres en edad fértil deben utilizar métodos anticonceptivos muy eficaces para evitar el embarazo durante la administración de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la BMP6 humana y durante los 125 días siguientes a la última dosis.
Población
La población del estudio estará formada por pacientes con insuficiencia renal en fase terminal que requieran terapia de hemodiálisis crónica al menos dos veces por semana y que presenten signos clínicos de anemia ferropénica funcional, definida como una anemia en presencia de unas reservas de hierro aparentemente suficientes, según determinen los niveles de ferritina y de saturación de transferrina. La Parte 1 incluye un plan para evaluar hasta 36 pacientes inicialmente en 6 cohortes (6 pacientes/cohorte). Si después de 6 cohortes no se observan efectos sobre la TSAT y la Hgb, y no hay problemas de seguridad (según determinen los correspondientes Investigadores y el o los representantes del Patrocinador), podrán añadirse hasta 2 cohortes adicionales de 6 pacientes (un total de 48 pacientes en la Parte 1). La Parte 2 consiste en hasta 3 grupos (2 niveles de dosis seleccionados para una evaluación adicional a partir de la Parte 1, y un grupo con placebo), con hasta aproximadamente 20 pacientes por grupo (un total de 60 pacientes en la Parte 2). Por lo tanto, está prevista la inscripción de un total de aproximadamente 96 pacientes (hasta un máximo de 108), de los cuales aproximadamente 60 serán aleatorizados en la Parte 2. Se espera que aproximadamente 60 pacientes (12 en la Parte 1, 48 en la Parte 2) completen el estudio. El investigador debe asegurarse de que todos los pacientes considerados para el estudio cumplen los siguientes criterios de elegibilidad. El investigador no deberá aplicar ningún criterio adicional, con el fin de que la población del estudio sea representativa de todos los pacientes elegibles.
La selección de los pacientes se establecerá comprobando todos los criterios de elegibilidad en la selección y en la primera situación inicial. Debe guardarse un registro pertinente (por ejemplo, una lista de comprobación) de los criterios de elegibilidad junto con la documentación original en el centro del estudio. La desviación de cualquier criterio de admisión excluye a un paciente de su inscripción en el estudio.
Criterios de inclusión (ambas Partes)
Los pacientes elegibles para su inclusión en este estudio tienen que cumplir todos los criterios siguientes:
1. Debe obtenerse el consentimiento informado por escrito antes de realizar cualquier evaluación. Si el consentimiento no puede expresarse por escrito, debe documentarse formalmente y atestiguarse, idealmente a través de un testigo independiente de confianza
2. Edad > 18 años en el momento de la selección.
3. Dependiente de hemodiálisis durante al menos 2 meses antes de la selección.
4. Recibir hemodiálisis adecuada al menos 2 veces por semana para la insuficiencia renal en fase terminal; adecuada se define como Kt/V> 1,2 en la evaluación mensual más reciente antes de la selección.
5. Recibir tratamiento crónico con eritropoyetina (EPO), según el protocolo de tratamiento de la anemia del centro de diálisis. Dosis de EPO no aumentada en un 50 % o más durante los 14 días anteriores a la situación inicial. La terapia con EPO debe ser únicamente con la formulación de acción corta (no con darbepoetina) y administrada por vía intravenosa (no subcutánea).
6. Hgb > 8,5, incluyendo Hgb > 8,5 y <11,5 g/dl, y que no haya aumentado >0,5 g/dl en al situación inicial frente a los 14 días anteriores.
7. Ferritina 200-2000 ng/ml (inclusive) durante al menos 28 días antes de la situación inicial (puede incluir la selección).
8. TSAT ≤ 30 % en un mínimo de un punto temporal durante los 90 días anteriores a la situación inicial, y TSAT ≤ 30 % en la situación inicial.
Criterios de exclusión (ambas Partes)
Los pacientes que cumplan alguno de los siguientes criterios no serán elegibles para su inclusión en este estudio. El investigador no podrá aplicar exclusiones adicionales, con el fin de garantizar que la población del estudio sea representativa de todos los pacientes elegibles.
1. Uso de otros fármacos en investigación en las 5 semividas siguientes a la inscripción, o hasta que el efecto farmacodinámico esperado haya vuelto a la situación inicial, lo que sea más largo.
2. Antecedentes de hipersensibilidad al fármaco del estudio o a los anticuerpos terapéuticos.
3. Diagnóstico conocido de hemocromatosis.
4. Cáncer conocido de la médula ósea, cáncer linfático o síndrome mielodisplásico.
5. Antecedentes de trombosis de la fístula AV en diálisis en los 2 meses anteriores a la selección, o 2 o más episodios de trombosis de la fístula AV en los 6 meses anteriores a la selección.
6. Enfermedad/disfunción hepática comórbida grave (puntuación Child-Pugh > 6) o trasplante hepático previo 7. Insuficiencia cardiaca (clase funcional III o IV de la New York Heart Association (NYHA))
8. Hemorragia gastrointestinal que haya requerido intervención en los últimos 2 meses de la selección. Los pacientes con infección por el virus de la hepatitis C (VHC) pueden ser incluidos si se cumplen todos los demás criterios de elegibilidad de la función hepática.
9. ALT, AST o bilirrubina > 1,5x ULN en las 4 semanas previas al situación inicial.
10. Osteodistrofia renal no controlada definida como PTH intacta > 750 μg/ml en la selección.
11. Afecciones que predispongan a un mayor riesgo de infección grave, tales como un catéter vascular permanente (vía venosa central o catéter de hemodiálisis) o una infección activa que requiera terapia antibiótica en cualquier momento durante las 2 semanas anteriores a la selección.
12. Transfusión de sangre administrada en las 4 semanas anteriores a la situación inicial.
13. Recibir una dosis de carga (100 mg/semana) de hierro intravenoso en la semana anterior al situación inicial. 14. Antecedentes de abuso de drogas o alcohol en los 12 meses anteriores a la administración de la dosis, o signos de dicho abuso en las pruebas de laboratorio realizadas durante la selección.
15. Un resultado positivo en la prueba del antígeno de superficie de la hepatitis B.
16. Antecedentes de enfermedades por inmunodeficiencia, incluyendo un resultado positivo en la prueba del VIH (ELISA e inmunoelectrotransferencia).
17. Las mujeres en edad fértil pueden ser inscritas en este estudio si utilizan métodos anticonceptivos muy eficaces, durante un mínimo de 125 días tras la administración del anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno que se une a la BMP6 humana. La anticoncepción muy eficaz se define como una de las siguientes: a. Abstinencia total (cuando ésta se ajusta al estilo de vida preferido y habitual de la paciente. La abstinencia periódica (por ejemplo, métodos de calendario, ovulación, sintotérmicos, postovulatorios) y la marcha atrás no son métodos anticonceptivos aceptables) b. Esterilización masculina/femenina c. Uso de métodos anticonceptivos hormonales orales, inyectados o implantados, o colocación de un dispositivo intrauterino (DIU) o un sistema intrauterino (SIU) u otras formas de anticoncepción hormonal que tengan una eficacia comparable (tasa de fallo <1 %), por ejemplo, un anillo vaginal hormonal o una anticoncepción hormonal transdérmica.
Tratamiento
Tratamiento en investigación
La terapia en investigación en este estudio es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno que se une a la BMP6 humana, por ejemplo, un anticuerpo anti-IgG1 de la BMP6 completamente humano. El anticuerpo se administra en solución líquida. La concentración de la solución madre se diluiráin situen función de la dosis que vaya a administrarse. El tiempo de infusión se mantendrá relativamente constante en todas las cohortes en aproximadamente 30 minutos. La Parte 1 será sin ocultación, de una sola dosis, y la Parte 2 será con ocultación doble, de una sola dosis, en comparación con un placebo equivalente (control con vehículo). El principio activo Ac anti-BMP6 humana y el placebo se administrarán como un líquido en viales. Los excipientes del principio activo y del placebo son idénticos.
Grupos de tratamiento
En la Parte 1, los pacientes serán asignados a una de hasta 6 cohortes de dosis consistentes en 6 pacientes cada una. La Parte 1 es un tratamiento sin ocultación. La dosis inicial, la dosis máxima y el fundamento del ajuste de la dosis se describen más arriba. Las dosis provisionales para la Parte 1 se proporcionan en la Tabla 12 (Hgb < 0,5 g/dl en la MRSD) y en la Tabla 13 (Hgb > 0,5 g/dl en la MRSD).
Tabla 12: Niveles de dosis provisionales para la Parte 1
Esta tabla pretende ser un ejemplo del ajuste de la dosis de la Parte 1 únicamente a título orientativo. Pueden utilizarse niveles de dosis intermedios o superiores y pueden omitirse algunos niveles de dosis tomando como base la evaluación de los datos durante los análisis intermedios informales entre cada cohorte. Los niveles de dosis reales serán confirmados por escrito por Novartis y facilitados a todos los centros participantes en el estudio antes del tratamiento de los pacientes de una nueva cohorte.
Tabla 13: Niveles de dosis provisionales para la Parte 1
Esta tabla pretende ser un ejemplo del ajuste de la dosis de la Parte 1 únicamente a título orientativo. Pueden utilizarse niveles de dosis intermedios o superiores y pueden omitirse algunos niveles de dosis tomando como base la evaluación de los datos durante los análisis intermedios informales entre cada cohorte.
Los tratamientos del estudio se definen como:
• A: dosis única de placebo.
• B: dosis única de Ac anti-BMP6 humana a la PAD mínima, según lo determinado en la Parte 1.
• C: dosis única de Ac anti-BMP6 humana a un nivel de dosis superior a la PAD mínima, determinada en la Parte 1.
Tratamiento concomitante
Todos los medicamentos recetados, los fármacos de venta libre y las terapias no farmacológicas significativas (incluyendo la fisioterapia y las transfusiones de sangre) administrados o tomados en el merco temporal definido en los criterios de admisión antes del inicio del estudio y durante el mismo, deben ser registrados en la sección Medicamentos concomitantes/Terapias no farmacológicas significativas del CRF. Los registros de medicamentos deben especificar el nombre comercial, la dosis individual y la unidad, la frecuencia y la vía de administración, la fecha de inicio y de interrupción y el motivo de la terapia.
Eficacia / Farmacodinámica
A continuación se especifican las evaluaciones de la eficacia. Las muestras para las evaluaciones de eficacia se recogerán en varios puntos temporales. Se evaluarán los análisis hematológicos. Los índices de Hgb y de Fe se revisarán durante cada análisis intermedio informal entre cohortes como parte de la evaluación del ajuste de dosis durante la Parte 1 del estudio. Si los tiempos de recogida de muestras fijados inicialmente se consideran subóptimos para comprender la relación entre el hierro y la PK, los tiempos de recogida de muestras podrán modificarse en las cohortes posteriores de la Parte 1.
Pruebas de los índices de hierro
Se espera que el Ac anti-BMP6 humana movilice el Fe de las reservas corporales dando lugar a cambios en los parámetros del Fe sérico, que incluye: Fe sérico, saturación de transferrina (TSAT), capacidad de unión del Fe no unido (UIBC), capacidad total de unión del Fe (TIBC), ferritina y contenido de hemoglobina reticulocitaria (CHr). Se medirán en suero mediante ensayos validados.
Seguridad
A continuación se especifican las evaluaciones de seguridad.
Exploración física
Una exploración física completa incluirá la exploración del aspecto general, la piel, el cuello (incluida la tiroides), los ojos, los oídos, la nariz, la garganta, los pulmones, el corazón, el abdomen, la espalda, los ganglios linfáticos, las extremidades, vascular y neurológica. Si está indicado en función de los antecedentes médicos y/o los síntomas, pueden realizarse exploraciones rectales, de los genitales externos, de las mamas y/o pélvicos.
Los hallazgos significativos que estén presentes antes del inicio del fármaco del estudio deben incluirse en la pantalla de Antecedentes Médicos de Interés/Afecciones Médicas Actuales del eCRF del paciente. Los hallazgos significativos realizados después del inicio del fármaco del estudio que cumplan la definición de Acontecimiento Adverso deben registrarse en la pantalla de Acontecimientos Adversos del eCRF del paciente.
Parámetros vitales
• Temperatura corporal
• Presión arterial (PA)
• Pulso
Altura y peso
• Altura
• Peso corporal
• Se calculará el índice de masa corporal (IMC) (Peso corporal (kg) / [Estatura (m)]2)
Evaluaciones de laboratorio
Las desviaciones clínicamente relevantes de los resultados de las pruebas de laboratorio se evaluarán según los criterios que definen un acontecimiento adverso y se notificarán como tales si se cumplen los criterios. Las evaluaciones repetidas son obligatorias hasta la normalización de los resultados o hasta que el cambio deje de ser clínicamente relevante.
Hematología
Se medirán la hemoglobina, el hematocrito, el recuento de glóbulos rojos, el recuento de glóbulos blancos con diferencial y el recuento de plaquetas. Se controlarán los índices de hierro.
Química clínica
Se controlarán el sodio, el potasio, la creatinina, la urea, el cloruro, la albúmina, el calcio, la fosfatasa alcalina, la bilirrubina total, la LDH, la GGT, la AST y la ALT. Si la concentración de bilirrubina total aumenta por encima de 1,5 veces el límite superior de la normalidad, debe diferenciarse la bilirrubina de reacción directa de la indirecta.
Electrocardiograma (ECG)
Intervalo PR, duración QRS, frecuencia cardiaca, RR, QT, QTc. Debe utilizarse la fórmula de corrección del QT de Fridericia (QTcF) para las decisiones clínicas.
Embarazo y evaluaciones de la fertilidad
Se exigen pruebas de embarazo a todas las pacientes, independientemente del estado reproductivo/menopáusico declarado.
Se realizarán pruebas séricas de embarazo para este estudio. Si son positivos, la paciente debe ser retirada del ensayo. Cuando se realiza en la selección y en la situación inicial, el resultado de esta prueba debe recibirse antes de administrar la dosis a la paciente.
Farmacocinética
Se recogerán muestras para PK. Los datos PK se revisarán durante cada análisis intermedio informal entre cohortes como parte de la evaluación del ajuste de dosis durante la Parte 1 del estudio. Si los tiempos de recogida de muestras fijados inicialmente se consideran inadecuados o inapropiados para caracterizar el perfil PK, los tiempos de recogida de muestras podrán modificarse en las cohortes posteriores. El número de extracciones de sangre y el volumen total de sangre extraído no excederán los establecidos en el protocolo.
Se recogerán y evaluarán muestras para PK en todos los pacientes en todos los niveles de dosis.
La concentración de Ac anti-BMP6 humana libre se determinará mediante un ensayo de ELISA. El límite inferior de cuantificación previsto (LIDC) es de 10 μg/ml.
Las muestras no tratadas (placebo) no se analizarán.
Las concentraciones de Ac anti-BMP6 humana libre se expresarán en μg/ml. Todas las concentraciones por debajo del LIDC o los datos que falten se etiquetarán como tales en los listados de datos de concentración. Las concentraciones por debajo del LIDC se tratarán como cero en las estadísticas de resumen únicamente para los datos de concentración. No se tendrán en cuenta en el cálculo de los parámetros PK.
Las muestras para PK restantes después de la determinación del Ac anti-BMP6 humana libre pueden utilizarse para evaluaciones exploratorias u otros fines bioanalíticos (por ejemplo, comprobación cruzada entre diferentes centros, evaluación de la estabilidad).
Los siguientes parámetros farmacocinéticos se determinarán (si es viable) utilizando método(s) no compartimental(es) con Phoenix WinNonlin (Versión 6.2 o superior): Cmáx, tmáx, AUC(0-t), AUC(O-túltimo), CmáxID y AUC/D tomando como base los datos de concentración sérica-tiempo. Se utilizará la regla trapezoidal lineal para los cálculos del AUC. La vida media terminal de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno que se une a la BMP6 humana (tl /2) también se estimará si es viable tomando como base los datos.
Otras evaluaciones
Inmunogenicidad
Se utilizará un ensayo de ELISA para detectar los anticuerpos anti-BMP6 humana. Las muestras de IG restantes tras el análisis de inmunogenicidad pueden utilizarse para una evaluación exploratoria u otros fines bioanalíticos (por ejemplo, la comprobación cruzada entre diferentes centros).
Evaluaciones exploratorias
Los biomarcadores son indicadores medidos y evaluados objetivamente de procesos biológicos normales, de procesos patógenos o de respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica (Biomarkers Definitions Working Group 2001). La vía de la BMP6-hepcidina es como sigue: La señalización de la BMP6 en los hepatocitos es necesaria para la expresión inducida de la hepcidina, inhibiendo la absorción de hierro por los enterocitos y la exportación de hierro por los macrófagos. El anticuerpo neutralizante de la BMP6 como terapia reductora de la hepcidina debería beneficiar a los pacientes con anemia por restricción de hierro al reducir la necesidad de EPO y aumentar el número de pacientes que alcanzan el nivel objetivo de Hgb.
Tomando como base la biología descrita anteriormente, las evaluaciones exploratorias de biomarcadores incluyen, pero no se limitan a, la hepcidina (medida mediante un ensayo de CL-EM).
Las evaluaciones exploratorias adicionales pueden investigar los papeles potenciales de los marcadores de absorción ósea, así como abordar la inflamación como un factor que contribuye al mecanismo de acción.
Los objetivos exploratorios son como sigue:
• Evaluar las relaciones entre los niveles de hepcidina y varias medidas clave tales como el IRE y los índices de hierro;
• Estudiar longitudinalmente la dinámica entre los criterios de valoración primarios y secundarios y los biomarcadores exploratorios;
• Evaluar la farmacogenética;
• Para evaluar la inmunogenicidad
Se recogerán muestras en varios puntos temporales.
Se facilitarán más detalles sobre la recogida, la numeración, el procesamiento y el envío de las muestras en un manual del laboratorio central.
ADN
Se han planificado estudios exploratorios de investigación del ADN como parte de este estudio con los objetivos de identificar factores genéticos que puedan (1) estar relacionados con pacientes en hemodiálisis crónica tratados con eritropoyetina con anemia ferropénica funcional, (2) predecir la respuesta al tratamiento con Ac anti-BMP6 humana o (3) predecir la predisposición genética a efectos secundarios.
Además, los recientes avances en las tecnologías de genotipado han hecho posibles los enfoques de genoma completo. Los enfoques de genoma completo también pueden llevarse a cabo dentro del ámbito restringido de estos estudios, como se ha descrito anteriormente.
Biomarcadores solubles
Se cuantificará la hepcidina en plasma como posible PD/ biomarcador.
Las descripciones detalladas de los ensayos se incluirán en los informes de datos bioanalíticos.
Otros biomarcadores
Las plataformas libres de hipótesis podrían utilizarse para comprender la heterogeneidad de la enfermedad, el modo de acción y/o la identificación potencial de marcadores de estratificación. Se recogerán muestras para inmunogenicidad (IG) en varios puntos temporales. La inmunogenicidad del anticuerpo anti-BMP6 humana se evaluará midiendo los anticuerpos que reconocen el anticuerpo anti-BMP6 humana.
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A menos que se definan de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende generalmente un especialista familiarizado con el campo al que pertenece la divulgación.
A menos que se indique de otro modo, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle se pueden llevar a cabo y se han llevado a cabo de una manera conocida de por sí, como quedará claro para el experto. Se hace referencia de nuevo, por ejemplo, a los manuales convencionales y a la técnica anterior general mencionados en el presente documento, y a las referencias adicionales citadas en los mismos.
Aunque en el presente documento se han divulgado en detalle aspectos y reivindicaciones particulares, esto se ha hecho a modo de ejemplo con fines meramente ilustrativos.
Se cree que la elección del material de partida de ácido nucleico, el clon de interés o el tipo de colección es una cuestión rutinaria para una persona con los conocimientos habituales en la materia y conocedora de los aspectos descritos en el presente documento. Los expertos en la materia reconocerán o podrán averiguar, sin más experimentación que la rutinaria, muchos equivalentes de los aspectos específicos de la invención como se define en las reivindicaciones.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a la BMP6 humana y que comprende: una secuencia VH de la SEQ ID NO: 75; y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 85.
2. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 77; y una secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 87.
3. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno es un componente de un inmunoconjugado.
4. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene alterada la función efectora por una mutación de la región Fc.
5. Una composición que comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
6. La composición de la reivindicación 5, que comprende un agente terapéutico adicional.
7. La composición de la reivindicación 6, en donde el agente terapéutico adicional reduce la actividad de la BMP6.
8. La composición de la reivindicación 6 o 7, en donde el agente terapéutico adicional es un agente estimulante de la eritropoyesis (AEE) o hierro.
9. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une a la BMP6 humana, de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
10. Un vector que comprende un polinucleótido de la reivindicación 9.
11. Una célula hospedadora que comprende un vector de la reivindicación 10 o el polinucleótido de la reivindicación 9.
12. El anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o una composición de cualquiera de las reivindicaciones 5-8, para usar como un medicamento.
13. El anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o una composición de cualquiera de las reivindicaciones 5-8, para usar en el tratamiento de la anemia en un paciente.
14. El anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo o la composición para usar de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la anemia es una anemia de enfermedad crónica.
15. El anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo o la composición para usar de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la anemia es una anemia ferropénica funcional.
16. El anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo o la composición para usar de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la anemia de enfermedad crónica es anemia de insuficiencia renal crónica, anemia de cáncer o anemia de inflamación.
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