KR20170089010A - Bmp6을 표적화하는 항체에 대한 조성물 및 방법 - Google Patents

Bmp6을 표적화하는 항체에 대한 조성물 및 방법 Download PDF

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펭 콩
윌리엄 디트리히
나탈리 조지
동 리우
아셔 스캐치터
아디티 소니
징 조우
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노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 인간 BMP6에 대한 항체 및 그의 항원-결합 단편 및 그의 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

BMP6을 표적화하는 항체에 대한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR ANTIBODIES TARGETING BMP6}
관련 출원
본 출원은 2014년 12월 19일에 출원된 미국 일련 번호 62/094,716 및 2015년 6월 19일에 출원된 미국 일련 번호 62/181,803에 대한 우선권을 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2015년 12월 16일에 생성된 상기 ASCII 카피는 PAT056599-WO-PCT_SL.txt로 명명되고, 68,301 바이트 크기이다.
서론
본 발명은 인간 BMP6에 대한 항체 및 그의 항원-결합 단편 및 그의 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.
빈혈은 만성 신장 질환 (CKD)을 갖는 환자에서 보편적이고, 심혈관 질환 및 사망을 포함하여, 더 낮은 삶의 질 및 더 높은 유해 결과의 위험과 연관된다. CKD를 갖는 환자에서의 빈혈 관리의 여러 방식은 적혈구생성-자극제 (ESA), 보충적 경구 및 정맥내 철의 사용 및 수혈을 수반한다. 그러나, 많은 환자는 이들 치료에 대해 충분히 반응하지 않거나 또는 더 높은 용량의 ESA 및/또는 철을 요구한다. 고용량의 철은 또한 산소 라디칼의 생성과 연관된 독성 및 알레르기 반응을 유발할 수 있다. 이들 치료는 빈혈의 기저 원인, 즉 손상된 철 흡수 및 신체 저장으로부터의 철 가동화를 충분히 다루지 않기 때문에 효능이 결여될 수 있다.
에리트로포이에틴 저항성을 관리하기 위한 시도는 현재 고용량 비경구 철의 공-투여에 의해 수행된다. 그러나, 정맥내 제제로부터의 대부분의 철은 먼저 대식세포에 의해 프로세싱되고, 적혈구생성을 위한 그의 이용은 페로포르틴-매개 철 유출에 의존한다.
많은 빈혈 환자에서, 페로포르틴-매개 철 유출은 높은 수준의 헵시딘에 의해 억제된다. 추가의 증거는 증가된 수준의 헵시딘이 혈액투석에서의 불량한 ESA 반응성과 상관된다고 시사한다. 헵시딘-저하제는 따라서 이러한 환자 집단에서 및 철 제한을 특징으로 하는 만성 질환에 의한 빈혈 (ACD)의 다른 형태에서 ESA-불응성 빈혈을 호전시키기 위한 효과적인 전략일 수 있다.
따라서, 순환 헵시딘 수준을 감소시키는 방법은 철 흡수를 증진시키고, 격리된 철의 방출을 용이하게 하고, 만성 신장 질환 환자에 존재하는 ESA-불응성 빈혈에서 적혈구생성을 촉진할 것이다.
질환 및 장애 연관 빈혈을 치료하기 위한 현행 치료 옵션에도 불구하고, 효과적이고 널리-허용되는 빈혈의 치료를 위한 개선된 조성물에 대한 필요가 남아있다.
본 발명은 단리된 BMP6-결합 분자 (예를 들어, BMP6-결합 항체 또는 그의 항원-결합 단편), 이러한 분자를 포함하는 제약 조성물, 이러한 분자 및 조성물을 제조하는 방법, 및 헵시딘 수준을 저하시키고 빈혈을 치료하는데 있어서의 그의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 표 1에서의 항체 중 임의의 것의 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 BMP6에 대한 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 표 1에 기재된 바와 같은, 항체 3의 6개의 CDR을 포함하는 BMP6에 대한 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 표 1에 기재된 바와 같은, 항체 5의 6개의 CDR을 포함하는 BMP6에 대한 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 표 1에 기재된 바와 같은, 항체 6의 6개의 CDR을 포함하는 BMP6에 대한 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 표 1에 기재된 바와 같은, 항체 7의 6개의 CDR을 포함하는 BMP6에 대한 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명의 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기를 포함한다:
각각 서열식별번호(SEQ ID NO): 9, 10 및 11의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
본 발명의 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기를 포함한다:
각각 서열식별번호: 12, 13 및 14의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 22, 23 및 24의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
본 발명의 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기를 포함한다:
각각 서열식별번호: 29, 30 및 31의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 39, 40 및 41의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
본 발명의 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기를 포함한다:
각각 서열식별번호: 32, 33 및 34의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 42, 43 및 44의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
본 발명의 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기를 포함한다:
각각 서열식별번호: 49, 50 및 51의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 59, 60 및 61의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
본 발명의 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기를 포함한다:
각각 서열식별번호: 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
본 발명의 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기를 포함한다:
각각 서열식별번호: 69, 70 및 71의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 79, 80 및 81의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
본 발명의 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기를 포함한다:
각각 서열식별번호: 72, 73 및 74의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 82, 83 및 84의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
본 발명의 한 실시양태에서, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
서열식별번호: 15의 VH (중쇄 가변 도메인) 서열;
서열식별번호: 35의 VH 서열;
서열식별번호: 55의 VH 서열; 또는
서열식별번호: 75의 VH 서열.
본 발명의 한 실시양태에서, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 기재된 VH 서열 중 1종에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성, 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기를 포함한다:
서열식별번호: 25의 VL (경쇄 가변 도메인) 서열;
서열식별번호: 45의 VL 서열;
서열식별번호: 65의 VL 서열; 또는
서열식별번호: 85의 VL 서열.
본 발명의 한 실시양태에서, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 기재된 VL 서열 중 1종에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성, 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기를 포함한다:
서열식별번호: 15의 VH 서열; 및 서열식별번호: 25의 VL 서열;
서열식별번호: 35의 서열의 VH 서열; 및 서열식별번호: 45의 VL 서열;
서열식별번호: 55의 서열의 VH 서열; 및 서열식별번호: 65의 VL 서열; 또는
서열식별번호: 75의 서열의 VH 서열; 및 서열식별번호: 85의 VL 서열.
본 발명의 한 실시양태에서, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 기재된 VH 서열 중 1종에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성, 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함하고, 상기 기재된 VL 서열 중 1종에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성, 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, VH 및 VL은 표 1에 열거된 동일한 항체로부터 유래된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기를 포함한다:
서열식별번호: 17의 중쇄 서열;
서열식별번호: 37의 중쇄 서열;
서열식별번호: 57의 중쇄 서열; 또는
서열식별번호: 77의 중쇄 서열.
본 발명의 한 실시양태에서, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 기재된 중쇄 서열 중 1종에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성, 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기를 포함한다:
서열식별번호: 27의 경쇄 서열;
서열식별번호: 47의 경쇄 서열;
서열식별번호: 67의 경쇄 서열; 또는
서열식별번호: 87의 경쇄 서열.
본 발명의 한 실시양태에서, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 기재된 경쇄 서열 중 1종에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성, 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 경쇄 서열을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP6에 결합하고, 하기 중쇄 및 경쇄를 포함한다:
서열식별번호: 17의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 27의 경쇄 서열;
서열식별번호: 37의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 47의 경쇄 서열;
서열식별번호: 57의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 67의 경쇄 서열; 또는
서열식별번호: 77의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 87의 경쇄 서열.
본 발명의 한 실시양태에서, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 기재된 중쇄 서열 중 1종에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성, 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함하고, 상기 기재된 경쇄 서열 중 1종에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성, 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 경쇄 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄는 표 1에 열거된 동일한 항체로부터 유래된다.
BMP6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하는 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 중 어느 하나 이상에 대해 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 1개의 상보성 결정 (CDR) 서열을 포함한다:
각각 서열식별번호: 9, 10 및 11의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 12, 13 및 14의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 22, 23 및 24의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 29, 30 및 31의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 39, 40 및 41의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 32, 33 및 34의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 42, 43 및 44의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 49, 50 및 51의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 59, 60 및 61의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 69, 70 및 71의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 79, 80 및 81의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열; 또는
각각 서열식별번호: 72, 73 및 74의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 82, 83 및 84의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6에 특이적으로 결합하고, 하기 중 어느 하나 이상과 동일한 적어도 1개의 상보성 결정 (CDR) 서열을 포함한다:
각각 서열식별번호: 9, 10 및 11의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 12, 13 및 14의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 22, 23 및 24의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 29, 30 및 31의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 39, 40 및 41의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 32, 33 및 34의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 42, 43 및 44의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 49, 50 및 51의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 59, 60 및 61의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 69, 70 및 71의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 79, 80 및 81의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열; 또는
각각 서열식별번호: 72, 73 및 74의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 82, 83 및 84의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6에 특이적으로 결합하며, 여기서 상기 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 중쇄 CDR 서열을 포함한다:
서열식별번호: 12, 13 및 14의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열;
서열식별번호: 29, 30 및 31의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열;
서열식별번호: 32, 33 및 34의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열;
서열식별번호: 49, 50 및 51의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열;
서열식별번호: 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열;
서열식별번호: 69, 70 및 71의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열;
서열식별번호: 72, 73 및 74의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열; 및
서열식별번호: 9, 10 및 11의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6에 특이적으로 결합하며, 여기서 상기 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 경쇄 CDR 서열을 포함한다:
각각 서열식별번호: 19, 20 및 21의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 22, 23 및 24의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 39, 40 및 41의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 42, 43 및 44의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 59, 60 및 61의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 79, 80 및 81의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열; 및
각각 서열식별번호: 82, 83 및 84의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
실시양태에서 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 모노클로날이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 BMP6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체는 적어도 약 1 X 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 또는 1011 M-1의 친화도 상수 (KA)를 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명은 BMP6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체는 적어도 1 X 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 또는 1011 M-1의 친화도 상수 (KA)를 갖는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6에 특이적으로 결합하며, 여기서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6에 약 1 nM 이하 또는 약 0.1 nM 이하의 Kd로 결합한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6에 특이적으로 결합하며, 여기서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6에 1 nM 이하 또는 0.1 nM 이하의 Kd로 결합한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6에 특이적으로 결합하며, 여기서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6에 ≤ 1 nM 또는 ≤ 0.1 nM의 Kd로 결합한다. 한 실시양태에서, Kd는 비아코어에 의해 측정된 바와 같다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6에 특이적으로 결합하고, BMP6 활성을 억제한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6에 특이적으로 결합하고, 하기 표 1에 기재된 항체와 교차 경쟁한다 (교차-차단한다). 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 표 1에 기재된 항체의 동일한 BMP6 에피토프에 결합하고, 그와 교차-경쟁한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP2, 인간 BMP5 또는 인간 BMP7 중 임의의 것보다 인간 BMP6에 대해 적어도 약 100-, 500- 또는 1000-배 더 큰 친화도를 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP2, 인간 BMP5 또는 인간 BMP7 중 임의의 것보다 인간 BMP6에 대해 적어도 100-, 500- 또는 1000-배 더 큰 친화도를 갖는다. 실시양태에서, BMP6에 대한 특이성은 ELISA에 의해 측정된 바와 같다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP2보다 인간 BMP6에 대해 적어도 약 100-, 500- 또는 1000-배 더 큰 친화도를 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP2보다 인간 BMP6에 대해 적어도 100-, 500- 또는 1000-배 더 큰 친화도를 갖는다. 실시양태에서, BMP6에 대한 특이성은 ELISA에 의해 측정된 바와 같다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP5보다 인간 BMP6에 대해 적어도 약 100-, 500- 또는 1000-배 더 큰 친화도를 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP5보다 인간 BMP6에 대해 적어도 100-, 500- 또는 1000-배 더 큰 친화도를 갖는다. 실시양태에서, BMP6에 대한 특이성은 ELISA에 의해 측정된 바와 같다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대해 적어도 약 100-, 500- 또는 1000-배 더 큰 친화도를 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대해 적어도 100-, 500- 또는 1000-배 더 큰 친화도를 갖는다. 실시양태에서, BMP6에 대한 특이성은 ELISA에 의해 측정된 바와 같다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP2 또는 BMP5에 대해 어떠한 검출가능한 결합도 갖지 않는다 (예를 들어, ELISA에서).
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP2에 대해 어떠한 검출가능한 활성도 갖지 않는다 (예를 들어, ELISA에서).
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 BMP5에 대해 어떠한 검출가능한 활성도 갖지 않는다 (예를 들어, ELISA에서).
한 실시양태에서, BMP6에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편은 단리된 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, BMP6에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편은 단리된 인간 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, BMP6에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편은 인간화 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, BMP6에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편은 단리된 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편은 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, BMP6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단일 쇄 항체이다.
본 발명의 한 실시양태에서, BMP6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fab 단편이다.
본 발명의 한 실시양태에서, BMP6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 scFv이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgM 또는 IgG이다. 본 발명의 한 실시양태에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 한 실시양태에서, IgG는 IgG1이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산이 각각 인간 VH 또는 VL 배선 서열로부터의 항체 프레임워크로 치환된 프레임워크를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 면역접합체의 성분이다. 한 실시양태에서, 면역접합체는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 비제한적 예로서 하기: 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자 또는 약물 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fc 영역의 돌연변이를 통해 변경된 이펙터 기능을 갖는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 항체 또는 단리된 그의 항원-결합 단편을 교차-차단한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 간 세포 (예를 들어, 시험관내 간 세포주 및/또는 1차 인간 간 세포)에서 BMP6-유도된 헵시딘 발현을 억제한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 간 세포 (예를 들어, 시험관내 간 세포주 및/또는 1차 인간 간 세포)에서 BMP6-유도된 헵시딘 발현을 적어도 약 50% 억제한다. 예를 들어, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 간 세포에서 BMP6-유도된 헵시딘 발현을 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 억제한다. 헵시딘 발현은, 비제한적 예로서, 헵시딘 mRNA 또는 단백질 수준의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 간 세포 (예를 들어, 시험관내 간 세포주 및/또는 1차 인간 간 세포)에서 BMP6-유도된 헵시딘 발현을 적어도 50% 억제한다. 예를 들어, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 간 세포에서 BMP6-유도된 헵시딘 발현을 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 억제한다. 헵시딘 발현은, 비제한적 예로서, 헵시딘 mRNA 또는 단백질 수준의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 시험관내 인간 BMP6의 활성을 감소시킨다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, HEP3B-BRE-Luc 리포터 유전자 검정에서 측정 시, 시험관내 인간 BMP6의 활성을 감소시킨다.
한 측면에서, 본 발명은 BMP6에 특이적으로 결합하고 서열 QTLVHLMNPEYVPKP (서열식별번호: 92, 또는 서열식별번호: 89의 아미노산 88 내지 102)를 포함하는 인간 BMP6의 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 BMP6에 특이적으로 결합하고 서열 QTLVHLMNPEYVPKP (서열식별번호: 92, 또는 서열식별번호: 89의 아미노산 88 내지 102)로 이루어진 인간 BMP6의 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (a) 서열 QTLVHFINPETVPKP (서열식별번호: 93, 또는 서열식별번호: 90의 아미노산 88 내지 102)로 이루어진 인간 BMP7 에피토프 또는 (b) 서열 QTLVHLMFPDHVPKP (서열식별번호: 94, 또는 서열식별번호: 91의 아미노산 87 내지 101)로 이루어진 인간 BMP5 에피토프보다 서열 QTLVHLMNPEYVPKP (서열식별번호: 92, 또는 서열식별번호: 89의 아미노산 88 내지 102)로 이루어진 인간 BMP6 에피토프에 대해 적어도 약 100-배 더 큰 친화도를 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (a) 서열 QTLVHFINPETVPKP (서열식별번호: 93, 또는 서열식별번호: 90의 아미노산 88 내지 102)로 이루어진 인간 BMP7 에피토프 또는 (b) 서열 QTLVHLMFPDHVPKP (서열식별번호: 94, 또는 서열식별번호: 91의 아미노산 87 내지 101)로 이루어진 인간 BMP5 에피토프보다 서열 QTLVHLMNPEYVPKP (서열식별번호: 92, 또는 서열식별번호: 89의 아미노산 88 내지 102)로 이루어진 인간 BMP6 에피토프에 대해 적어도 100-배 더 큰 친화도를 갖는다. 이러한 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 비제한적 예로서, 하기를 포함할 수 있다: (a) 각각 서열식별번호: 69, 70 및 71의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 79, 80 및 81의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열 또는 (b) 각각 서열식별번호: 72, 73 및 74의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 82, 83 및 84의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 75의 VH 서열; 및 서열식별번호: 85의 VL 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 친화도는 비아코어에 의해 측정된 바와 같다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (a) 서열 QTLVHFINPETVPKP (서열식별번호: 93, 또는 서열식별번호: 90의 아미노산 88 내지 102)로 이루어진 인간 BMP7 에피토프 또는 (b) 서열 QTLVHLMFPDHVPKP (서열식별번호: 94, 또는 서열식별번호: 91의 아미노산 87 내지 101)로 이루어진 인간 BMP5 에피토프보다 서열 QTLVHLMNPEYVPKP (서열식별번호: 92, 또는 서열식별번호: 89의 아미노산 88 내지 102)로 이루어진 인간 BMP6 에피토프에 대해 적어도 약 500-배 더 큰 친화도를 갖는다. 이러한 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 비제한적 예로서, 하기를 포함할 수 있다: (a) 각각 서열식별번호: 69, 70 및 71의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 79, 80 및 81의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열 또는 (b) 각각 서열식별번호: 72, 73 및 74의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 82, 83 및 84의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 75의 VH 서열; 및 서열식별번호: 85의 VL 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 친화도는 비아코어에 의해 측정된 바와 같다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이전 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 추가의 치료제를 추가로 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 추가의 치료제는 BMP6의 활성을 감소시킨다.
본 발명의 한 실시양태에서, 추가의 치료제는 siRNA, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 소분자이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 추가의 치료제는 적혈구생성 자극제 (ESA) 및 철 (예를 들어, 보충 식이 철 또는 IV 철)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 추가의 치료제는 적혈구생성 자극제 (ESA), 예를 들어 EPO이다.
한 실시양태에서, 표 1에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 예컨대 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 치료 방법 또는 절차와 함께 그를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 표 1에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 방법 또는 절차 전에, 그 후에 또는 그와 동시에 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 치료 방법 또는 절차는 수혈이다. 한 실시양태에서, 치료 방법 또는 절차는 투석이다. 한 실시양태, 치료 방법 또는 절차는 ESA, 예를 들어, EPO의 투여이다. 한 실시양태에서, 치료 방법 또는 절차는 철, 예를 들어, IV 철의 투여이다. 한 실시양태, 치료 방법 또는 절차는 ESA, 예를 들어, EPO의 투여 및 철, 예를 들어, IV 철의 투여이다. 한 실시양태에서, 치료 방법 또는 절차는 상기 중 임의의 것의 조합이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 (폴리뉴클레오티드)을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하기 중 어느 하나 이상을 포함하는 표 1에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다:
각각 서열식별번호: 9, 10 및 11의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 12, 13 및 14의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 22, 23 및 24의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 29, 30 및 31의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 39, 40 및 41의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 32, 33 및 34의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 42, 43 및 44의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 49, 50 및 51의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 59, 60 및 61의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
각각 서열식별번호: 69, 70 및 71의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 79, 80 및 81의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열; 또는
각각 서열식별번호: 72, 73 및 74의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 82, 83 및 84의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 표 1에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 (폴리뉴클레오티드)을 제공한다:
서열식별번호: 17의 중쇄 서열;
서열식별번호: 15의 VH 서열;
서열식별번호: 27의 경쇄 서열;
서열식별번호: 25의 VL 서열;
서열식별번호: 37의 중쇄 서열;
서열식별번호: 35의 VH 서열;
서열식별번호: 47의 경쇄 서열;
서열식별번호: 45의 VL 서열;
서열식별번호: 57의 중쇄 서열;
서열식별번호: 55의 VH 서열;
서열식별번호: 67의 경쇄 서열;
서열식별번호: 65의 VL 서열;
서열식별번호: 77의 중쇄 서열;
서열식별번호: 75의 VH 서열;
서열식별번호: 87의 경쇄 서열; 및
서열식별번호: 85의 VL 서열.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 표 1에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 (폴리뉴클레오티드)을 제공한다:
서열식별번호: 17의 중쇄 서열;
서열식별번호: 15의 VH 서열;
서열식별번호: 27의 경쇄 서열;
서열식별번호: 25의 VL 서열;
서열식별번호: 37의 중쇄 서열;
서열식별번호: 35의 VH 서열;
서열식별번호: 47의 경쇄 서열;
서열식별번호: 45의 VL 서열;
서열식별번호: 57의 중쇄 서열;
서열식별번호: 55의 VH 서열;
서열식별번호: 67의 경쇄 서열;
서열식별번호: 65의 VL 서열;
서열식별번호: 77의 중쇄 서열;
서열식별번호: 75의 VH 서열;
서열식별번호: 87의 경쇄 서열; 및
서열식별번호: 85의 VL 서열.
한 실시양태에서, 본 발명은 표 1에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 (폴리뉴클레오티드)을 제공하며, 여기서 핵산은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다:
서열식별번호: 18의 중쇄 서열;
서열식별번호: 38의 중쇄 서열;
서열식별번호: 58의 중쇄 서열;
서열식별번호: 78의 중쇄 서열;
서열식별번호: 28의 경쇄 서열;
서열식별번호: 48의 경쇄 서열;
서열식별번호: 68의 경쇄 서열;
서열식별번호: 88의 경쇄 서열;
서열식별번호: 16의 VH 서열;
서열식별번호: 36의 VH 서열;
서열식별번호: 56의 VH 서열;
서열식별번호: 76의 VH 서열;
서열식별번호: 26의 VL 서열;
서열식별번호: 46의 VL 서열;
서열식별번호: 66의 VL 서열; 및
서열식별번호: 86의 VL 서열.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 이러한 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 이러한 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단리된 숙주 세포는 이러한 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (1) 본 발명의 항체의 중쇄를 코딩하는 재조합 핵산 절편, 및 (2) 본 발명의 항체의 경쇄를 코딩하는 제2 재조합 핵산 절편을 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공하며; 여기서 상기 DNA 절편은 제1 및 제2 프로모터에 각각 작동가능하게 연결되고, 상기 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 단리된 숙주 세포는 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄 각각을 코딩하는 재조합 DNA 절편을 포함하며, 여기서 상기 DNA 절편은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 비-인간 포유동물 세포주이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
본 발명은 의약의 제조에서의, 본원에 기재된 바와 같은, BMP6에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다. 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명은 요법에서 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명은 빈혈, 예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈을 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 만성 질환은 만성 신장 질환이다. 한 실시양태에서, 만성 질환은 암이다. 한 실시양태에서, 만성 질환은 염증이다. 실시양태에서, 빈혈을 갖는 환자는 적혈구생성 자극제 (ESA), 예를 들어 에리트로포이에틴 (EPO)으로 치료받은바 있거나 또는 치료받고 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은, 항체 및 그의 항원-결합 단편을 사용하는 방법, 및 이러한 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 헵시딘의 활성 또는 수준을 감소시키는 것을 필요로 하는 환자에게 본원에 기재된 바와 같은 BMP6에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 헵시딘의 활성 또는 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법의 한 실시양태에서, 헵시딘의 활성 또는 수준은 적어도 50% 감소된다. 한 실시양태에서, 환자는 빈혈을 갖는다. 실시양태에서, 빈혈은 만성 질환에 의한 빈혈 (ACD), 예를 들어, 만성 신장 질환에 의한 빈혈 (CKD), 암에 의한 빈혈 또는 염증에 의한 빈혈이다. 한 실시양태에서, 빈혈은 적혈구생성 자극제 (ESA) 저항성 빈혈 또는 철-제한 빈혈이다.
본 발명은 빈혈을 치료하는 것을 필요로 하는 환자에게 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 빈혈을 치료하는 방법을 제공한다. 실시양태에서, 빈혈은 만성 질환에 의한 빈혈 (ACD), 예를 들어, 만성 신장 질환에 의한 빈혈 (CKD), 암에 의한 빈혈 또는 염증에 의한 빈혈이다. 한 실시양태에서, 빈혈은 적혈구생성 자극제 (ESA) 저항성 빈혈 또는 철-제한 빈혈이다. 실시양태에서, 환자는 적혈구생성 자극제 (ESA), 예를 들어, 에리트로포이에틴 (EPO)으로 치료받고 있거나 또는 치료받은 바 있다. 실시양태에서, 빈혈은 EPO-저반응성 빈혈이다. 실시양태에서, 빈혈은 철-제한 빈혈이다. 실시양태에서, 환자는 만성 혈액투석 환자이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 BMP6을 억제하는 것을 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 BMP6을 억제하는 방법을 제공한다. 실시양태에서, 환자는 빈혈을 갖는다. 실시양태에서, 빈혈은 만성 질환에 의한 빈혈 (ACD), 예를 들어, 만성 신장 질환에 의한 빈혈 (CKD), 암에 의한 빈혈 또는 염증에 의한 빈혈이다. 한 실시양태에서, 빈혈은 적혈구생성 자극제 (ESA) 저항성 빈혈 또는 철-제한 빈혈이다. 실시양태에서, 환자는 적혈구생성 자극제 (ESA), 예를 들어, 에리트로포이에틴 (EPO)으로 치료받고 있거나 또는 치료받은 바 있다. 실시양태에서, 빈혈은 EPO-저반응성 빈혈이다. 실시양태에서, 빈혈은 철-제한 빈혈이다. 실시양태에서, 환자는 만성 혈액투석 환자이다.
본 발명은 또한 세포를 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 BMP6의 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 혈청 철 수준, 트랜스페린 포화 (TSAT), 망상적혈구 헤모글로빈 함량 (CHr), 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈 및/또는 적혈구용적률을 증가시키는 것을 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 혈청 철 수준, 트랜스페린 포화 (TSAT), 망상적혈구 헤모글로빈 함량 (CHr), 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈 및/또는 적혈구용적률을 증가시키는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 환자에게 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 헤모글로빈 수준을 증가 또는 유지시키는 방법을 추가로 제공한다. 실시양태에서, 환자는 빈혈을 갖는다. 실시양태에서, 빈혈은 만성 질환에 의한 빈혈 (ACD), 예를 들어, 만성 신장 질환에 의한 빈혈 (CKD), 암에 의한 빈혈 또는 염증에 의한 빈혈이다. 한 실시양태에서, 빈혈은 적혈구생성 자극제 (ESA) 저항성 빈혈 또는 철-제한 빈혈이다. 실시양태에서, 환자는 적혈구생성 자극제 (ESA), 예를 들어, 에리트로포이에틴 (EPO)으로 치료받고 있거나 또는 치료받은 바 있다. 실시양태에서, 빈혈은 EPO-저반응성 빈혈이다. 실시양태에서, 빈혈은 철-제한 빈혈이다. 실시양태에서, 환자는 만성 혈액투석 환자이다. 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편에 의한 치료의 부재 하의 상기 EPO 용량 요건 및/또는 철 용량 요건에 비해, 환자의 철 용량 요건을 감소시키거나, 환자의 EPO 용량 요건을 감소시키거나, 또는 환자의 철 용량 요건 및 환자의 EPO 용량 요건 둘 다를 감소시키는 것을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 헤모글로빈 수준은 적어도 약 10.0, 적어도 약 11.0, 또는 적어도 약 12.0 g/dL 수준으로 증가 또는 유지된다. 실시양태에서, 헤모글로빈 수준은 적어도 10.0, 적어도 11.0, 또는 적어도 12.0 g/dL 수준으로 증가 또는 유지된다.
상기 언급된 방법 중 임의의 것에서, 환자에게 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 단계는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 언급된 방법 중 임의의 것에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 0.001 내지 0.1 mg/kg의 용량으로, 예를 들어, 0.001 mg/kg, 0.0016 mg/kg, 0.0025 mg/kg, 0.0040 mg/kg, 0.0063 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.016 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.040 mg/kg, 0.063 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 상기 언급된 방법 중 임의의 것에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 약 0.001 내지 약 0.1 mg/kg의 용량으로, 예를 들어, 약 0.001 mg/kg, 약 0.0016 mg/kg, 약 0.0025 mg/kg, 약 0.0040 mg/kg, 약 0.0063 mg/kg, 약 0.01 mg/kg, 약 0.016 mg/kg, 약 0.025 mg/kg, 약 0.040 mg/kg, 약 0.063 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 피하로 투여된다. 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 약 30 내지 약 60분의 기간에 걸쳐 주입에 의해 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표 1에 열거된 CDR을 포함하는 BMP6에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명은 표 1에 열거된 BMP6에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명은 표 1에 열거된 CDR을 포함하는 BMP6에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 단리된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단리된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 "BMP6"은 단백질 골 형태발생 단백질 6 (BMP6) 또는 BMP6을 코딩하는 유전자 또는 핵산을 의미한다. 문헌 [Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759-62; Sauermann et al. 1993 J. Neurosci. Res. 33: 142-7; NCBI Gene ID: 654]. BMP6은 또한 하기로 공지된다: BMP-6; VGR; VGR1; 외부 ID: OMIM: 112266 MGI: 88182; 호몰로진: 1300; 진카드: BMP6 유전자. 오르토로그: 종: 인간: 엔트레즈: 654; Ensembl: ENSG00000153162; 유니프롯: P22004; RefSeq (mRNA): NM_001718; RefSeq (단백질): NP_001709; 위치 (UCSC): Chr 6: 7.73 - 7.88 Mb; 종: 마우스: 엔트레즈: 12161; Ensembl: ENSMUSG00000039004; 유니프롯: P20722; RefSeq (mRNA): NM_007556; RefSeq (단백질): NP_031582; 위치 (UCSC): Chr 13: 38.35 - 38.5 Mb. 본원에 기재된 바와 같이, BMP6에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6 단백질에 결합한다.
본원에 사용된 "BMP2"는 단백질 골 형태발생 단백질 2 (BMP2) 또는 BMP2를 코딩하는 유전자 또는 핵산을 의미한다. BMP2는 또한 하기로 공지된다: BDA2; 및 BMP2A; 외부 ID OMIM: 112261 MGI: 88177 호몰로진: 926 진카드: BMP2 유전자. 종: 인간; 엔트레즈: 650; Ensembl: ENSG00000125845; 유니프롯: P12643; RefSeq (mRNA): NM_001200; RefSeq (단백질): NP_001191; 위치 (UCSC): Chr 20: 6.75 - 6.76 Mb. 종: 마우스; 엔트레즈: 12156; Ensembl: ENSMUSG00000027358; 유니프롯: P21274; RefSeq (mRNA): NM_007553; RefSeq (단백질): NP_031579; 위치 (UCSC): Chr 2: 133.55 - 133.56 Mb. 본원에 기재된 바와 같이, BMP2에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP2 단백질에 결합한다.
본원에 사용된 "BMP5"는 단백질 골 형태발생 단백질 5 (BMP5) 또는 BMP5를 코딩하는 유전자 또는 핵산을 의미한다. BMP5는 또한 하기로 공지된다: MGC34244; 외부 ID OMIM: 112265 MGI: 88181 호몰로진: 22412 진카드: BMP5 유전자. 종: 인간; 엔트레즈: 653; Ensembl: ENSG00000112175; 유니프롯: P22003; RefSeq (mRNA): NM_021073; RefSeq (단백질): NP_066551; 위치 (UCSC): Chr 6: 55.62 - 55.74 Mb. 종: 마우스; 엔트레즈: 12160; Ensembl: ENSMUSG00000032179; 유니프롯: P49003; RefSeq (mRNA): NM_007555; RefSeq (단백질): NP_031581; 위치 (UCSC): Chr 9: 75.78 - 75.9 Mb. 본원에 기재된 바와 같이, BMP5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP5 단백질에 결합한다.
본원에 사용된 "BMP7"은 단백질 골 형태발생 단백질 7 (BMP7) 또는 BMP7을 코딩하는 유전자 또는 핵산을 의미한다. BMP7은 또한 하기로 공지된다: 골형성 단백질-1; OP-1; 외부 ID OMIM: 112267 MGI: 103302 호몰로진: 20410 진카드: BMP7 유전자. 종: 인간; 엔트레즈: 655; Ensembl: ENSG00000101144; 유니프롯: P18075; RefSeq (mRNA): NM_001719; RefSeq (단백질): NP_001710; 위치 (UCSC): Chr 20: 55.74 - 55.84 Mb. 종: 마우스; 엔트레즈: 12162; Ensembl: ENSMUSG00000008999; 유니프롯: P23359; RefSeq (mRNA): NM_007557; RefSeq (단백질): NP_031583; 위치 (UCSC): Chr 2: 172.87 - 172.94 Mb. 본원에 기재된 바와 같이, BMP7에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP7 단백질에 결합한다.
"헵시딘"은 유전자 헵시딘 또는 단백질 헵시딘, 펩티드 호르몬을 의미한다. 헵시딘은 또한 하기로 공지된다: HAMP (헵시딘 항미생물 단백질 또는 펩티드); HEPC; HFE2B; LEAP1 (LEAP-1); PLTR; OMIM: 606464; 호몰로진: 81623; 진카드: HAMP 유전자; 엔트레즈 57817; Ensembl ENSG00000105697; 유니프롯 P81172; RefSeq (mRNA) NM_021175; RefSeq (단백질) NP_066998; 위치 (UCSC) Chr 19: 35.77 - 35.78 Mb. 문헌 [Krause et al. FEBS Lett. 480: 147-150; 및 Pigeon et al. 2001 J. Biol. Chem. 276: 7811-9]. 또한 문헌 [Ganz 2003 Blood 102: 783-8; Roy et al. 2005 Curr. Opin. Hemat. 12: 107-111; Fleming et al. 2006 Semin. Liver Dix. 25: 411-9; Park et al. 2001 J. Biol. Chem. 276: 7806-10; Majore et al. 2002 Haematologica 87: 221-2; Kluver et al. 2002 J. Pept. Res. 59 : 241-8; Hunter et al. 2002 J. Biol. Chem. 277 : 37597-603; Weinstein et al. 2003 Blood 100 : 3776-81; Nemeth et al. 2003 Blood 101: 2461-3; Roetto et al. 2003 Nat. Genet. 33: 21-2; Strausberg et al. 2003 Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-903; Gehrke et al. 2003 Blood 102: 371-6; Merryweather-Clarke et al. 2004 Human Mol. Genet. 12:2241-7; Clark et al. 2003 Genome Res. 13: 2265-70; Roetto et al. 2004 Blood 103: 2407-9; Jacolot et al. 2004 Blood 103: 2835-40; 및 Ota et al. 2004 Nat. Genet. 36: 40-45]을 참조한다.
본원에 사용된 "빈혈"은 산소를 운반하는 혈액의 감소된 능력과 함께, 적혈구의 수에서의 감소, 또는 혈액 중 헤모글로빈 또는 철의 양에서의 감소를 의미한다.
빈혈은, 비제한적 예로서, 남성에서 헤모글로빈을 기반으로 하여 약 130 내지 140 g/L (13 내지 14 g/dL) 미만 및 여성에서 약 120 내지 130 g/L (12 내지 13 g/dL) 미만을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 진단될 수 있다. 문헌 [Janz et al. 2013 Emerg. Med. Pract. 15: 1-15; 및 Smith 2010 Am. J. Man. Care 16 Supp. S59-66].
본원에 사용된 용어 "BMP6 항체", "항-인간 BMP6 항체", "BMP6-결합 항체", "BMP6 길항제 항체" 등 (및 그의 항원-결합 단편)은 단백질 BMP6에 결합하는 항체 (및 그의 항원-결합 단편)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체", "그의 항원-결합 단편", "항원 결합 부분" 등은 전체 항체 및 임의의 항원-결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 그의 단일 쇄를 포함한다. 자연 발생 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (C1q)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 단편", "그의 항원-결합 단편", "항원 결합 부분" 등은 주어진 항원 (예를 들어, BMP6)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합 부분"에 포괄되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb) 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
게다가, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 코딩되기는 하지만, 재조합 방법을 사용하여 이들이 단일 단백질 쇄가 될 수 있게 하는 인공 펩티드 링커에 의해 이들을 연결시킬 수 있으며, 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍형성하여 1가 분자를 형성한다 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426; 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조). 이러한 단일 쇄 항체는 항체의 1개 이상의 "항원 결합 부분"을 포함한다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
항원 결합 부분은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136] 참조). 항체의 항원 결합 부분은 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기반한 스캐폴드에 그라프팅될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기재한 미국 특허 번호 6,703,199 참조).
항원 결합 단편은 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 단일 쇄 분자 내로 혼입될 수 있다 (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8 (10):1057-1062; 및 미국 특허 번호 5,641,870).
본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 수많은 부위에서 항원과 약한 비-공유결합력을 통해 상호작용하고; 상호작용이 더 많을수록 친화도가 더 강해진다.
본원에 사용된 용어 "결합력"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도의 유익한 척도를 지칭한다. 이는 3가지 주요 인자: 항체 에피토프 친화도; 항원과 항체 둘 다의 원자가; 및 상호작용 부분의 구조적 배열에 의해 제어된다. 궁극적으로, 이들 인자는 항체의 특이성, 즉 특정한 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합할 가능성을 규정한다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 것, 뿐만 아니라 이후에 변형된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합되는 알파 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "결합 특이성"은 단지 1개의 항원 결정기와 반응하는 개별 항체 결합 부위의 능력을 지칭한다. 항체의 결합 부위는 분자의 Fab 부분에 위치하고, 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역으로부터 구축된다. 항체의 결합 친화도는 단일 항원 결정기와 항체 상의 단일 결합 부위 사이의 반응의 강도이다. 이것은 항원 결정기와 항체의 결합 부위 사이에서 작용하는 인력 및 척력의 합이다.
2개의 엔티티 사이의 특이적 결합은 적어도 1 X 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 또는 1011 M-1의 평형 상수 (KA 또는 KA)를 갖는 결합을 의미한다. 어구 항체 (예를 들어, BMP6-결합 항체)에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하는"은 단백질 및 다른 생물제제의 불균질 집단에서 동족 항원 (예를 들어, 인간 BMP6 단백질)의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 상기에 나타낸 평형 상수 (KA)에 더하여, 본 발명의 BMP6-결합 항체는 전형적으로 또한 약 1 X 10-2 s-1, 1 X 10-3 s-1, 또는 그 미만의 해리율 상수 (Kd 또는 KD 또는 KD)를 갖고, 비-특이적 항원 (예를 들어, BMP2, BMP5 또는 BMP7)에의 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 2-배 더 큰 친화도로 BMP6에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환가능하게 사용된다.
2개의 엔티티 사이의 특이적 결합은 적어도 102M-1, 적어도 5 X 102M-1, 적어도 103M-1, 적어도 5 X 103M-1, 적어도 104M-1, 적어도 5 X 104M-1, 적어도 105M-1, 적어도 5 X 105M-1, 적어도 106M-1, 적어도 5 X 106M-1, 적어도 107M-1, 적어도 5 X 107M-1, 적어도 108M-1, 적어도 5 X 108M-1, 적어도 109M-1, 적어도 5 X 109M-1, 적어도 1010M-1, 적어도 5 X 1010M-1, 적어도 1011M-1, 적어도 5 X 1011M-1, 적어도 1012M-1, 적어도 5 X 1012M-1, 적어도 1013M-1, 적어도 5 X 1013 M-1, 적어도 1014M-1, 적어도 5 X 1014M-1, 적어도 1015M-1, 또는 적어도 5 X 1015M-1의 평형 상수 (KA) (kon/koff)로의 결합을 의미한다.
용어 "키메라 항체" (또는 그의 항원-결합 단편)는 (a) 항원 결합 부위 (가변 영역)가, 상이하거나 변경된 부류, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 불변 영역 또는 그의 부분이 변경, 대체 또는 교환되거나; 또는 (b) 가변 영역 또는 그의 부분이, 상이하거나 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 대체 또는 교환된 항체 분자 (또는 그의 항원-결합 단편)이다. 예를 들어, 마우스 항체는 그의 불변 영역을 인간 이뮤노글로불린으로부터의 불변 영역으로 대체함으로써 변형될 수 있다. 인간 불변 영역으로의 대체로 인해, 키메라 항체는 원래 마우스 항체와 비교 시 인간에서 감소된 항원성을 가지면서 항원을 인식하는 그의 특이성을 보유할 수 있다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정한 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축중성 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 지정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변경시키지 않으면서 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 1종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 통상의 기술자는 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포된다.
폴리펩티드 서열의 경우에, "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는, 폴리펩티드 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 부가적인 것이고 이들을 배제하지 않는다. 하기의 8개의 군은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조). 한 실시양태에서, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치거나 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "차단하다"는 상호작용 또는 프로세스를 정지시키거나 막는 것, 예를 들어 리간드-의존성 또는 리간드-비의존성 신호전달을 정지시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "인식하다"는 그의 입체형태적 에피토프를 발견하여 이와 상호작용 (예를 들어, 결합)하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭한다.
용어 "교차-차단하다", "교차-차단된", "교차-차단하는", "경쟁하다", "교차 경쟁하다" 및 관련 용어는 본원에서, 표준 경쟁적 결합 검정에서 다른 항체 또는 결합제가 BMP6에 결합하는 것을 방해하는 항체 또는 다른 결합체의 능력을 의미하는 것으로 상호교환가능하게 사용된다.
항체 또는 다른 결합제가 BMP6에 대한 또 다른 항체 또는 결합 분자의 결합을 방해할 수 있는 능력 또는 정도, 및 따라서 본 발명에 따라 교차-차단하는 것으로 언급될 수 있는지의 여부는 표준 경쟁 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 하나의 적합한 검정은 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어 기술 (예를 들어, 비아코어 3000 기기 (비아코어(Biacore), 스웨덴 웁살라)를 사용함)의 사용을 수반한다. 교차-차단을 측정하기 위한 또 다른 검정은 ELISA-기반 접근법을 사용한다.
용어 "중화시키다"는 항체가, 그의 표적에의 결합 시, 표적의 활성, 수준 또는 안정성을 감소시키는 것을 의미하고; 예를 들어, BMP6 항체는, BMP6에의 결합 시 헵시딘 수준 및 빈혈에서의 신호전달 또는 그의 역할과 같은 BMP6의 활성, 수준 또는 안정성을 적어도 부분적으로 감소시킴으로써 BMP6을 중화시킨다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 분자의 화학적 활성 표면 기, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄로 이루어지고, 통상적으로 특이적 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비입체형태적 에피토프는, 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에 상실되지만 후자에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
용어 "에피토프"는 이뮤노글로불린에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 달리 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 분자의 화학적 활성 표면 기, 예컨대 아미노산 BMP6 또는 탄수화물 또는 당 측쇄로 이루어지고, 특이적 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체형태적"일 수 있다.
용어 "선형 에피토프"는 단백질과 상호작용 분자 (예컨대, 항체) 사이의 상호작용의 모든 지점이 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 발생하는 (연속적) 에피토프를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 IgG 항체에 대한 "높은 친화도"는 표적 항원, 예를 들어, BMP6에 대해 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M, 또는 10-11 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "높은 친화도" 결합은 다른 항체 이소형의 경우에 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "높은 친화도" 결합은 10-7 M 이하, 또는 10-8 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체" (또는 그의 항원-결합 단편)는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체 (및 그의 항원-결합 단편)를 포함하는 것으로 의도된다. 게다가, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역도 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 배선 서열, 또는 인간 배선 서열의 돌연변이된 버전으로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체 및 그의 항원-결합 단편은 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물" (또는 그의 항원-결합 단편)은 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 동일한 유전자 공급원으로부터 유래된, 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체 등을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 용어는 또한 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 포함한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 디스플레이한다.
용어 "인간 모노클로날 항체" (또는 그의 항원-결합 단편)는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 디스플레이하는 항체 (및 그의 항원-결합 단편)를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 어구 "재조합 인간 항체" (또는 그의 항원-결합 단편)는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체 (및 그의 항원-결합 단편), 예컨대 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에 사용된 "인간화" 항체 (또는 그의 항원-결합 단편)는 인간에서 덜 면역원성이면서 비-인간 항체의 반응성을 보유하는 항체 (또는 그의 항원-결합 단편)이다. 이는, 예를 들어 비-인간 CDR 영역을 보유하고 항체의 나머지 부분을 그의 인간 대응물 (즉, 불변 영역 뿐만 아니라 가변 영역의 프레임워크 부분)로 대체하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; 및 Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994]을 참조한다. 인간 조작 기술의 다른 예는 미국 특허 번호 5,766,886에 개시된 조마(Xoma) 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 2개의 서열은, 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의한 측정 시 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대한 상응하도록 비교 및 정렬한 경우에, 2개의 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율 (즉, 명시된 영역에 걸쳐, 또는 명시되지 않은 경우에, 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 임의로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성)을 갖는 경우에 "실질적으로 동일하다". 임의로, 동일성은 적어도 약 50개 뉴클레오티드 (또는 10개 아미노산) 길이인 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 100 내지 500 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 20, 50, 200개 또는 그 초과의 아미노산) 길이인 영역에 걸쳐 존재한다. 임의로, 동일성은 적어도 50개 뉴클레오티드 (또는 10개 아미노산) 길이인 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 100 내지 500 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 20, 50, 200개 또는 그 초과의 아미노산)의 길이인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 1개의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우에 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 하여 참조 서열 대비 시험 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
본원에 사용된 "비교 윈도우"는 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 서열을 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교할 수 있는, 20 내지 600개, 통상적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 통상적으로 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 어느 하나의 절편에 대한 언급을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, 문헌 [Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 2가지 예는 각각 문헌 [Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; 및 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물 정보 센터를 통해 공중 이용가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드와 정렬했을 때 일부 양의 값의 역치 점수 T에 매칭되거나 또는 이를 충족시키는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 점수화 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 워드 점수 역치를 지칭한다 (Altschul et al., 상기 문헌). 이들 초기 이웃 워드 히트는 이를 함유하는 보다 긴 HSP를 발견하는 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우에는 점수화 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 1개 이상의 음으로 점수화된 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하로 떨어지거나; 또는 어느 하나의 서열의 말단에 도달한 경우에, 각각의 방향으로의 워드 히트의 연장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감수성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드길이 (N) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이 3, 및 기대값 (E) 10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참조) 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률 (P (N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한, ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된 문헌 [E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)]의 알고리즘을 사용하여, PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 이용가능함) 내의 GAP 프로그램에 혼입된 문헌 [Needleman and Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)] 알고리즘을 사용하여, Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여 결정할 수 있다.
상기 나타낸 서열 동일성의 백분율 이외에, 2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 하기 기재된 바와 같이 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대하여 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 전형적으로, 예를 들어 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 2개의 분자 또는 그의 상보체가 하기 기재된 바와 같이 엄격한 조건 하에 서로 혼성화된다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.
본원에 사용된 용어 "단리된 항체" (또는 그의 항원-결합 단편)는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체 (또는 그의 항원-결합 단편)를 지칭한다 (예를 들어, BMP6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 BMP6 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류 (예를 들어, IgM, IgE, IgG 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다. 이소형은 또한 Fc 기능을 변경시키는, 예를 들어 이펙터 기능 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 증진시키거나 감소시키는 변형이 이루어진, 이들 부류 중 1종의 변형된 버전을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Kassoc" 또는 "Ka" 또는 "KA" 또는 "KA"는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 것으로 의도되는 반면에, 본원에 사용된 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하는 것으로 의도된다. 한 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비 (즉 Kd/Ka)로부터 수득되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되고, 몰 농도 (M)로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하거나 또는 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어® 시스템을 사용하는 것에 의한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" (또는 그의 항원-결합 단편) 또는 "모노클로날 항체 (또는 그의 항원-결합 단편) 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자 (또는 그의 항원-결합 단편)의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 디스플레이한다.
용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환가능하게 사용되고, 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 합성, 자연 발생 및 비-자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포괄한다. 이러한 유사체의 예는, 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명확하게 나타낸 서열, 뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환) 및 상보적 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 하기 상술되는 바와 같이, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994)
용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 절편 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 전형적으로, 이는 전사된 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열이 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템 내에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조정하는 경우에, 그것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사되는 서열에 물리적으로 인접하며, 즉 이들은 시스-작용성이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는 전사를 증진시키는 코딩 서열에 물리적으로 인접하거나 또는 근접하여 위치할 필요가 없다.
본원에 사용된 용어 "최적화된"은, 뉴클레오티드 서열이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어 피키아(Pichia) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경되었음을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은, 또한 "모" 서열로도 공지되어 있는 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 코딩되는 아미노산 서열을 완전하게 또는 가능한 한 많이 보유하도록 조작된다. 본원의 최적화된 서열은 포유동물 세포에서 바람직한 코돈을 갖도록 조작된 바 있다. 그러나, 다른 진핵 세포 또는 원핵 세포에서의 이들 서열의 최적화된 발현도 또한 본원에서 고려된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열도 또한 최적화된 것으로 언급된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 폴리펩티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체도 함축적으로 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체" (또는 그의 항원-결합 단편)는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체 (및 그의 항원-결합 단편), 예컨대 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 그러나, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 지칭하는 것으로 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다.
용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 나타내어지는 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "치료하는"은 질환, 상태 또는 장애의 증상을 완화시키거나 추가의 진행을 정지 또는 억제하면서 질환 (예를 들어, 빈혈)의 증상, 합병증 또는 생화학적 적응증의 발병을 방지하거나 지연시키기 위한 조성물 또는 항체의 투여를 포함한다. 치료는 예방적 (질환의 발병을 방지하거나 지연시키거나, 또는 그의 임상적 또는 준임상적 증상의 징후를 방지하기 위함)이거나, 또는 질환의 징후 후에 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다.
용어 "벡터"는 그것이 연결된 또 다른 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 이는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)와 같이, 동등한 기능을 하는 발현 벡터의 이러한 다른 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "적혈구용적률" 또는 "혈구용적률"은 또한 충전 세포 부피 (PCV) 또는 적혈구 부피 분획 (EVF)으로도 공지되어 있고, 혈액 중 적혈구의 부피 (%)이다. 이는 정상적으로 남성의 경우에 약 45% 및 여성의 경우에 약 50%이다. 이는 헤모글로빈 농도, 백혈구 계수, 및 혈소판 계수와 함께, 인간의 전혈구 계수 결과의 필수 부분으로 간주된다. 한 실시양태에서, 빈혈은 비정상적으로 높은 적혈구용적률인 다혈구혈증과는 대조적으로, 비정상적으로 낮은 적혈구용적률을 지칭한다.
도 1a는 리포터 유전자 검정에서 길항제 항체 5, 6 및 7에 의한 BMP 활성의 억제를 제시한다. BMP2, BMP5, BMP6, 및 BMP7에 대한 활성이 제시된다. 도 1b는 인간 BMP6, 인간 BMP7, 인간 BMP5, 마우스 BMP6, hBaffR, BSA 및 Neu에 대한 항체 7 결합을 시험한 ELISA 결합 검정을 제시한다. 본 도면 및 다양한 다른 도면, 및 명세서의 다른 부분에서, Ab 5 = 항체 5; Ab 6 = 항체 6; 및 Ab 7 = 항체 7.
도 2는 단일 용량 래트 선별 PK 연구의 약역학 프로파일을 제시한다. 항체 5, 6 및 7을 사용하였다. 혈청 헵시딘 및 철 수준을 투여 (10 mg/kg, IV) 1시간, 6시간, 1, 2, 4, 8, 16일 후에 측정하였다.
도 3은 철 대사의 혈청 바이오마커에 대한 BMP6 항체의 용량-의존성 효과를 제시한다. 상부: 제시된 용량으로의 항체 6의 단일 IV 주사 후 시간의 경과에 따른 혈청 hIgG 농도. 하부: 좌측 패널은 단일 항체 6 또는 대조군 인간 IgG 주사 후 혈청 헵시딘 농도의 정량 분석이고, 반면에 우측 패널은 혈청 철 농도이다.
도 4는 염증 마우스 모델의 ESA-저항성 빈혈에서 BMP6 항체의 치유적 치료를 제시한다. 상부: 염증 모델의 BA-유도된 ESA-저항성 빈혈의 실험 스킴. 하부: BA 치료 13일 후의 적혈구생성 파라미터. HGB : 헤모글로빈; HCT: 적혈구용적률; RETA: 망상적혈구 계수; RET-HE: 망상적혈구 헤모글로빈 당량. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 대 BA+EPO+hIgG1.
도 5는 HDxMS (질량 분광계와 커플링된 수소/중수소 교환)에 의한 선형 에피토프 맵핑을 제시한다. 항체 7에 의해 결합된 BMP6의 에피토프를 제시한다 (인간 BMP6 (QTLVHLMNPEYVPKP (서열식별번호: 92))의 잔기 88-102). HDxMS를 사용하여, 상업적으로 입수가능한 BMP6 항체의 인간화 버전인 항체 676이 인간 BMP6의 잔기 23-35 (VSSASDYNSSELK (서열식별번호: 95))로 이루어진 에피토프에 결합한다는 것을 발견하였다.
도 6은 BMP6 항체의 안전성 및 효능을 조사하기 위한 임상 프로그램의 파트 1에 대한 프로토콜을 제시한다.
도 7은 BMP6 항체의 안전성 및 효능을 조사하기 위한 임상 프로그램에 대한 용량 조정 결정 트리를 제시한다.
도 8은 BMP6 항체의 안전성 및 효능을 조사하기 위한 임상 프로그램의 파트 2에 대한 프로토콜을 제시한다.
도 9는 수컷 래트에서의 단일 용량 항체 7의 약동학 프로파일을 제시한다.
도 10은 래트에서의 철 대사의 혈청 바이오마커에 대한 항체 7의 용량-의존성 효과를 제시한다. 표시된 용량으로의 단일 항체 7 또는 대조군 (비히클) 주사 후 혈청 헵시딘 농도의 정량 분석을 제시한다. 좌측 패널은 투여 후 처음 24시간 내의 효과의 확대도를 제시한다.
도 11은 래트에서의 혈청 철에 대한 항체 7의 의존성 효과를 제시한다. 표시된 용량으로의 단일 항체 7 또는 대조군 (비히클) 주사 후 혈청 철 농도의 정량 분석을 제시한다. 좌측 패널은 투여 후 처음 24시간 내의 효과의 확대도를 제시한다.
도 12는 시노몰구스 원숭이에서 항체 7 (3mg/kg)의 단일 용량 IV 주사의 농도-시간 프로파일을 제시한다. 총 항체 7 농도 (유리 및 BMP6-결합된 것 둘 다)를 플롯팅한다.
도 13은 3 mg/kg의 용량으로의 항체 7의 단일 정맥내 주사 후 수컷 시노몰구스 원숭이에서의 혈청 헵시딘 및 Fe 농도를 제시한다. 3종의 상이한 원숭이로부터의 데이터를 평균과 함께 제시한다.
본 발명은 BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편, 및 제약 조성물, 제조 방법, 및 이러한 항체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다.
BMP6 항체 및 그의 항원-결합 단편
본 발명은 인간 BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
BMP6, 분비된 BMP 패밀리 성장 인자 리간드는 철 대사 호르몬 헵시딘의 간 발현의 결정적 내인성 조절제로서 확인된 바 있다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본 개시내용은 헵시딘-저하 요법으로서 BMP6 길항제 항체가, 기저 질환의 이환율을 실질적으로 더하고 종종 유해 결과의 예측인자인 적혈구생성 자극제 (ESA)에 대한 저항성을 극복함으로써 철-제한 빈혈을 갖는 환자에게 이익이 될 것으로 예상된다는 것을 시사한다.
이러한 항-인간 BMP6 항체의 예는 항체 3, 5, 6 및 7이며, 그의 서열은 표 1에 열거된다.
항체 5, 6 및 7은 모두 인간 BMP6에 대해 높은 친화도로, 인간 BMP7, 인간 BMP5 및 인간 BMP2보다 높은 선택성으로 결합한다 (도 1a 참조). 이들 항체는 또한 모두 래트에서 혈청 헵시딘의 감소 및 혈청 철의 증가를 입증한다 (도 2 참조).
이러한 경로를 표적화하는 것이 기능적 종점의 개선을 부여할 수 있다는 추가의 증거를 제공하기 위해, 본 발명자들은 정상 마우스 및 래트에서 철 대사에 대한 혈청 바이오마커를 조정하고 염증에 의한 빈혈의 마우스 모델에서 ESA-저항성 빈혈을 역전시키는 BMP6-특이적 항체, 항체 5 내지 7의 능력을 시험하였다. 본 발명자들은 동물의 BMP6 항체에 의한 단일 주사가 순환 헵시딘의 강력한 억제를 동반하면서, 혈청 철 수준의 지속적인 증가를 발생시킨다는 것을 발견하였다. 게다가, 염증-구동된 빈혈에 적용된 마우스의 치유적 치료는 공동 에리트로포이에틴 치료에 반응하여 적혈구생성 파라미터를 유의하게 개선시켰다.
본 개시내용에서, 염증에 의한 빈혈의 마우스 모델에서의 BMP6 신호전달의 억제는 철-의존성 적혈구 파라미터를 실질적으로 개선시켰다.
본원에 개시된 BMP6 길항제 항체는 에리트로포이에틴 저반응성 빈혈을 안전하게 개선시키기 위한 신규 치료 접근법을 나타낸다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본 개시내용은 이것이 적혈구성 구획으로부터의 요구에 대한 철 저장의 가동화 및 이용가능성을 통해 일어날 수 있다는 것을 시사한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 인간 BMP5 또는 인간 BMP7 단백질 중 임의의 것보다 인간 BMP6 단백질에 대해 100-, 500- 또는 1000-배 더 높은 친화도로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. BMP7에는 결합하지 않으면서 BMP6에 대한 특이성은, BMP6의 녹아웃이 마우스에게 치명적이지 않기 때문에 중요하다. 그러나, BMP7에 대한 녹아웃 마우스는 신장, 눈 및 골 결손으로 인해 출생 후 사망한다. 어느 하나의 유전자의 개별 녹아웃은 심장발생을 변경시키지 않지만, BMP6 및 BMP7의 이중 녹아웃은 여러 결손 및 심장에서의 지연을 입증하였고; 배아는 심기능부전으로 사멸되었다. BMP7은 섬유증과 연관된 만성 심장 질환의 진행을 방지하는데 중요하다. 따라서, BMP7과 항-BMP6 항체의 교차-반응성은 바람직하지 않다. 본원에 제공된 항체는 BMP7보다 BMP6에 대해 특이적이고; 예를 들어, 표 4A를 참조한다. 도 1b는 또한 인간 BMP2, BMP5 및 BMP7 단백질보다 인간 BMP6에 대한 결합 특이성의 증거를 제시한다. 대조적으로, 예를 들어 알앤디 시스템즈(R&D Systems)로부터 상업적으로-입수가능한 BMP6 항체는 리포터 유전자 검정에서 BMP7과 강한 교차-반응성을 갖고, BMP6 및 BMP7 둘 다를 억제하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 항체는 실시예 (하기 섹션 6 참조)에 기재된 바와 같이 단리된 인간 모노클로날 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
이러한 항-인간 BMP6 항체의 예는 항체 3, 5, 6 및 7이며, 그의 서열은 표 1에 열거된다.
성숙 항체 7은 모 IgG 히트 NOV0442 (VH3_3-15, Vl1_1e)로부터 유래된 NOV0442_VL(YGQ) 배선화/PTM 제거로부터 유래된다. 항체 7은 ELISA 결합 검정에서 인간 BMP6에 대해 높은 친화도로, 인간 BMP7보다 500-배 초과의 선택성 (즉, 인간 BMP6에 대해 인간 BMP7보다 500-배 더 큰 친화도)으로 결합한다. 이 항체는 또한 인간 BMP2 또는 BMP5에 대해 어떠한 검출가능한 활성도 갖지 않는다. 모 IgG NOV0442 및 항체 7에 의해 인식되는 BMP6 펩티드를 도 5에 제시한다. 펩티드는 인간 BMP6의 아미노산 QTLVHLMNPEYVPKP (서열식별번호: 92)를 포함한다. IgG NOV0442 및 항체 7과 대조적으로, 인간화 mAb507 (알앤디 시스템즈)은 인간 BMP6의 서열 VSSASDYNSSELK (서열식별번호: 95)에 결합한다. 따라서, IgG NOV0442 및 항체 7에 의해 인식되는 에피토프는 신규 BMP6 에피토프를 나타낸다. 항체 7은 또한 시험관내에서 수용체에 대한 BMP6 결합을 억제한다. BMP6의 BMPR1A에 대한 결합은 최대 59% 억제되고; BMPR1B에 대한 결합은 최대 85% 억제되고; RGM-c에 대한 결합은 최대 72% 억제된다. 래트에서 단일 10 mg/kg 처리는 순환 헵시딘의 지속적인 억제로 이어진다. 마우스에서 추정되는 최소 유효 용량은 0.1 mg/kg 이하이다. 혈청 철은 또한, 원숭이에서 3 mg/kg의 단일 항체 용량 후에 증가를 제시하였고, 헵시딘은 감소를 제시하였다. 브루셀라 아보르투스 항원을 빈혈을 모의하는데 사용한 마우스에서, 항체 7 (2 mg/kg)의 치료 효과는 만성 EPO 요법에 대한 임상적으로 유의한 적혈구생성 반응과 일치하였고, 기준선으로부터 > 2.0 g/dL의 점진적 헤모글로빈 증가가 존재하였다.
항체 7에서, 이후의 생성물 동질성을 증가시키기 위해 LCDR2 내에서의 N51Q 돌연변이에 의해 잠재적인 번역후 변형 부위를 제거하였다. VH3/람다1 프레임워크로부터 유래된 항체는 가장 가까운 인간 배선 서열과 매칭시키기 위해: VH에서 V40A 돌연변이에 의해, VL에서 D1Q, I2S 돌연변이, 및 2개의 잔기가 처음부터 누락되어 있는 프레임워크를 복구시키기 위해 아미노산 Y49 및 G50의 도입에 의해 조작하였다.
이러한 작업은 항체 7 (= NOV0958 = NOV0806_VH[V40A]_VL[D1Q, I2S, Y49, G50, N51Q])을 생성하였다.
항체 3, 5, 6 및 7은 모두 인간 BMP2, BMP5 또는 BMP7 단백질과 비교 시 인간 BMP6 단백질에 대한 높은 특이성을 제시한다. 모든 이들 항체의 에피토프는 그들이 모두 친화도 성숙 전에 단일 모 Fab로부터 유래되었기 때문에 동일한 것으로 예측된다. 항체 3은, 예를 들어, HCDR2의 친화도 성숙 전에 항체 5 및 7 둘 다와 동일한 Fab 클론을 공유한다. 항체 5는 하기로부터 유래된다: NOV0442 (VH3_3-15, VI1_1e) → NOV0442_VL(YGQ) → (HCDR2 친화도 성숙) → 항체 5. 항체 3은 하기로부터 유래된다: NOV0442 (VH3_3-15,VI1_1e) → NOV0442_VL(YGS) → (HCDR2 친화도 성숙) → 항체 3. 본원에 기재된 항체의 생성에 관하여 추가의 세부사항은 실시예에 제공된다.
본 발명은 BMP6 (예를 들어, 인간 BMP6 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 표 1에 열거된 VH 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 표 1에 열거된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함한다. 특히, 본 발명은 BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 표 1에 열거된 VH CDR 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 VH CDR을 포함한다 (또는 대안적으로, 이로 이루어진다).
본 발명은 또한 BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열)에서 약 10개 이하의 아미노산은 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 부가, 치환 또는 결실임). 본 발명은 또한 BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열)에서 10개 이하의 아미노산은 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 부가, 치환 또는 결실임).
본 발명은 또한 BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열)에서 약 20개 이하의 아미노산은 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 부가, 치환 또는 결실임). 본 발명은 또한 BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VH 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열)에서 20개 이하의 아미노산은 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 부가, 치환 또는 결실임).
본 발명은 또한 BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열)에서 약 10개 이하의 아미노산은 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 부가, 치환 또는 결실임). 본 발명은 또한 BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열)에서 10개 이하의 아미노산은 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 부가, 치환 또는 결실임).
본 발명은 또한 BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열)에서 약 20개 이하의 아미노산은 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 부가, 치환 또는 결실임). 본 발명은 또한 BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL 아미노산 서열을 포함하고 (또는 대안적으로, 이로 이루어지고), 여기서 프레임워크 서열 (예를 들어, CDR이 아닌 서열)에서 20개 이하의 아미노산은 돌연변이된다 (여기서 돌연변이는, 다양한 비제한적 예로서, 부가, 치환 또는 결실임).
본 발명은 BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함한다. 특히, 본 발명은 BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 VL CDR 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3개 또는 그 초과의 VL CDR을 포함한다 (또는 대안적으로, 이로 이루어진다).
본 발명의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 돌연변이되었지만 CDR 영역에서 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95 퍼센트 동일성을 여전히 갖는 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서, 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 비교하였을 때 CDR 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 BMP6 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편의 VH, VL, 전장 중쇄, 및 전장 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다 (예를 들어, 표 1은 항체 3, 5, 6 및 7의 중쇄 및 경쇄에 대한 예시적인 핵산 서열을 제시함).
표 1. 본 발명의 BMP6 항체의 예
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본 발명의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편은 아미노산 또는 아미노산을 코딩하는 핵산이 돌연변이되었지만 표 1에 기재된 서열과 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95 퍼센트 동일성을 여전히 갖는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 표 1에 기재된 서열에 도시된 가변 영역과 비교하였을 때 가변 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 한편 실질적으로 동일한 치료 활성을 보유하는 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고 각각 서열식별번호: 9, 10 및 11의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고 각각 서열식별번호: 12, 13 및 14의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 22, 23 및 24의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고 각각 서열식별번호: 29, 30 및 31의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 39, 40 및 41의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고 각 서열식별번호: 32, 33 및 34의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 42, 43 및 44의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고 각 서열식별번호: 49, 50 및 51의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 59, 60 및 61의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고 각 서열식별번호: 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고 각각 서열식별번호: 69, 70 및 71의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 79, 80 및 81의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 인간 BMP6에 결합하고 각각 서열식별번호: 72, 73 및 74의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 82, 83 및 84의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
각각의 이들 항체는 BMP6에 결합할 수 있기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄, 및 전장 중쇄 서열 (아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매칭"되어 본 발명의 다른 BMP6-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 BMP6-결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 결합 검정 (예를 들어, ELISA, 및 실시예 섹션에 기재된 다른 검정)을 사용하여 시험될 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH/VL 쌍형성으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍형성으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 VH/VL 쌍형성으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍형성으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표 1에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 BMP6-결합 항체 또는 그의 조합을 제공한다. CDR 영역은 카바트 시스템 (Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242)을 사용하거나, 코티아 시스템 [Chothia et al. 1987 J. Mol. Biol. 196: 901-917; 및 Al-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 927-948]을 사용하여 서술된다.
각각의 이들 항체가 BMP6에 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공된다는 것을 고려하면, 각각의 항체가 본 발명의 다른 BMP6-결합 분자를 생성하기 위해서는 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유해야 하기는 하지만, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있다 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있음). 이러한 "혼합 및 매칭"된 BMP6-결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 결합 검정 및 실시예에 기재된 것 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 시험될 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 1개 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 제시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 돌연변이시킴으로써 신규 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
따라서, 본 발명은 서열식별번호: 29, 49, 69, 12, 32, 52, 72 또는 9 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 10, 30, 50, 70, 13, 33, 53, 또는 73 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 11, 31, 51, 71, 14, 34, 54, 또는 74 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 19, 39, 59, 79, 22, 42, 62, 또는 82 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 20, 40, 60, 80, 23, 43, 63, 또는 83 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 21, 41, 61, 81, 24, 44, 64, 또는 84 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공하며, 여기서 항체는 BMP6에 특이적으로 결합한다.
한 실시양태에서, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체는 표 1에 기재된 항체이다.
본원에 사용된 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득된 경우에 특정한 배선 서열"의 생성물"이거나 또는 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화하거나 또는 파지 상에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 또는 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고 인간 항체의 서열에 서열면에서 가장 가까운 (즉, 최대 % 동일성인) 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 또는 "그로부터 유래된" 인간 항체는 배선 서열과 비교 시, 예를 들어 자연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적 도입으로 인한 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, VH 또는 VL 프레임워크 영역에서, 선택된 인간 항체는 전형적으로 아미노산 서열에서 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 뮤린 배선 서열)과 비교 시 인간 항체를 인간의 것으로 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 항체는 아미노산 서열에서 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 재조합 인간 항체는 VH 또는 VL 프레임워크 영역에서 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 디스플레이할 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 디스플레이할 수 있다.
BMP 패밀리 구성원 및 헵시딘
한 실시양태에서, 본 발명은 BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 결합 단편은 표 1에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 항체 또는 결합된 그의 단편은 BMP6에 특이적으로 결합하지만 다른 BMP 단백질 (예컨대 BMP2, BMP5 또는 BMP7)에는 그렇지 않다.
BMP6, 분비된 BMP 패밀리 성장 인자 리간드는 그의 성숙한 활성 형태에서 30 kDa 디술피드-연결된 동종이량체이다. 단백질은 TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원이다. 골 형태발생 단백질은 골 및 연골의 성장을 유도하는 그의 능력이 공지되어 있다. BMP6은 중간엽 줄기 세포에서 모든 골형성 마커를 유도할 수 있다.
골 형태발생 단백질 (BMP)은 이소성 골 성장을 유도할 수 있는 분비된 신호전달 분자의 패밀리이다. BMP는 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타) 슈퍼패밀리의 일부이다. BMP는 원래 탈염된 골 추출물이 생체내 골격외 부위에서 연골내 골형성을 유도하는 능력에 의해 확인되었다. 배아발생에서 초기의 그의 발현에 기초하여, 이러한 유전자에 의해 코딩된 BMP는 초기 발생에서 제안된 역할을 갖는다. 게다가 이러한 BMP가 BMP5 및 BMP7과 밀접하게 관련되어 있다는 사실은 가능한 골 유도 활성의 추측으로 이어졌다. BMP6의 추가의 기능은 문헌 [Nature Genetics April; 41 [4]:386-8]에 기재된 바와 같이 확인된 바 있다.
BMP6이 녹아웃된 마우스는 생존가능하고 생식력이 있고, 정상 골 및 연골 발생을 제시한다.
BMP6은 간에 의해 분비되는 작은 펩티드인, 헵시딘의 핵심 조절제이며, 이는 포유동물에서 철 대사의 주요 조절제이다. 헵시딘은 십이지장에서 흡수되는 식이 철 및 세망내피 세포에 의해 방출되는 철 둘 다의 양을 제어한다. 헵시딘은 염증 및 철 과부하를 포함한 다양한 자극에 의해 상향조절되고, 빈혈, 저산소증 및 철 결핍에 의해 하향조절된다.
어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본 개시내용은 헵시딘-저하 요법으로서 BMP6 길항제 항체가, 기저 질환의 이환율을 실질적으로 더하고 종종 유해 결과의 예측인자인 적혈구생성 자극제 (ESA)에 대한 저항성을 극복함으로써 철-제한 빈혈을 갖는 환자에게 이익이 될 것으로 예상된다는 것을 시사한다. BMPR1 및 BMPR2 수용체와의 상호작용을 통해, 이는 수용체 이량체화 및 헵시딘의 전사를 유도한다. BMP6은 또한 간 및 근육 세포에서 HJV 보조-수용체에 결합한다.
따라서, BMP6은 헵시딘의 발현을 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 헵시딘은 철 항상성에 수반되는 핵심 호르몬인 것으로 공지되어 있다. 높은 헵시딘 수준은 ACD에서 철 제한된 적혈구생성과 연관된다.
WO 2010/056981은 BMP6에 대한 항체를 마우스에 투여하는 것은 헵시딘을 감소시키고 철을 증가시킨다는 것을 개시하였다.
BMP6은 관련 기술분야, 예를 들어 문헌 [Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759-62; Sauermann et al. 1993 J. Neurosci. Res. 33: 142; Celeste et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843; Schluesener et al. 1995 Atherosclerosis 113: 153; Gitelman et al. 1994 J. Cell Biol. 126: 1595; Barnes et al. 1997 W. J. Urol. 13: 337; 및 Hamdy et al. 1997 Cancer Res. 57: 4427]에 추가로 기재되어 있다.
다른 골 형태발생 단백질과 같이, BMP2는 골 및 연골의 발생에서 중요한 역할을 한다. 이는 헷지호그 경로, TGF-베타 신호전달 경로, 및 시토카인-시토카인 수용체 상호작용에 수반된다. 이는 또한 심장 세포 분화 및 상피의 중간엽 전이에 수반된다. BMP2는 문헌 [Kishimoto et al. 1997 Dev. 124: 4457; Ma et al. 2005 Dev. 132: 5601; Wang et al. Bone 48: 524; 및 Rosen 2009 Cyt. Growth Fact. Rev. 20: 475]에 제시된 바와 같은 많은 필수적 역할을 갖는다. 따라서 BMP6 항체는 BMP2에 결합하지 않는 것이 바람직하다.
BMP2는 특히 문헌 [Sampath et al. 1990 J. Biol. Chem. 265: 13198; Chen et al. 2004 Growth Factors 22: 233; Marie et al. 2002 Histol. Histopath. 17: 877; Nickel et al. 2001 J. Bone Joint Surg. 83-A Supp. 1: S7-14; Kirsch et al. 2000 FEBS Lett. 468: 215; Kirsch et al. 2000 EMBO J. 19: 3314; Gilboa et al. 2000 Mol. Biol. Cell 11: 1023]에 추가로 기재되어 있다.
BMP5는 또한 TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원이다. 다른 BMP와 같이, 이는 골 및 연골 발생을 유도하는 그의 능력이 공지되어 있다. BMP5는 섬유주 및 시신경 유두에서 발현되고, 발생 및 정상 기능에서 역할을 가질 수 있다. 이는 또한 폐 및 간에서 발현된다.
BMP5에 대한 추가의 정보는 관련 기술분야, 예를 들어 문헌 [Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759; Beck et al. 2003 BMC Neurosci. 2: 12; Celeste et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843; 및 Sakaue et al. 1996 Biochem. Biophys. Res. Comm. 221: 768]에 공지되어 있다.
BMP7은 또한 TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원이다. 단백질의 BMP 패밀리의 다른 구성원과 같이, 이는 중간엽 세포의 골 및 연골로의 변환에서 핵심 역할을 한다. 이는 SMAD1 및 SMAD5의 인산화를 유도하고, 이는 결과적으로 수많은 골형성 유전자의 전사를 유도한다.
상기 제시된 바와 같이, BMP6이 녹아웃된 마우스는 생존가능하고 생식력이 있고, 정상 골 및 연골 발생을 제시한다. 그러나, BMP7에 대한 녹아웃 마우스는 신장, 눈 및 골 결손으로 인해 출생 후 사망한다. 어느 하나의 유전자의 개별 녹아웃은 심장발생을 변경시키지 않지만, BMP6 및 BMP7의 이중 녹아웃은 여러 결손 및 심장에서의 지연을 입증하였고; 배아는 심기능부전으로 사멸되었다. BMP7은 섬유증과 연관된 만성 심장 질환의 진행을 방지하는데 중요하다. 따라서, BMP7과 항-BMP6 항체의 교차-반응성은 바람직하지 않다.
BMP7과 관련된 추가의 정보는 관련 기술분야, 예를 들어, 문헌 [Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759; Chen et al. 2004 Growth Factors 22: 233; Itoh et al. 2001 EMBO J. 20: 4132; Zeisberg et al. 2003 Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285: F1060; Kallui et al. 2009 J. Clin. Invest. 119: 1420; 및 Wang et al. 2001 J. Am. Soc. Neph. 12: 2392]에 제공되어 있다.
헵시딘은 또한 HAMP (헵시딘 항미생물 단백질 또는 펩티드)로 공지된 펩티드 호르몬이다.
마우스 진화에서 최근 유전자 중복 이벤트는 마우스에서의 2종의 유사한 헵시딘 유전자, 헵시딘1 및 헵시딘2의 존재로 이어졌다. 문헌 [Ilyin et al. 2003 FEBS Lett. 542: 22-26]. 마우스 헵시딘2는 포유동물 헵시딘에서 발견되는 여러 보존된 잔기가 결여되어 있다. 문헌 [Lou et al. 2004 Blood 103: 2816-2821].
헵시딘 유전자 산물은 철 항상성의 유지에 수반되고, 이는 대식세포에서의 철 저장의 조절, 및 장의 철 흡수를 위해 필요하다. 이들 펩티드는 항미생물 활성을 나타낸다.
전전구단백질 (또는 전전구호르몬 또는 전전구헵시딘) (84 aa) 및 전구단백질 (또는 전구호르몬 또는 전구헵시딘) (60 aa)은 20, 22 및 25개 아미노산의 성숙 펩티드로 프로세싱된다. 25-aa 펩티드는 주로 간에 의해 분비되고, 철 대사의 "마스터 조절제"로 간주된다. 20- 및 22-aa 대사물은 소변에 존재한다. 헵시딘의 N-말단 영역은 기능에 필요하고; 5개의 N-말단 아미노산의 결실은 기능의 상실을 발생시킨다.
활성 헵시딘 펩티드는 시스테인이 풍부하며, 이는 그의 베타 시트 구조를 안정화하는 분자내 결합을 형성한다.
헵시딘은 주로 간에서 합성되고, 보다 적은 양이 다른 조직에서 합성되는 것으로 발견되었다. 문헌 [Bekri et al. 2006 Gastroent. 131: 788-96].
25-aa 헵시딘 펩티드는 주로 간에 의해 분비되고, 철 대사의 "마스터 조절제"로 간주된다. 헵시딘은 장의 장세포의 기저측 표면 및 세망내피 세포 (대식세포)의 형질 막 상에 위치하는 철 유출 채널 페로포르틴에 결합함으로써 철 수송을 억제한다. 페로포르틴을 억제함으로써, 헵시딘은 장의 장세포가 간 문맥계로 철을 분비하는 것을 방지하고, 이에 의해 철 흡수가 기능적으로 감소된다. 대식세포로부터의 철 방출은 또한 페로포르틴 억제에 의해 방지되고; 따라서, 헵시딘은 철 항상성을 유지한다. 헵시딘 활성은 또한 부분적으로 만성 염증 예컨대 염증성 장 질환, 만성 심부전, 암종, 류마티스 관절염 및 신부전에 의한 빈혈에서 관찰되는 철 격리를 담당한다.
헵시딘 유전자에서의 돌연변이는, 심근병증, 간경변증, 및 내분비 부전을 발생시키는 중증 철 과부하에 의해 유발되는 질환인, 소아 혈색소증으로도 공지된, 혈색소증 유형 2B를 유발한다. 소아 혈색소증 경우의 대부분은 헵시딘 생산의 조절제인 헤모쥬벨린에서의 돌연변이로 인한 것이다.
헵시딘을 과다발현하도록 조작된 유전자 변형된 마우스는 중증 철 결핍으로 인해 출생 직후 사망하며, 이는 철 조절에서의 과도하지는 않지만 중심적인 역할을 시사한다. 헵시딘을 염증에 의한 빈혈과 연결시킨 제1 증거는 연구원이 철 보충제에 반응하지 않는 중증 소구성 빈혈을 갖는 2명의 간 종양 환자로부터의 조직을 검사했을 때 도출되었다. 종양 조직은 헵시딘을 과다생산하였고, 외과적으로 종양을 제거하는 것은 빈혈을 치유하였다.
적절하게 철을 흡수하는 것에 대한 실패가 철 결핍 및 철 결핍성 빈혈에 기여하는 많은 질환이 존재한다. 헵시딘이 경장 흡수를 차단하고 있는 경우에 경구 치료는 비효과적일 수 있으므로, 치료는 헵시딘 수준에 의존할 것이다.
한 실시양태에서, BMP6에 대한 항체 또는 그의 결합 단편의 투여는 헵시딘의 활성 및/또는 수준을 감소시키고, 따라서 빈혈을 치료하는데 유용하다. 한 실시양태에서, 본 발명은 헵시딘의 활성 또는 수준을 감소시키는 것을 필요로 하는 환자에게 BMP6에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 헵시딘의 활성 또는 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 헵시딘의 활성 또는 수준은 적어도 50% 감소된다.
헵시딘에 대한 억제제, 예컨대 BMP6 항체는 헵시딘-관련 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 이는 헵시딘 및/또는 돌연변이 및/또는 야생형 및/또는 돌연변이체 헵시딘의 과다발현과 연관된 임의의 질환, 및/또는 헵시딘 및/또는 돌연변이 및/또는 야생형 및/또는 돌연변이체 헵시딘의 과다발현의 존재 및/또는 소변을 통한 헵시딘의 감소된 신장 제거에 의해 질환 진행이 증진되거나 예후가 악화되는 질환을 포함한다. 헵시딘-관련 질환의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 빈혈, 철-결핍 적혈구생성, 저철혈증, 식이 철 흡수 장애, 철 격리, 염증에 의한 빈혈 (AI), 아테롬성동맥경화증, 당뇨병, 및 다중 신경변성 장애 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 프리드리히 운동실조, 심부전, 만성 신장 질환, 심신성-빈혈 증후군, 감염, 혈액 손실, 용혈, 비타민 B12 또는 폴레이트 결핍, 부갑상선기능항진증, 혈색소병증 및 악성종양, 암, AIDS, 수술, 성장 부진, 및/또는 탈모. 한 실시양태에서, 대상체는 투석 환자이다. 한 실시양태에서, 헵시딘-관련 질환은 빈혈이고 대상체는 투석 환자이다. 철 및 ESA-불응성 빈혈의 유병률은 만성 혈액투석 집단에서 높다.
빈혈은, 특히, 만성 질환에 의한 빈혈 (ACD), 만성 신장 질환에 의한 빈혈 (CKD), 암에 의한 빈혈, 적혈구생성 자극제 (ESA) 저항성 빈혈 및/또는 철-제한 빈혈을 포함한다.
CKD의 빈혈은 만성 신장 질환의 통상적인 초기 합병증이다. 암에 의한 빈혈은 혈액 악성종양 및 일부 고형 종양에 의해 유발된다. 본원에 정의된 바와 같이, 이러한 용어는 또한 화학요법제에 의해 유발된 빈혈인 화학요법-유도된 빈혈을 포함한다. 만성 신장 질환에서의 빈혈은 당뇨병성 신경병증, 심혈관 질환, 망막병증 및 다른 문제를 악화시킬 수 있다. 암-관련 빈혈은 증가된 사망의 위험과 연관된다.
일부 만성 질환 예컨대 암, 신장 질환 및 자가면역 장애는 빈혈로 이어질 수 있다. 과다활성 염증성 시토카인은 철 항상성의 조절이상, 적혈구생성의 감소, 및 적혈구의 수명의 감소를 유발할 수 있다. 빈혈을 위한 일부 치료는 ESA, 에리트로포이에틴, 철 (식이성 보충제로서)의 투여 또는 수혈을 포함한다.
헵시딘은 철 항상성에 수반되는 핵심 호르몬이다. 높은 수준의 헵시딘은 ACD에서의 철 제한된 적혈구생성과 연관된다. BMP6은 헵시딘의 발현을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.
BMP6에 대한 다양한 유형의 항체 및 그의 항원-결합 단편이 하기 기재된다.
상동 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 표 1에 기재된 서열에 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체는 BMP6에 결합하고, 표 1에 기재된 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 (또는 그의 기능적 항원-결합 단편)를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 16; 36; 56 또는 76으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 26; 46; 66 또는 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 항체는 BMP6 단백질에 특이적으로 결합하고, 항체는 용혈 검정에서 적혈구 용해를 억제할 수 있으며, 여기서 용혈 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 구체적 예에서, 이러한 항체는 100 pM 인간 BMP6으로 재구성된 인간 BMP6-고갈 혈청을 사용한 경우에 용혈 검정에서 20-200 pM의 IC50 값을 갖는다.
한 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 표 1에 제시된 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 한 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고 동일할 수 있다. 표 1에 기재된 것의 VH 및 VL 영역과 높은 (즉, 80% 이상) 동일성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는, 각각 서열식별번호: 16; 36; 56; 또는 76; 및 26; 46; 66; 또는 86을 코딩하는 핵산 분자를 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)하고 이어서 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 코딩된 변경된 항체를 보유 기능에 대해 시험함으로써 수득할 수 있다.
한 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 아미노산 서열은 표 1에 제시된 서열과 50% 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 각각 서열식별번호: 18; 38; 58; 또는 78 중 임의의 것의 전장 중쇄 및 서열식별번호: 28; 48; 68 또는 88 중 임의의 것의 전장 경쇄와 높은 (즉, 80% 이상) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는, 각각 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)하고 이어서 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 코딩된 변경된 항체를 보유 기능에 대해 시험함으로써 수득할 수 있다.
한 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시된 서열과 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
한 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 영역은 표 1에 제시된 서열과 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성은 동일한 위치의 수/위치의 총 수 X 100과 같음). 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은, 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공중 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다.
보존적 변형을 갖는 항체
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지며, 여기서 이들 CDR 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체에 기초하여 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 갖고, 여기서 항체는 본 발명의 BMP6-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1은 서열식별번호: 29, 49, 69, 12, 32, 52, 72, 또는 9 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 중쇄 가변 영역 CDR2는 서열식별번호: 10, 30, 50, 70, 13, 33, 53, 또는 73 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 중쇄 가변 영역 CDR3은 서열식별번호: 11, 31, 51, 71, 14, 34, 54, 또는 74 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1은 서열식별번호: 19, 39, 59, 79, 22, 42, 62, 또는 82 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR2는 서열식별번호: 20, 40, 60, 80, 23, 43, 63, 또는 83 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 및 경쇄 가변 영역 CDR3 은 서열식별번호: 21, 41, 61, 81, 24, 44, 64, 또는 84 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변이체를 포함하고; 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 BMP6에 특이적으로 결합하고, 및 용혈 검정에서 적혈구 용해를 억제한다.
한 실시양태에서, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 본 발명의 항체는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 가지며, 여기서 이들 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체에 기초하여 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 갖고, 여기서 항체는 본 발명의 BMP6-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄로 이루어진 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 단리된 모노클로날 항체를 제공하며 여기서: 전장 중쇄는 서열식별번호: 18; 38; 58 또는 78의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형을 갖고; 전장 경쇄는 서열식별번호: 28; 48; 68 또는 88의 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형을 갖고; 항체는BMP6에 특이적으로 결합하고; 항체는 본원에 기재된 바와 같은 용혈 검정에서 적혈구 용해를 억제한다. 구체적 실시양태에서, 이러한 항체는 100 pM 인간 BMP6으로 재구성된 인간 BMP6-고갈 혈청을 사용한 경우에 용혈 검정에서 20-200 pM의 IC50 값을 갖는다.
동일한 에피토프에 결합하는 항체
본 발명은 표 1에 열거된 BMP6-결합 항체와 같이 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 항체 7에 의해 결합된 에피토프를 도 5에 제시한다. 추가의 항체는 따라서 BMP6 결합 검정에서 본 발명의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편과 교차-경쟁하는 (예를 들어, 통계학적으로 유의한 방식으로 그의 결합을 경쟁적으로 억제하는) 그의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. BMP6 단백질에 대한 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 BMP6에의 결합에 대해 그러한 항체와 경쟁할 수 있다는 것을 입증하고; 이러한 항체는, 비제한적 이론에 따르면, 그것이 경쟁하는 항체와 BMP6 상의 동일하거나 관련된 (예를 들어, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편과 BMP6 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조 및 단리될 수 있다.
일단 항원 상의 목적하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어 본 발명에 기재된 기술을 사용하여 그러한 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것이 가능하다. 대안적으로, 발견 프로세스 동안 항체의 생성 및 특징화는 바람직한 에피토프에 관한 정보를 규명할 수 있다. 이러한 정보로부터, 이어서 동일한 에피토프에의 결합에 대해 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 이를 달성하기 위한 접근법은 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 예를 들어 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 발견하기 위한 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다. 교차-경쟁을 기초로 하여 항체를 "비닝"하기 위한 고처리량 프로세스가 국제 특허 출원 번호 WO 2003/48731에 기재되어 있다. 통상의 기술자가 인식할 바와 같이, 실제로 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 것이 에피토프일 수 있다. 에피토프는 항체가 결합하는 잔기를 포함할 수 있다.
일반적으로, 특정한 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
에피토프를 포함하는 주어진 폴리펩티드의 영역은 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는, 예를 들어 단백질 분자의 부분에 상응하는 펩티드인 다수의 펩티드를 고체 지지체 상에서 공동 합성하고, 펩티드가 지지체 상에 계속 부착되어 있는 동안 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,708,871; 문헌 [Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715]에 기재되어 있다. 유사하게, 입체형태적 에피토프는, 예를 들어 수소/중수소 교환, X선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명에 의해서와 같이 아미노산 BMP6의 공간 입체형태를 결정함으로써 용이하게 확인된다. 예를 들어, [Epitope Mapping Protocols, 상기 문헌]을 참조한다. 또한, 단백질의 항원 영역은 표준 항원성 및 소수친수성 플롯, 예컨대 예를 들어 옥스포드 몰레큘라 그룹(Oxford Molecular Group)으로부터 입수가능한 오미가(Omiga) 버전 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 것을 사용하여 확인될 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일 결정을 위해 호프/우즈 방법, 문헌 [Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828]; 및 소수친수성 플롯을 위해 카이트-두리틀 기술, 문헌 [Kyte et al., (1982) J.MoI. Biol. 157:105-132]을 사용한다.
조작 및 변형된 항체
본 발명의 항체는 추가로, 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 본원에 제시된 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있고, 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역 내 및/또는 1개 이상의 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 유형은 CDR 그라프팅이다. 항체는 우세하게 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 개별 항체 사이에서 CDR 외부의 서열보다 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 특정 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방한 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공중 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷상 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능함), 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서 찾아볼 수 있고; 이들 각각의 내용은 명확하게 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체 및 그의 항원-결합 단편에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스 서열 및/또는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 프레임워크 서열이 유래된 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 배선 서열과 비교 시 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형은, "친화도 성숙"으로 공지된, VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 1개 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선시키는 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 다른 관심 기능적 특성은 본원에 기재되고 실시예에 제공되는 것과 같은 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 또한, 전형적으로 CDR 영역 내에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
대안적 프레임워크 또는 스캐폴드로의 항원-결합 도메인 그라프팅
생성된 폴리펩티드가 BMP6에 특이적으로 결합하는 적어도 1개의 결합 영역을 포함하는 한, 매우 다양한 항체/이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 이뮤노글로불린의 5종의 주요 이디오타입 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하고, 바람직하게는 인간화 측면을 갖는 다른 동물 종의 이뮤노글로불린을 포함한다. 이와 관련하여, 낙타류에서 확인되는 것과 같은 단일 중쇄 항체가 특히 관심대상이다. 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 계속해서 발견되고 개발되고 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 그라프팅될 수 있는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-이뮤노글로불린 기반 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 표적 BMP6 단백질에 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 공지된 또는 향후의 비-이뮤노글로불린 프레임워크 및 스캐폴드가 사용될 수 있다. 공지된 비-이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 피브로넥틴 (컴파운드 테라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 매사추세츠주 월섬), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd.), 매사추세츠주 캠브리지, 및 아블링스 엔브이(Ablynx nv), 벨기에 츠뷔나아르드), 리포칼린 (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이징), 소형 모듈 면역제약 (트루비온 파마슈티칼스 인크.(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 워싱턴주 시애틀), 맥시바디 (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰), 단백질 A (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴) 및 아필린 (감마-결정질 또는 유비퀴틴) (실 프로테인스 게엠베하(SciI Proteins GmbH), 독일 할레)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
피브로넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 유형 III의 제10 모듈 (10 Fn3 도메인))을 기반으로 한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 그 자체가 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 베타 가닥을 서로 연결하고 용매 노출되는 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각 가장자리에 적어도 3개의 이러한 루프가 존재하며, 여기서 가장자리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (미국 특허 번호 6,818,418 참조). 이들 피브로넥틴-기반 스캐폴드는 이뮤노글로불린이 아니지만, 전반적인 폴드는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄의 가변 영역인 최소의 기능적 항체 단편의 것과 밀접하게 관련된다. 이러한 구조로 인해, 비-이뮤노글로불린 항체는 속성 및 친화도가 항체의 것과 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이들 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙 프로세스와 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링 전략에 사용될 수 있다. 이들 피브로넥틴-기반 분자는 표준 클로닝 기술을 사용하여 분자의 루프 영역이 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
안키린 기술은 상이한 표적에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 보유하도록 안키린 유래의 반복 모듈을 갖는 단백질을 스캐폴드로서 사용하는 것을 기반으로 한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행 알파-헬릭스 및 베타-턴으로 이루어진 33개 아미노산 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.
아비머는 천연 A-도메인 함유 단백질 예컨대 LRP-1로부터 유래된다. 이들 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용을 위해 사용되고, 인간에서 250종 초과의 단백질이 구조적으로 A-도메인을 기반으로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 다수의 상이한 "A-도메인" 단량체 (2-10개)로 이루어진다. 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 기재된 방법론을 사용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머를 생성할 수 있다.
아피바디 친화성 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 1개의 스캐폴드를 기반으로 하는 3-헬릭스 다발로 구성된 소형의 단순 단백질이다. 단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 이러한 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 이루어지며, 이 중 13개는 무작위화되어 다수의 리간드 변이체를 갖는 아피바디 라이브러리를 생성한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,831,012 참조). 아피바디 분자는 항체를 모방하고, 이는 150 kDa인 항체의 분자량과 비교하여 6 kDa의 분자량을 갖는다. 그의 작은 크기에도 불구하고, 아피바디 분자의 결합 부위는 항체의 것과 유사하다.
안티칼린은 피에리스 프로테오랩 아게(Pieris ProteoLab AG) 회사에 의해 개발된 제품이다. 이는 화학적으로 감수성 또는 불용성 화합물의 생리학적 수송 또는 저장에 통상적으로 수반되는 소형의 강건한 단백질의 광범위한 그룹인 리포칼린으로부터 유래된 것이다. 여러 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에서 발생한다. 단백질 아키텍처는 초가변 루프가 경질 프레임워크의 상부에 존재하는 이뮤노글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 그의 재조합 단편과 대조적으로, 리포칼린은 160 내지 180개 아미노산 잔기를 갖는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성되어, 단일 이뮤노글로불린 도메인보다 단지 조금 더 크다. 결합 포켓을 구성하는 4개의 루프 세트는 현저한 구조적 가소성을 제시하고 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서, 상이한 형상의 규정된 표적 분자를 높은 친화도 및 특이성으로 인식하도록 하기 위해 결합 부위를 독점적 프로세스로 재형상화할 수 있다. 리포칼린 패밀리의 한 단백질인 피에리스 브라시카에(Pieris Brassicae)의 빌린-결합 단백질 (BBP)이, 4개 루프 세트를 돌연변이유발시킴으로써 안티칼린을 개발하는데 사용되어 왔다. 안티칼린을 기재한 특허 출원의 한 예는 PCT 공개 번호 WO 199916873이다.
아필린 분자는 단백질 및 소분자에 대한 특이적 친화도를 위해 설계된 소형의 비-이뮤노글로불린 단백질이다. 신규 아필린 분자는 각각 상이한 인간 유래의 스캐폴드 단백질을 기반으로 하는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선택될 수 있다. 아필린 분자는 이뮤노글로불린 단백질과 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. 현재, 2종의 아필린 스캐폴드가 사용되며, 이 중 하나는 감마 결정질의 인간 구조적 눈 수정체 단백질이고, 다른 것은 "유비퀴틴" 슈퍼패밀리 단백질이다. 인간 스캐폴드 둘 다는 매우 소형이고, 고온 안정성을 나타내고, pH 변화 및 변성제에 거의 내성이다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 결정질 유래 단백질의 예는 WO200104144에 기재되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO2004106368에 기재되어 있다.
단백질 에피토프 모방체 (PEM)는 단백질-단백질 상호작용에 수반되는 주요 2차 구조인, 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방한 중간-크기의 시클릭 펩티드-유사 분자 (MW 1-2 kDa)이다.
인간 BMP6-결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 항체를 조작된 인간 항체로 전환시키기 위해 인간공학 기술이 사용된다. 미국 특허 공개 번호 20050008625는 동일한 결합 특징을 유지하거나 또는 비인간 항체의 것에 비해 우수한 결합 특징을 제공하면서 항체에서 비인간 항체 가변 영역을 인간 가변 영역으로 대체하는 생체내 방법을 기재한다. 상기 방법은 비인간 참조 항체의 가변 영역을 완전 인간 항체로 에피토프 유도 대체하는 것에 의존한다. 생성되는 인간 항체는 일반적으로 참조 비인간 항체와 구조적으로 비관련되지만, 참조 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 간략하게, 일련의 에피토프-유도된 상보성 대체 접근법은, 제한된 양의 항원에의 결합에 대한 "경쟁자"와 참조 항체의 다양한 하이브리드의 라이브러리 ("시험 항체") 사이의 세포내 경쟁을 항원에 대한 시험 항체의 결합에 반응하는 리포터 시스템의 존재 하에서 설정함으로써 가능하게 된다. 경쟁자는 참조 항체 또는 그의 유도체, 예컨대 단일 쇄 Fv 단편일 수 있다. 경쟁자는 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항원의 천연 또는 인공 리간드일 수 있다. 경쟁자의 유일한 요건은 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하고, 항원 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 것이다. 시험 항체는 비인간 참조 항체로부터의 공통적인 1개의 항원-결합 V-영역, 및 다양한 공급원, 예컨대 인간 항체의 레퍼토리 라이브러리로부터 무작위로 선택된 다른 V-영역을 갖는다. 참조 항체로부터의 공통 V-영역은 유도자로서의 역할을 하여, 시험 항체를 항원 상의 동일한 에피토프에 동일한 배향으로 위치시켜, 선택이 참조 항체에 대해 가장 높은 항원-결합 충실도 쪽으로 편향되도록 한다.
많은 유형의 리포터 시스템이 시험 항체와 항원 사이의 목적하는 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 항원에 결합할 때에만 단편 상보성에 의한 리포터 활성화가 일어나도록 상보성 리포터 단편을 항원 및 시험 항체 각각에 연결할 수 있다. 시험 항체- 및 항원-리포터 단편 융합체가 경쟁자와 공동-발현되는 경우에, 리포터 활성화는 경쟁자와 경쟁하는 시험 항체의 능력에 의존하게 되고, 이는 항원에 대한 시험 항체의 친화도에 비례한다. 사용될 수 있는 다른 리포터 시스템은 미국 특허 출원 일련 번호 10/208,730 (공개 번호 20030198971)에 개시된 바와 같은 자기-억제 리포터 재활성화 시스템 (RAIR)의 재활성화제, 또는 미국 특허 출원 일련번호 10/076,845 (공개 번호 20030157579)에 개시된 경쟁적 활성화 시스템을 포함한다.
일련의 에피토프-유도된 상보성 대체 시스템에 의해, 경쟁자, 항원 및 리포터 성분과 함께 단일 시험 항체를 발현하는 세포를 확인하는 선택을 수행한다. 이들 세포에서, 각각의 시험 항체는 제한된 양의 항원에의 결합에 대해 경쟁자와 일-대-일로 경쟁한다. 리포터의 활성은 시험 항체에 결합된 항원의 양에 비례하고, 이는 결과적으로 항원에 대한 시험 항체의 친화도 및 시험 항체의 안정성에 비례한다. 시험 항체는 처음에는 시험 항체로 발현될 때 참조 항체의 것에 비해 그의 활성에 기초하여 선택된다. 제1 라운드의 선택의 결과는 "하이브리드" 항체의 세트이고, 이들은 각각 참조 항체로부터의 동일한 비-인간 V-영역 및 라이브러리로부터의 인간 V-영역으로 구성되고, 이들은 각각 참조 항체와 동일한 항원 상의 에피토프에 결합한다. 제1 라운드에서 선택된 하이브리드 항체 중 1종 이상은 참조 항체의 것과 대등하거나 또는 그보다 높은 항원에 대한 친화도를 가질 것이다.
제2 V-영역 대체 단계에서, 제1 단계에서 선택된 인간 V-영역이 나머지 비-인간 참조 항체 V-영역을 동족 인간 V-영역의 다양한 라이브러리로 인간 대체하기 위한 선택의 가이드로서 사용된다. 제1 라운드에서 선택된 하이브리드 항체는 또한 제2 라운드의 선택을 위한 경쟁자로서 사용될 수 있다. 제2 라운드의 선택의 결과는 참조 항체와 구조적으로 상이하지만, 동일한 항원에의 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 완전 인간 항체의 세트이다. 선택된 인간 항체 중 일부는 참조 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 이들 선택된 인간 항체 중에서, 1종 이상은 참조 항체의 것과 대등하거나 또는 그보다 높은 친화도로 동일한 에피토프에 결합한다.
상기 기재된 마우스 또는 키메라 BMP6-결합 항체 중 1종을 참조 항체로서 사용함으로써, 이러한 방법은 동일한 결합 특이성 및 동일하거나 더 우수한 결합 친화도로 인간 BMP6에 결합하는 인간 항체를 생성하는데 용이하게 사용될 수 있다. 또한, 이러한 인간 BMP6-결합 항체는 또한 인간 항체를 통상적으로 생산하는 회사, 예를 들어 칼로바이오스, 인크.(KaloBios, Inc.) (캘리포니아주 마운틴 뷰)로부터 상업적으로 수득될 수 있다.
낙타류 항체
신세계 구성원, 예컨대 라마 종 (라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 포함한 낙타 및 단봉낙타 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius)) 패밀리의 구성원으로부터 수득된 항체 단백질을 인간 대상체에 대해 크기, 구조적 복합성 및 항원성에 대해 특성화하였다. 자연에서 발견되는 바와 같은 이러한 패밀리의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체에는 경쇄가 결여되어 있고, 따라서 다른 동물로부터의 항체의 경우에 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4차 구조와 구조적으로 구분된다. PCT/EP93/02214 (1994년 3월 3일에 공개된 WO 94/04678)를 참조한다.
VHH로 확인된 소형 단일 가변 도메인인 낙타류 항체 영역은 "낙타류 나노바디"로 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 생성하는, 표적에 대해 높은 친화도를 갖는 소형 단백질을 생성하기 위한 유전자 조작에 의해 수득될 수 있다. 1998년 6월 2일에 등록된 미국 특허 번호 5,759,808을 참조하고; 또한 문헌 [Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; 및 Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타류 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는 예를 들어 아블링스 (벨기에 겐트)로부터 상업적으로 입수가능하다. 비-인간 기원의 다른 항체 및 그의 항원-결합 단편과 마찬가지로, 낙타류 항체의 아미노산 서열은 인간 서열과 보다 밀접하게 유사한 서열을 수득하기 위해 재조합적으로 변경될 수 있고, 즉 나노바디는 "인간화"될 수 있다. 따라서, 인간에 대한 낙타류 항체의 천연적으로 낮은 항원성을 추가로 감소시킬 수 있다.
낙타류 나노바디는 분자량이 인간 IgG 분자의 대략 1/10이고, 상기 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 갖는다. 작은 크기로 인한 한가지 중요성은 보다 큰 항체 단백질의 경우에는 기능적으로 보이지 않는 항원 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력으로, 즉 낙타류 나노바디는 전형적인 면역학적 기술을 사용하여 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기로 인한 또 다른 중요성은, 낙타류 나노바디는 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈새 내의 특이적 부위에 대한 결합의 결과로서 억제할 수 있고, 따라서 전형적인 항체의 기능보다 전형적인 저분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력을 제공할 수 있다는 것이다.
저분자량 및 조밀한 크기는 추가로, 낙타류 나노바디가 극도로 열안정성이고, 극한 pH 및 단백질분해적 소화에 대해 안정성이고, 낮은 항원성이도록 한다. 또 다른 중요성은 낙타류 나노바디가 순환계로부터 조직 내로 용이하게 이동하고, 심지어는 혈액-뇌 장벽을 횡단하며, 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 추가로, 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 약물 수송을 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일에 공개된 미국 특허 출원 20040161738을 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이들 특색은 큰 치료 잠재력을 나타낸다. 또한, 이들 분자는 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 내에서 완전하게 발현될 수 있고, 박테리오파지와의 융합 단백질로서 발현되며, 기능적이다.
따라서, 본 발명의 특색은 BMP6에 대해 높은 친화도를 갖는 낙타류 항체 또는 나노바디이다. 본원의 한 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 낙타류 동물에서 자연적으로 생산되고, 즉 다른 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 사용하여 BMP6 또는 그의 펩티드 단편으로 면역화시킨 후에 낙타류에 의해 생산된다. 대안적으로, BMP6-결합 낙타류 나노바디는 조작되며, 즉 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 BMP6을 사용하는 패닝 절차를 사용하여 적절하게 돌연변이시킨 낙타류 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지의 라이브러리로부터 선택함으로써 생산된다. 조작된 나노바디는 수용 대상체 내에서의 반감기가 45분 내지 2주가 되도록 유전자 조작함으로써 추가로 적합화될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214에 기재된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열에 그라프팅하는 것에 의해 수득된다.
이중특이적 분자 및 다가 항체
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 BMP6-결합 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특색으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 영역은 유도체화되거나 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결되어 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 유도체화되거나 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고; 이러한 다중특이적 분자도 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 포괄된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 1종 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결되어 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 또는 다른 것에 의함) 이중특이적 분자를 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 BMP6에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한 BMP6의 또 다른 에피토프이다.
추가적으로, 이중특이적 분자가 다중특이적인 본 발명의 경우에, 상기 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 더하여 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 적어도 1종의 항체 또는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 쇄 Fv를 포함한 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner et al.)에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편, 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있다.
디아바디는 VH 및 VL 도메인이 동일한 쇄 상에서 2개 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커에 의해 연결된, 단일 폴리펩티드 쇄로 발현된 2가, 이중특이적 분자이다. VH 및 VL 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성함으로써, 그에 의해 2개의 항원 결합 부위를 생성한다 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poijak et al., 1994 Structure 2:1121-1123] 참조). 디아바디는 동일한 세포 내에서 구조 VHA-VLB 및 VHB-VLA (VH-VL 배위), 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA (VL-VH 배위)의 2개의 폴리펩티드 쇄를 발현하는 것에 의해 생산될 수 있다. 이들 대부분은 박테리아 내에서 가용성 형태로 발현될 수 있다. 단일 쇄 디아바디 (scDb)는 대략 15개의 아미노산 잔기의 링커로 2개의 디아바디-형성 폴리펩티드 쇄를 연결하는 것에 의해 생산된다 (문헌 [Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36] 참조). scDb는 박테리아 내에서 가용성, 활성 단량체 형태로 발현될 수 있다 (문헌 [Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21] 참조). 디아바디는 Fc와 융합되어 "디-디아바디"를 생성할 수 있다 (문헌 [Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65] 참조).
본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이체를 개별적으로 생성한 다음 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교제가 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-5-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스 (2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83, 및 Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 접합제는 둘 다 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.) (일리노이주 록포드)에서 입수가능한 SATA 및 술포-SMCC이다.
결합 특이체가 항체인 경우에, 이는 2개 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합에 의해 접합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수의 술프히드릴 잔기, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 결합 특이체 둘 다가 동일한 벡터 내에 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 분자가 mAb X mAb, mAb X Fab, Fab X F (ab')2 또는 리간드 X Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자의 그의 특이적 표적에 대한 결합은, 예를 들어 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (REA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 확인될 수 있다. 각각의 이들 검정은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용하는 것에 의해 특정한 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 BMP6에 결합하는 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 적어도 2개의 동일하거나 상이한 항원-결합 부분을 포함하는 다가 화합물을 제공한다. 항원-결합 부분은 단백질 융합 또는 공유 또는 비 공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 연결 방법은 이중특이적 분자에 대해 기재된 바 있다. 4가 화합물은 예를 들어 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체 및 항원-결합 단편과 가교시켜 수득할 수 있다.
삼량체화 도메인은, 예를 들어 보레안(Borean) 특허 EP 1 012 280B1에 기재되어 있다. 오량체화 모듈은, 예를 들어 PCT/EP97/05897에 기재되어 있다.
연장된 반감기를 갖는 항체
본 발명은 연장된 생체내 반감기를 갖는, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
많은 인자가 단백질의 생체내 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 신장 여과, 간에서의 대사, 단백질분해 효소 (프로테아제)에 의한 분해 및 면역원성 반응 (예를 들어, 항체에 의한 단백질 중화, 및 대식세포 및 수지상 세포에 의한 흡수). 다양한 전략을 사용하여 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 반감기를 연장시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), reCODE PEG, 항체 스캐폴드, 폴리시알산 (PSA), 히드록시에틸 전분 (HES), 알부민-결합 리간드, 및 탄수화물 쉴드에 대한 화학적 연결에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 알부민, IgG, FcRn 및 트랜스페린에 결합하는 단백질에의 유전자 융합에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 나노바디, Fab, DARPin, 아비머, 아피바디 및 안티칼린에 결합하는 다른 결합 모이어티에 대한 (유전자적 또는 화학적) 커플링에 의해; rPEG, 알부민, 알부민의 도메인, 알부민-결합 단백질 및 Fc에의 유전자 융합에 의해; 또는 나노담체, 서방성 제제 또는 의료 장치에의 혼입에 의한다.
항체의 생체내 혈청 순환을 연장시키기 위해, 불활성 중합체 분자, 예컨대 고분자량 PEG를 다관능성 링커의 존재 또는 부재 하에 항체 또는 그의 단편에 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위-특이적 접합을 통해 또는 리신 잔기에 존재하는 엡실론-아미노 기를 통해 부착시킬 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해, 항체, 그의 항원-결합 단편을 전형적으로, 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. 한 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비-글리코실화 항체이다. 최소한의 생물학적 활성의 손실을 일으키는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 것이다. 항체에 대한 PEG 분자의 적절한 접합을 보장하기 위해 접합 정도를 SDS-PAGE 및 질량 분광측정법에 의해 면밀히 모니터링할 수 있다. 미반응 PEG는 크기-배제 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화된 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 본원에 기재된 면역검정에 의해 결합 활성 뿐만 아니라 생체내 효능에 대해 시험될 수 있다. 단백질을 PEG화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.
다른 변형된 PEG화 기술은, tRNA 신테타제 및 tRNA를 포함하는 재구성된 시스템을 통해 화학적으로 명시된 측쇄를 생합성 단백질에 혼입시키는, 화학적으로 직교 지시된 조작 기술의 재구성 (ReCODE PEG)을 포함한다. 이러한 기술은 이. 콜라이, 효모 및 포유동물 세포에서 30개 초과의 새로운 아미노산을 생합성 단백질 내로 혼입시킬 수 있게 한다. tRNA는 앰버 코돈이 위치한 임의의 위치에 규범적 아미노산을 혼입시켜, 앰버가 정지 코돈으로부터 화학적으로 명시된 아미노산의 혼입을 신호하는 것으로 전환되게 한다.
또한, 재조합 PEG화 기술 (rPEG)이 혈청 반감기 연장을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술은 300-600개 아미노산의 비구조화 단백질 꼬리를 기존의 제약 단백질에 유전자 융합시키는 것을 수반한다. 이러한 비구조화 단백질 쇄의 겉보기 분자량은 그의 실제 분자량보다 약 15-배 더 크기 때문에, 상기 단백질의 혈청 반감기는 매우 증가된다. 화학적 접합 및 재정제를 필요로 하는 전통적인 PEG화와 대조적으로, 상기 제조 방법은 매우 단순화되고 생성물은 균질하다.
폴리시알화는 활동 수명을 연장시키고 치료 펩티드 및 단백질의 안정성을 개선시키기 위해 천연 중합체 폴리시알산 (PSA)을 사용하는 또 다른 기술이다. PSA는 시알산의 중합체 (당)이다. 단백질 및 치료 펩티드 약물 전달을 위해 사용되는 경우에, 폴리시알산은 접합체에 보호 미세환경을 제공한다. 이는 순환 중인 치료 단백질의 활동 수명을 증가시키고, 면역계에 의해 인식되는 것을 예방한다. PSA 중합체는 인간 신체에서 자연적으로 발견된다. 이는 특정 박테리아에 의해 채택되어 수백만년에 걸쳐 그의 벽을 이것으로 코팅하도록 진화되어 왔다. 이들 천연 폴리시알릴화 박테리아는 이어서 분자 모방에 의해 신체의 방어 시스템을 이겨낼 수 있었다. 자연계의 궁극적인 은폐 기술인 PSA는 이러한 박테리아로부터 대량으로 미리 결정된 물리적 특성을 갖는 것으로 용이하게 생산될 수 있다. 박테리아 PSA는 인간 신체 내의 PSA와 화학적으로 동일하기 때문에 단백질에 커플링될 때에도 완전하게 비-면역원성이다.
또 다른 기술은 항체에 연결된 히드록시에틸 전분 ("HES") 유도체의 사용을 포함한다. HES는 찰옥수수 전분에서 유래된 변형된 천연 중합체이고, 신체의 효소에 의해 대사될 수 있다. HES 용액은 통상적으로 결핍된 혈액량을 대체하고 혈액의 레올로지 특성을 개선시키기 위해 투여된다. 항체의 HES화는 분자의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 신장 클리어런스를 감소시킴으로써 순환 반감기의 연장을 가능하게 하여 증가된 생물학적 활성을 생성한다. 다양한 파리미터, 예컨대 HES의 분자량을 변경시킴으로써, 광범위한 HES 항체 접합체를 맞춤화할 수 있다.
증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 또한 1개 이상의 아미노산 변형 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인, 또는 그의 FcRn 결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편)에 도입하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 98/23289; 국제 공개 번호 WO 97/34631; 및 미국 특허 번호 6,277,375를 참조한다.
또한, 항체는 항체 또는 항체 단편을 생체내에서 보다 안정적이게 하거나 또는 보다 긴 생체내 반감기를 갖도록 알부민에 접합될 수 있다. 상기 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 국제 공개 번호 WO 93/15199, WO 93/15200, 및 WO 01/77137; 및 유럽 특허 번호 EP 413,622를 참조한다.
반감기를 증가시키는 전략은 증가된 생체내 반감기를 목적으로 하는 나노바디, 피브로넥틴-기반 결합제, 및 다른 항체 또는 단백질에 특히 유용하다.
항체 접합체
본 발명은 이종 단백질 또는 폴리펩티드 (또는 그의 항원-결합 단편, 바람직하게는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개의 아미노산의 폴리펩티드)에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 접합되어 (공유 접합 및 비공유 접합 둘 다를 포함) 융합 단백질을 생성하는, BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 또는 VL CDR) 및 이종 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 항체 또는 항체 단편에 융합 또는 접합시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 및 5,112,946; 유럽 특허 번호 EP 307,434 및 EP 367,166; 국제 공개 번호 WO 96/04388 및 WO 91/06570; 문헌 [Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; 및 Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341]을 참조한다.
추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링 (집합적으로 "DNA 셔플링"으로 언급됨)의 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 활성을 변경시키기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 보다 높은 친화도 및 보다 낮은 해리율을 갖는 항체 및 그의 항원-결합 단편). 일반적으로, 미국 특허 번호 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, 및 5,837,458; 문헌 [Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; 및 Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313]을 참조한다 (이들 특허 및 간행물은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 항체 및 그의 항원-결합 단편, 또는 코딩된 항체 및 그의 항원-결합 단편은 재조합 전에 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 방법에 의한 무작위 돌연변이유발에 의해 변경될 수 있다. BMP6에 특이적으로 결합하는 항체 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 이종 분자의 1종 이상의 성분, 모티프, 절편, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
또한, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 마커 서열, 예컨대 정제를 용이하게 하는 펩티드에 융합될 수 있다. 한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드 (서열식별번호: 96), 예컨대 특히 pQE 벡터 (퀴아젠, 인크.(QIAGEN, Inc.), 91311 캘리포니아주 채츠워스 에톤 애비뉴 9259)에서 제공된 태그이며, 다수는 상업적으로 입수가능하다. 문헌 [Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 예를 들어 헥사-히스티딘 (서열식별번호: 96)은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌 ("HA") 태그 (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) 및 "flag" 태그를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편은 진단제 또는 검출가능한 작용제에 접합된다. 이러한 항체는 특정한 요법의 효능을 결정하는 것과 같은 임상 시험 절차의 일부로서 질환 또는 장애의 발병, 발생, 진행 및/또는 중증도를 모니터링하거나 진단하는데 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 항체를 다양한 효소, 예컨대 이에 제한되지는 않는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제; 보결분자단, 예컨대 이에 제한되지는 않는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광 물질, 예컨대 이에 제한되지는 않는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 발광 물질, 예컨대 이에 제한되지는 않는 루미놀; 생물발광 물질, 예컨대 이에 제한되지는 않는 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린; 방사성 물질, 예컨대 이에 제한되지는 않는 아이오딘 (131I, 125I, 123I 및 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115In, 113In, 112In 및 111In), 테크네튬 (99Tc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데넘 (99Mo), 크세논 (133Xe), 플루오린 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149 Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 및 117Tin; 및 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함하나 이에 제한되지는 않는 검출가능한 물질에 커플링시켜 달성될 수 있다.
본 발명은 추가로, 치료 모이어티에 접합된 항체 및 그의 항원-결합 단편의 용도를 포괄한다. 항체 그의 항원-결합 단편은 치료 모이어티, 예컨대 세포독소, 예를 들어 세포증식억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예를 들어 알파-방출체에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 임의의 작용제를 포함한다.
추가로, 항체 그의 항원-결합 단편은 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 치료 모이어티 또는 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 치료 모이어티 또는 약물 모이어티는 전형적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아폽토시스제, 항혈관신생제; 또는 생물학적 반응 조절제, 예컨대 예를 들어 림포카인을 포함할 수 있다.
또한, 항체는 치료 모이어티, 예컨대 방사성 금속 이온, 예컨대 알파-방출체, 예컨대 213Bi, 또는 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방사성금속 이온을 폴리펩티드에 접합시키는데 유용한 마크로시클릭 킬레이트화제에 접합될 수 있다. 한 실시양태에서, 마크로시클릭 킬레이트화제는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 관련 기술분야에 통상적으로 공지되어 있고, 문헌 [Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4 (10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4):553-7; 및 Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26 (8):943-50]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
항체에 치료 모이어티를 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]을 참조한다.
항체는 또한 면역검정 또는 표적 항원의 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체를 생산하는 방법
항체를 코딩하는 핵산
본 발명은 상기 기재된 BMP6-결합 항체 쇄의 절편 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 실질적으로 정제된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 일부 핵산은 서열식별번호: 16; 36; 56; 또는 76 중 임의의 것에 제시된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 서열식별번호: 26; 46; 66; 또는 86 중 임의의 것에 제시된 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 핵산 분자는 표 1에서 확인되는 것이다. 본 발명의 일부 다른 핵산 분자는 표 1에서 확인되는 것의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 65, 80%, 95%, 또는 99%) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적절한 발현 벡터로부터 발현된 경우에, 이들 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드는 BMP6 항원 결합 능력을 나타낼 수 있다.
또한, 표 1에 제시된 BMP6-결합 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터 적어도 1개의 CDR 영역 및 통상적으로 모든 3개의 CDR 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 제공된다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 표 1에 제시된 BMP6-결합 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 서열을 모두 또는 실질적으로 모두 코딩한다. 코드의 축중성으로 인해, 다양한 핵산 서열이 각각의 이뮤노글로불린 아미노산 서열을 코딩할 것이다.
본 발명의 핵산 분자는 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 다를 코딩할 수 있다. 본 발명의 일부 핵산 서열은 서열식별번호: 16; 36; 56; 또는 76 중 임의의 것에 제시된 성숙 중쇄 가변 영역 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 90%, 또는 99%) 성숙 중쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 다른 핵산 서열은 서열식별번호: 26; 46; 66; 또는 86 중 임의의 것에 제시된 성숙 경쇄 가변 영역 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 90%, 또는 99%) 성숙 경쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 BMP6-결합 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 기존 서열 (예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 신생 고체-상 DNA 합성 또는 PCR 돌연변이유발에 의해 생산될 수 있다. 핵산의 직접적 화학적 합성은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌 [Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌 [Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 번호 4,458,066의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은, 예를 들어 문헌 [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
또한, 상기 기재된 BMP6-결합 항체를 생산하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 본 발명에 제공된다. BMP6-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생산하기 위해 바이러스-기반 및 비바이러스 발현 벡터 둘 다가 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 전형적으로 단백질 또는 RNA 발현을 위한 발현 카세트를 갖는 에피솜 벡터, 및 인간 인공 염색체 (예를 들어, 문헌 [Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997] 참조)를 포함한다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간) 세포에서의 BMP6-결합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 유용한 비-바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 샌디에고), MPSV 벡터, 및 다른 단백질 발현에 대해 관련 기술분야에 공지된 수많은 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관 바이러스, 포진 바이러스를 기반으로 하는 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스를 기반으로 하는 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 (SFV)를 포함한다. 문헌 [Brent et al., 상기 문헌; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; 및 Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992]을 참조한다.
발현 벡터의 선택은 벡터를 발현시키고자 의도되는 숙주 세포에 의존한다. 전형적으로, 발현 벡터는 BMP6-결합 항체 쇄 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)을 함유한다. 한 실시양태에서, 유도성 프로모터는 유도 조건 하인 경우를 제외하고 삽입된 서열의 발현을 방지하기 위해 사용된다. 유도성 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은, 발현 산물이 숙주 세포에 의해 보다 우수하게 허용되는 서열을 코딩하는 집단으로 편향되지 않으면서 비유도 조건 하에서 확장될 수 있다. 프로모터에 더하여, BMP6-결합 항체 쇄 항원-결합 단편의 효율적인 발현을 위해 다른 조절 요소가 또한 요구되거나 바람직할 수 있다. 이들 요소는 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현의 효율은 사용상 세포계에 적절한 인핸서를 포함시키는 것에 의해 증진될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키기 위해 SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 사용될 수 있다.
발현 벡터는 또한 삽입된 BMP6-결합 항체 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드와 융합 단백질을 형성하기 위한 분비 신호 서열 위치를 제공할 수 있다. 보다 종종, 삽입된 BMP6-결합 항체 서열은 신호 서열에 연결된 후 벡터에 포함된다. BMP6-결합 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열을 수용하는데 사용되는 벡터는 때때로 또한 불변 영역 또는 그의 일부를 코딩한다. 이러한 벡터는 불변 영역과의 융합 단백질로서 가변 영역의 발현을 허용함으로써 그에 의해 무손상 항체 및 그의 항원-결합 단편이 생산되게 한다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 인간의 것이다.
BMP6-결합 항체 쇄를 보유하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키는데 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용하기 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 엔테로박테리아세아에, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용가능한 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 임의로는 오퍼레이터 서열과 함께 전형적으로 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 본 발명의 BMP6-결합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 조합되어 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포가 본 발명의 BMP6-결합 폴리펩티드를 발현시키고 생산하는데 사용된다. 예를 들어, 이는 내인성 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 (예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 1D6.C9 골수종 하이브리도마 클론) 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 (예를 들어, 하기 예시된 SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 사멸, 또는 정상적이거나 비정상적인 불멸 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함한 무손상 이뮤노글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되어 있다. 폴리펩티드를 발현시키기 위한 포유동물 조직 세포 배양물의 사용은 예를 들어 문헌 [Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에서 일반적으로 논의된다. 포유동물 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터 및 인핸서 (예를 들어, 문헌 [Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 통상적으로 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적 및/또는 조정가능하거나 조절가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP poIIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라시클린-유도성 CMV 프로모터 (예컨대, 인간 극초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 관련 기술분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어 염화칼슘 형질감염은 통상적으로 원핵 세포에 대해 사용되는 반면에, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다. (일반적으로, [Sambrook, et al., 상기 문헌] 참조). 다른 방법은 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개 형질전환, 주사 및 미세주사, 탄도적 방법, 비로솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 포진 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합 (Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), 작용제-증진된 DNA 흡수, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 종종 바람직할 것이다. 예를 들어, BMP6-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 안정적으로 발현하는 세포주는, 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선택 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조할 수 있다. 벡터의 도입 후에, 세포를 1-2일 동안 풍부화 배지에서 성장되도록 한 다음 선택 배지로 전환할 수 있다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하기 위한 것이고, 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포가 선택 배지에서 성장하게 한다. 안정적으로 형질감염된 내성 세포는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체의 생성
모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 많은 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환이 사용될 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마를 생산하는 것은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메라 또는 인간화 항체 및 그의 항원-결합 단편은 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득될 수 있고, 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하도록 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 CDR 영역을 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6180370 (Queen et al.)을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. BMP6에 대해 지시된 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하며, 본원에서 집합적으로 "인간 Ig 마우스"로 지칭된다.
HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 뮤 및 카파 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (뮤 및 감마) 및 카파 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al., 1994 Nature 368 (6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 K의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 대한 반응으로 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 부류 전환 및 체세포 돌연변이를 거쳐 높은 친화도의 인간 IgG-카파 모노클로날을 생성한다 ([Lonberg, N. et al., 1994 상기 문헌]; 문헌 [Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 검토됨). HuMAb 마우스의 제조 및 사용, 및 이러한 마우스에 의해 보유된 게놈 변형은 문헌 [Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; 및 Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기재되어 있고, 모든 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 구체적으로 참조로 포함된다. 추가로, 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429 (모두 Lonberg 및 Kay); 미국 특허 번호 5,545,807 (Surani et al.); PCT 공개 번호 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 Lonberg 및 Kay); 및 PCT 공개 번호 WO 01/14424 (Korman et al.)를 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모솜 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되며, PCT 공개 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세하게 기재되어 있다.
추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스제닉 동물 시스템이 관련 기술분야에서 이용가능하고, 본 발명의 BMP6-결합 항체 및 항원-결합 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 (아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))로 지칭되는 대안적 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.
또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 관련 기술분야에서 이용가능하고, 본 발명의 BMP6-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜 둘 다를 보유하는 마우스가 사용될 수 있고; 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 소가 관련 기술분야에 기재되어 있고 (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894), 이는 본 발명의 BMP6-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있거나 또는 하기 실시예에 기재되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner et al.); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (Dower et al.); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths et al.)을 참조한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화 시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 발명의 조작된 항체 및 그의 항원-결합 단편은 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형을 가한 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 항체가 유래된 배선 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배위로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "복귀돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이" 항체도 또한 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포-에피토프를 제거하여 그에 의해 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 프레임워크 영역 내 또는 심지어는 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로도 지칭되고, 미국 특허 공개 번호 20030153043 (Carr et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 더하여 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 1종 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 항체의 1종 이상의 기능적 특성을 다시 변경시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 1종 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 또는 그의 글리코실화가 변경되도록 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시양태가 하기에 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역에서 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 것이다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역이 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 항체의 Fc 힌지 영역이 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입되어, 항체는 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖게 된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 하기 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체의 이펙터 기능을 변경시키기 위해 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 Fc 영역을 변경시킨다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다 Winter et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기로부터 선택된 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 그에 의해 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/거나 Fc-감마 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 Fc 영역이 변형된다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 추가로, 인간 IgG1 상의 Fc-감마 RI, Fc-감마 RII, Fc-감마 RIII 및 FcRn에 대한 결합 부위가 맵핑되어 있고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비-글리코실화 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는, 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 생성하는 1개 이상의 아미노산 치환이 이루어져, 그에 의해 그 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 글리코실화 유형을 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 항체 또는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주, LecI3 세포를 기재하고, 그러한 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화가 또한 일어난다 (또한, 문헌 [Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342 (Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)--N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 상기 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내어 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 생성한다 (또한 문헌 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).
변경된 항체를 조작하는 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 BMP6-결합 항체를 사용하여, 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 BMP6-결합 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 BMP6-결합 항체의 구조적 특색은 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 적어도 1종의 기능적 특성, 예컨대 인간 BMP6에 대한 결합 및 또한 BMP6의 1종 이상의 기능적 특성의 억제 (예를 들어, 용혈 검정에서 적혈구 용해의 억제)를 보유하는 구조적으로 관련된 BMP6-결합 항체를 생성하는데 사용된다.
예를 들어, 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편의 1개 이상의 CDR 영역, 또는 그의 돌연변이는 공지된 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어, 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 추가의 재조합적으로-조작된 BMP6-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 이전 섹션에 기재된 것을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에 제공되는 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상, 또는 그의 1개 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에 제공된 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상 또는 그의 1개 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 원래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성한 다음, "제2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.
변경된 항체 서열은 또한 US20050255552에 기재된 바와 같은 고정된 CDR3 서열 또는 최소 필수 결합 결정기 및 CDR1 및 CDR2 서열에 대한 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터 항체를 스크리닝하는데 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예컨대 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술을 사용하여 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩된 항체는 본원에 기재된 BMP6-결합 항체의 기능적 특성 중 1종, 일부 또는 모두를 보유하는 것이고, 기능적 특성은 인간 BMP6 단백질에 대한 특이적 결합을 포함하나 이에 제한되지는 않고; 항체는 용혈 검정에서 적혈구 용해를 억제한다.
변경된 항체의 기능적 특성은 관련 기술분야에서 이용가능하고/거나 본원에 기재된 표준 검정, 예컨대 실시예에 제시된 것 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 평가될 수 있다.
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 조작하는 방법의 한 실시양태에서, 돌연변이는 BMP6-결합 항체 코딩 서열의 모두 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성된 변형된 BMP6-결합 항체는 결합 활성 및/또는 다른 기능적 특성에 대해 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 관련 기술분야에 기재되어 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 02/092780 (Short)은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 어셈블리, 또는 그의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재하고 있다. 대안적으로, PCT 공개 WO 03/074679 (Lazar et al.)는 항체의 생리화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 기재하고 있다.
본 발명의 항체의 특징화
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편은 다양한 기능적 검정에 의해 특징화될 수 있다. 예를 들어, 그들은 BMP6을 억제하는 그의 능력에 의해 특징화될 수 있다.
BMP6에 결합하는 항체의 능력은 관심 항체를 직접 표지하는 것에 의해 검출될 수 있거나, 또는 항체는 표지되지 않고 관련 기술분야에 공지된 다양한 샌드위치 검정 포맷을 사용하여 결합이 간접적으로 검출될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 BMP6-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편은 BMP6 폴리펩티드에 대한 참조 BMP6-결합 항체의 결합을 차단하거나 그와 경쟁한다. 이들은 상기 기재된 완전 인간 BMP6-결합 항체일 수 있다. 이들은 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 마우스, 키메라 또는 인간화 BMP6-결합 항체일 수 있다. 참조 항체 결합을 차단하거나 그와 경쟁하는 능력은 시험 하의 BMP6-결합 항체가 참조 항체에 의해 규정되는 것과 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하거나, 또는 참조 BMP6-결합 항체에 의해 결합되는 에피토프와 충분히 근접한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 이러한 항체는 특히 참조 항체에 대해 확인된 유리한 특성을 공유할 가능성이 있다. 참조 항체를 차단하거나 그와 경쟁하는 능력은 예를 들어 경쟁 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 경쟁 결합 검정에 의해, 시험 하의 항체는 공통 항원, 예컨대 BMP6 폴리펩티드에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 능력에 대해 조사된다. 시험 항체는 과량의 시험 항체가 참조 항체의 결합을 실질적으로 억제하는 경우에 항원에 대한 특이적 결합에 대해 참조 항체와 경쟁한다. 실질적인 억제는 시험 항체가 참조 항체의 특이적 결합을 통상적으로 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 90% 감소시킨다는 것을 의미한다.
항체가 특정한 단백질, 본 경우에, BMP6에 대한 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 것을 평가하기 위해 사용될 수 있는 수많은 공지된 경쟁 결합 검정이 존재한다. 이들은 예를 들어 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986] 참조), 고체 상 직접 표지된 검정, 고체 상 직접 표지된 샌드위치 검정 ([Harlow & Lane, 상기 문헌] 참조); I-125 표지를 사용하는 고체 상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990); 및 직접 표지된 RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990)를 포함한다. 전형적으로, 이러한 검정은 고체 표면에 결합된 정제된 항원, 또는 비표지된 시험 BMP6-결합 항체 및 표지된 참조 항체 중 어느 하나를 보유하는 세포의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정하는 것에 의해 측정된다. 통상적으로, 시험 항체는 과량으로 존재한다. 경쟁 검정 (경쟁 항체)에 의해 확인된 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 참조 항체가 결합하는 에피토프에 입체 장애를 일으키기에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
선택된 BMP6-결합 모노클로날 항체가 고유한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 각각의 항체를 상업적으로 입수가능한 시약 (예를 들어, 일리노이주 록포드 소재의 피어스(Pierce)로부터의 시약)을 사용하여 비오티닐화시킬 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체 및 비오티닐화된 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 연구는 BMP6 폴리펩티드 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 비오티닐화된 MAb 결합은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로 검출될 수 있다. 정제된 BMP6-결합 항체의 이소형을 결정하기 위해, 이소형 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 1 μg/ml의 항-인간 IgG로 4℃에서 밤새 코팅할 수 있다. 1% BSA로 차단한 후, 플레이트를 1 μg/ml 이하의 모노클로날 BMP6-결합 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 이어서, 플레이트를 발색시키고 분석하여 정제된 항체의 이소형을 결정할 수 있다.
BMP6 폴리펩티드를 발현하는 살아있는 세포에 대한 모노클로날 BMP6-결합 항체의 결합을 입증하기 위해, 유동 세포측정법을 사용할 수 있다. 간략하게, BMP6을 발현하는 세포주 (표준 성장 조건 하에 성장됨)를 0.1% BSA 및 10% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 BMP6-결합 항체와 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 세척한 후, 세포를 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 샘플은 단세포에 대해 게이팅되는, 광 및 측방 산란 특성을 사용한 팩스캔(FACScan) 기기에 의해 분석될 수 있다. 유동 세포측정법 검정에 더하여 또는 그 대신에 형광 현미경검사를 사용한 대안적 검정이 사용될 수 있다. 세포는 상기 기재된 바와 같이 정확하게 염색되고 형광 현미경검사에 의해 검사될 수 있다. 이러한 방법은 개별 세포의 가시화를 가능하게 하지만, 항원의 밀도에 따라 감수성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 BMP6-결합 항체 및 그의 항원-결합 단편은 웨스턴 블롯팅에 의해 BMP6 폴리펩티드 또는 항원 단편과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간략하게, 정제된 BMP6 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 BMP6을 발현하는 세포로부터의 세포 추출물을 제조하여 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용할 수 있다. 전기영동 후에, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 10% 소 태아 혈청으로 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙한다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출되고, BCIP/NBT 기질 태블릿 (시그마 켐. 캄파니(Sigma Chem. Co.), 미주리주 세인트 루이스)으로 발색시킬 수 있다.
기능적 검정의 예는 또한 하기 실시예 섹션에 기재된다.
예방 및 치료 용도
본 발명은 증가된 BMP6 활성과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써 증가된 BMP6 활성과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본 발명은 빈혈을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써 빈혈을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 특히, 빈혈의 진행을 방지하는데 사용될 수 있다. 또한 이는 빈혈 환자의 치료를 위한 다른 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 BMP6 관련 질환 또는 장애를 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써 BMP6 관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 공지된 BMP6 관련 질환 또는 장애의 예는 비제한적 예로서: 만성 질환에 의한 빈혈 (ACD), 만성 신장 질환에 의한 (예를 들어, 이와 연관된) 빈혈 (CKD), 암에 의한 빈혈, 염증에 의한 빈혈, 적혈구생성 자극제 (ESA) 저항성 빈혈 (예를 들어 에리트로포이에틴 (EPO) 저항성 빈혈, ESA 저반응성 빈혈 (예를 들어, EPO 저반응성 빈혈), 기능적 철-결핍성 빈혈 및/또는 철-제한 빈혈을 포함한 빈혈을 포함한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 BMP6 관련 질환 또는 장애를 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써 BMP6 관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 질환 또는 장애는 빈혈이다. 한 실시양태에서 빈혈은 만성 질환에 의한 빈혈이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 만성 신장 질환이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 암이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 염증이다. 한 실시양태에서 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 ESA (예를 들어, EPO)-저항성 빈혈이다. 한 실시양태에서 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 ESA (예를 들어, EPO)-저반응성 빈혈이다. 한 실시양태에서, 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 철-제한 빈혈이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 만성 혈액투석 (HD) 대상체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 신질환, 예를 들어, 말기 신질환을 갖는다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 BMP6 관련 질환 또는 장애를 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써 BMP6 관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 질환 또는 장애는 기능적 철 결핍성 빈혈이다. 한 실시양태에서, 대상체는 ESA (예를 들어, EPO) 치료받은 만성 혈액투석 환자이다. 한 실시양태에서, 대상체는 만성 신장 질환을 갖는 ESA (예를 들어, EPO) 치료받은 만성 혈액투석 환자이다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 빈혈을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여함으로써 빈혈을 치료하는 방법을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본 발명은 빈혈을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여함으로써 빈혈을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서 빈혈은 만성 신장 질환에 의한 빈혈이다. 한 실시양태에서 빈혈은 ESA (예를 들어, EPO)-저항성 빈혈이다. 한 실시양태에서 빈혈은 ESA (예를 들어, EPO)-저반응성 빈혈이다. 한 실시양태에서, 빈혈은 철-제한 빈혈이다. 한 실시양태에서, 빈혈은 신장 질환, 예를 들어, 만성 신장 질환과 연관된 빈혈이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 만성 혈액투석 (HD) 대상체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 신질환, 예를 들어, 말기 신질환을 갖는다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 BMP6 관련 질환 또는 장애를 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여함으로써 BMP6 관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 질환 또는 장애는 기능적 철 결핍성 빈혈이다. 한 실시양태에서, 대상체는 ESA (예를 들어, EPO) 치료받은 만성 혈액투석 환자이다. 한 실시양태에서, 대상체는 만성 신장 질환을 갖는 ESA (예를 들어, EPO) 치료받은 만성 혈액투석 환자이다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 빈혈을 치료하는 방법을 제공한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 ESA (예를 들어, EPO) 투여 필요를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써 대상체의 ESA (예를 들어, EPO) 투여 필요를 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서 빈혈은 만성 질환에 의한 빈혈이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 만성 신장 질환이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 암이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 염증이다. 한 실시양태에서 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 ESA (예를 들어, EPO)-저항성 빈혈이다. 한 실시양태에서 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 ESA (예를 들어, EPO)-저반응성 빈혈이다. 한 실시양태에서, 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 철-제한 빈혈이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 만성 혈액투석 (HD) 대상체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 신질환, 예를 들어, 말기 신질환을 갖는다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 ESA (예를 들어, EPO) 투여 필요를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써 대상체의 ESA (예를 들어, EPO) 투여 필요를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 대상체는 기능적 철 결핍성 빈혈을 갖는다. 한 실시양태에서, 대상체는 ESA (예를 들어, EPO) 치료받은 만성 혈액투석 환자이다. 한 실시양태에서, 대상체는 만성 신장 질환을 갖는 ESA (예를 들어, EPO) 치료받은 만성 혈액투석 환자이다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 ESA (예를 들어, EPO) 투여 필요를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여함으로써 대상체의 ESA (예를 들어, EPO) 투여 필요를 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 대상체는 빈혈을 갖는다. 한 실시양태에서 빈혈은 만성 질환에 의한 빈혈이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 만성 신장 질환이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 암이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 염증이다. 한 실시양태에서 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 ESA (예를 들어, EPO)-저항성 빈혈이다. 한 실시양태에서 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 ESA (예를 들어, EPO)-저반응성 빈혈이다. 한 실시양태에서, 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 철-제한 빈혈이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 만성 혈액투석 (HD) 대상체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 신질환, 예를 들어, 말기 신질환을 갖는다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 ESA (예를 들어, EPO) 투여 필요를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여함으로써 대상체의 ESA (예를 들어, EPO) 투여 필요를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 대상체는 기능적 철 결핍성 빈혈을 갖는다. 한 실시양태에서, 대상체는 ESA (예를 들어, EPO) 치료받은 만성 혈액투석 환자이다. 한 실시양태에서, 대상체는 만성 신장 질환을 갖는 ESA (예를 들어, EPO) 치료받은 만성 혈액투석 환자이다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 철 (예를 들어, IV 철) 투여 필요를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써 대상체의 철 (예를 들어, IV 철) 투여 필요를 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 대상체는 빈혈을 갖는다. 한 실시양태에서 빈혈은 만성 질환에 의한 빈혈이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 만성 신장 질환이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 암이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 염증이다. 한 실시양태에서 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 ESA (예를 들어, EPO)-저항성 빈혈이다. 한 실시양태에서 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 ESA (예를 들어, EPO)-저반응성 빈혈이다. 한 실시양태에서, 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 철-제한 빈혈이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 만성 혈액투석 (HD) 대상체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 신질환, 예를 들어, 말기 신질환을 갖는다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 철 (예를 들어, IV 철) 투여 필요를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써 대상체의 철 (예를 들어, IV 철) 투여 필요를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 대상체는 기능적 철 결핍성 빈혈을 갖는다. 한 실시양태에서, 대상체는 ESA (예를 들어, EPO) 치료받은 만성 혈액투석 환자이다. 한 실시양태에서, 대상체는 만성 신장 질환을 갖는 ESA (예를 들어, EPO) 치료받은 만성 혈액투석 환자이다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 철 (예를 들어, IV 철) 투여 필요를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여함으로써 대상체의 철 (예를 들어, IV 철) 투여 필요를 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 대상체는 빈혈을 갖는다. 한 실시양태에서 빈혈은 만성 질환에 의한 빈혈이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 만성 신장 질환이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 암이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 염증이다. 한 실시양태에서 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 ESA (예를 들어, EPO)-저항성 빈혈이다. 한 실시양태에서 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 ESA (예를 들어, EPO)-저반응성 빈혈이다. 한 실시양태에서, 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 철-제한 빈혈이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 만성 혈액투석 (HD) 대상체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 신질환, 예를 들어, 말기 신질환을 갖는다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 철 (예를 들어, IV 철) 투여 필요를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여함으로써 대상체의 철 (예를 들어, IV 철) 투여 필요를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 대상체는 기능적 철 결핍성 빈혈을 갖는다. 한 실시양태에서, 대상체는 ESA (예를 들어, EPO) 치료받은 만성 혈액투석 환자이다. 한 실시양태에서, 대상체는 만성 신장 질환을 갖는 ESA (예를 들어, EPO) 치료받은 만성 혈액투석 환자이다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편 또는 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 철 (예를 들어, IV 철) 투여 필요를 감소시키고 대상체의 ESA (예를 들어, EPO) 투여 필요를 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서 빈혈은 만성 질환에 의한 빈혈이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 만성 신장 질환이다. 한 실시양태에서 만성 질환은 암이다. 한 실시양태에서, 대상체는 빈혈을 갖는다. 한 실시양태에서 만성 질환은 염증이다. 한 실시양태에서 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 ESA (예를 들어, EPO)-저항성 빈혈이다. 한 실시양태에서 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 ESA (예를 들어, EPO)-저반응성 빈혈이다. 한 실시양태에서, 빈혈 (예를 들어, 만성 질환에 의한 빈혈)은 철-제한 빈혈이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 만성 혈액투석 (HD) 대상체이다. 상기 실시양태 중 임의의 것을 포함한 실시양태에서, 대상체는 신질환, 예를 들어, 말기 신질환을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 격리된 철을 가동화하는 것을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써 격리된 철을 가동화하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 격리된 철을 가동화하는 것을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여함으로써 격리된 철을 가동화하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 에리트로포이에틴 및/또는 철 (예를 들어, IV 철)에 의한 투여의 필요를 감소시키면서, 빈혈을 갖는 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 개선 (예를 들어, 증가)시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 빈혈은 만성 질환과 연관된 빈혈이다. 한 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준을 개선시키는 것은 그 수준을 임상 실시 가이드라인, 예를 들어, 그의 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 [Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335]에 의해 명시된 바와 같은 수준까지 개선시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준을 개선시키는 것을 헤모글로빈의 수준을 적어도 약 11.0 g/dL까지, 예를 들어, 약 11.0 g/dL 내지 약 12.5 g/dL까지 개선시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준을 개선시키는 것을 헤모글로빈의 수준을 적어도 11.0 g/dL까지, 예를 들어 11.0 g/dL 내지 12.5 g/dL까지 개선시키는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 에리트로포이에틴 및/또는 철 (예를 들어, IV 철)에 의한 투여의 필요를 감소시키면서, 빈혈을 갖는 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 개선 (예를 들어, 증가)시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 빈혈은 만성 질환과 연관된 빈혈이다. 한 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준을 개선시키는 것은 그 수준을 임상 실시 가이드라인, 예를 들어, 그의 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 [Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335]에 의해 명시된 바와 같은 수준까지 개선시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준을 개선시키는 것을 헤모글로빈의 수준을 적어도 약 11.0 g/dL까지, 예를 들어, 약 11.0 g/dL 내지 약 12.5 g/dL까지 개선시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준을 개선시키는 것을 헤모글로빈의 수준을 적어도 11.0 g/dL까지, 예를 들어 11.0 g/dL 내지 12.5 g/dL까지 개선시키는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 에리트로포이에틴 및/또는 철 (예를 들어, IV 철)에 의한 투여의 필요를 감소시키면서, 빈혈을 갖는 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 유지시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 빈혈은 만성 질환과 연관된 빈혈이다. 한 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준을 개선시키는 것은 그 수준을 임상 실시 가이드라인, 예를 들어, 그의 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 [Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335]에 의해 명시된 바와 같은 수준까지 개선시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준을 개선시키는 것을 헤모글로빈의 수준을 적어도 약 11.0 g/dL까지, 예를 들어, 약 11.0 g/dL 내지 약 12.5 g/dL까지 개선시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준을 개선시키는 것을 헤모글로빈의 수준을 적어도 11.0 g/dL까지, 예를 들어 11.0 g/dL 내지 12.5 g/dL까지 개선시키는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 에리트로포이에틴 및/또는 철 (예를 들어, IV 철)에 의한 투여의 필요를 감소시키면서, 빈혈을 갖는 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 유지시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 빈혈은 만성 질환과 연관된 빈혈이다. 한 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준을 개선시키는 것은 그 수준을 임상 실시 가이드라인, 예를 들어, 그의 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 [Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335]에 의해 명시된 바와 같은 수준까지 개선시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준을 개선시키는 것을 헤모글로빈의 수준을 적어도 약 11.0 g/dL까지, 예를 들어, 약 11.0 g/dL 내지 약 12.5 g/dL까지 개선시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준을 개선시키는 것을 헤모글로빈의 수준을 적어도 11.0 g/dL까지, 예를 들어 11.0 g/dL 내지 12.5 g/dL까지 개선시키는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 표 1에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 치료 방법 또는 절차와 함께 그를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 방법 또는 절차는, 비제한적 예로서, 치료 유효량의 ESA (예를 들어, EPO), 에리트로포이에틴 또는 철의 투여, 및 수혈을 포함한다. 치료는 전형적으로 1주, 1개월, 3개월, 6개월 또는 1년의 기간의 간격으로 계속된다. 일부 환자에서, 치료는 최대 환자의 나머지 일생 동안 투여된다.
본 발명의 치료제가 또 다른 작용제와 함께 투여되는 경우에, 2가지는 임의의 순서로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 항체는 제2 작용제 또는 방법 (예를 들어, ESA, 에리트로포이에틴, 철, 수혈)에 의한 요법을 받은 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, 결합 분자는 외과적 치료와 함께 투여된다.
BMP6-결합 항체와의 조합 치료에 적합한 작용제는 BMP6의 발현, 수준, 안정성 및/또는 활성을 억제하거나 감소시키는 관련 기술분야에 공지된 작용제를 포함한다. 이러한 작용제는 BMP6에 대한 항체, siRNA, 및 소분자를 포함한다.
BMP6에 대한 다양한 항체가, 특히, 하기에 기재된 것을 포함한 관련 기술분야에 공지되어 있다:
Figure pct00011
Figure pct00012
BMP6에 대한 추가의 항체가 관련 기술분야에 공지되어 있고; 많은 것이 상업적으로 입수가능하다.
BMP6에 대한 다양한 siRNA가, 특히, 하기에 기재된 것을 포함한 관련 기술분야에 공지되어 있다:
Figure pct00013
BMP6의 추가의 억제제가 공지되어 있다. 이들 중 임의의 것은 본원에 개시된 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 조합되어 사용될 수 있다.
조합 치료 요법은 상가적일 수 있거나, 또는 이는 상승작용적 결과 (예를 들어, 2종의 작용제의 조합 사용에 대해 예상되는 것을 초과하는 BMP6 활성에서의 감소)를 생성할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 BMP6-결합 항체 및 항-빈혈 작용제 또는 방법, 예컨대 ESA, 에리트로포이에틴, 철, 또는 수혈에 의한, 상기 기재된 바와 같은 빈혈 또는 또 다른 BMP6 관련 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 조합 요법을 제공한다.
진단 용도
한 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, 혈청, 세포, 조직)과 관련하여 또는 질환 또는 장애를 앓고 있거나 또는 빈혈과 연관된 장애가 발생할 위험이 있는 개체로부터 BMP6 및/또는 핵산 발현 뿐만 아니라 BMP6 기능을 결정하는 진단 검정을 포괄한다.
진단 검정, 예컨대 경쟁적 검정은 표지된 유사체 ("트레이서")가 시험 샘플 분석물과 공통의 결합 파트너 상의 제한된 수의 결합 부위에 대해 경쟁하는 능력에 의존한다. 일반적으로 경쟁 전 또는 후에 결합 파트너를 불용화시킨 다음, 결합 파트너에 결합된 트레이서 및 분석물을 미결합 트레이서 및 분석물로부터 분리한다. 이러한 분리는 경사분리 (결합 파트너가 사전불용화된 경우) 또는 원심분리 (결합 파트너가 경쟁적 반응 후에 침전된 경우)에 의해 달성된다. 시험 샘플 분석물의 양은 마커 물질의 양에 의해 측정되는 바와 같은 결합된 트레이서의 양에 반비례한다. 공지된 양의 분석물을 사용한 용량-반응 곡선을 제조하고, 시험 결과와 비교하여 시험 샘플에 존재하는 분석물의 양을 정량적으로 결정한다. 이들 검정은, 검출가능한 마커로서 효소가 사용되는 경우에 ELISA 시스템으로 불린다. 이러한 형태의 검정에서, 항체와 BMP6-결합 항체 사이의 경쟁적 결합은 결합된 BMP6, 바람직하게는 본 발명의 BMP6 에피토프를 생성하고, 이는 혈청 샘플 중 항체, 가장 특히 혈청 샘플 중 중화 항체의 척도이다.
검정의 유의한 이점은 중화 항체 (즉, BMP6, 특히 에피토프의 결합을 방해하는 것)의 직접 측정이 이루어진다는 것이다. 특히 ELISA 시험 형태의 이러한 검정은 임상 환경 및 상용 혈액 스크리닝에 상당한 용도를 갖는다.
빈혈과 연관된 장애를 갖는 환자의 임상 진단 또는 모니터링에서, 정상 대상체로부터의 상응하는 생물학적 샘플 중 수준과 비교 시 BMP6 단백질의 검출은 빈혈과 연관된 장애를 갖는 환자를 나타낸다.
생체내 진단 또는 영상화가 US2006/0067935에 기재되어 있다. 간략하게, 이들 방법은 일반적으로 환자에게 비-침습 방법에 의해 검출가능한 마커 또는 표지에 작동가능하게 부착된 BMP6 결합 분자의 진단 유효량을 투여 또는 도입하는 것을 포함한다. 항체-마커 접합체는 BMP6에 국재화하고 이에 결합하기에 충분한 시간이 허용된다. 이어서, 환자를 검출 장치에 노출시켜 검출가능한 마커를 확인하고, 이에 따라 환자의 조직 내에서 BMP6 결합 분자의 위치의 영상이 형성된다. BMP6 결합 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 존재는 항체-마커가 조직의 성분에 결합하는지 여부를 결정함으로써 검출된다. 빈혈을 갖지 않는 정상 개체와 비교 시 BMP6 단백질 또는 단백질 조합물에서의 증가된 수준의 검출은, 빈혈과 연관된 장애에 대한 소인 및/또는 그의 발병을 나타낸다. 본 발명의 이들 측면은 또한 조직 영상화 방법 및 조합 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 진단 검정, 예후 검정, 약리유전체학 및 임상 시험 모니터링을 예후 (예측) 목적으로 사용함으로써 개체를 예방적으로 치료하는 예측 의학 분야에 관한 것이다.
본 발명은 또한 개체가 BMP6 경로 활성의 조절이상과 연관된 장애가 발생할 위험에 있는지 여부를 결정하기 위한 예후 (또는 예측) 검정을 제공한다. 예를 들어, BMP6 유전자 내의 돌연변이가 생물학적 샘플에서 검정될 수 있다. 이러한 검정을 예후 또는 예측 목적으로 사용함으로써, BMP6, 핵산 발현 또는 활성을 특징으로 하거나 또는 이와 연관된 장애의 발병 전에 개체를 예방적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 개체에서 BMP6 핵산 발현 또는 BMP6 활성을 결정함으로써 그러한 개체에게 적절한 치료제 또는 예방제를 선택하는 방법을 제공한다 (본원에서 "약리유전체학"이라 지칭됨). 약리유전체학은 개체의 유전자형 (예를 들어, 개체가 특정한 작용제에 반응하는 능력을 결정하기 위해 검사된 개체의 유전자형)을 기반으로 하여 개체를 치료적 또는 예방적 치료하기 위한 작용제 (예를 들어, 약물)의 선택을 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 측면은 임상 시험에서 BMP6의 발현 또는 활성에 대한 작용제 (예를 들어, 약물)의 영향을 모니터링하는 방법을 제공한다.
제약 조성물
본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 BMP6-결합 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 조성물은 추가적으로 BMP6-연관 질환 (예를 들어, 빈혈)을 치료 또는 예방하는데 적합한 1종 이상의 다른 치료제를 함유할 수 있다. 제약상 담체는 조성물을 증진 또는 안정화시키거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 한다. 제약상 허용되는 담체는 생리학상 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라진다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하일 수 있거나, 또는 표적의 부위에 근접하여 투여될 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 불활성화할 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
조성물은 멸균되고 유동성이어야 한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨 및 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것은 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지되고 상용적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 및 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 제약 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에 제조된다. 전형적으로, BMP6-결합 항체의 치료 유효 용량 또는 효과적인 용량이 본 발명의 제약 조성물에 사용된다. BMP6-결합 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제제화된다. 투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급성에 의해 제시되는 바와 같이 용량이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합화된 물리적 이산 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 특정한 환자에게 독성이 아니면서 상기 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기에 유효한 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정한 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용된 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료할 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력을 포함한 다양한 약동학적 인자 및 유사 인자에 의존한다.
의사 또는 수의사는 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편을 목적하는 치료학적 효과를 달성하는데 필요한 것보다 낮은 수준의 용량으로 출발하여, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 알레르기성 염증성 장애의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부를 포함한 많은 상이한 인자에 따라 달라진다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하도록 적정될 필요가 있다. 항체를 전신 투여하는 경우에, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 및 보다 통상적으로 0.01 내지 15 mg/kg의 범위이다. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 1개월 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다. 항체를 유리체내 투여하는 경우에, 투여량은 약 0.0001 내지 약 10 mg의 범위이다. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 1개월 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다.
항체는 통상적으로 다수회 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 BMP6-결합 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 제시되는 바에 따라 불규칙적일 수 있다. 전신 투여의 일부 방법에서, 투여량은 1-1000 μg/ml 및 일부 방법에서 25-500 μg/ml의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다. 대안적으로, 항체는 지속 방출 제제로서 투여될 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화 항체는 키메라 항체 및 비인간 항체의 것보다 더 긴 반감기를 제시한다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서, 상대적으로 낮은 투여량이 상대적으로 빈번하지 않은 간격으로 장기간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 여생 동안 계속 치료를 받는다. 치료적 적용에서, 질환의 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 제시할 때까지 상대적으로 짧은 간격의 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방 요법이 투여될 수 있다.
구체적 실시양태에서 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 0.001 mg/kg 내지 0.1 mg/kg의 용량 (항체 또는 그의 항원-결합 단편)으로 투여된다. 구체적 실시양태에서 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg의 용량으로 투여된다. 구체적 실시양태에서 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 0.001 mg/kg, 0.0016 mg/kg, 0.0025 mg/kg, 0.0040 mg/kg, 0.0063 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.016 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.040 mg/kg, 0.063 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg의 용량으로 투여된다. 구체적 실시양태에서 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 약 0.001 mg/kg, 약 0.0016 mg/kg, 약 0.0025 mg/kg, 약 0.0040 mg/kg, 약 0.0063 mg/kg, 약 0.01 mg/kg, 약 0.016 mg/kg, 약 0.025 mg/kg, 약 0.040 mg/kg, 약 0.063 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg의 용량으로 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은, 예를 들어, 상기 언급된 용량 중 임의의 것을 포함하여, 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 정맥내 투여는 정맥내 주입이다. 실시양태에서, 주입은 30-60분에 걸쳐 이루어진다. 실시양태에서, 주입은 약 30-60분에 걸쳐 이루어진다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 그의 범주를 제한하지는 않는다. 본 발명의 다른 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이며, 첨부된 청구범위에 의해 포괄된다.
실시예 1
실시예는, 특히, 항체 3, 5, 6 및 7을 기재한다.
하기는 이들과 모 항체 사이의 관계를 기재한다:
Figure pct00014
모든 클론은 인간 IgG1 항체이다.
약어 목록
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
개요
이러한 작업에서 본 발명자들은 인간 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 파지 디스플레이를 적용함으로써 특이적 항-인간 BMP6 항체를 성공적으로 확인하였다.
서론
빈혈은 만성 신장 질환 (CKD)을 갖는 환자에서 보편적이고, 심혈관 질환 및 사망을 포함하여, 더 낮은 삶의 질 및 더 높은 유해 결과의 위험과 연관된다.
BMP6 항체의 목적은 헵시딘-저하 요법으로서 적혈구생성 자극제, 예컨대 에리트로포이에틴 및 정맥내 철의 요건은 감소시키고 동시에 헤모글로빈을 증가시킴으로써 철-제한 빈혈을 갖는 환자에게 이익이 되기 위한 것이다. 헵시딘-저하제는 이러한 환자 집단 및 철 제한을 특징으로 하는 만성 질환에 의한 빈혈 (ACD)의 다른 형태에서 ESA-저반응성 빈혈을 호전시키기 위한 효과적인 전략일 수 있다.
프로젝트의 전체 목적은, 헵시딘 수준을 저하시킬 수 있어서 적혈구생성 자극제 (ESA)의 요건을 감소시킴으로써 철-제한 빈혈을 갖는 환자에게 이익이 되는 BMP6에 대한 항체를 확인하고 개발하는 것이다. 이러한 작업에서, 본 발명자들은 BMP6 특이적 결합제를 확인하기 위해 파지 디스플레이를 적용하였다.
바람직한 BMP6 항체는 대부분의 또는 모든 하기 열거된 기준을 충족시킨다:
1 nM 미만의 인간 BMP6에 대한 Fab 단편의 해리 상수 (KD-값).
인간 BMP6에 대한 것보다 5-배 이하로 약한 시노 BMP6 항원에 대한 KD-값.
인간 BMP6에 대한 것보다 5-배 이하로 약한 마우스 BMP6 항원에 대한 KD-값.
100-배 초과의 차이로의 인간 BMP5 및 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대한 선택성.
HEP3B-BRE-Luc 리포터 유전자 검정에서 BMP6에 결합하고 그의 신호전달 활성을 중화시키는 능력. BRE2-luc2 리포터 유전자로 안정적으로 형질감염된 HEP3B 세포는 hBMP 단백질 (알앤디(R&D))에 의해 유도되었고, 이를 항-BMP6 항체로 처리하였다. 브라이트글로 검정을 처리 24시간 후에 수행하였다.
간 세포주 및 1차 인간 간 세포에서 BMP6-유도된 헵시딘 발현을 억제하는 능력.
낮은 정도 내지 중간 정도의 개발가능성 위험. 1종의 최종 항체 포맷은 인간 IgG1이다.
항체를 상업적으로 입수가능한 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 이전에 기재된 바와 같이 (Knappik et al. 2000 J. Mol. Biol. 296: 57-86, Prassler et al. 2011 J. Mol. Biol. 413: 261-278), Fab를 파지 표면 상에 디스플레이하기 위한 기술 (Rothe et al. 2008 J. Mol. Biol. 376: 1182-1200)을 사용하여 생성하였다. 패닝 및 초기 ELISA 스크리닝을 알앤디 시스템즈로부터의 hBMP6에 대해 수행하였다. 단백질 결합 히트의 ELISA 스크리닝은 hBMP6-특이적 결합제가 확인되게 하였다. 항체 Fab 단편을 추가로 마우스 BMP6 상동체에 대한 종 교차-반응성에 대해 특징화하고, 인간 BMP6에 대한 그의 결합 친화도를 결정하였다. Fab의 특이성을 또한 ELISA에서 hBMP2, hBMP5 및 hBMP7 단백질을 사용하여 체크하였다. Fab의 BMP6-특이적 활성을 또한 리포터 유전자 검정에서 평가하였다.
이러한 초기 특징화에 기초하여, 여러 클론을 인간 IgG1 포맷으로 전환시키고, 동일한 결합, 특이성 및 활성 검정을 사용하여 특징화하였다. 개발가능성 평가로부터 생성된 프로파일과 조합된 이러한 기능적 특징화의 결과는 친화도 성숙을 위해 3종의 클론이 선택되게 하였다 (NOV0429, NOV0441 및 NOV0442).
클론을 그의 LCDR3 내에서 또는 그의 HCDR2에서 무작위화하여 모 클론당 2종의 새로운 Fab 라이브러리를 생성하였다. 페프로테크(Peprotech)로부터의 hBMP6을 사용하여 고체 상 패닝을 수행하고, 뿐만 아니라 페프로테크로부터의 무작위 비오티닐화된 hBMP6을 사용하여 액체 상 패닝을 수행하였다. hBMP5 및 hBMP7 단백질에 대한 특이성 ELISA와 조합된 이. 콜라이 Fab 용해물의 MSD-SET 스크리닝은 모 클론과 비교 시 개선된 친화도를 갖는 hBMP6-특이적 결합제의 확인을 발생시켰다. 이어서 이들 개선된 유도체를 인간 IgG1 포맷으로 전환시키고, ELISA 및 RGA에서 추가로 특징화하여 그의 hBMP6-특이적 활성을 평가하였다.
목적하는 특성 및 우수한 개발가능성 프로파일을 갖는 18종의 성숙 항체 클론을 조작 (잠재적 PTM 부위의 제거 및 배선화)을 위해 선택하였다. 28종의 생성된 변이체를 마이크로-규모 발현으로 hIgG1로서 생산하고, 이전에 기재된 바와 같이 특징화하였다.
개발가능성 평가로부터 생성된 프로파일과 조합된 이러한 기능적 특징화의 결과는 선택 리드 후보를 생성하였다.
직접적으로 코팅된 항원에 대한 ELISA 스크리닝
ELISA 스크리닝을 사용하여, 단일 Fab 클론을 표적 항원에 대한 결합에 대해 패닝 산출물로부터 확인하였다. 조 이. 콜라이 용해물을 함유하는 Fab를 사용하여 Fab 단편을 시험하였다 (섹션 2.3.3 참조).
1차 스크리닝은 hBMP6_RD에 의해 50 mM 시트레이트 완충제 pH 4.7 중 1.5 μg/mL의 농도로 o/n 4℃에서 코팅된 맥시소르프 384-웰 플레이트를 사용하여 수행하였다.
1차 히트의 2차 스크리닝은 특이성 체크를 위해 hBMP6_RD (50 mM 시트레이트 완충제 pH 4.7 중 1.5 μg/mL)로 코팅된 맥시소르프 96-웰 플레이트, 뿐만 아니라 hBMP7 (50 mM 시트레이트 완충제 pH 4.7 중 3 μg/mL)로 코팅된 맥시소르브 96-웰 플레이트를 사용하여 수행하였다.
세척 후, 플레이트를 PBS 중 5% 탈지유에 의해 2시간 동안 차단하였다. Fab-함유 이. 콜라이 용해물을 첨가하고, RT에서 2시간 동안 결합되도록 하였다. 결합된 Fab 단편을 검출하기 위해, 플레이트를 TBST로 5x 세척하고, AP-항 인간 F(ab')2 항체를 1/5000 희석으로 첨가하였다. RT에서 2시간 후에, 플레이트를 TBST로 5x 세척하고, 아토포스 기질을 제조업체의 명세에 따라 첨가하였다. 플레이트를 기질 첨가 10분 후에 ELISA 판독기에서 판독하였다.
친화도 성숙 후 SET 스크리닝
친화도 등급화는 원칙적으로 하기 기재된 바와 같이 수행하였다. 문헌 [Haenel et al., 2005]에 기재된 원칙에 기초하여 용액 평형 적정에 의해 성숙 결합제의 등급화를 위해, 희석된 BEL 추출물의 일정한 양을 상이한 농도의 항원으로 밤새 평형화하였다.
이어서, 혼합물을 이전에 항원으로 코팅한 MSD 플레이트로 옮기고, 인큐베이션하고 세척한 후, 적합한 MSD-술포-태그 표지된 검출 항체를 첨가하였다.
후속해서, 섹터 이미저 6000 (메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), 미국 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용하여 ECL 검출을 통해 미결합 Fab의 농도를 정량하였다.
결과를 XLfit (IDBS) 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하고, 상응하는 피트 모델을 적용하여 (섹션 2.6.2.2), 친화도를 추정하고, 이에 따라 친화도 성숙에 의해 가장 개선된 클론을 확인하였다.
시험관내 검정
ELISA에 의한 선택성 및 교차-반응성의 평가
항-BMP6 항체의 종 교차-반응성을 결정하기 위해, 재조합 인간 및 마우스 BMP6 단백질을 플레이트에 결합시키고, 항체가 재조합 단백질에 결합하는 능력을 ELISA에 의해 결정하였다. 선택성을 평가하기 위해, 가장 가까운 상동체 인간 BMP5 및 BMP7에 대한 결합을 또한 평가하였다.
항원 시약을 ELISA 플레이트에 4℃에서 o/n 3-5 ug/mL로의 직접 고정화에 의해 코팅하였다. hBMP6 (페프로테크)을 코팅을 위해 50 mM 트리스 pH 8.0 중에 희석시켰다. hBMP6, mBMP6 및 hBMP5 (알앤디 시스템즈)를 50 mM 시트레이트 완충제 pH 4.7 중에 희석시켰다. hBMP7 (페프로테크)은 50 mM 시트레이트 완충제 pH 4.7 중에 희석시켰다. 비관련 항원으로서, hDKK1-His를 PBS 중 5 ug/mL로 코팅하였다.
다음날, 항원 용액을 폐기하고, 플레이트를 100 uL TBST로 3회 세척하였다. 후속해서 각 웰을 RT에서 2시간 동안 TBST 중 100 uL 5% 우유로 차단하였다. 후속 실험에서, 슈퍼블록 차단 완충제 100 uL로 차단을 수행하였다.
플레이트를 100 uL TBST로 3회 세척한 후, 각각의 항원을 40 uL의 정제된 Fab 또는 IgG 샘플과 각각 1 uM 및 0.2 uM의 농도 (PBST 완충제 중)로 인큐베이션하였다.
RT에서 2시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 다시 3회 세척하고, 1:5000 희석의 2차 AP-접합된 항-인간 IgG F(ab2) 항체 40 uL를 첨가하여 결합된 Fab/IgG를 검출하였다. RT에서 1시간 후, 40 uL 아토포스 기질을 제조업체의 프로토콜에 따라 첨가하여 신호를 발생시켰고, ELISA 플레이트 판독기에 의해 430 nm의 여기 파장 및 535 nm의 방출 파장을 사용하여 플레이트를 즉시 분석하였다.
친화도 평가
ELISA 결합 곡선
hBMP6 (페프로테크) 항원을 50 mM 트리스 완충제 pH 8.0 중 1.5 ug/mL로의 직접 고정화에 의해 ELISA 플레이트에 코팅하고, 4℃에서 o/n 인큐베이션하였다. 다음날, 항원 용액을 폐기하고, 플레이트를 100 uL TBST로 3회 세척하였다. 이어서 각 웰을 RT에서 2시간 동안 TBST 중 100 uL 5% 우유로 차단하였다. 후속 실험에서, 슈퍼블록 차단 완충제 100 uL로 차단을 수행하였다.
플레이트를 100 uL TBST로 3회 세척한 후, 항원을 30 uL의 정제된 Fab 또는 IgG 샘플의, Fab의 경우에 PBST 중 1 uM으로부터 출발하여 0.03 nM까지, IgG의 경우에 PBST 중 0.5 uM으로부터 출발하여 0.01 nM까지의 일련의 희석물과 인큐베이션하였다.
RT에서 2시간 인큐베이션 후, 플레이트를 다시 3회 세척하고, 1:5000 희석의 2차 AP-접합된 항-인간 IgG F(ab2) 항체 30 uL를 첨가하여 결합된 Fab/IgG를 검출하였다. RT에서 1시간 후, 30 uL 아토포스 기질을 제조업체의 프로토콜에 따라 첨가하여 신호를 발생시켰고, ELISA 플레이트 판독기에 의해 430 nm의 여기 파장 및 535 nm의 방출 파장을 사용하여 플레이트를 즉시 분석하였다.
섹터 이미저 6000 (MSD)을 사용한 KD 결정을 위한 용액 평형 적정 (SET) 방법
용액 중 친화도 결정은 기본적으로 문헌 (Friquet et al., 1985)에 기재된 바와 같이 수행하였다. SET 방법의 감수성 및 정확도를 개선시키기 위해, 전형적 ELISA에서 ECL-기반 기술 (Haenel et al., 2005)로 바꾸었다.
1 mg/ml 염소 항-인간 IgG (Fab)2 단편 특이적 항체를 MSD 술포-TAG™ NHS-에스테르 (메소 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 게이더스버그)로 제조업체의 지침에 따라 표지하였다.
실험을 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트 및 검정 완충제로서 0.5% (w/v) BSA 및 0.02% (v/v) 트윈20을 함유하는 PBS 중에서 수행하였다. 비표지된 항원을 예상되는 KD보다 적어도 10배 더 높은 농도로 출발하여 2n 시리즈로 희석시켰다. 항원이 없는 웰을 Bmax 값을 결정하는데 사용하고; 단지 검정 완충제 만을 함유하는 웰은 배경을 결정하는데 사용하였다. 적절한 양의 결합제 (예상되는 KD와 유사하거나 그 미만의 항체 농도, 60 μL 최종 부피)의 첨가 후, 혼합물을 RT에서 밤새 인큐베이션하였다.
MSD 플레이트를 항원으로 코팅하였다 (웰당 30 μL). 플레이트를 0.05% (v/v) 트윈20을 함유하는 PBS로 세척한 후, 평형화된 샘플을 그러한 플레이트로 옮기고 (웰당 30 μl), 20분 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 웰당 30 μl의 MSD-술포-태그 표지된 검출 항체 (항-인간 (Fab)2, 최종 희석 전형적으로 1:2000)를 MSD 플레이트에 첨가하고, 에펜도르프 진탕기 (700 rpm) 상에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
MSD 플레이트를 세척하고, 계면활성제를 함유하는 MSD 판독 완충제 T를 30 μL/웰 첨가한 후, 섹터 이미저 6000 (메소 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용하여 전기화학발광 신호를 검출하였다.
데이터를 XLfit (IDBS) 소프트웨어로 맞춤화 피팅 모델을 적용하여 평가하였다. Fab 분자의 KD 결정을 위해, 하기 피트 모델을 사용하였다 ((Abraham et al., 1996)에 따라 변형된 (Haenel et al., 2005)에 따름):
Figure pct00019
[Fab]t: 적용된 총 Fab 농도
x: 적용된 총 가용성 항원 농도 (결합 부위)
Bmax: 항원이 없는 Fab의 최대 신호
KD: 친화도
IgG 분자의 KD 결정을 위해, IgG에 대한 하기의 피트 모델을 사용하였다 ((Piehler et al., 1997)에 따라 변형됨):
Figure pct00020
[IgG]: 적용된 총 IgG 농도
x: 적용된 총 가용성 항원 농도 (결합 부위)
Bmax: 항원이 없는 IgG의 최대 신호
KD: 친화도
실험 설정:
Fab의 KD 결정은 기본적으로 하기와 같이 수행하였다: MSD 플레이트를 웰당 10 uL의 hBMP6에 의해 10 mM 트리스 완충제 pH 8 중 1 - 3 ug/mL로 o/n 4℃에서 코팅하였다. 후속해서, 플레이트를 5% BSA를 함유하는 PBS로 1시간 동안 차단하였다. hBMP6 항원을 유리 Fab 단편의 적정을 위해 사용하였다. 항원 원액을 10 mM 트리스 완충제 pH 8.0 중 1:40으로 475 nM로 사전-희석한 후 검정 완충제로 적정을 위해 의도되는 출발 농도로 조정하였다.
포르테바이오 옥테트 동역학적 측정
동역학적 파라미터를 결정하는 것에 의한 친화도 평가를 바이오-레이어 간섭측정법 기술을 통해 수행하였다.
정제된 Fab 샘플을 스트렙타비딘 딥 및 판독 바이오센서를 사용하여 측정하였다. 플레이트를 옥테트 QK 기기 (포르테바이오(ForteBio)) 내에 넣고, 온도조절 챔버 내에서 25℃로 평형화되도록 하였다. 센서를 15 ug/mL 비오티닐화된 hBMP6 항원을 함유하는 웰에 600초 동안 넣어둠으로써 실행을 개시하였다. 이어서 센서를 0, 200, 400, 800, 1600 nM 중 어느 하나의 정제된 Fab 샘플을 함유하는 웰에 넣었다. 0 nM Fab 농도는 배경 결정에 사용되었다. Fab 회합 및 해리는, 모두 컴퓨터 제어 하에 시간에 따른 층 두께 (나노미터, nm 단위)에서의 변화를 각각 800초 동안 측정함으로써 기록하였다. 옥테트 사용자 소프트웨어 버전 3.0을 사용하여 데이터를 자동적으로 프로세싱하였다.
비아코어 동역학적 측정
정제된 Fab 및 IgGs 샘플, 및 인간 BMP6 및 BMP7 항원을 사용하여 측정을 수행하였다.
ELISA에 의한 에피토프 비닝
경쟁 ELISA에 의해 에피토프 비닝을 수행하여 항체를 동일 또는 유의하게 중첩되는 에피토프의 그룹, 즉, 서로의 결합을 억제할 수 있는 항체로 분류하였다.
항-BMP6 IgG를 20 uL로 PBS 중 66 nM로 맥시소르프 384-웰 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 o/n 인큐베이션하였다. TBST로 2회 세척한 후, 플레이트를 웰당 100 uL의 슈퍼블록 차단 완충제로 RT에서 2.5시간 동안 차단하고, 이어서 TBST로 2회 세척하였다.
플레이트 차단 동안, PBST 중 66 nM의 페프로테크 hBMP6을 에펜도르프 튜브 내에서 PBST 중 300 nM의 정제된 항-BMP6 Fab (Flag-His 태그부착됨)과 사전-혼합하였다 (혼합물 중 최종 농도가 언급됨). RT에서 2시간 인큐베이션한 후, 사전-혼합된 hBMP6/Fab 20 uL를 플레이트 레이아웃에 따라 차단된 항-BMP6 IgG-코팅된 웰에 첨가하고, RT에서 최대 20분 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 TBST로 4회 세척하고, PBST 중 1/1000 희석된 항-His6-POD (서열식별번호: 96으로 개시된 "His6") 항체 접합체를 플레이트에 첨가하였다. RT에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 TBST로 5x 세척하였다. 화학발광 ELISA 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 인큐베이션 시간 없이 테칸 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 판독하였다.
리포터 유전자 검정 (RGA)에서의 시험관내 효력
항체 클론을 리포터 유전자 검정 (RGA)에서 정제된 Fab 단편 및/또는 IgG 샘플로서 실험하였다.
간략하게, 반딧불이 루시페라제를 구동하는 프로모터에서 BMP-반응성 성분 BRE를 함유하는 pGL4-BRE2-Luc2 렌티바이러스 벡터로 HEP3B 간세포암 세포주를 안정하게 형질감염시켰다. 알앤디 시스템즈로부터의 BMP 단백질을 사용하여 신호전달을 유도하였다. 브라이트글로 검정을 처리 24시간 후에 수행하였다.
오프-타겟 활성의 평가
프로젠 유니칩(Progen UNIchip)® AV-VAR EP는 이. 콜라이에서 N-말단 His-태그 융합 단백질로서 발현된 384종의 정제된 세포외 또는 분비 단백질을 함유한다.
항-hBMP6 항체와 5 ug/mL로의 인큐베이션 후에, 결합된 항체를 DyLight649 접합된 F(ab')2-염소 항 hIgG F(ab')2 단편 특이적 항체를 사용하여 검출하였다.
내부 제어 hIgG의 신호를 100%로 설정하고; 오프-타겟 활성을 hIgG로 정규화하고; 히트는 신호가 4% 이상인 경우에 양성으로 간주하였다 (컷-오프는 배경에 대해 측정된 m+3에 상응함).
마우스 모델에서의 생체내 효능
항체 5, 항체 6 및 항체 7 정제된 항체를 ESA-저항성 빈혈 마우스 모델에서 시험하였다.
결과
항-BMP6 항체의 특징화
조작된 IgG의 특이성 평가
28종의 항-hBMP6 조작된 IgG (배선화되고 PTM-제거됨)를 마이크로-규모로 생성하고, 특이성 ELISA에서 0.2 uM의 농도에서 시험하였다.
비-조작된 성숙 클론과 비교 시 다른 BMP 단백질에 대한 제한된 교차-반응성 및 hBMP6에 대한 강한 친화도를 보유하는 조작된 변이체를 추가의 특징화를 위해 선택하였다.
Figure pct00021
모든 NOV0429 조작된 IgG 변이체는 BSA에 대해 고도로 증가된 비특이적 결합을 제시하였다.
Figure pct00022
NOV0441 조작된 IgG 변이체는 그의 성숙 모체와 비교 시 hBMP5에 대해 약간 증가된 교차-반응성을 제시하였다.
Figure pct00023
NOV0442 조작된 IgG 변이체는 hBMP7 및 hBMP5에 대해 그의 제한된 교차-반응성을 보유하였다.
표 0. 조작된 IgG 항체 클론의 특이성 ELISA; 3종의 리드 항체를 회색으로 강조표시하였다
Figure pct00024
Figure pct00025
리포터 유전자 검정 (RGA)에서의 활성
28종의 마이크로-규모로 생성된 항-hBMP6 조작된 IgG (배선화되고 PTM-제거됨)를 전에 기재된 바와 같이 시험하였다. 결과를 표 3에 요약한다.
Figure pct00026
NOV0429 조작된 IgG 변이체는 3 내지 5-배 개선된 BMP6 활성을 제시하였지만, 대신 모든 다른 BMP와 효능작용 활성을 획득하였다.
Figure pct00027
NOV0441 조작된 IgG 변이체는 모든 3종의 다른 BMP에 대해 일부 교차-반응성을 획득하였다.
Figure pct00028
NOV0442 조작된 IgG 변이체는 개선된 BMP-활성을 제시하였지만, 또한 25 ug/ml의 최고 농도에서 BMP7-유도된 시스템의 일부 억제를 제시하였다.
표 3. RGA에서 조작된 IgG 항체 클론의 활성; IC50 값은 [ug/mL] 단위이다. NOV0951, NOV0954 및 NOV0958을 리드 항체로서 선택하였다.
Figure pct00029
Figure pct00030
개발가능성 평가 S-DAS 3
배선화 및 PTM-제거 후에, 18종의 성숙 클론의 23종의 항-hBMP6 조작된 변이체를 제3 개발가능성 평가에 적용하였다.
높은 응집 수준으로 인해 높은 위험을 제시하는 2종의 클론을 제외하고 (NOV0942, NOV0429의 HCDR2-유도체; NOV0944, NOV0441의 LCDR3-유도체), 항체는 바람직한 위험 개발가능성 프로파일을 갖는 것으로 발견되었다.
2종의 다른 클론을 그의 낮은 생산성 역가로 인해 중간 위험 프로파일로 표지하였다 (NOV0957 및 NOV0960, NOV0442 모 항체의 HCDR2-유도체).
표 4. 항-BMP6 항체 (23종의 조작된 hIgG1)의 S-DAS 3 요약; NOV0951, NOV0954 및 NOV0958을 리드 항체로서 선택하였다.
Figure pct00031
오프-타겟 활성의 평가
3종의 리드 후보 NOV0951, NOV0954 및 NOV0958을 정제된 hIgG1로서 상기 기재된 바와 같이 384종의 정제된 세포외 또는 분비 단백질로 코팅된 프로타젠 유니칩 상에서의 오프-타겟 결합에 대해 시험하였다. 이들은 모두 낮은 오프-타겟 활성 (≤ 10 히트)을 제시하였고, 이는 문제되지 않는 것으로 간주될 수 있다.
표 5. 3종의 리드 항체에 대한 단백질 칩 결과의 개관.
Figure pct00032
리드 및 백-업 항체의 선택
RGA에서의 단백질 결합 데이터, 활성 및 특이성 데이터, 뿐만 아니라 개발가능성 평가를 기반으로 하여, 조작된 후보 NOV0951, NOV0954, NOV0958을 리드 항체로서 선택하기로 결정하였다. 또한, 이들은 모두 항체 항체 676과 비교 시 hBMP6에 대한 특이성의 우수한 윈도우를 제시하였다. 조작된 후보 NOV0961, NOV0943, NOV0945는 백-업 항체로 간주하였다. 표 6은 최종 후보의 패밀리 트리를 개괄한다.
표 6. 선택된 항-hBMP6 리드 및 백-업 항체의 패밀리 트리
Figure pct00033
결론 및 논의
이 프로젝트의 목적은 BMP6 신호전달을 억제하는 항체를 밝히는 것으로, 따라서 만성 질환에 의한 빈혈의 치료에 적합하였다.
따라서, 3종의 상이한 단백질 기반 패닝 전략을 적용하였다. 1차 ELISA 히트는 주로 고체 상 패닝 풀에서 발견되었지만, RGA에서의 활성 시험 후 12종의 항체는 hBMP6-신호전달을 억제하는 것으로 제시되었다. 패닝 서브코드 2023.5로부터 유래된 3종의 항체 클론 (NOV0429, NOV0441 및 NOV0442)은 BMP6-특이적 활성 및 우수한 개발가능성 특성을 제시하였고, 따라서 친화도 성숙을 위해 선택하였다.
각 항체 클론에 대해 2종의 라이브러리를 생성하고, LCDR3 또는 HCDR2 무작위화하였다. 3종의 상이한 성숙 패닝 전략을 적용하였다. SET 스크리닝, 특이성 ELISA 및 서열분석 후에, 18종의 성숙 항체 클론이 RGA에서 BMP6 신호전달을 특이적으로 억제한다는 것을 발견하였고, 조작을 위해 선택하였다.
NOV0442의 패밀리로부터 유래된 성숙 클론을 LCDR2에서의 잠재적 탈-아미드화 부위의 제거, 프레임워크 복구 및 배선화에 적용하였다. 이는 항체 NOV0951, NOV0954, NOV0958 및 NOV0961을 발생시켰고, 이는 그의 각각의 비-돌연변이체 성숙 모체와 유사한 결합 특성을 갖는 것으로 제시되었다.
NOV0441의 패밀리로부터 유래된 성숙 클론을 배선화에 적용하였고, 이는 항체 NOV0943, NOV0945 및 NOV0946을 발생시켰으며, 이는 그의 각각의 비-돌연변이체 성숙 모체와 비교 시 BMP5에 대한 증가된 교차-반응성을 갖는 것으로 제시되었다.
다른 BMP 단백질과 제한된 교차-반응성을 가지면서 BMP6-신호전달을 억제하는 그의 능력 및 그의 바람직한 개발가능성 프로파일을 기반으로 하여, EPO-저항성 (철-제한) 빈혈을 위한 치료 약물로서의 그의 유용성을 추가로 평가하기 위해 NOV0951, NOV0954 및 NOV0958을 더 높은 양으로 생성하고 전달하였다. ESA-저항성 빈혈 마우스 모델을 사용하여 그의 생체내 효능을 결정하였다.
3종의 리드 항체 NOV0951, NOV0954 및 NOV0958을 최종 개발가능성 평가에 적용하였다. 3종의 리드 항체의 생체내 적합도는 래트에서의 그의 PK 프로파일을 결정함으로써 평가하였다.
표 7은 프로젝트의 초기에 규정된 항체 요건을 충족시키는 최종 리드 후보의 특성을 요약한다.
표 7. 선택된 항-hBMP6 리드 항체의 특성
Figure pct00034
실시예 2 - 항-BMP6 항체의 시험관내 및 생체내 활성, 및 PK/PD
물질
시험 화합물은 50mM 시트레이트 완충제, pH 7.0, 150 mM NaCl 중 ~8 mg/ml의 농도의 항체 5, 6 및 7 (표 8)이고, 이를 동물 투여 전에 PBS 중에 희석시켰다. 수컷 C56BL/6 마우스 또는 스프라그 돌리 래트를 사용하였다 (표 9).
표 8. BMP6 길항제 항체의 특성
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표 9. 동물 특징
Figure pct00036
BMP 리포터 유전자 검정을 위해, pGL4-BRE2-Luc2로부터 유래된 반딧불이 루시페라제를 구동하는 프로모터에서 BMP 반응성 요소 BRE를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 구축하였다 [Korchynskyi et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 4882-91]. 렌티바이러스 벡터를 사용하여 HEP3B 간세포암 세포주를 안정하게 형질감염시켰다. 세포주를 10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 및 5ug/ml 블라스티시딘을 함유하는 EMEM 중에 유지시켰다. 재조합 인간 BMP 단백질은 알앤디 시스템즈로부터 구입하였다.
60 ml 병에 든 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) 링 시험 항원 (균주 1119-3)을 아이오와주 에임스 소재의 미국 농무부, 동식물 검역소, 국립 수의청 실험실로부터 구입하였다. 브루셀라증 링 시험 항원은 페놀화 완충제 중 사멸, 염색된 비. 아보르투스 균주 1119-3 세포의 현탁액을 함유한다. 각각의 60 mL 병의 농도는 대략 109개 입자/ml이다. 5 X 109 스톡을 세척하고, 하기 방식으로 제조한다. 먼저, 60 ml 병을 냉장고에서 꺼내어 완전히 혼합한다. 이어서 BA 500 ml를 500 mL 원심분리 병으로 옮긴다. 이어서 초원심분리기를 사용하여 이들을 10,000 rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 100 mL PBS 중에 재현탁시켜, 5 X 10 9개 입자/ml 원액을 생성하고, 이를 분취하고 -80℃에서 동결시켰다.
동물 유지 조건
동물을 순응 및 연구 기간 동안 마이크로-아이솔레이터 고체-바닥 케이지에서 사회적 수용하였다. 동물을 하기와 같이 표준 광 주기 하에 유지시켰다: 12시간 암, 12시간 명 (불 켬: 6:30 AM, 불 끔: 6:30 PM), 실내 온도 21 - 23℃ 및 습도 30 - 70%. 순응 및 연구 기간 동안, 동물이 설치류 식이 및 물에 자유롭게 (ad lib) 접근하게 하였다.
실험 조건
BMP 리포터 유전자 검정에서 항체 활성의 결정
전형적 검정에서, 혈청을 2%로 감소시킨 것을 제외한 기초 배양 배지 25ul 중의 384-웰 플레이트 상에 0.6 X 104 BRE-Luc2 HEP3B 세포를 시딩하였다. 다음날 PBS 중에 희석시킨 항체를 첨가하고, 이어서 BMP6을 10 ng/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 어떠한 혈청도 존재하지 않는 EMEM 배지로 부피를 50ul에 이르게 하여 최종 혈청 농도 1%가 되게 하였다. 카운터 검정으로서, BMP2/4/7에 의한 활성화를 병행하였다. 엔비전 플레이트 판독기 (퍼킨엘머(PerkinElmer))를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 브라이트글로 검정 (프로메가)을 항체 첨가 24시간 후에 수행하였다. 데이터는 대조군 항체에 의한 완전 리포터 활성화와 비교 시 각각의 항체에 대한 억제의 퍼센트로서 계산하였다.
래트에서의 단일 용량 항체 약동학 연구
래트 PK 선별 연구는 규정된 통계적 확실성으로 전형적 PK 파라미터를 결정하고자 하는 것이 아니고, 오히려 시험 항체에 대한 혈청 반감기의 추정치를 제공하기 위한 것이다. 3마리의 동물에게 항체의 단일 IV 용량을 주사하였다.
마우스 용량-반응 PK/PD 연구를 위해, 동물을 동일한 수의 2개의 분리 코호트로 나누었다. 각각의 코호트는 비히클- 및 화합물-처리된 마우스 둘 다를 포함한다. 한 코호트는 제2일, 제4일에 분석에 적용하는 한편, 제2 코호트는 항체 주사 후 제6일, 제8일에 분석하였다. 코호트의 분리 이유는 혈청 철 파라미터에 대한 영향이 최소로 유지되도록 일련의 출혈에 대한 필요를 감소시키기 위한 것이다. 동물 그룹을 표 10에 제시한다.
표 10. 설계, 동물 할당 및 시험 물품 용량
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마우스에서의 염증에 의한 빈혈의 확립 및 치유적 치료
주사를 위한 5 X 108개 BA 입자를 하기 방식으로 제조한다 (10마리의 마우스에 대한 예). 200 μl/마우스가 주사될 것이기 때문에 출발 농도는 2.5 X 109개 입자/ml인 것이 필요하다. PBS를 사용하여 스톡을 2-배 희석한다. 예를 들어, 10마리 마우스 X 0.200 μl=2 ml+20% 과잉=2.2 mL의 2.5 X 109개 입자/ml가 필요하다. 1.1 ml BA 스톡+1.1 mL PBS. ESA 처리 1 내지 8일 전 BA 투여는 6 내지 7일 후 무딘 HGB 반응을 발생시키는 것으로 제시되었다.
C57BL/6 마우스에게 BA (3 X 108개 입자/마우스)를 주사하고, 혈청 IL6 수준을 5시간 후 ELISA (KMC0061, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies))에 의해 측정하여 염증 반응을 결정하였다. 모든 BA-처리된 동물에 대한 평균의 95% 신뢰 구간보다 낮은 IL6 농도를 갖는 동물은 연구에서 제외시켜, 일부 그룹에는 5-6마리 미만의 마우스가 남았다. 이러한 제외 프로세스를 수행하여 무딘 ESA 반응에 대해 충분한 염증을 갖지 않는 동물을 포함시킴으로써 생성되는 가-양성 결과의 가능성을 줄였다. 제외 프로세스 후, 마우스에게 제6일에 제시된 바와 같은 항체로 IV 주사하고, EPO (100 g/kg 피하 다르베포에틴 알파, 암젠(Amgen))를 BA 처리와 관련하여 제7일에 100mg/kg으로 투여하였다. ESA 및 항체 요법에 대한 반응을 6일 후에 측정하였다.
약동학, 약역학, 및 효능 종점의 분석
마우스 및 래트 PK/PD 연구를 위해, 혈청 샘플을 항체 주사 후 제시된 시점에 수집하였다. 혈청의 분취물을 사용하여, 1차 포획 항체로서 비오티닐화 항-인간 IgG를 사용하여 자동화된 고처리량 면역검정 시스템 (기로스(Gyros))을 통해 순환 항체 농도를 결정하였다. 각각의 샘플의 제2 혈청 분취물을 정량적 악템라 철 검정 (쿤티크롬(Quntichrom), DIFE-250, 바이오어세이 시스템즈(Bioassay Systems))에 사용하였다. 제3분취물을 이전에 기재된 변형된 절차에 따라 래트 또는 마우스 헵시딘-25 펩티드의 LC-MS 정량화를 위해 프로세싱하였다. 문헌 [Li et al. 2009. J. Pharm. Tox. Meth. 59: 171-80].
BA-유도된 빈혈 및 항체 치료 연구를 위해, 종결 시 심장 천자를 통해 EDTA-코팅된 BD 마이크로 테이너 튜브 내로 최종 출혈을 수득하였다. XT-2000iV 혈액 분석기 상에서의 전혈구 계수 분석을 위해 전혈을 사용하였다. 효능 종점은 HGB, HCT, RETA, 및 RET-HE를 포함한다.
통계적 분석
일원 분산 분석 (ANOVA)에 이어 본페로니의 사후 검정을 수행하여 혈액 파라미터에서의 그룹 차이를 분석하였다 (p< 0.05가 유의한 것으로 간주됨). 데이터를 평균 ± SEM으로 보고한다.
결과
세포 BMP-의존성 전사 검정에서의 BMP6 길항제 항체의 생물학적 활성
모든 3종의 BMP6 길항제 항체 5, 6 및 7은 인간 간세포암 세포주 Hep3B에서 재조합 인간 BMP6-유도된 BMP 리포터 (BRE-luc) 활성의 생물활성을 완전히 억제하고 (0.3nM rhBMP6에 대해 IC50 = 0.4nM) 따라서 1:1 Ag/mAb 몰비에서 활성이거나 또는 우수하다. 항체는 BMP2, 5, 및 7을 포함한 관련 BMP 패밀리 단백질보다 500 배 이상의 윈도우로 우수한 선택성을 입증하였다. 도 1을 참조한다.
래트에서의 BMP6 길항제 항체의 스냅샷 약동학 및 약역학 프로파일
스프라그 돌리 래트에서의 단일 용량 선별 약동학 연구를 BMP6 항체 5, 6 및 7에 대해 경정맥 카테터를 통한 10 mg/kg 체중으로의 IV 주사를 통해 수행하였다. 3종의 항체의 혈청 중 총 항체 농도-시간 관계 (특히 t1/2, MRT)를 표준 프로파일과 비교한 것은 전형적인 인간 IgG와 일치하는 특징을 시사하였다 (도 2 및 표 11 참조). 표적-매개 약물 배치의 어떠한 증거도 존재하지 않았다. 이러한 용량에서, 모든 BMP6 항체는 주사 후 제1일째에 혈청 헵시딘을 검출 수준 미만으로 억제하였다. 헵시딘 발현의 지속적인 강한 억제는 제16일째에 여전히 분명하였고, 이는 활성의 장기 지속기간을 시사한다. 상응하게, 순환 철 농도에서의 일시적인 피크 상승이 항체 주사 후 제2일에 관찰되었고, 수준은 제16일째에 상승된 상태로 유지되었다.
혈청 항체 농도를 단일 항체 주사 후 시간의 경과에 따라 측정하였다. 샘플을 투여 (10 mg/kg, IV) 1시간, 6시간, 1, 2, 4, 8, 16, 28일 후에 수집하였다.
표 11. 단일 용량 래트 선별 PK 연구에서의 주요 파라미터
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또한, 항체 7 (유리 및 BMP6-결합된 것 둘 다)의 총 혈청 농도를 래트 및 시노몰구스 원숭이에서 항체 7의 단일 IV 주사 후에 (래트에서는 10, 3, 1, 0.3, 0.1 및 0.03 mg/kg의 용량으로; 원숭이에서는 3 mg/kg으로) 제시된 시점에서 ELISA에 의해 래트에서는 LLOQ 46 ng/mL (점선)으로 및 원숭이에서는 LLOQ 0.2 ug/mL (점선)으로 측정하였다. 결과를 도 9 (래트) 및 12 (원숭이)에 제시한다.
마우스 및 시노몰구스 원숭이에서 BMP6 항체 처리 후의 혈청 철 파라미터에서의 용량-의존성 반응
BMP6 항체 처리에 대한 철 대사의 용량-의존성 반응을 추가로 규정하기 위해, 나이브 C57BL/6 마우스에게 항체 6을 제시된 바와 같이 0.02로부터 0.5 mg/kg까지의 범위의 증가하는 용량으로 주사하였다. 3종의 항체는 유사한 프레임워크, 설치류 PK 프로파일 및 시험관내 활성을 공유하기 때문에 항체 6을 그들을 대표하는 것으로서 선택하였다. 단일 용량의 0.5 또는 0.1 mg/kg은 처리 2일 후에 혈청 헵시딘을 유의하게 억제하였고, 따라서 혈청 철 농도를 증가시켰다. 그러나, 단지 0.5 mg/kg에서만, 주사 후 최대 8일까지 관찰한 철 대사에 대해 강한 지속 효과가 있었다. 도 3을 참조한다. 이들 결과는 용량-의존성, 포화가능한 표적 중화가 강력한 BMP6 길항제 항체를 사용하여 용이하게 달성될 수 있다는 것을 시사한다.
도 3, 철 대사의 혈청 바이오마커에 대한 BMP6 항체의 용량-의존성 효과를 참조한다. 상부: 제시된 용량으로의 항체 6의 단일 IV 주사 후 시간의 경과에 따른 혈청 hIgG 농도. 하부: 좌측 패널은 단일 항체 6 또는 대조군 인간 IgG 주사 후 혈청 헵시딘 농도의 정량 분석이고, 반면에 우측 패널은 혈청 철 농도이다.
항체 7을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 항체 7에 의한 순환 혈청 헵시딘의 용량- 및 시간-의존성 억제를 수컷 스프라그-돌리 래트에서 시험하였다. 단일 용량의 항체 7을 0.03 mg/kg으로부터 10 mg/kg까지의 범위의 용량으로 IV 주사에 의해 투여한 후 투여 0.25, 1, 2, 6시간, 및 1, 2, 4, 7 및 14일 후에 혈청 샘플을 수집하였다. 혈청 헵시딘 수준을 LC/MS에 의해 LLOQ = 9 ng/mL로 측정하였다. 동일한 동물에서, 혈청 철 수준을 또한 측정하였다. 결과를 도 11에 보고한다.
이들 결과는 본 발명의 항-BMP6 항체가 혈청 철에서 용량-의존성 증가를 유발할 수 있다는 것을 나타낸다. 효과는 항체 투여 후 적어도 2 주 동안 강건하였고 지속되었다.
항-BMP6 항체에 반응한 혈청 철 파라미터에 대한 효과를 또한 시노몰구스 원숭이에서 시험하였다. 수컷 시노몰구스 원숭이에게 항체 7의 단일 정맥내 주사를 3 mg/kg의 용량으로 제공하였다. 주사 후 제시된 날에, 혈청 샘플을 수집하고, 총 혈청 철 (Fe) 및 헵시딘 농도에 대해 분석하였다. 결과를 도 13에 제시한다. 3마리의 개별 동물로부터의 데이터를 나타낸다 (투여-전 기준선 수준에 대해 플롯팅함). 평균 값은 "x" 선으로 표시한다. 혈청 철에서의 증가 및 혈청 헵시딘의 억제가 항체 투여 24시간 후에 관찰되었고, 효과는 28-일 연구 종료까지 내내 유지되었다 (투여-전 수준에 비해). 이들 결과는 본 발명의 BMP6 항체가 비-인간 영장류에서 헵시딘 발현을 강력하게 유도하고, 순환 철 농도를 감소시킨다는 것을 나타낸다.
마우스에서 염증-구동된, ESA-저항성 빈혈에서의 적혈구 파라미터에 대한 BMP6 항체의 효과
염증에 의한 빈혈의 마우스 모델에서 항-BMP6 항체의 치료 유용성을 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 도 4를 참조한다. 브루셀라 아보르투스 항원 (BA)으로 처리된 마우스에서 6일 후 빈혈이 발생하였다. 빈혈 동물을 1일 떨어져서 개시되는 항-BMP6 플러스 항체 재조합 에리트로포이에틴 (EPO)으로 처리하고, 빈혈 진행에 대한 항체 요법의 효과를 BA와 관련하여 제13일에 모니터링하였다. HGB 및 HCT 값은 처리의 개시와 제13일 사이에 감소되었고, 이는 EPO 처리 단독에 대해 저항성이었다. 조합된 BMP6 항체 및 EPO 처리는 EPO 반응을 효과적으로 회복시켰고, HGB 및 HCT 수준을 유의하게 상승시켰다. 이러한 효과는, RETA에서의 지속적 증가에 의해 반영되는 바와 같이, 에리트로포이에틴 활성의 동반 자극, 뿐만 아니라 회복된 망상적혈구 헤모글로빈 함량과 연관되고, 이는 적혈구생성 구획에서의 기능적 철 결핍으로 인한 헴 합성의 교정을 시사한다.
도 4, 염증 마우스 모델의 ESA-저항성 빈혈에서 BMP6 항체의 치유적 치료를 참조한다. 상부: 염증 모델의 BA-유도된 ESA-저항성 빈혈의 실험 스킴. 하부: BA 치료 13일 후의 적혈구생성 파라미터. HGB : 헤모글로빈; HCT: 적혈구용적률; RETA: 망상적혈구 계수; RET-HE: 망상적혈구 헤모글로빈 당량.
* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 대 BA+EPO+hIgG1
실시예 3 - 인간에서의 BMP6 항체의 시험을 위한 임상 계획
임상 시험 계획: 인간 BMP6에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용한 요법의 평가.
말기 신질환 (ESRD)을 갖는 환자는, 만약 있더라도 에리트로포이에틴 (EPO)을 소량 생산하고, 일반적으로 외인성 EPO 주기적 투여 및 Hgb의 EPO-유도된 합성을 가능하게 하는 철의 정맥내 (IV) 주입을 필요로 한다. 만성 혈액투석 (HD) 환자 중 최대 1/3은 주로 철의 세포내 격리로 인해 EPO에 충분히 반응하지 않는다. 헵시딘은 주로 신장에 의해 소거되지만, 투석에 의한 제거는 불충분하다. 따라서, 만성 HD 환자는 유의하게 상승된 헵시딘 수준을 갖는 경향이 있고, 이는 적혈구생성을 위한 철의 가동화를 차단한다. IV 철 요법은 더 이상 효과적이지 않거나, 또는 신체 철 저장이 임계 수준 (높은 혈청 페리틴 수준에 의해 나타내어짐)에 도달하면 권고된다. 현행 가이드라인은 높은 페리틴 수준을 갖는 빈혈 투석 환자에게 IV 철을 제공하는 것을 권장하지 않고, 따라서 이들 환자는 심지어 더 높은 EPO 용량을 제공받을 수 있으므로, EPO 저반응성 빈혈의 잠재적인 연관 위험을 갖는다 (Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group 2012). EPO 저반응성 빈혈은 혈액투석 (Kilpatrick et al. 2008, Lopez-Gomez et al. 2008, Fukuma et al. 2012) 및 복막 투석 환자 (Suttorp et al. 2013)에서 빈혈 및 보다 높은 EPO 용량 둘 다와 관련된, 유의하게 증가된 모든 원인에 의한 사망률의 위험을 부여한다. 본 개시내용의 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 헤모글로빈 (Hgb) 수준을 개선시키면서 동시에 EPO 및 IV 철 투여 필요를 감소시킴으로써 철-제한 빈혈을 갖는 만성 신장 질환 환자에게 이익이 될 수 있다. 보다 낮은 EPO 저항성 지수 (EPO 용량 vs. Hgb 수준의 비)는 보다 낮은 사망률 위험과 상관된다.
요약하면, 본 개시내용의 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 요법의 목적은 격리된 철을 가동화하기 위한 것이고, 이는 이어서 EPO 및 철 투여 필요를 감소시킬 수 있고 Hgb 수준을 개선시킬 수 있으며, 이들은 모두 환자 결과를 개선시킬 것으로 예상된다. 이는 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용한 요법의 최초-인간, 단일 용량 연구이다. 이러한 연구는 만성 혈액투석 환자 집단에서 안전성, 내약성, 약동학, 약역학 및 효능을 평가할 것이다. 이러한 연구의 목적은 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용한 요법이 만성 신장 질환과 연관된 빈혈에서 임상 개발을 추가로 정당화하는지 여부를 평가하기 위한 것이다.
임상시험용 계획
연구 설계
이는 만성 혈액투석 환자 집단에서 안전성, 내약성, PK, PD 및 효능을 평가하기 위한, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 최초-인간, 2-파트, 단일-용량, 비-확증적 연구이다. 파트 1은 최초-인간, 단일-용량, 개방-표지 용량-발견 연구이다. 파트 2는 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 2종의 용량 수준을 비교할 무작위, 이중-맹검, 위약-대조, 단일-용량 연구이다.
안전성 평가는 신체 검사, ECG, 활력 징후, 표준 임상 실험실 평가 (혈액학, 혈액 화학, 혈청 철 지수) 유해 사건 및 심각한 유해 사건 모니터링을 포함할 것이다.
파트 1
파트 1의 목적은 (a) 단일-용량 안전성, PK, PD 및 내약성을 평가하고, (b) 투여 29일 후에 Hgb에서의 증가를 발생시키는 (기준선으로부터 ~ 0.5 g/dL 중앙 변화) 파트 1에서 시험된 최저 용량으로 규정되는, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 최소 PAD를 결정하기 위한 것이다.
파트 1 동안, 스크리닝 방문이 있을 것이고, 여기서 연구에 들어가기 위한 환자의 적격성이 결정될 것이다 (도 6). 적격인 환자는 연구 장소에 수용될 것이고, 기준선 방문 동안 적격성 기준에 대해 재평가될 것이다. 모든 기준선 안전성 평가 결과는 투여 전 이용가능해야 하고 검토되어야 한다.
도 6은 파트 1에 대한 연구 설계의 개관을 제공한다. 환자는 그의 상용 투석 방문 직후 제1일에 연구 장소에 도착할 것을 요청받을 것이다. 이어서 환자는 인간 BMP6에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 주입을 제공받을 것이다 (정확한 용량은 코호트에 의존할 것임). 가능한 경우에, 투여는 2일의 투석간 전의 투석 일 (예를 들어 금요일 또는 토요일)에 바람직하게 행해질 것이고, 그 날의 투석 세션 후에 이루어질 것이다. 그러나 가능하지 않을 경우에, 투여는 2일의 투석간 전이 아닌 투석 일에 이루어질 수 있다. 투여 후, 파트 1에서의 첫번째 2명의 환자는 안전성 및 PK/PD 평가를 위해 적어도 48시간 동안 정주될 것이다. 환자는 PK /PD 평가를 위해 제4일 및 제6일에, 및 이어서 PK 평가를 위해 총 29일, 및 안전성 평가를 위해 총 12주 동안 매주 연구 장소로 되돌려질 것이고, 최종-연구 방문은 대략 제85일이다. 투석-후 PK 평가 이외의 모든 실험실 시험을 포함한 연구 방문은 환자의 스케줄링된 투석 방문 전에 이루어져야 한다.
파트 1은 약리학적으로 활성이 아닌 것으로 예측되는 용량으로 개시될 것이다. 용량은 통계적 고찰 섹션에서 논의되고 도 7에 제시된 바와 같이 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 단일 용량 후 Hgb에서의 각각의 코호트의 중앙 변화 및 트랜스페린 포화 (TSAT) 수준을 기반으로 하여 각각의 후속 파트 1 코호트에 대해 조정될 것이다. 이러한 결정 트리의 목적은 철 가동화를 유도하고 (투여-후 1주에 6-환자 코호트에서 적어도 4명의 환자에서 관찰되는 > 50%의 트랜스페린 포화 (TSAT) 수준에 의해 제시되는 바와 같음) Hgb를 증가시키는 최소 실현가능한 용량을 확인하기 위한 것이다. 투여 29일 후에 철은 가동화되었지만 Hgb가 적어도 0.5 g/dL 증가하지 않는 경우에, 잠재적 혼동 요인 (예를 들어 과도한 비-연구 정맥절개술로 인한 혈액 손실)을 평가하기 위해 임상 데이터가 분석될 것이다. 적용가능한 조사자 및 후원사로부터의 대표(들)는 각각의 코호트의 유해 사건을 검토할 것이고, (a) 만성 신부전과 연관된 공지된 의료 문제 및 (b) 비임상 독성학 발견과 관련하여 이들 사건을 평가할 것이다. 후속 코호트는 조사자 및 후원사가 그것이 진행하기에 안전하다고 제시할 때까지 투여되지 않을 것이다.
도 7은 파트 1에서의 용량의 조정을 위한 알고리즘을 제공한다. Hgb 측정을 포함한 혈액 작업은 투석-전 이루어질 것이다. 출발 용량은 0.01 mg/kg일 것이다. 파트 1에서, 환자는 각각 최대 6명의 환자의 최대 6개의 개방 표지 용량 코호트 중 하나로 할당될 것이다. 상기에 정의된 바와 같은, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 최소 PAD는 파트 2를 위해 선택되는 보다 낮은 용량 부문일 것이다. 각각의 후속 코호트에 대한 용량은 도 7에 제시된 바와 같이 더 높거나 또는 더 낮게 조정될 수 있다. 최소 실현가능한 용량 (0.001 mg/kg)이 Hgb에서 ≥ 0.5 g/dL의 중앙 증가를 발생시키는 경우에, 이는 파트 2를 위해 선택되는 최소 PAD 및 보다 낮은 용량일 것이고, 파트 1에서 평가된 다음 최고 용량은 파트 2를 위한 보다 높은 용량 부문일 것이다. 파트 1에서 평가된 최고 용량 (0.1 mg/kg)이 최소 PAD인 경우에, 파트 2는 단지 2개의 부문: 위약 및 최소 PAD로만 진행될 것이다. 파트 1에서 추가의 용량 코호트가 필요한 경우에, 이들 코호트는 본원에 기재된 바와 같이 추가될 것이다.
각각의 파트 1 코호트는 6명의 환자를 포함할 것이다. 파트 1의 제1 코호트에서 처음 2명의 환자는 적어도 7일 떨어져서 투여될 것이다. 후속 파트 1 코호트 환자 투여의 시기는 각각의 장소의 스케줄 및 지지 자원에 대해 실현가능한 바에 따라 이루어질 것이다. 모든 파트 1 환자는 투여 후 12주 동안 추적될 것이다.
파트 2
파트 2의 목적은 (a) 안전성, PK, PD, 및 내약성을 평가하고, (b) 인간 BMP6에 결합하는 항체 vs. 위약의 단일 용량에 대한 반응으로 Hgb 변화에 기초하여 효능을 결정하기 위한 것이다. 파트 2는 최대 3개 부문: 최대 2개의 Ab 용량 부문 및 위약 부문을 포함할 것이다 (도 8). 2개의 Ab 용량 부문은 파트 1에서 생성된 데이터로부터 유래될 것이다. 파트 2는 3개의 부문에 대해 1:1:1로 무작위화된 대략 60명의 환자를 포함할 것이다. 파트 1에서, 최소 PAD가 또한 평가된 최고 용량 (0.1 mg/kg)인 경우에, 파트 2는 단지 2개의 부문: 최소 PAD 및 위약만을 가질 것이다. 이 경우에, 40명의 환자는 2개의 부문으로 1:1의 무작위화 비로 무작위화될 것이다. 파트 2의 샘플 크기는 파트 1에서 Hgb에서의 기준선으로부터의 변화의 변동성에 기초하여 조정될 수 있다.
도 8은 파트 2를 위한 연구 설계를 제공한다. 파트 2 동안, 스크리닝 방문이 있을 것이고, 여기서 연구에 들어가기 위한 환자의 적격성이 결정될 것이다. 적격인 환자는 기준선 방문 동안 적격성 기준에 따라 재평가될 것이다. 모든 기준선 안전성 평가 결과는 투여 전 이용가능해야 하고 검토되어야 한다.
환자는 그의 상용 투석 방문 직후 제1일에 연구 장소에 도착할 것을 요청받을 것이다. 이어서 환자는 무작위화 할당에 의해 결정된 바와 같이 Ab 또는 위약의 주입을 제공받을 것이다. 가능한 경우에, 투여는 2일의 투석간 전의 투석 일 (예를 들어 금요일 또는 토요일)에 바람직하게 행해질 것이고, 그 날의 투석 세션 후에 이루어질 것이다. 그러나 가능하지 않을 경우에, 이어서 투여는 2일의 투석간 전이 아닌 투석 일에 이루어질 수 있다. 환자는 제4일 및 제6일에, 이어서 추적 평가를 위해 매주 연구 장소로 되돌려질 것이다. 추적 방문 동안 환자는 상용 안전성 평가를 거칠 것이고, PK 데이터가 또한 85일 동안 수집될 것이다. 연구 방문은 환자의 투석 스케줄과 맞추기 위해 환자의 스케줄링된 투석 방문 후에 이루어질 수 있다. 파트 2에 등록된 모든 환자는 Ab (또는 위약)의 투여 후 12주 동안 추적될 것이다.
EPO 용량 관리 (둘 다의 파트)
둘 다의 파트 동안의 개별 EPO 용량 조정은 각각의 투석 장소의 표준 관리 프로토콜에 따라 관리될 것이다. 장소 프로토콜은 장소 평가의 일부로서 검토될 것이고, 표준 관리 가이드라인 (KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012)의 준수에 대해 체크될 것이다. 연구 동안 임의의 시점에 ≥ 13 g/dL의 Hgb 수준을 달성한 환자는, 표적 수준을 초과하는 Hgb 값을 관리하는 것에 대한 장소-특이적 가이드라인에 더하여, 조사자의 판단 하에 치료 정맥절개술에 의해 관리될 수 있다.
정맥내 철 관리 (둘 다의 파트)
IV 철의 부하 용량 (100 mg/주)을 제공받은 환자는 연구에서 제외될 것이다. 매주 유지 IV 철 (< 100 mg/주)을 제공받은 환자는 이러한 연구에 포함될 수 있다. 매주 유지 IV 철 용량은 Ab 투여 제1주의 시작 시 유지될 것이다. 철 지수는 Ab 투여 후 제1주 동안 모니터링될 것이고, 구출 철 요법 및 유지 IV 철 관리는 혈액투석 단위의 프로토콜을 관리하는 것에 따라 표준 관리 가이드라인을 따를 것이다. 장소 프로토콜은 장소 평가의 일부로서 검토될 것이고, 표준 관리 가이드라인 (KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012)의 준수에 대해 체크될 것이다.
연구 설계의 근거
2-파트 연구 설계에 대한 근거
동일한 환자 집단에서 2개의 파트에 대한 근거는 최소 PAD를 안전하고 효율적으로 확인하여, 잠재적으로 치료 용량 미만에 노출되는 환자 및 코호트의 수를 최소화하는 것을 목적으로 한다. 파트 2는 위약군과 비교 시, 최소 PAD, 및 최소 PAD보다 1 용량 수준 초과 (파트 1에서 결정된 바와 같음)의 효능을 평가할 것이다.
파트 1은 개방 표지 연구에서 Ab의 단일-용량 안전성, 내약성, PK/PD, 뿐만 아니라 최소 PAD를 평가하기 위해 설계된다. 최소 PAD는 Ab 투여 후 29일에 Hgb에서의 각각의 용량 코호트의 중앙 변화를 기반으로 하여 결정될 것이다. PAD 결정 기준에 대한 근거는 EPO에 대한 임상적으로 의미있는 반응이 EPO 용량 변화 후 최대 4주를 요구할 수 있다는 것이다. Ab가 표적 집단에서 철을 가동화하는 경우에, 이는 환자의 현재 EPO 용량이 보다 강건한 적혈구생성 효과를 발휘하도록 할 수 있다. PAD 결정 기준에 열거된 29일 Hgb 범위는 EPO 용량 (29일에 걸쳐 ~ 0.5 g/dL)에 반응한 Hgb에서의 임상적으로 유의하고 & 안전한 증가 속도를 기반으로 한다. 최대 효과보다 오히려 최소 PAD를 찾는 근거는 과도하게 강건한 Hgb 반응은, 현행 표준 관리 가이드라인 (Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group 2012)에서 표적 Hgb 범위에 의해 반영되는 바와 같이, 이러한 환자 집단에서 안전성 위험이라는 점이다. 파트 1에서의 안전성 및 내약성 평가의 목적은 (a) 안전성 신호를 확인하고, (b) 용량 조정 결정에 대해 정보를 제공하여, 파트 2를 위해 선택된 용량 (최소 PAD + 1 용량 초과)이 위약에 비해 안전성 및 효능 둘 다의 추가의 평가에 적합하게 하는 것을 보장하기 위한 것이다. 파트 1은 비편향된 안전성 평가를 제공하는데 불충분한 한편, 파트 2에서의 위약 그룹 및 보다 큰 샘플 크기는 최소 PAD 및 1 용량 초과에서 비편향된 안전성 평가를 가능하게 할 것이다. 안전성, 내약성, 및 PK/PD에 더하여, 파트 2는 이중-맹검 연구에서 효능 vs. 위약을 평가하기 위해 설계된다. 효능 평가는, 주요 2차 종점으로서 EPO 저항성 지수 (ERI = 매주 중량-조정된 EPO 용량 / Hgb)와 함께, 주로 Hgb를 기반으로 할 것이다. ERI는 주어진 Hgb 값을 달성하는데 필요한 EPO의 양의 정량적 척도를 제공하고, 따라서 Hgb 단독에 더하여 임상적으로 중요한 정보를 제공한다.
투석 환자에서의 FIH를 위한 근거
이러한 최초-인간 (FIH) 연구는 건강한 지원자 (HV)보다는 오히려 만성 혈액투석 (HD) 환자에서 수행될 것이다. HV에서의 항-인간 BMP6 Ab에 대한 안전성, 내약성, 및 PK/PD 반응의 평가는 여러 이유로 만성 HD 환자에 대해 해석가능하지 않을 가능성이 있다:
HV와는 달리, 빈혈, 높은 혈청 페리틴, 및 낮은 TSAT을 갖는 만성 HD 환자는 만성적으로 축적된 세포내 철 저장을 갖는다. 따라서, 낮은 용량의 Ab에 대한 반응으로 철 가동화와 관련된 안전성, 내약성 및 약리학적 효과는 만성 HD 환자에서 가장 적절하게 평가된다. 정상 신기능을 갖는 HV에서, 헵시딘 (BMP6이 그의 주요 조절제임)은 신장에 의해 여과되고, 소변으로 효율적으로 배설되어, 낮은 순환 수준으로 이어진다. 대조적으로, 헵시딘은 투석에 의해 덜 효율적으로 일시적으로 여과되어, 만성 HD 환자에서는 보다 높은 순환 수준으로 이어진다 (Zaritsky et al. 2010). 게다가, 정상 신장은 내인성 EPO 수준을 동적으로 조정할 것이고 Hgb에서의 변화는 Ab에 대한 반응인지 분명하지 않을 수 있다. 따라서, BMP6 경로에 의한 헵시딘의 조정 및 Hgb에 대한 Ab의 효과와 관련된 안전성 및 내약성은 만성 HD 환자에서 가장 적절하게 평가된다.
표적 환자 집단에 대한 근거
이 연구는 EPO-저반응성, 철-제한 빈혈의 설정에서 항-인간 BMP6 Ab를 평가하기 위해 설계된다. 확립된 임상 가이드라인 (KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012)은 EPO 저반응성을 안정한 Hgb 농도를 유지하기 위해 안정한 용량을 최대 50% 초과하는, EPO 용량에서의 2회의 증가를 필요로 하는 것으로서 규정한다. 제안되는 적격성 기준은 빈혈을 갖는 안정한 만성 HD 환자 및 철 제한의 임상 지표: 증가된 페리틴 및 낮은 TSAT (TSAT = 혈청 철 / 총 철 결합 능력; TSAT은 혈청 철과 매우 밀접하게 상관됨)에 대한 선택을 위해 설계된다. 게다가, EPO 및 IV 철 용량에서의 조정은 표적 Hgb, TSAT, 및 페리틴에 대한 엄격한 표준 관리를 고수할 것이다. 이러한 설계는 철 및 혈액 파라미터에서의 변화가 표준 관리에 따라 계속 관리될 것이기 때문에 목적하는 Hgb 표적을 지나칠 위험을 감소시킨다. 게다가, 기준선 전 1주 내에 부하 용량의 IV 철을 제공받은 환자는 제외될 것이다. 유지 IV 철을 제공받은 환자는 포함될 수 있다 (모든 다른 적격성 기준을 충족시키는 경우). 이들 환자를 포함시키는 근거는 미국에서의 현행 표준 관리가 Hgb 및 TSAT가 좁은 제한 내에서 유지되도록 지시하고 있다는 점이고, 따라서 보다 낮은 TSAT 적격성 기준을 충족시킬 목적으로 유지 철 요법의 완전한 철회는 환자를 표준 관리에 따라 IV 철 부하 용량 과정을 필요로 하는 25% 미만의 TSAT 위험에 놓이게 할 것이다. 그러나, 유지 IV 철에 대해 적격인 환자는 그의 매주 IV 철 투여가 Ab 투여 주의 시작 시에 실시될 것이고, 유지 IV 철 요법은 오직 모니터링된 철 지수를 기반으로 한 장소의 표준 관리 프로토콜에 의해 결정되는 바와 같이 재개할 것이다.
용량/요법, 치료 지속기간의 근거
출발 용량 근거
최대 권장 출발 용량 (MRSD)은 래트 및 시노몰구스 원숭이에서 수행된 13-주 (14-용량) GLP 독성학 연구로부터의 무 유해 효과 수준 (NOAEL)을 기반으로 하여 계산하였다. 동물에게 0.1, 1, 10, 및 100 mg/kg의 매주 IV 볼루스 용량을 제공하였다. 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 최종 투여 후 1 및 100 mg/kg 용량 그룹 (유일)을 후속해서 래트에서는 16주 동안 또는 시노몰구스 원숭이에서는 24주 동안 추적하였다. MRSD는 먼저 이들 연구 (0.1 mg/kg)로부터 NOAEL에 대해 인간 등가 용량 (HED)을 계산하고-분자량이 > 100 kDa인 약물에 대해 적절한 것으로 간주되는 접근법- 후속해서 비임상 종과 환자 사이의 차이, 예컨대 저장된 철의 양 및 적혈구생성에 대한 요구를 고려하기 위해 안전성 인자 10을 적용하여 추정하였다. 비임상 종에 대한 PK 파라미터는 IND-허가 독성학 연구 동안 수집된 독성동태학 (TK) 데이터로부터 추론하였다. 이어서 환자에서 상응하는 PK 파라미터를 알로메트릭 척도화를 사용하여 추정하고, 이들 파라미터를 사용하여 주어진 용량에 대한 환자에서의 시간의 함수로서 유리 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 농도를 예측하였다. 독성학 연구로부터의 TK 데이터를 환자에서 모델-기반 Ab PK와 비교한 것은 NOAEL/HED보다 10-배 미만의 용량이 Ab 농도를 기반으로 하여 (최소) 10-배 여유를 생성하는 것으로 예측된다는 것을 나타내었다.
동물 연구에서 Ab에 대한 반응으로 관찰된 혈청 철의 최대 수준은, IV 철 요법을 투여받은 HD 환자가 건강한 동물보다 더 높은 철의 조직 저장을 가질 가능성이 있기 때문에, Ab에 대해 예측되는 인간 철 반응을 과소추정할 수 있다. 그러나, 건강한 비-빈혈 동물과 달리, HD 환자는 적혈구생성을 위해 방출된 혈청 철을 이용할 것으로 예상되고; 따라서 동물 모델은 철 상승의 지속기간을 과대추정할 수 있다. 13-주 연구에서 관찰되는 간 병리상태는 4-주 연구에서는 관찰되지 않았고, 이는 독성이 철의 급성 방출에 대한 반응이라기 보다는 혈청 철에 대한 누적 반응으로 인한 것임을 시사한다.
비임상 종과 환자 사이의 저장된 철에서의 예상되는 차이를 설명하기 위해, 혈청 철 농도의 모델-기반 분석을 기반으로 하여 MRSD를 또한 예측하였다. 독성학 발견을 발생시킨 혈청 철에 대한 누적 노출이 철 곡선하 면적 (Fe AUC)으로서 나타내어진다. 이러한 접근법에서, NOAEL 용량 (0.1 mg/kg)을 위해 계산된 Fe AUC는 충분히 안전한 것으로 간주된다. 이어서 환자에서 제안되는 MRSD에서의 Fe AUC를 예측하고, 비임상 종에서 NOAEL에서의 Fe AUC와 비교하였다. 환자에서 MRSD에서의 모델-예측 혈청 철 노출이 비임상 종에서 NOAEL에서의 것보다 > 10-배 더 낮았기 때문에, NOAEL/HED를 안전성 인자 10만큼 감소시키는 것은 MRSD의 추정에 충분한 것으로 간주되었다. 따라서 제안되는 MRSD는 0.01 mg/kg이다.
용량 조정 근거
이 연구를 위해, 최대 시험 용량 (xmax)은 각각의 2회의 IND-허가 독성학 연구에서의 NOAEL에 상응하는 HED 일 것이다: 0.1 mg/kg. 최소 실현가능한 시험 용량 (xmin)은 상용성 연구를 기반으로 한 최저 기술적으로 실현가능한 용량이다: 0.001 mg/kg. MRSD (x0)는 안전성, TSAT, 및 Hgb 기준에 따라 평가될 것이다 (도 7). x0이 투여전에 비해 Hgb에서 < 0.5 g/dL의 중앙 변화를 발생시키는 경우에, x0과 xmax 사이의 자연 밑수 로그 눈금 (S자형 용량-반응의 예상에서)에의 선형 외삽에 의해 x + (도 7)의 선택이 유도될 것이다. 이러한 용량 증량을 위한 잠정 용량이 상기 제공된다. 이들 잠정 용량은 각각의 코호트 사이에서 비공식 중간 분석 동안 데이터의 검토를 기반으로 하여 조정될 수 있다. 이러한 접근법은 최소 PAD가 확인되거나 xmax가 도달될 때까지 계속될 것이다. xmax가 Hgb에서 < 0.5 g/dL의 중앙 변화를 발생시키는 경우에, 이러한 용량의 안전성이 평가될 것이고, 안전성, PK, 및 PD 데이터를 기반으로 하여 xmax를 초과하는 용량에서 추가의 코호트를 추가하기 위해 프로토콜을 수정할 지의 결정이 이루어질 것이다. 파트 1에서 시험된 최고 용량이 Hgb에서 < 0.5 g/dL의 중앙 증가를 발생시키고 TSAT를 50% 초과로 증가시키지 않고, 그러한 용량이 xmax 미만인 경우에, 프로토콜은 추가의 코호트를 추가하기 위해 수정될 수 있다.
그 대신 x0이 투여전에 비해 Hgb에서 ≥ 0.5 g/dL의 중앙 변화를 발생시키는 경우에, 다음 코호트를 위한 용량은 xmin으로 조정될 것이다. xmin이 또한 Hgb에서 ≥ 0.5 g/dL의 중앙 변화를 발생시키는 경우에, xmin은 최소 PAD로 간주할 것이고, xmin 및 x0은 파트 2에서 평가될 것이다. xmin이 Hgb에서 < 0.5 g/dL 및 TSAT에서 ≤ 50%의 중앙 변화를 발생시키는 경우에 (도 7), 용량은 최소 PAD가 확인될 때까지 또는 6 용량 (코호트)이 평가될 때까지 자연 밑수 로그 눈금 상의 간격 (xmin, x0) 내에서의 선형 외삽에 의해 증가될 것이다. 간격 (xmin, x0) 내에서의 잠정 용량이 상기 제공된다. 이들 잠정 용량은 각각의 코호트 사이에서 비공식 중간 분석 동안 데이터의 검토를 기반으로 하여 조정될 수 있다. 최소 PAD는 투여전에 비해 Hgb에서 ≥ 0.5 g/dL의 중앙 변화를 발생시키는 시험된 최저 용량으로서 정의될 것이다.
Ab는 비임상 독성학 연구에서 유해 발견과 연관된 것보다 낮은 혈청 철 노출 (Fe AUC)을 보증하기 위해 단일 용량 IV 주입으로서 투여될 것이다. Ab 용액은 PK 또는 투여 직후 철 생체이용률에 대한 투석의 잠재적 영향을 최소화하기 위해 혈액투석 세션 직후 제1일에 주입될 것이다. 투석 후 추가의 대략 30분의 투여 주입 (오직 투여 일)은 환자에게 어떠한 유의한 위험 또는 불편을 제기할 것으로 예상되지 않는다.
비교자의 선택에 대한 근거
위약은 임상 결과의 비편향된 평가를 가능하게 하기 위해 파트 2에서 비교자로서 사용된다.
중간 분석/설계 적응의 목적 및 시기
파트 1에서, 각각의 코호트의 6명의 환자가 제4주 투여후 평가를 마친 후, 다음 코호트를 위한 용량 조정 결정을 위해 비공식 중간 분석이 수행될 것이다. 안전성 및 PD 마커는 적용가능한 조사자 및 후원사로부터의 대표(들)를 포함한 용량 조정 팀의 모든 구성원에 의해 검토될 것이다. 새로운 코호트는 안전성 및 내약성이 확인되고 PD 조건이 도 7에 기재된 바와 같이 충족되는 경우에만 촉발될 것이다. 파트 1에서는 최대 5회의 비공식 중간 분석이 존재할 것이다. 공식 중간 분석은 파트 1의 최종 코호트로부터의 모든 환자가 제4주 투여후 평가를 마친 후 조사되는 용량의 임상 효과를 평가하고 추가의 비-임상 연구를 잠재적으로 촉발하기 위해 계획되고, 후속 임상 연구에 대해 파트 1에서 수행된 최종 코호트의 제29일에 걸쳐 수집된 체온, 혈압, 맥박수, ECG 평가, 혈액 화학, 혈액학 철 지수, EPO 저항성 지수, 및 유해 사건을 통지할 수 있다.
최소 PAD 및 최소 PAD보다 1 수준 높은 용량이 파트 2를 위해 선택될 것이다. 최저의 가능한 시험된 용량이 ≥ 0.5 g/dL의 Hgb 증가를 유도하는 경우에, 시험된 2종의 최저 용량이 파트 2를 위해 선택될 것이다.
위험 및 이익
이 연구에 참여한 환자에 대한 잠재적 이익은 치료 기간 동안의 및 약간의 기간을 초과하는 동안의 감소된 EPO 및 IV 철 필요, 및 개선된 Hgb 수준을 포함할 수 있다.
이 시험에서 환자에 대한 위험은 적격성 기준을 준수하고 Ab 투여 후 처음 48시간 동안 모든 환자를 근접 임상 모니터링함으로써 (및 파트 1에서의 처음 2명의 환자를 정주시킴으로써) 최소화될 것이다.
철 가동화와 연관된 잠재적 위험은 (a) 조직 및 기관 예컨대 비장, 간, 심장, 췌장, 및 뇌하수체에의 철 재분포, 및 (b) 특히 유치 혈관 카테터를 갖는 환자에서, 박테리아 감염에 대한 적은 증가된 감수성을 포함한다. 몇몇 적격성 기준은 합병증의 위험을 감소시킨다. 간 기능 검사의 증가된 수준은 철 재분포과 연관되어 관찰될 수 있다. 간 기능은 혈액학 및 철 파라미터와 병행하여 모니터링될 것이다. 표준 관리 Hgb 표적을 지나치는 것은 다혈구혈증을 야기할 수 있다. Hgb, EPO 요법, 및 철 요법의 관리가 수행될 수 있다
IV 철 요법이 투여된 HD 환자는 건강한 동물보다 더 높은 조직 철 저장을 가질 수 있고; 따라서 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 치료받은 환자에서 관찰되는 혈청 철의 최대 수준은 동물 연구에서 관찰되는 것을 초과할 수 있다. 그러나, 건강한 동물과 달리, HD 환자는 적혈구생성을 위해 방출된 혈청 철을 이용할 것으로 예상되고; 따라서 동물 모델은 철 상승 지속기간을 과대추정할 수 있다. MRSD에서의 Ab에 대한 모델-예측 노출 (예를 들어, Cmax, AUC)은 비임상 연구에서 NOAEL에서 관찰되는 것보다 10-배 낮은 것으로 예상된다. 이러한 노출은 전임상 연구에서 관찰된 상승된 간 트랜스아미나제 및 간에서의 단세포 괴사와 연관된 혈청 철 노출 (AUC) 수준을 야기할 것으로 예상되지 않는다. NOAEL로의 Ab 용량의 증량은 기재된 안전성 평가 후에 이루어질 것이다. 만성 철 과부하를 갖는 환자 뿐만 아니라 비경구 철을 제공받은 환자에 의한 임상 경험은 Ab에 의해 유도된 세포내 철에서의 급성 증가로부터 발생할 수 있는 효과를 반드시 예측하지는 않을 것이다. 따라서 Ab-유도된 급성 철 독성의 잠재적 위험은 아마도 낮을 것이다. 급성 철 독성은 심장, 간 및/또는 췌장에 영향을 미칠 수 있다. 급성 철 독성의 임상 징후는 심장 전도 결손, 상승된 간 트랜스아미나제, 및 글루코스 불내성/고혈당증을 포함할 수 있다. 중증 급성 철 독성은 또한 대사성 산증, 전해질 이상, 및 신경계 징후를 포함할 수 있다. 급성 철 독성이 발생한 경우에, 환자는 혈액투석과 조합된 철 킬레이트화 요법 예컨대 데페록사민으로 응급 치료받을 수 있다. 연구의 일부로서 각각의 환자로부터 115일의 기간에 걸쳐 최대 134 mL (파트 1) 및 172 mL (파트 2)의 혈액을 수집할 것으로 계획된다. 임의의 안전성 발견의 모니터링을 위한 추가의 샘플이 여기에 추가될 것이다. 이는 이러한 집단에 대한 위험으로 간주되지 않는다.
지금까지 항-인간 BMP6 항체를 사용한 어떠한 생식 독성 연구도 수행되지 않고 있다. 수컷 또는 암컷 생식 기관에 대한 잠재적 효과는 시노몰구스 원숭이에서의 13-주 독성 연구에서 난소 및 고환 및 부생식 기관의 주의깊은 표준 조직병리학적 검사에 의해 평가되어 왔다. 어떠한 치료-관련 효과도 관찰되지 않았다. BMP6 녹아웃 마우스는 지연된 흉골 경화 및 철 과부하를 제시하였다 (Meynard et al. 2009).
유의한 태아 및 모체 이환율 및 사망률은 만성 혈액투석과 연관된다. 만성 혈액투석 중의 여성 (267 출생)과 신장 이식을 받은 여성 (264 출생)을 비교한 하나의 후향적 코호트 연구에서, 혈액투석 중의 여성은 더 높은 비율의 태반 조기박리, 수혈, 임신 기간에 비해 저체중 아기, 태아 사망 및 모체 사망을 입증하였다 (Saliem et al. 2015). 따라서, 가임 여성은 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 투여 동안 및 최종 투여 후 125일 동안 임신을 방지하기 위해 고도로 효과적인 피임을 사용하여야 한다.
집단
연구 집단은 1주에 적어도 2회의 만성 혈액투석 요법을 필요로 하고, 페리틴 및 트랜스페린 포화 수준에 의해 결정된 바와 같은 명백하게 충분한 철 저장의 존재 하의 빈혈로 정의되는, 기능적 철-결핍성 빈혈의 임상 증거를 갖는 말기 신질환을 갖는 환자로 구성될 것이다. 파트 1은 처음에 6개 코호트에서의 최대 36명의 환자 (6명의 환자/코호트)를 평가할 계획을 포함한다. 6개의 코호트 후에, TSAT 및 Hgb에 대한 어떠한 효과도 관찰되지 않고 어떠한 안전성 우려도 존재하지 않는 경우에 (적용가능한 조사자 및 후원사로부터의 대표(들)에 의해 결정된 바와 같음), 최대 2개의 추가의 6-환자 코호트를 추가할 수 있다 (파트 1에서 총 48명의 환자). 파트 2는 최대 3개의 부문 (파트 1로부터 추가의 평가를 위해 선택된 2 용량 수준, 및 위약 그룹)으로, 부문당 최대 대략 20명의 환자로 이루어진다 (파트 2에서 총 60명의 환자). 따라서, 총 대략 96명의 환자 (최대 108명까지)의 등록이 계획되고, 이 중 대략 60명은 파트 2에서 무작위화될 것이다. 대략 60명의 환자 (파트 1에서 12명, 파트 2에서 48명)가 연구를 완료할 것으로 예상된다. 조사자는 연구를 위해 고려되는 모든 환자가 하기 적격성 기준을 충족시킨다는 것을 확실하게 하여야 한다. 연구 집단이 모든 적격 환자를 대표하도록 하기 위해 조사자에 의해 어떠한 추가의 기준도 적용되지 않아야 한다.
환자 선택은 스크리닝 및 제1 기준선에서 모든 적격성 기준을 통해 체크함으로써 확립된다. 적격성 기준의 관련 기록 (예를 들어, 체크리스트)은 연구 장소에 자료 문서와 함께 저장되어야 한다. 임의의 참가 기준에서 벗어나면 환자는 연구 등록에서 제외한다.
포함 기준 (둘 다의 파트)
이 연구에 포함되기에 적격인 환자는 하기 기준 모두를 충족시켜야 한다:
1. 서면 사전 동의가 임의의 평가가 수행되기 전에 입수되어야 한다. 동의가 서면으로 표현될 수 없다면, 그것은 이상적으로는 독립적인 신뢰되는 목격자를 통해, 형식적으로 문서화되고 목격되어야 한다.
2. 스크리닝 시 연령 ≥ 18세.
3. 스크리닝 전 적어도 2개월 동안 혈액투석-의존.
4. 말기 신질환을 위해 1주에 적어도 2회의 충분한 혈액투석을 받음; 적당한은 스크리닝 전 가장 최근의 매월 평가에서 Kt/V ≥ 1.2로서 정의됨.
5. 투석 장소의 빈혈 관리 프로토콜에 따라, 만성 에리트로포이에틴 (EPO) 요법을 받음. EPO 용량은 기준선 전 14일 동안 50% 이상 증가되지 않음. EPO 요법은 단지 단기-작용 제제이어야 하고 (다르베포에틴이 아님), IV 투여되어야 함 (SC가 아님).
6. Hgb ≥ 8.5 및 < 11.5 g/dL를 포함한 Hgb ≥ 8.5, 및 기준선 vs. 14일 전에 ≥ 0.5 g/dL만큼 증가하지 않음.
7. 기준선 전 적어도 28일 동안 (스크리닝을 포함할 수 있음) 페리틴 200 - 2000 ng/mL (포함).
8. 기준선 전 90일 동안 최소 1회의 시점에 TSAT ≤ 30%, 및 기준선에서 TSAT ≤ 30%.
제외 기준 (둘 다의 파트)
하기 기준 중 임의의 것을 충족시키는 환자는 이 연구에 포함되기에 적격이 아니다. 연구 집단이 모든 적격 환자를 대표하도록 확실하게 하기 위해 조사자에 의해 어떠한 추가의 제외도 적용될 수 없다.
1. 등록의 5 반감기 이내, 또는 예상되는 약역학적 효과가 기준선으로 복귀될 때까지 (이들 중 보다 긴 기간) 다른 임상시험용 약물의 사용.
2. 연구 약물 또는 치료 항체에 대한 과민성의 병력.
3. 혈색소증의 공지된 진단.
4. 공지된 골수 악성종양, 림프 악성종양 또는 골수이형성 증후군.
5. 스크리닝 전 2개월 내의 투석 AV 누공 혈전증의 병력, 또는 스크리닝 전의 6개월 내의 AV 누공 혈전증의 2회 이상의 에피소드.
6. 중증 동반이환 간 질환/기능장애 (차일드-퍼 점수 ≥ 6) 또는 이전 간 이식
7. 심부전 (뉴욕 심장 학회 (NYHA) 기능 분류 III 또는 IV)
8. 스크리닝의 과거 2개월 내에 개입을 필요로 하는 위장 출혈. C형 간염 바이러스 (HCV) 감염을 갖는 환자는 다른 모든 간 기능 적격성 기준이 충족되면 포함될 수 있다.
9. 기준선 전 4주 이내 ALT, AST 또는 빌리루빈 ≥ 1.5x ULN.
10. 스크리닝 시 무손상 PTH ≥ 750 pg/mL로 규정되는 비제어 신장 골이영양증.
11. 스크리닝 전 2주 동안 임의의 시점에 항생제 요법을 필요로 하는 심각한 감염, 예컨대 유치 혈관 카테터 (중심 정맥 라인 또는 혈액투석 카테터) 또는 활성 감염의 증가된 위험의 소인이 있는 상태.
12. 기준선 전 4주 내에 투여된 수혈.
13. 기준선 전 1주 내에 부하 용량 (100 mg/주) IV 철을 제공받음.
14. 투여 전 12개월 내에 약물 또는 알콜 남용의 병력, 또는 스크리닝 동안 수행된 실험실 검정에 의해 나타난 바와 같은 이러한 남용의 증거.
15. 양성 B형 간염 표면 항원 시험 결과.
16. 양성 HIV (ELISA 및 웨스턴 블롯) 시험 결과를 포함한, 면역결핍 질환의 병력.
17. 가임 여성은 인간 BMP6에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 사용한 투여 후 최소 125일 동안 고도로 효과적인 피임을 사용한 경우에 본 연구에 등록될 수 있음. 고도로 효과적인 피임은 다음 중 하나로서 규정된다: a. 완전한 금욕 (이것은 환자의 바람직하고 통상적인 생활방식에 따르는 경우임. 주기적 금욕 (예를 들어, 캘린더, 배란, 증상체온법, 배란후 방법) 및 회피는 피임의 허용되는 방법이 아님) b. 남성/여성 불임법 c. 경구, 주사 또는 이식형 피임 호르몬 방법의 사용 또는 자궁내 장치 (IUD) 또는 자궁내 시스템 (IUS)의 배치 또는 대등한 효능 (실패율 <1%)을 갖는 다른 형태의 호르몬 피임, 예를 들어 호르몬 질 링 또는 경피 호르몬 피임.
치료
임상시험용 치료
본 연구에서 임상시험용 요법은 인간 BMP6에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편, 예를 들어 항-BMP6 IgG1, 완전 인간 항체이다. 항체는 액체 용약 중에 제공된다. 원액 농도는 장소에서 투여될 용량에 따라 희석될 것이다. 주입 시간은 대략 30분으로 코호트에 걸쳐 상대적으로 일정하게 유지될 것이다. 파트 1은 개방 표지 단일 용량일 것이고, 파트 2는 매칭 위약 (비히클 대조군)과 비교하는 이중-맹검, 단일 용량일 것이다. 항-인간 BMP6 Ab 활성 물질 및 위약은 바이알 내의 액체로서 공급될 것이다. 활성 및 위약에서 부형제는 동일하다.
치료 부문
파트 1에서, 환자는 각각 6명의 환자로 이루어진 최대 6개의 용량 코호트 중 1개로 할당될 것이다. 파트 1은 개방 표지 치료이다. 출발 용량, 상부 용량, 및 용량 조정 근거는 상기 기재되어 있다. 파트 1을 위한 잠정 용량은 표 12 (MRSD에서 Hgb < 0.5 g/dL) 및 표 13 (MRSD에서 Hgb ≥ 0.5 g/dL)에 주어진다.
표 12: 파트 1을 위한 잠정 용량 수준
Figure pct00039
이 표는 단지 안내를 위한 파트 1 용량 조정의 예로서 의도된다. 중간 또는 더 높은 용량 수준이 사용될 수 있고, 일부 용량 수준은 각각의 코호트 사이의 비공식 중간 분석 동안의 데이터 평가에 기초하여 건너뛸 수 있다. 실제 용량 수준은 노파르티스(Novartis)에 의한 서면에서 확인될 것이고, 이는 새로운 코호트 내의 환자의 치료 전 모든 참여 연구 장소에 제공될 것이다.
표 13: 파트 1을 위한 잠정 용량 수준
Figure pct00040
이 표는 단지 안내를 위한 파트 1 용량 조정의 예로서 의도된다. 중간 또는 더 높은 용량 수준이 사용될 수 있고, 일부 용량 수준은 각각의 코호트 사이의 비공식 중간 분석 동안의 데이터 평가에 기초하여 건너뛸 수 있다.
연구 치료는 하기와 같이 규정된다:
Figure pct00041
A: 위약의 단일 용량.
Figure pct00042
B: 파트 1에서 결정된 바와 같은, 최소 PAD에서의 항-인간 BMP6 Ab의 단일 용량.
Figure pct00043
C: 파트 1에서 결정된 바와 같은, 최소 PAD보다 1 용량 초과 수준에서의 항-인간 BMP6 Ab의 단일 용량.
병용 치료
연구 시작 전 및 연구 동안 진입 기준에 규정된 기간 이내에 투여되거나 또는 취해진 모든 처방 의약, 일반의약 약물 및 유의한 비-약물 요법 (물리 요법 및 수혈 포함)은 CRF의 병용 의약/ 유의한 비-약물 요법 섹션에 기록하여야 한다. 의약 항목은 상표명, 단일 용량 및 단위, 투여의 빈도 및 경로, 시작 및 중단 날짜 및 요법의 이유에 대해 구체적이어야 한다.
효능 / 약역학
효능 평가가 하기 명시된다. 효능 평가를 위한 샘플은 다양한 시점에 수집될 것이다. 혈액학 실험실이 평가될 것이다. Hgb 및 Fe 지수는 연구의 파트 1 동안 용량 조정 평가의 일부로서 각각의 코호트-간 비공식 중간 분석 동안 검토될 것이다. 초기 샘플 수집 시간 설정이 철과 PK 사이의 관계를 이해하는데 준최적인 것으로 간주되는 경우에, 샘플 수집 시간은 파트 1에서의 후속 코호트에서 변경될 수 있다.
철 지수 패널
항-인간 BMP6 Ab는 신체 저장으로부터 Fe를 가동화하여 혈청 Fe, 트랜스페린 포화 (TSAT), 미결합 Fe 결합 능력 (UIBC), 총 Fe 결합 능력 (TIBC), 페리틴, 및 망상적혈구 헤모글로빈 함량 (CHr)을 포함한 혈청 Fe 파라미터에서 변화를 발생시킬 것으로 예상된다. 이들은 검증된 검정을 사용하여 혈청에서 측정될 것이다.
안전성
안전성 평가가 하기 명시된다.
신체 검사
완전한 신체 검사는 전반적 외관, 피부, 목 (갑상선 포함), 눈, 귀, 코, 인후, 폐, 심장, 복부, 등, 림프절, 사지, 혈관 및 신경계의 검사를 포함할 것이다. 병력 및/또는 증상을 기반으로 하여 제시되는 경우에, 직장, 외부 생식기, 유방, 및/또는 골반 검사가 수행될 수 있다.
연구 약물의 개시 전에 존재하는 중요한 발견은 환자의 eCRF 상의 관련 병력/현재 의학적 상태 스크린에 포함되어야 한다. 유해 사건의 정의를 충족시키는 연구 약물의 개시 후에 이루어진 유의한 발견은 환자의 eCRF 상의 유해 사건 스크린에 기록되어야 한다.
활력 징후
Figure pct00044
체온
Figure pct00045
혈압 (BP)
Figure pct00046
맥박
신장 및 체중
Figure pct00047
신장
Figure pct00048
체중
Figure pct00049
체질량 지수 (BMI)는 (체중 (kg) / [신장 (m)]2)로 계산될 것이다
실험실 평가
실험실 시험 결과의 임상적으로 적절한 편차는 유해 사건을 규정하는 기준에 대해 평가될 것이고, 기준이 충족되면 그대로 보고될 것이다. 결과(들)의 정규화까지 또는 변화가 더이상 임상적으로 적절하지 않을 때까지 반복적 평가가 필수적이다.
혈액학
헤모글로빈, 적혈구용적률, 적혈구 계수, 감별 백혈구 계수 및 혈소판 계수가 측정될 것이다. 철 지수가 모니터링될 것이다.
임상 화학
나트륨, 칼륨, 크레아티닌, 우레아, 클로라이드, 알부민, 칼슘, 알칼리성 포스파타제, 총 빌리루빈, LDH, GGT, AST, 및 ALT가 모니터링될 것이다. 총 빌리루빈 농도가 정상 상한치를 1.5배 초과하여 증가되면, 직접 및 간접 반응 빌리루빈이 구별되어야 한다.
심전도 (ECG)
PR 간격, QRS 지속기간, 심박수, RR, QT, QTc. 프리데리시아 QT 보정식 (QTcF)이 임상 결정에 사용되어야 한다.
임신 및 수정의 평가
임신 검사는 보고된 생식/ 폐경 상태에 관계없이 모든 여성 환자에게 요구된다.
혈청 임신 검사가 이 연구 동안 수행될 것이다. 양성인 경우에, 환자는 시험을 중단하여야 한다.
스크리닝 및 기준선에서 수행 시, 이러한 시험의 결과는 환자에게 투여될 수 있기 전에 수신되어야 한다.
약동학
PK 샘플이 수집될 것이다. PK 데이터는 연구의 파트 1 동안 용량 조정 평가의 일부로서 각각의 코호트-간 비공식 중간 분석 동안 검토될 것이다. 초기 샘플 수집 시간 설정이 PK 프로파일을 특징화하는데 불충분 또는 부적절한 것으로 간주되는 경우에, 샘플 수집 시간은 후속 코호트에서 변경될 수 있다. 혈액 채취의 횟수 및 수집되는 총 혈액량은 프로토콜에서 언급된 것을 초과하지 않을 것이다.
PK 샘플은 모든 환자에서 모든 용량 수준에서 수집되고 평가될 것이다.
유리 항-인간 BMP6 Ab의 농도는 ELISA 검정을 사용하여 결정될 것이다. 예상되는 정량 하한치 (LLOQ)는 10 pg/mL이다.
비치료 (위약) 샘플은 분석되지 않을 것이다.
유리 항-인간 BMP6 Ab 농도는 μg/mL로 표현될 것이다. LLOQ 미만의 모든 농도 또는 누락 데이터는 농도 데이터 목록에 그대로 라벨링될 것이다. LLOQ 미만의 농도는 단지 농도 데이터에 대한 요약 통계에서만 0으로 처리될 것이다. 이들은 PK 파라미터의 계산에서 고려되지 않을 것이다.
유리 항-인간 BMP6 Ab의 결정 후에 남은 PK 샘플은 탐색적 평가 또는 다른 생분석 목적에 사용될 수 있다 (예를 들어 상이한 장소 사이의 교차-체크, 안정성 평가).
포에닉스 윈논린 (버전 6.2 이상)에 의해 비-구획화 방법(들)을 사용하여 하기 약동학적 파라미터가 결정될 것이다 (실현가능한 경우): 혈청 농도-시간 데이터를 기반으로 한 Cmax, tmax, AUC(0-t), AUC(0-tlast), Cmax/D, 및 AUC/D. 선형 사다리꼴 규칙이 AUC 계산에 사용될 것이다. 인간 BMP6에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편의 말단 반감기 (t1/2)가 또한 실현가능한 경우에 데이터를 기반으로 하여 추정될 것이다.
다른 평가
면역원성
ELISA 검정은 항-인간 BMP6 항체를 검출하는데 사용될 것이다. 면역원성 분석 후에 남은 IG 샘플은 탐색적 평가 또는 다른 생분석 목적에 사용될 수 있다 (예를 들어 상이한 장소 사이의 교차-체크).
탐색적 평가
바이오마커는 치료적 개입에 대한 정상 생물학적 과정, 발병 과정, 또는 약리학적 반응의 객관적으로 측정되고 평가되는 지표이다 (Biomarkers Definitions Working Group 2001).
BMP6-헵시딘 경로는 다음과 같다: 간세포에서의 BMP6 신호전달은 헵시딘의 유도된 발현, 장세포 철 흡수 및 대식세포 철 유출 억제에 요구된다. 헵시딘-저하 요법으로서 BMP6-중화 항체는 EPO 요건을 감소시키고 표적 Hgb 수준에 이르는 환자의 수를 증가시킴으로써 철-제한 빈혈을 갖는 환자에게 유익할 것이다.
상기 기재된 생물학을 기반으로 하여, 탐색적 바이오마커 평가는 헵시딘을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (LC-MS 검정을 사용하여 측정됨).
추가의 탐색적 평가는 골 흡수 마커의 잠재적 역할을 조사할 수 있을 뿐만 아니라, 작용 메카니즘에 기여하는 인자로서 염증을 다룰 수 있다.
탐색적 목적은 하기와 같다:
Figure pct00050
헵시딘 수준과 여러 주요 척도 예컨대 ERI 및 철 지수 사이의 관계를 평가하기 위함;
Figure pct00051
1차 및 2차 종점과 탐색적 바이오마커 사이의 역학을 종축으로 연구하기 위함;
Figure pct00052
약리유전학을 평가하기 위함;
Figure pct00053
면역원성을 평가하기 위함.
샘플(들)은 다양한 시점(들)에 수집될 것이다.
샘플 수집, 넘버링, 프로세싱 및 운송에 대한 추가의 세부사항은 중심 실험실 매뉴얼에 제공될 것이다.
DNA
탐색적 DNA 조사 연구는 (1) 기능적 철-결핍성 빈혈을 갖는 에리트로포이에틴-치료받은 만성 혈액투석 환자와 관련될 수 있거나, (2) 항-인간 BMP6 Ab에 의한 치료에 대한 반응을 예측할 수 있거나, 또는 (3) 부작용에 대한 유전적 소인을 예측할 수 있는 유전 인자를 확인하기 위한 목적으로 이 연구의 일부로서 계획된다.
또한, 유전자형결정 기술에서의 최근의 진보는 게놈 전반적 접근을 가능하게 하고 있다. 게놈 전반적 접근은 또한 상기 기재된 바와 같은 이들 연구의 제한된 범주 내에서 수행될 수 있다.
가용성 바이오마커
헵시딘은 잠재적 PD/ 바이오마커로서 혈장에서 정량화될 것이다.
검정의 상세한 설명은 생분석 데이터 보고에 포함될 것이다.
다른 바이오마커
질환 이질성, 계층화 마커의 작용 방식 및/또는 잠재적 확인을 이해하기 위해 무가설 플랫폼이 사용될 수 있다. 면역원성 (IG) 샘플은 다양한 시점에 수집될 것이다. 항-인간 BMP6 Ab의 면역원성은 항-인간 BMP6 항체를 인식하는 항체를 측정함으로써 평가될 것이다.
참고문헌
Figure pct00054
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야에 친숙한 전문가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
달리 나타내지 않는 한, 상세한 설명에 구체적으로 기재되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은, 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있고 수행되어 왔다. 참조는, 예를 들어 표준 핸드북 및 본원에 언급된 일반적인 배경기술에 대해, 및 그에 인용된 추가의 참고문헌에 대해 다시 이루어진다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 인용된 참고문헌은 각각 그 전문이 참조로 포함된다.
본 발명에 대한 청구범위는 비-제한적이며, 하기 제공된다.
특정한 측면 및 청구범위가 본원에 상세히 개시되어 있더라도, 이는 단지 예시의 목적으로 예로서 행해진 것이며, 첨부된 청구범위의 범주, 또는 임의의 상응하는 추후 출원의 청구범위의 주제의 범주와 관련하여 제한하고자 의도되는 것은 아니다. 특히, 본 발명자들은 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 개시내용의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서, 본 개시내용에 다양한 치환, 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것을 고려한다. 핵산 출발 물질, 관심 클론, 또는 라이브러리 유형의 선택은 본원에 기재된 측면의 지식을 갖는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 상용 문제인 것으로 여겨진다. 다른 측면, 이점 및 변형이 하기 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험의 범위를 넘지 않고 이를 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 측면의 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다. 다양한 국가의 특허법에 의한 제한으로 인해 이후 출원되는 상응하는 출원에서 청구범위가 재작성될 수 있으며, 이것을 청구범위의 주제를 포기하는 것으로 해석해서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> CONG, FENG DIETRICH, WILLIAM GEORGE, NATHALIE LIU, DONG SCHACHTER, ASHER SONI, ADITI ZHOU, JING <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ANTIBODIES TARGETING BMP6 <130> PAT056599-US-NP <140> 14/974,318 <141> 2015-12-18 <150> 62/181,803 <151> 2015-06-19 <150> 62/094,716 <151> 2014-12-19 <160> 96 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <400> 1 000 <210> 2 <400> 2 000 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <400> 4 000 <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <400> 6 000 <210> 7 <400> 7 000 <210> 8 <400> 8 000 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Ser Tyr Val Val His 1 5 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Arg Ile Lys Asp His Lys Gln Gly Tyr Thr Thr Ala Tyr Ala Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Val 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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 18 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 caggtgcaat tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggcag cctgcgcctg 60 agctgcgccg cctccggatt caccttttct tcttacgttg ttcattgggt gcgccaggcc 120 ccgggcaaag gtctcgagtg ggtgggccgt atcaaagacc acaaacaggg ctacactact 180 gcttatgccg cctctgtgaa aggccgcttt accattagcc gcgatgattc gaaaaacacc 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaagatacgg ccgtgtatta ttgcgcgcgt 300 gttgaacgtt ctaaatctgg tttcgataac tggggccaag gcaccctggt gactgttagc 360 tcagcctcca ccaagggtcc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Val His 1 5 10 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Gly Ser Ser Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Gln Ser Trp Asp Ser Ser Gln Thr Leu Val Val 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Gly Ser Ser 1 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Trp Asp Ser Ser Gln Thr Leu Val 1 5 <210> 25 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ser Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Ser Ser 85 90 95 Gln Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 26 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 26 cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtg agcggtgcac cgggccagcg cgtgaccatt 60 agctgtaccg gcagcagcag caacattggt gctggttact ctgtgcattg gtaccagcag 120 ctgccgggca cggcgccgaa actgctgatc tatggtagct ctgaacgccc gagcggcgtg 180 ccggatcgct ttagcggatc caaaagcggc accagcgcca gcctggcgat taccggcctg 240 caagcagaag acgaagcgga ttattactgc cagtcttggg actcttctca gactctggtt 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtc cta 333 <210> 27 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ser Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Ser Ser 85 90 95 Gln Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser 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acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc a 651 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Ser Tyr Val Val His 1 5 <210> 30 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Arg Ile Lys Arg Glu Ser Ser Ser Tyr Thr Thr Met Tyr Ala Ala Pro 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Lys Arg Glu Ser Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 35 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Lys Arg Glu Ser Ser Ser Tyr Thr Thr Met Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 36 caggtgcagc tggtggaatc aggcggcgga ctggtcaagc ctggcggtag cctgagactg 60 agctgcgctg ctagtggctt caccttctct agctacgtgg tgcactgggt cagacaggcc 120 cctggtaaag gcctggagtg ggtcggacgg attaagagag agtcctctag ctacactact 180 atgtacgccg ctcccgtgaa gggccggttc actatctcta gggacgactc taagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaatag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtctacta ctgcgctaga 300 gtggaacggt ctaagtcagg cttcgataac tggggtcagg gcaccctggt caccgtgtct 360 agc 363 <210> 37 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Lys Arg Glu Ser Ser Ser Tyr Thr Thr Met Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp 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atgtacgccg ctcccgtgaa gggccggttc actatctcta gggacgactc taagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaatag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtctacta ctgcgctaga 300 gtggaacggt ctaagtcagg cttcgataac tggggtcagg gcaccctggt caccgtgtct 360 agcgctagca ctaagggccc aagtgtgttt cccctggccc ccagcagcaa gtctacttcc 420 ggcggaactg ctgccctggg ttgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgacagtg 480 tcctggaact ctggggctct gacttccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg acagtgccct ccagctctct gggaacccag 600 acctatatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagtggag 660 cccaagagct gcgacaagac ccacacctgc cccccctgcc cagctccaga actgctggga 720 gggccttccg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 780 cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg acccagaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagtac 900 aacagcacct acagggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaagaataca agtgcaaagt ctccaacaag gccctgccag ccccaatcga aaagacaatc 1020 agcaaggcca agggccagcc acgggagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgat 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccca 1200 gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagtccagg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgagcct gagccccggc aag 1353 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Val His 1 5 10 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Gly Gln Ser Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Gln Ser Trp Asp Ser Ser Gln Thr Leu Val Val 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Ser 1 5 10 <210> 43 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Gly Gln Ser 1 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Trp Asp Ser Ser Gln Thr Leu Val 1 5 <210> 45 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Gln Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Ser Ser 85 90 95 Gln Thr Leu Val Val Phe 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gtatcagcag 120 ctgcccggca ccgcccctaa gctgctgatc tacggtcagt cagagcggcc tagcggcgtg 180 cccgataggt ttagcggctc taagtcaggc actagcgcta gtctggctat caccggcctg 240 caggctgagg acgaggccga ctactactgt cagtcctggg actctagtca gaccctggtg 300 gtgttcggcg gaggcactaa gctgaccgtg ctgggtcagc ctaaggctgc ccccagcgtg 360 accctgttcc cccccagcag cgaggagctg caggccaaca aggccaccct ggtgtgcctg 420 atcagcgact tctacccagg cgccgtgacc gtggcctgga aggccgacag cagccccgtg 480 aaggccggcg tggagaccac cacccccagc aagcagagca acaacaagta cgccgccagc 540 agctacctga gcctgacccc cgagcagtgg aagagccaca ggtcctacag ctgccaggtg 600 acccacgagg gcagcaccgt ggaaaagacc gtggccccaa ccgagtgcag c 651 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Ser Tyr Val Val His 1 5 <210> 50 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Arg Thr Arg His Ser Asp Met Gly Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Ala Pro 1 5 10 15 Val Lys 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 57 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Thr Arg His Ser Asp Met Gly Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly 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<400> 88 cagtcagtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60 agctgcaccg gctctagctc taatatcggc gctggctata gcgtgcactg gtatcagcag 120 ctgcccggca ccgcccctaa gctgctgatc tacggtcagt cagagcggcc tagcggcgtg 180 cccgataggt ttagcggctc taagtcaggc actagcgcta gtctggctat caccggcctg 240 caggctgagg acgaggccga ctactactgt cagtcctggg actctagtca gaccctggtg 300 gtgttcggcg gaggcactaa gctgaccgtg ctgggtcagc ctaaggctgc ccccagcgtg 360 accctgttcc cccccagcag cgaggagctg caggccaaca aggccaccct ggtgtgcctg 420 atcagcgact tctacccagg cgccgtgacc gtggcctgga aggccgacag cagccccgtg 480 aaggccggcg tggagaccac cacccccagc aagcagagca acaacaagta cgccgccagc 540 agctacctga gcctgacccc cgagcagtgg aagagccaca ggtcctacag ctgccaggtg 600 acccacgagg gcagcaccgt ggaaaagacc gtggccccaa ccgagtgcag c 651 <210> 89 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Ser Ala Ser Ser Arg Arg Arg Gln Gln Ser Arg Asn Arg Ser Thr Gln 1 5 10 15 Ser Gln Asp Val Ala Arg Val Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser 20 25 30 Glu Leu Lys Thr Ala Cys Arg Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln 35 40 45 Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Gly Tyr Ala Ala 50 55 60 Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn 65 70 75 80 Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro 85 90 95 Glu Tyr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile 100 105 110 Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Asn Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr 115 120 125 Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His 130 135 <210> 90 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys 1 5 10 15 Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser 20 25 30 Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala 50 55 60 Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn 65 70 75 80 Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro 85 90 95 Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile 100 105 110 Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr 115 120 125 Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His 130 135 <210> 91 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Ala Ala Asn Lys Arg Lys Asn Gln Asn Arg Asn Lys Ser Ser Ser His 1 5 10 15 Gln Asp Ser Ser Arg Met Ser Ser Val Gly Asp Tyr Asn Thr Ser Glu 20 25 30 Gln Lys Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp 35 40 45 Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Phe 50 55 60 Tyr Cys Asp Gly Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala 65 70 75 80 Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Met Phe Pro Asp 85 90 95 His Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser 100 105 110 Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg 115 120 125 Asn Met Val Val Arg Ser Cys Gly Cys His 130 135 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro Glu Tyr Val Pro Lys Pro 1 5 10 15 <210> 93 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro 1 5 10 15 <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Gln Thr Leu Val His Leu Met Phe Pro Asp His Val Pro Lys Pro 1 5 10 15 <210> 95 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Val Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 96 His His His His His His 1 5

Claims (82)

  1. 인간 BMP6에 결합하고 하기를 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (a) 각각 서열식별번호: 69, 70 및 71의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 79, 80 및 81의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (b) 각각 서열식별번호: 72, 73 및 74의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 82, 83 및 84의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (c) 각각 서열식별번호: 29, 30 및 31의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 39, 40 및 41의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (d) 각각 서열식별번호: 32, 33 및 34의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 42, 43 및 44의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (e) 각각 서열식별번호: 49, 50 및 51의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 59, 60 및 61의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (f) 각각 서열식별번호: 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (g) 각각 서열식별번호: 9, 10 및 11의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열; 또는
    (h) 각각 서열식별번호: 12, 13 및 14의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 22, 23 및 24의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
  2. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (a) 서열식별번호: 75의 VH 서열
    (b) 서열식별번호: 35의 VH 서열
    (c) 서열식별번호: 55의 VH 서열 또는
    (d) 서열식별번호: 15의 VH 서열.
  3. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (e) 서열식별번호: 85의 VL 서열
    (f) 서열식별번호: 45의 VL 서열
    (g) 서열식별번호: 65의 VL 서열 또는
    (h) 서열식별번호: 25의 VL 서열.
  4. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (i) 서열식별번호: 75의 VH 서열; 및 서열식별번호: 85의 VL 서열
    (j) 서열식별번호: 35의 VH 서열; 및 서열식별번호: 45의 VL 서열
    (k) 서열식별번호: 55의 VH 서열; 및 서열식별번호: 65의 VL 서열 또는
    (l) 서열식별번호: 15의 VH 서열; 및 서열식별번호: 25의 VL 서열.
  5. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (a) 서열식별번호: 77의 중쇄 서열;
    (b) 서열식별번호: 37의 중쇄 서열;
    (c) 서열식별번호: 57의 중쇄 서열; 또는
    (d) 서열식별번호: 17의 중쇄 서열.
  6. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (e) 서열식별번호: 87의 경쇄 서열;
    (f) 서열식별번호: 47의 경쇄 서열;
    (g) 서열식별번호: 67의 경쇄 서열; 또는
    (h) 서열식별번호: 27의 경쇄 서열.
  7. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (i) 서열식별번호: 77의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 87의 경쇄 서열;
    (j) 서열식별번호: 37의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 47의 경쇄 서열;
    (k) 서열식별번호: 57의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 67의 경쇄 서열; 또는
    (l) 서열식별번호: 17의 중쇄 서열; 및 서열식별번호: 27의 경쇄 서열.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 BMP6에 ≤ 1 nM의 KD로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 BMP6에 ≤ 0.1 nM의 KD로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대해 적어도 약 100-배 더 큰 친화도를 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 BMP2, 인간 BMP5, 또는 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대해 적어도 약 100-배 더 큰 친화도를 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 BMP2, 인간 BMP5, 또는 인간 BMP7보다 인간 BMP6에 대해 적어도 약 500-배 더 큰 친화도를 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, ELISA에서 인간 BMP2 또는 BMP7에 대해 어떠한 검출가능한 결합도 갖지 않는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 간 세포주 또는 1차 인간 간 세포에서 BMP6-유도된 헵시딘 발현을 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 간 세포주 또는 1차 인간 간 세포에서 BMP6-유도된 헵시딘 발현에서 적어도 약 50% 감소를 나타내는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 인간 BMP6의 활성을 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, HEP3B-BRE-Luc 리포터 유전자 검정에서 측정 시, 시험관내 인간 BMP6의 활성을 감소시키는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, IgM 및 IgG로부터 선택된 스캐폴드를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 IgM 및 IgG이고, 여기서 IgG는 IgG1, IgG2, 및 IgG3 또는 IgG4로부터 선택된 것인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체의 성분인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역의 돌연변이를 통해 변경된 이펙터 기능을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 단리된 그의 항원-결합 단편을 교차-차단하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  24. 서열 QTLVHLMNPEYVPKP (서열식별번호: 92)로 이루어진 인간 BMP6 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  25. 제24항에 있어서, (a) 서열 QTLVHFINPETVPKP (서열식별번호: 93)로 이루어진 인간 BMP7 에피토프 또는 (b) 서열 QTLVHLMFPDHVPKP (서열식별번호: 94)로 이루어진 인간 BMP5 에피토프보다 서열 QTLVHLMNPEYVPKP (서열식별번호: 92)로 이루어진 인간 BMP6 에피토프에 대해 적어도 약 100-배 더 큰 친화도를 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  26. 제24항에 있어서, (a) 서열 QTLVHFINPETVPKP (서열식별번호: 93)로 이루어진 인간 BMP7 에피토프 또는 (b) 서열 QTLVHLMFPDHVPKP (서열식별번호: 94)로 이루어진 인간 BMP5 에피토프보다 서열 QTLVHLMNPEYVPKP (서열식별번호: 92)로 이루어진 인간 BMP6 에피토프에 대해 적어도 약 500-배 더 큰 친화도를 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (a) 각각 서열식별번호: 69, 70 및 71의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 79, 80 및 81의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열 또는
    (b) 각각 서열식별번호: 72, 73 및 74의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 82, 83 및 84의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
  28. 제27항에 있어서, 서열식별번호: 75의 VH 서열; 및 서열식별번호: 85의 VL 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 교차-차단하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 추가의 치료제를 포함하는 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 추가의 치료제가 BMP6의 활성을 감소시키는 것인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 추가의 치료제가 siRNA, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 소분자인 조성물.
  35. 제32항 또는 제33항에 있어서, 치료제가 적혈구생성 자극제 (ESA) 또는 철인 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 치료제가 적혈구생성 자극제 (ESA)인 조성물.
  37. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의, 인간 BMP6에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  38. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의, 인간 BMP6에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH 또는 VL 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  39. 인간 BMP6에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH 또는 VL 서열을 코딩하는 서열을 포함하며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드:
    (a) 각각 서열식별번호: 69, 70 및 71의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 79, 80 및 81의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (b) 각각 서열식별번호: 72, 73 및 74의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 82, 83 및 84의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (c) 각각 서열식별번호: 29, 30 및 31의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 39, 40 및 41의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (d) 각각 서열식별번호: 32, 33 및 34의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 42, 43 및 44의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (e) 각각 서열식별번호: 49, 50 및 51의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 59, 60 및 61의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (f) 각각 서열식별번호: 52, 53 및 54의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 62, 63 및 64의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열;
    (g) 각각 서열식별번호: 9, 10 및 11의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열; 또는
    (h) 각각 서열식별번호: 12, 13 및 14의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호: 22, 23 및 24의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열.
  40. 하기 중 어느 것의 서열을 포함하는, BMP6에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드:
    (a) 서열식별번호: 78의 중쇄 서열;
    (b) 서열식별번호: 76의 VH 서열;
    (c) 서열식별번호: 88의 경쇄 서열;
    (d) 서열식별번호: 86의 VL 서열.
    (e) 서열식별번호: 38의 중쇄 서열;
    (f) 서열식별번호: 36의 VH 서열;
    (g) 서열식별번호: 48의 경쇄 서열;
    (h) 서열식별번호: 46의 VL 서열;
    (i) 서열식별번호: 58의 중쇄 서열;
    (j) 서열식별번호: 56의 VH 서열;
    (k) 서열식별번호: 68의 경쇄 서열;
    (l) 서열식별번호: 66의 VL 서열;
    (m) 서열식별번호: 18의 중쇄 서열;
    (n) 서열식별번호: 16의 VH 서열;
    (o) 서열식별번호: 28의 경쇄 서열; 또는
    (p) 서열식별번호: 26의 VL 서열.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  42. 제41항의 벡터 또는 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  43. 제42항에 있어서, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 숙주 세포.
  44. 세포를 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 BMP6의 활성을 감소시키는 방법.
  45. BMP6을 억제하는 것을 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 BMP6을 억제하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 환자가 빈혈을 갖는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 빈혈이 만성 질환에 의한 빈혈 (ACD), 만성 신장 질환에 의한 빈혈 (CKD), 암에 의한 빈혈, 염증에 의한 빈혈, 적혈구생성 자극제 (ESA) 저항성 빈혈, 또는 철-제한 빈혈인 방법.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 만성 혈액투석 환자인 방법.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 적혈구생성 자극제 (ESA)를 투여받은 바 있거나 또는 투여받고 있는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, ESA가 에리트로포이에틴 (EPO)인 방법.
  51. 혈청 철 수준, 트랜스페린 포화 (TAST), 망상적혈구 헤모글로빈 함량 (CHr), 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 또는 적혈구용적률의 증가를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 혈청 철 수준, 트랜스페린 포화 (TAST), 망상적혈구 헤모글로빈 함량 (CHr), 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 또는 적혈구용적률을 증가시키는 방법.
  52. 헵시딘의 활성 또는 수준을 감소시키는 것을 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 헵시딘의 활성 또는 수준을 감소시키는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 헵시딘의 활성 또는 수준이 적어도 50% 감소되는 것인 방법.
  54. 빈혈을 치료하는 것을 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 빈혈을 치료하는 방법.
  55. 환자에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 헤모글로빈 수준을 증가 또는 유지시키는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물에 의한 치료의 부재 하의 EPO 용량 요건 및/또는 철 용량 요건에 비해, 환자의 철 용량 요건을 감소시키거나, 환자의 EPO 용량 요건을 감소시키거나, 또는 환자의 철 용량 요건 및 환자의 EPO 용량 요건 둘 다를 감소시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 환자가 빈혈을 갖는 것인 방법.
  58. 제54항 또는 제57항에 있어서, 빈혈이 만성 질환과 연관된 빈혈인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 만성 질환이 만성 신장 질환, 암 또는 염증인 방법.
  60. 제54항, 제58항 및 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 적혈구생성 자극제 (ESA)로 치료받고 있거나 또는 치료받은 바 있는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, ESA가 에리트로포이에틴 (EPO)인 방법.
  62. 제54항 및 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 빈혈이 EPO-저반응성 빈혈인 방법.
  63. 제54항 및 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 빈혈이 철-제한 빈혈인 방법.
  64. 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 만성 혈액투석 환자인 방법.
  65. 제44항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 0.001 mg/kg 내지 0.1 mg/kg 범위의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 0.0063 내지 0.1 mg/kg 범위의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  67. 제44항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 0.001 mg/kg, 0.0016 mg/kg, 0.0025 mg/kg, 0.0040 mg/kg, 0.0063 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.016 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.040 mg/kg, 0.063 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  68. 제44항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 정맥내로 또는 피하로 투여되는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 투여가 약 30 내지 약 60분의 기간에 걸쳐 주입에 의한 것인 방법.
  71. 표 1에 열거된 CDR을 포함하는 BMP6에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  72. 표 1에 열거된 BMP6에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  73. 표 1에 열거된 BMP6에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 CDR을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  74. 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물, 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제41항의 벡터, 또는 제42항 또는 제43항의 숙주 세포의 용도.
  75. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 조성물.
  76. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에서 사용하기 위한, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 조성물.
  77. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에서 헤모글로빈 수준을 증가 또는 유지시키는데 사용하기 위한, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 조성물.
  78. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 빈혈을 갖는 환자를 치료하는데 사용하기 위한, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 빈혈이 만성 질환에 의한 빈혈인 항체 또는 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 만성 질환이 만성 신장 질환, 암 또는 염증인 항체 또는 조성물.
  81. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 적혈구생성 자극제 (ESA)로 치료받고 있거나 또는 치료받은 바 있는 것인 항체 또는 조성물.
  82. 제81항에 있어서, ESA가 에리트로포이에틴 (EPO)인 항체 또는 조성물.
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