TWI714545B - 靶向ｂｍｐ６之抗體之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於針對人類BMP6之抗體及其抗原結合片段及組合物及其使用方法。

Description

靶向BMP6之抗體之組合物及方法
本發明係關於針對人類BMP6之抗體及其抗原結合片段及組合物及其使用方法。
貧血係於慢性腎病(CKD)患者中盛行且係與低品質生活及較高風險之不良結果(包括心血管疾病及死亡)相關聯。CKD患者之貧血管理的幾個模式涉及使用紅血球生成刺激劑(ESA)，補充口服及靜脈內鐵及輸血。然而，許多患者對該等治療沒有作出充分反應或需要較高劑量之ESA及/或鐵。高劑量之鐵亦可導致與生成氧自由基及過敏性反應相關聯之毒性。此等治療可能缺乏療效，此乃因其不完全解決貧血之潛在病因(即受損之鐵吸收及自身體儲備之鐵動員)所致。
管理促紅血球生成素耐藥性之嘗試當前係藉由高劑量非經腸鐵之共同投藥來進行。然而，自靜脈內製劑之大部分鐵係首先藉由巨噬細胞加工，且其就紅血球生成之利用係取決於鐵轉運蛋白介導之鐵運輸。
於許多貧血患者中，鐵轉運蛋白介導之鐵運輸係受高含量之鐵調節素(hepcidin)抑制。其他證據表明，於血液透析中升高含量之鐵調節素與不良ESA反應性相關。因此降鐵調節素劑可係用於改善此患者群體之ESA難治性貧血及其他形式之由鐵限制表徵之慢性疾病貧血 (ACD)的有效策略。
因此，降低循環鐵調節素含量之方法應增強存在於慢性腎疾病患者中之ESA-難治性貧血之鐵吸收，促進螯合鐵之釋放，及促進紅血球生成。
儘管當前存在用於治療與貧血相關聯之疾病及病症之治療選項，然對用於治療貧血之有效及良好耐受性的經改良之組合物仍存在需求。
本發明提供單離BMP6-結合分子(例如BMP6-結合抗體或其抗原結合片段)，包括該等分子之醫藥組合物，製造該等分子及組合物之方法，及於降低鐵調節素含量中及於治療貧血中使用其之方法。
於一態樣中，本發明提供一種包括表1中之任何抗體之任一1、2、3、4、5或6種CDR之針對BMP6的單離抗體或其抗原結合片段。
於一態樣中，本發明提供一種包括如表1中所述之抗體3之6種CDR之針對BMP6的單離抗體或其抗原結合片段。
於一態樣中，本發明提供一種包括如表1中所述之抗體5之6種CDR之針對BMP6的單離抗體或其抗原結合片段。
於一態樣中，本發明提供一種包括如表1中所述之抗體6之6種CDR之針對BMP6的單離抗體或其抗原結合片段。
於一態樣中，本發明提供一種包括如表1中所述之抗體7之6種CDR之針對BMP6的單離抗體或其抗原結合片段。
於本發明之一態樣中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括：分別如SEQ ID NO：9、10及11之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：19、20及21之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於本發明之一態樣中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類 BMP6及包括：分別如SEQ ID NO：12、13及14之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：22、23及24之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列
於本發明之一態樣中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括：分別如SEQ ID NO：29、30及31之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：39、40及41之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於本發明之一態樣中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括：分別如SEQ ID NO：32、33及34之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：42、43及44之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於本發明之一態樣中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括：分別如SEQ ID NO：49、50及51之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：59、60及61之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於本發明之一態樣中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括：分別如SEQ ID NO：52、53及54之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：62、63及64之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於本發明之一態樣中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括：分別如SEQ ID NO：69、70及71之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：79、80及81之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於本發明之一態樣中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括：分別如SEQ ID NO：72、73及74之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列 及分別如SEQ ID NO：82、83及84之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括：SEQ ID NO：15之VH(重鏈可變域)序列；SEQ ID NO：35之VH序列；SEQ ID NO：55之VH序列；或SEQ ID NO：75之VH序列。
於本發明之一實施例中，結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段包括與上述之VH序列中之一者具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性，然小於100%序列一致性的VH序列。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括：SEQ ID NO：25之VL(輕鏈可變域)序列；SEQ ID NO：45之VL序列；SEQ ID NO：65之VL序列；或SEQ ID NO：85之VL序列。
於本發明之一實施例中，結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段包括與上述之VL序列中之一者具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性，但小於100%序列一致性的VL序列。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括：SEQ ID NO：15之VH序列；及SEQ ID NO：25之VL序列； SEQ ID NO：35之VH序列；及SEQ ID NO：45之VL序列；SEQ ID NO：55之VH序列；及SEQ ID NO：65之VL序列；或SEQ ID NO：75之VH序列；及SEQ ID NO：85之VL序列。
於本發明之一實施例中，結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段包括與上述之VH序列中之一者具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性，但小於100%序列一致性的VH序列，及包括與上述之VL序列中之一者具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性，但小於100%序列一致性的VL序列。於一實施例中，VH及VL係衍生自表1中所列之相同抗體。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括：SEQ ID NO：17之重鏈序列；SEQ ID NO：37之重鏈序列；SEQ ID NO：57之重鏈序列；或SEQ ID NO：77之重鏈序列。
於本發明之一實施例中，結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段包括與上述之重鏈序列中之一者具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性，但小於100%序列一致性的重鏈序列。
於本發明之一實施例中，單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括：SEQ ID NO：27之輕鏈序列； SEQ ID NO：47之輕鏈序列；SEQ ID NO：67之輕鏈序列；或SEQ ID NO：87之輕鏈序列。
於本發明之一實施例中，結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段包括與上述之輕鏈序列之一者具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性，但小於100%序列一致性的輕鏈序列。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段結合人類BMP6及包括重鏈及輕鏈，其中：SEQ ID NO：17之重鏈序列；及SEQ ID NO：27之輕鏈序列；SEQ ID NO：37之重鏈序列；及SEQ ID NO：47之輕鏈序列；SEQ ID NO：57之重鏈序列；及SEQ ID NO：67之輕鏈序列；或SEQ ID NO：77之重鏈序列；及SEQ ID NO：87之輕鏈序列。
於本發明之一實施例中，結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段包括與上述之重鏈序列中之一者具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性，但小於100%序列一致性的重鏈序列，及包括與上述之輕鏈序列之一者具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性，但小於100%序列一致性的輕鏈序列。於一實施例中，該重鏈及輕鏈係衍生自表1中所列之相同抗體。
於本發明之一實施例中提供一種特異性結合BMP6之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括與以下中之任何一或多者具有至少90%、95%、97%、98%或至少99%序列一致性的至 少一種互補決定(CDR)序列：分別如SEQ ID NO：9、10及11之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別如SEQ ID NO：19、20及21之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：12、13及14之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：22、23及24之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：29、30及31之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：39、40及41之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：32、33及34之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：42、43及44之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：49、50及51之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：59、60及61之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：52、53及54之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：62、63及64之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：69、70及71之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：79、80及81之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或分別如SEQ ID NO：72、73及74之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：82、83及84之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段特異性結合BMP6及包括與以下中之任何一或多者相同的至少一種互補決定(CDR)序列：分別如SEQ ID NO：9、10及11之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：19、20及21之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：12、13及14之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：22、23及24之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：29、30及31之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列 及分別如SEQ ID NO：39、40及41之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：32、33及34之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：42、43及44之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：49、50及51之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：59、60及61之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：52、53及54之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：62、63及64之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：69、70及71之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：79、80及81之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或分別如SEQ ID NO：72、73及74之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：82、83及84之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於本發明之一實施例中，單離抗體或其抗原結合片段特異性結合BMP6，其中該等抗體包括至少一種選自由以下組成之群的重鏈CDR序列：SEQ ID NO：12、13及14之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列；SEQ ID NO：29、30及31之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列；SEQ ID NO：32、33及34之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列；SEQ ID NO：49、50及51之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列；SEQ ID NO：52、53及54之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列；SEQ ID NO：69、70及71之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列；SEQ ID NO：72、73及74之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及；SEQ ID NO：9、10及11之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段特異性結合BMP6，其中該等抗體包括至少一種選自由以下組成之群的輕鏈CDR序列：分別如SEQ ID NO：19、20及21之LCDR1、LCDR2及LCDR3序 列；分別如SEQ ID NO：22、23及24之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：39、40及41之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：42、43及44之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：59、60及61之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：62、63及64之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：79、80及81之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；及分別如SEQ ID NO：82、83及84之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段係單株。
於一實施例中，本發明提供特異性結合BMP6之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體具有至少約1 X 107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1或1011M-1之親和常數(KA)。於一實施例中，本發明提供特異性結合BMP6之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體具有至少1 X 107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1或1011M-1之親和常數(KA)。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段特異性結合BMP6，其中該抗體或其抗原結合片段以不大於約1nM或不大於約0.1nM之Kd結合BMP6。於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段特異性結合BMP6，其中該抗體或其抗原結合片段以不大於1nM或不大於0.1nM之Kd結合BMP6。於本發明之一實施例中， 該單離抗體或其抗原結合片段特異性結合BMP6，其中該抗體或其抗原結合片段以Kd
Figure 104142804-A0305-02-0012-13
1nM或
Figure 104142804-A0305-02-0012-14
0.1nM結合BMP6。於一實施例中，Kd係如藉由Biacore所測量。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段特異性結合BMP6，並抑制BMP6活性。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段特異性結合BMP6，及與下表1中所述之抗體交叉競爭(交叉阻斷)。於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段結合下表1中所述之抗體之相同BMP6抗原決定基，與其交叉競爭。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段針對人類BMP6比針對人類BMP2、人類BMP5或人類BMP7中任一者具有大至少約100-、500-或1000-倍之親和力。於本發明之一實施例中，單離抗體或其抗原結合片段針對人類BMP6比針對人類BMP2、人類BMP5或人類BMP7中任一者具有大至少100-、500-或1000-倍之親和力。於實施例中，針對BMP6之特異性係如藉由ELISA測量。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段針對人類BMP6比針對人類BMP2具有大至少約100-、500-或1000-倍之親和力。於本發明之一實施例中，單離抗體或其抗原結合片段針對人類BMP6比針對人類BMP2具有大至少100-、500-或1000-倍之親和力。於實施例中，BMP6之特異性係如藉由ELISA測量。
於本發明之一實施例中，單離抗體或其抗原結合片段針對人類BMP6比針對人類BMP5具有大至少約100-、500-或1000-倍之親和力。於本發明之一實施例中，單離抗體或其抗原結合片段針對人類BMP6比針對人類BMP5具有大至少100-、500-或1000-倍之親和力。於實施例中，BMP6之特異性係如藉由ELISA測量。
於本發明之一實施例中，單離抗體或其抗原結合片段針對人類 BMP6比針對人類BMP7具有大至少約100-、500-或1000-倍之親和力。於本發明之一實施例中，單離抗體或其抗原結合片段針對人類BMP6比針對人類BMP7具有大至少100-、500-或1000-倍之親和力。於實施例中，BMP6之特異性係如藉由ELISA測量。
於本發明之一實施例中，該抗體或其抗原結合片段沒有可偵測的人類BMP2或BMP5結合性(例如，於ELISA中)。
於本發明之一實施例中，該抗體或其抗原結合片段沒有可偵測的抗人類BMP2之活性(例如，於ELISA中)。
於本發明之一實施例中，該抗體或其抗原結合片段沒有可偵測的抗人類BMP5之活性(例如，於ELISA中)。
於一實施例中，特異性結合BMP6之本發明抗體及其抗原結合片段係單離單株抗體。於一實施例中，特異性結合BMP6之本發明抗體及其抗原結合片段係單離人類單株抗體。於一實施例中，特異性結合BMP6之本發明抗體及其抗原結合片段係人源化單株抗體。於一實施例中，特異性結合BMP6之本發明抗體及其抗原結合片段係單離嵌合抗體。於一實施例中，本發明抗體及其抗原結合片段包括人類重鏈恆定區及人類輕鏈恆定區。
於本發明之一實施例中，特異性結合BMP6之單離抗體或其抗原結合片段係單鏈抗體。
於本發明之一實施例中，特異性結合BMP6之單離抗體或其抗原結合片段係Fab片段。
於本發明之一實施例中，特異性結合BMP6之單離抗體或其抗原結合片段係scFv。
於一實施例中，本發明抗體係IgM或IgG。於本發明之一實施例中，IgG係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。於一實施例中，IgG係IgG1。
於本發明之一實施例中，單離抗體或其抗原結合片段包括框 架，其中胺基酸已經取代至來自各自人類VH或VL生殖系序列之抗體框架中。
於本發明之一實施例中，單離抗體或其抗原結合片段係免疫共軛物之組分。於一實施例中，該免疫共軛物可包括單離抗體或其抗原結合片段及以下任一者(作為非限制性實例)：酶、毒素、激素、生長因子或藥物。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段具有經由Fc區之突變經改變之效應功能。
於本發明之一實施例中，該抗體或其抗原結合片段交叉阻斷表1中所列之抗體或其單離抗原結合片段。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段抑制肝細胞(例如，肝細胞系及/或活體外初級人類肝細胞)中之BMP6誘導之鐵調節素表現。於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段抑制肝細胞(例如，肝細胞系及/或活體外初級人類肝細胞)中之BMP6誘導之鐵調節素表現至少約50%。例如，該單離抗體或其抗原結合片段抑制肝細胞中之BMP6誘導之鐵調節素表現至少約50、60、70、80、90或100%。鐵調節素表現可(作為非限制性實例)藉由測量鐵調節素mRNA或蛋白質含量之量來測量。於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段抑制肝細胞(例如，肝細胞系及/或活體外初級人類肝細胞)中的BMP6誘導之鐵調節素表現至少50%。例如，該單離抗體或其抗原結合片段抑制肝細胞中之BMP6誘導之鐵調節素表現至少50、60、70、80、90或100%。鐵調節素表現可藉由(作為如非限制性實例)測量鐵調節素mRNA或蛋白質含量之量來測量。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段減少活體外人類BMP6的活性。於本發明之一實施例中，如於HEP3B-BRE-Luc報導基因測定中所測量，該單離抗體或其抗原結合片段減少活體 外人類BMP6的活性。
於一態樣中，本發明提供一種單離抗體或其抗原結合片段，其特異性結合BMP6且其結合包括序列QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：89之胺基酸88至102)之人類BMP6的抗原決定基。於一態樣中，本發明提供一種單離抗體或其抗原結合片段，其特異性結合BMP6且其結合由序列QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO：92，或SEQ ID NO：89之胺基酸88至102)組成之人類BMP6的抗原決定基。於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段針對由序列QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO：92，或SEQ ID NO：89之胺基酸88至102)組成之人類BMP6抗原決定基比以下各者具有大至少約100-倍之親和力：(a)由序列QTLVHFINPETVPKP(SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：90之胺基酸88至102)組成之人類BMP7抗原決定基，或(b)由序列QTLVHLMFPDHVPKP(SEQ ID NO：94，或SEQ ID NO：91之胺基酸87至101)組成之人類BMP5抗原決定基。於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段針對由序列QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO：92，或SEQ ID NO：89之胺基酸88至102)組成之人類BMP6抗原決定基比以下各者具有大至少100-倍之親和力：(a)由序列QTLVHFINPETVPKP(SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：90之胺基酸88至102)組成之人類BMP7抗原決定基，或(b)由序列QTLVHLMFPDHVPKP(SEQ ID NO：94，或SEQ ID NO：91之胺基酸87至101)組成之人類BMP5抗原決定基。該單離抗體或其抗原結合片段可包括(作為非限制性實例)：(a)分別如SEQ ID NO：69、70及71之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別如SEQ ID NO：79、80及81之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列或(b)分別如SEQ ID NO：72、73及74之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別如SEQ ID NO：82、83及84之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。於本發明之一實施例中，該單離抗 體或其抗原結合片段包括SEQ ID NO：75之VH序列；及SEQ ID NO：85之VL序列。於一實施例中，親和力係如藉由Biacore測量。
於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段針對由序列QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO：92，或SEQ ID NO：89之胺基酸88至102)組成之人類BMP6抗原決定基具有比以下各者大至少約500-倍之親和力：(a)由序列QTLVHFINPETVPKP(SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：90之胺基酸88至102)組成之人類BMP7抗原決定基或(b)由序列QTLVHLMFPDHVPKP(SEQ ID NO：94，或SEQ ID NO：91之胺基酸87至101)組成之人類BMP5抗原決定基。該單離抗體或其抗原結合片段可包括(作為非限制性實例)：(a)分別如SEQ ID NO：69、70及71之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：79、80及81之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列或(b)分別如SEQ ID NO：72、73及74之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：82、83及84之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。於本發明之一實施例中，該單離抗體或其抗原結合片段包括SEQ ID NO：75之VH序列；及SEQ ID NO：85之VL序列。於一實施例中，親和力係如藉由Biacore測量。
於另一態樣中，本發明提供一種組合物(例如醫藥組合物)，其包括任何先前態樣或實施例之單離抗體或其抗原結合片段。
於一實施例中，該組合物進一步包括醫藥上可接受之載劑。
於一實施例中，該組合物進一步包括額外治療劑。
於本發明之一實施例中，該額外治療劑減少BMP6之活性。
於本發明之一實施例中，該額外治療劑係siRNA、抗體或其抗原結合片段或小分子。
於本發明之一實施例中，該額外治療劑係選自由以下組成之群：紅血球生成刺激劑(ESA)及鐵(例如，補充膳食鐵或IV鐵劑)。
於本發明之一實施例中，該額外治療劑係紅血球生成刺激劑 (ESA)，例如EPO。
於一實施例中，表1中所述之單體抗體或其抗原結合片段可結合治療方法或程序(諸如本文所述或此項技術中已知者)投與給有此需要之患者。表1中所述之單離抗體或其抗原結合片段可在方法或程序之前、之後或同時投與。
於一實施例中，該治療方法或程序係輸血。於一實施例中，該治療方法或程序係透析。於一實施例中，該治療方法或程序係投與ESA，例如EPO。於一實施例中，該治療方法或程序係投與鐵，例如IV鐵劑。於一實施例中，該治療方法或程序係投與ESA(例如EPO)及投與鐵(例如IV鐵劑)。於一實施例中，該治療方法或程序係任何前述之組合。
於另一態樣中，本發明包括一種編碼本文所述之任何抗體或其抗原結合片段之核酸(聚核苷酸)。於一實施例中，本發明提供一種核酸，其編碼包括以下之任何一或多者的表1中所述之單離抗體或其抗原結合片段：分別如SEQ ID NO：9、10及11之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：19、20及21之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：12、13及14之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：22、23及24之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：29、30及31之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：39、40及41之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：32、33及34之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：42、43及44之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：49、50及51之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：59、60及61之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：52、53及54之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列 及分別如SEQ ID NO：62、63及64之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；分別如SEQ ID NO：69、70及71之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：79、80及81之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或分別如SEQ ID NO：72、73及74之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：82、83及84之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於一實施例中，本發明提供一種核酸(聚核苷酸)，其編碼包括包含選自由以下組成之群的序列之胺基酸序列的表1中所述之單離抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO：17之重鏈序列；SEQ ID NO：15之VH序列；SEQ ID NO：27之輕鏈序列；SEQ ID NO：25之VL序列；SEQ ID NO：37之重鏈序列；SEQ ID NO：35之VH序列；SEQ ID NO：47之輕鏈序列；SEQ ID NO：45之VL序列；SEQ ID NO：57之重鏈序列；SEQ ID NO：55之VH序列；SEQ ID NO：67之輕鏈序列；SEQ ID NO：65之VL序列；SEQ ID NO：77之重鏈序列；SEQ ID NO：75之VH序列；SEQ ID NO：87之輕鏈序列；及SEQ ID NO：85之VL序列。
於一實施例中，本發明提供一種核酸(聚核苷酸)，其編碼包括與 選自由以下組成之群的序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列的表1中所述之單離抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO：17之重鏈序列；SEQ ID NO：15之VH序列；SEQ ID NO：27之輕鏈序列；SEQ ID NO：25之VL序列；SEQ ID NO：37之重鏈序列；SEQ ID NO：35之VH序列；SEQ ID NO：47之輕鏈序列；SEQ ID NO：45之VL序列；SEQ ID NO：57之重鏈序列；SEQ ID NO：55之VH序列；SEQ ID NO：67之輕鏈序列；SEQ ID NO：65之VL序列；SEQ ID NO：77之重鏈序列；SEQ ID NO：75之VH序列；SEQ ID NO：87之輕鏈序列；及SEQ ID NO：85之VL序列。
於一實施例中，本發明提供一種核酸(聚核苷酸)，其編碼表1中所述之單離抗體或其抗原結合片段，其中該核酸包括選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：18之重鏈序列；SEQ ID NO：38之重鏈序列；SEQ ID NO：58之重鏈序列；SEQ ID NO：78之重鏈序列； SEQ ID NO：28之輕鏈序列；SEQ ID NO：48之輕鏈序列；SEQ ID NO：68之輕鏈序列；SEQ ID NO：88之輕鏈序列；SEQ ID NO：16之VH序列；SEQ ID NO：36之VH序列；SEQ ID NO：56之VH序列；SEQ ID NO：76之VH序列；SEQ ID NO：26之VL序列；SEQ ID NO：46之VL序列；SEQ ID NO：66之VL序列；及SEQ ID NO：86之VL序列。
於另一態樣中，本發明亦提供一種包括該等核酸或聚核苷酸之載體。
於另一態樣中，本發明亦提供一種包括該等核酸或聚核苷酸之宿主細胞。於一實施例中，該宿主細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。於本發明之一實施例中，該單離宿主細胞包括包含該等核酸或聚核苷酸之載體。
於一實施例中，本發明提供一種單離宿主細胞，其包括(1)編碼本發明抗體之重鏈的重組核酸片段，及(2)編碼本發明抗體之輕鏈的第二重組核酸片段；其中該等DNA片段係分別以可操作方式連接第一及第二啟動子，且能夠於該宿主細胞內表現。於本發明之另一實施例中，該單離宿主細胞包括分別編碼本發明抗體之重鏈及輕鏈的重組DNA片段，其中該DNA片段係以可操作方式連接啟動子，且能夠於該宿主細胞內表現。於一實施例中，該等宿主細胞係非人類哺乳動物細胞系。於一實施例中，該抗體或其抗原結合片段係人類單株抗體或 其抗原結合片段。
本發明提供一種如本文所述之針對BMP6之抗體或其抗原結合片段、聚核苷酸、載體、宿主細胞於製造藥劑之用途。本發明提供一種如本文所述之抗體或其抗原結合片段，其用作藥劑。本發明提供一種如本文所述之抗體或其抗原結合片段，其用於治療中。本發明提供一種如本文所述之抗體或其抗原結合片段，其用於治療貧血(例如，慢性疾病貧血)。於一實施例中，慢性疾病係慢性腎病。於一實施例中，慢性疾病係癌症。於一實施例中，慢性疾病係發炎。於實施例中，貧血患者已用或正用紅血球生成刺激劑(ESA)(例如促紅血球生成素(EPO))治療。
於另一態樣中，本發明提供使用如本文所述之抗體及其抗原結合片段，及包括該等抗體及其抗原結合片段之組合物的方法。於一態樣中，本發明提供一種減少有此需要之患者之鐵調節素之活性或含量的方法，該方法包括向該患者投與如本文所述之針對BMP6之抗體或其抗原結合片段的步驟。於此方法之一實施例中，鐵調節素之活性或含量係減少至少50%。於一實施例中，該患者罹患貧血。於實施例中，貧血係慢性疾病貧血(ACD)，例如，慢性腎病(CKD)之貧血，癌症之貧血，或發炎之貧血。於一實施例中，該貧血係紅血球刺激劑(ESA)耐藥性貧血，或限鐵性貧血。
本發明提供一種治療有此需要之患者之貧血的方法，該方法包括向該患者投與本文所述之抗體或其抗原結合片段的步驟。於實施例中，該貧血係慢性疾病貧血(ACD)，例如慢性腎病(CKD)之貧血、癌症之貧血、或發炎之貧血。於一實施例中，該貧血係紅血球刺激劑(ESA)耐藥性貧血、或限鐵性貧血。於實施例中，該患者正用或已用紅血球生成刺激劑(ESA)(例如促紅血球生成素(EPO))治療。於實施例中，該貧血係EPO低反應性貧血。於實施例中，該貧血係限鐵性貧 血。於實施例中，該患者係慢性血液透析患者。
於另一實施例中，本發明提供一種抑制有此需要之患者之BMP6的方法，其中該方法包括向該患者投與有效量之包括本發明抗體或其抗原結合片段的組合物的步驟。於實施例中，該患者罹患貧血。於實施例中，該貧血係慢性疾病貧血(ACD)，例如慢性腎病(CKD)之貧血、癌症之貧血、或發炎之貧血。於一實施例中，該貧血係紅血球刺激劑(ESA)耐藥性貧血、或限鐵性貧血。於實施例中，該患者正用或已用紅血球生成刺激劑(ESA)(例如促紅血球生成素(EPO))治療。於實施例中，該貧血係EPO低反應性貧血。於實施例中，該貧血係限鐵性貧血。於實施例中，該患者係慢性血液透析患者。
本發明亦提供一種減少細胞中之BMP6之活性的方法，其包括用本發明抗體或其抗原結合片段接觸該細胞的步驟。
本發明進一步提供一種增加有此需要之患者之血清鐵含量、轉鐵蛋白飽和度(TSAT)、網織紅血球血紅素含量(CHr)、網織紅血球計數、紅血球計數、血紅素及/或血容比的方法，其包括向該患者投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段的步驟。
本發明進一步提供一種增加或維持患者之血紅素含量的方法，該方法包括向該患者投與本文所述之抗體或其抗原結合片段。於實施例中，該患者罹患貧血。於實施例中，該貧血係慢性疾病貧血(ACD)，例如慢性腎病(CKD)之貧血、癌症之貧血、或發炎之貧血。於一實施例中，該貧血係紅血球刺激劑(ESA)耐藥性貧血、或限鐵性貧血。於實施例中，該患者正用或已用紅血球生成刺激劑(ESA)(例如促紅血球生成素(EPO))治療。於實施例中，該貧血係EPO低反應性貧血。於實施例中，該貧血係限鐵性貧血。於實施例中，該患者係慢性血液透析患者。於實施例中，該方法進一步包括相對於在不存在用本文所述之抗體或其抗原結合片段治療時的該EPO劑量需求及/或鐵劑 量需求來減少患者之鐵劑量需求，減少患者之EPO劑量需求或減少患者之鐵劑量需求及患者之EPO劑量需求二者。於實施例中，血紅素含量係增加或維持於至少約10.0、至少約11.0或至少約12.0g/dL下之含量。於實施例中，血紅素含量係增加或維持於至少10.0、至少11.0或至少12.0g/dL下之含量。
於任一前述之方法中，向該患者投與本文所述之抗體或其抗原結合片段的之步驟包括向該患者投與包括本文所述之抗體或其抗原結合片段之組合物的步驟。
於任一前述之方法中，該抗體或其抗原結合片段可以0.001至0.1mg/kg之劑量，例如以0.001mg/kg、0.0016mg/kg、0.0025mg/kg、0.0040mg/kg、0.0063mg/kg、0.01mg/kg、0.016mg/kg、0.025mg/kg、0.040mg/kg、0.063mg/kg、或0.1mg/kg之劑量投與。於任一前述之方法中，該抗體或其抗原結合片段可以約0.001至約0.1mg/kg之劑量，例如以約0.001mg/kg、約0.0016mg/kg、約0.0025mg/kg、約0.0040mg/kg、約0.0063mg/kg、約0.01mg/kg、約0.016mg/kg、約0.025mg/kg、約0.040mg/kg、約0.063mg/kg、或約0.1mg/kg之劑量投與。
於實施例中，該抗體或其抗原結合片段係靜脈內投與。於實施例中，該抗體或其抗原結合片段係皮下投與。於實施例中，該抗體或其抗原結合片段係藉由約30至約60分鐘之時間內的輸注來投與。
於另一態樣中，本發明提供一種包括表1中所列之CDR的針對BMP6之抗體或其抗原結合片段。本發明提供一種表1中所列之針對BMP6之抗體或其抗原結合片段。本發明提供一種編碼包括表1中所列之CDR的針對BMP6之抗體或其抗原結合片段的單離聚核苷酸。於本發明之一實施例中，聚核苷酸或核酸係經單離。於本發明之一實施例中，該抗體或其抗原結合片段係經單離。
定義
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有如由本發明所屬之領域中之一般技術者通常所理解般之相同含義。
如本文所用之「BMP6」意謂蛋白質骨形態生成蛋白6(BMP6)或編碼BMP6之基因或核酸。Hahn等人，1992 Genomics 14：759-62；Sauermann等人，1993 J.Neurosci.Res.33：142-7；NCBI基因ID：654。BMP6亦係稱為：BMP-6；VGR；VGR1；外部ID：OMIM：112266 MGI：88182；同源基因：1300；GeneCards：BMP6基因。直系同源基因：物種：人類：Entrez：654；Ensembl：ENSG00000153162；UniProt：P22004；RefSeq(mRNA)：NM_001718；RefSeq(蛋白質)：NP_001709；位置(UCSC)：Chr 6：7.73-7.88Mb；物種：小鼠：Entrez：12161；Ensembl：ENSMUSG00000039004；UniProt：P20722；RefSeq(mRNA)：NM_007556；RefSeq(蛋白質)：NP_031582；位置(UCSC)：Chr 13：38.35-38.5Mb。如本文所述，結合BMP6之抗體及其抗原結合片段結合BMP6蛋白質。
如本文所用之「BMP2」意謂蛋白質骨形態生成蛋白2(BMP2)或編碼BMP2之基因或核酸。BMP2亦係稱為BDA2；及BMP2A；外部ID OMIM：112261MGI：88177；同源基因：926；GeneCards：BMP2基因。物種：人類；Entrez：650；Ensembl：ENSG00000125845；UniProt：P12643；RefSeq(mRNA)：NM_001200；RefSeq(蛋白質)：NP_001191；位置(UCSC)：Chr 20：6.75-6.76Mb。物種：小鼠；Entrez：12156；Ensembl：ENSMUSG00000027358；UniProt：P21274；RefSeq(mRNA)：NM_007553；RefSeq(蛋白質)：NP_031579；位置(UCSC)：Chr 2：133.55-133.56Mb。如本文所述，結合BMP2之抗體及其抗原結合片段結合BMP2蛋白質。
如本文所用之「BMP5」意謂蛋白質骨形態生成蛋白5(BMP5)或編碼BMP5之基因或核酸。BMP5亦係稱為MGC34244；外部ID OMIM：112265 MGI：88181；同源基因：22412；GeneCards：BMP5基因。物種：人類；Entrez：653；Ensembl：ENSG00000112175；UniProt：P22003；RefSeq(mRNA)：NM_021073；RefSeq(蛋白質)：NP_066551；位置(UCSC)：Chr 6：55.62-55.74Mb。物種：小鼠；Entrez：12160；Ensembl：ENSMUSG00000032179；UniProt：P49003；RefSeq(mRNA)：NM_007555；RefSeq(蛋白質)：NP_031581；位置(UCSC)：Chr 9：75.78-75.9Mb。如本文所述，結合BMP5之抗體及其抗原結合片段結合BMP5蛋白質。
如本文所用之「BMP7」意謂蛋白質骨形態生成蛋白質7(BMP7)或編碼BMP7之基因或核酸。BMP7亦係稱為成骨蛋白質-1；OP-1；外部ID OMIM：112267 MGI：103302；同源基因：20410；GeneCards：BMP7基因。物種：人類；Entrez：655；Ensembl：ENSG00000101144；UniProt：P18075；RefSeq(mRNA)：NM_001719；RefSeq(蛋白質)：NP_001710；位置(UCSC)：Chr 20：55.74-55.84Mb。物種：小鼠；Entrez：12162；Ensembl：ENSMUSG00000008999；UniProt：P23359；RefSeq(mRNA)：NM_007557；RefSeq(蛋白質)：NP_031583；位置(UCSC)：Chr 2：172.87-172.94Mb。如本文所述，結合BMP7之抗體及其抗原結合片段結合BMP7蛋白質。
「鐵調節素」意謂基因鐵調節素或蛋白質鐵調節素，一種勝肽激素，鐵調節素亦係稱為HAMP(鐵調節素抗-微生物蛋白或勝肽)；HEPC；HFE2B；LEAP1(LEAP-1)；PLTR；OMIM：606464；同源基因：81623；GeneCards：HAMP基因；Entrez 57817；Ensembl ENSG00000105697；UniProt P81172；RefSeq(mRNA)NM_021175； RefSeq(蛋白質)NP_066998；位置(UCSC)Chr 19：35.77-35.78Mb。Krause等人，FEBS Lett.480：147-150；及Pigeon等人，2001 J.Biol.Chem.276：7811-9。亦可參：Ganz 2003 Blood 102：783-8；Roy等人，2005 Curr.Opin.Hemat.12：107-111；Fleming等人，2006 Semin.Liver Dix.25：411-9；Park等人，2001 J.Biol.Chem.276：7806-10；Majore等人，2002 Haematologica 87：221-2；Kluver等人，2002 J.Pept.Res.59：241-8；Hunter等人，2002 J.Biol.Chem.277：37597-603；Weinstein等人，2003 Blood 100：3776-81；Nemeth等人，2003 Blood 101：2461-3；Roetto等人，2003 Nat.Genet.33：21-2；Strausberg等人，2003 Proc.Natl.Acad.Sci USA 99：16899-903；Gehrke等人，2003 Blood 102：371-6；Merryweather-Clarke等人，2004 Human Mol.Genet.12：2241-7；Clark等人，2003 Genome Res.13：2265-70；Roetto等人，2004 Blood 103：2407-9；Jacolot等人，2004 Blood 103：2835-40；及Ota等人，2004 Nat.Genet.36：40-45。
如本文所用之「貧血」意謂紅血球之數量減少，或血液中之血紅素或鐵的量減少，同時血液攜帶氧之能力減少。
貧血可使用於此項技術中已知之任何方法來診斷，該等方法包括(作為非限制性實例)：於基於男性中小於約130至140g/L(13至14g/dL)之血紅素及於女性中小於約120至130g/L(12至13g/dL)之血紅素。Janz等人，2013 Emerg.Med.Pract.15：1-15；及Smith 2010 Am.J.Man.Care 16 Supp.S59-66。
如本文所用，術語「BMP6抗體」、「抗人類BMP6抗體」、「BMP6結合抗體」、「BMP6拮抗劑抗體」及類似者(及其抗原結合片段)包括結合蛋白質BMP6之抗體(及其抗原結合片段)。
如本文所用，術語「抗體」、「其抗原結合片段」、「抗原結 合部分」及類似者包括整個抗體及其任何抗原結合片段(即「抗原結合部分」)或單鏈。自然存在之「抗體」係包括藉由二硫鍵相互連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的糖蛋白。每條重鏈係由重鏈可變區(本文略寫為VH)及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區係由三個域CH1、CH2及CH3組成。每條輕鏈係由輕鏈可變區(本文略寫為VL)及輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區係由一個域CL組成。VH及VL區可經進一步細分為穿插稱為框架區(FR)之更為保守的區之稱為互補決定區(CDR)的超突變區。每條VH及VL係由自胺基端至羧基端以下列順序排列之三個CDR及四個FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q))之結合。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合片段」、「其抗原結合片段」、「抗原結合部分」及類似者係指保留特異性結合給定抗原(例如BMP6)之能力的完整抗體之一或多個片段。抗體之抗原結合功能可藉由完整抗體之片段來進行。涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」中之結合片段的實例包括由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段(Fab片段)；包括於鉸鏈區處藉由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段之二價片段(F(ab)2片段)；由VH及CH1域組成之Fd片段；由抗體之單臂之VL及VH域組成的Fv段；由VH域組成之單域抗體(dAb)片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)；及單離互補決定區(CDR)。
還有，儘管Fv片段之兩個域VL及VH係藉由單獨基因編碼，但其可使用重組方法藉由能夠使其作為其中VL及VH區成對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv))之單蛋白質鏈製造的人造肽連接子來接合；參見例如Bird等人，1988 Science 242：423-426；及Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。該等單鏈抗體包括抗體之一或 多個「抗原結合部分」。該等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術來獲得，且片段經篩選以如完整抗體般之相同方式來利用。
抗原結合部分亦可經併入單域抗體、最大抗體、最小抗體、胞內抗體、二抗體、三抗體、四抗體、v-NAR及雙-scFv(參見例如Hollinger及Hudson,2005,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136)。抗體之抗原結合部分可接枝至基於多肽(諸如III型纖連蛋白(Fn3))之支架(參見美國專利第6,703,199號，其描述纖連蛋白多肽單體)中。
抗原結合部分可經併入包括與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區之一對串聯Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的單鏈分子中(Zapata等人，1995 Protein Eng.8(10)：1057-1062；及美國專利第5,641,870號)。
如本文所用，術語「親和力」係指於單抗原位點處抗體與抗原之間的相互作用強度。於每個抗原位點內，抗體「臂」之可變區經由弱非共價力與於多個位點處之抗原相互作用；相互作用越大，親和力越強。
如本文所用，術語「抗體親抗原性」係指抗體-抗原複合物之整體穩定性或強度之信息化量度。其受三個主要因素控制：抗體抗原決定基親和力；抗原及抗體二者之配價；及相互作用部分之結構排列。最終該等因素定義抗體之特異性，即特定抗體係結合明確抗原抗原決定基之可能性。
術語「胺基酸」係指自然存在及合成胺基酸，以及以類似於自然存在胺基酸之方式發揮作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。自然存在胺基酸係彼等藉由遺傳密碼編碼者，以及彼等隨後經修飾之胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基穀胺酸、及O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指具有與自然存在胺基酸相同之基礎化學結構(即α碳係結合氫、羧基、胺基及R基)之化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞 碸、甲硫胺酸二甲碸。該等類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽主鏈，然保留與自然存在胺基酸相同之基礎化學結構。胺基酸模擬物係指具有不同於胺基酸之一般化學結構的結構，然以類似於自然存在胺基酸之方式發揮作用的化學化合物。
如本文所用之術語「結合特異性」係指個別抗體組合位點僅與一個抗原決定子反應的能力。抗體之組合位點係位於分子之Fab部分且係由重鏈及輕鏈之超變區構造。抗體之結合親和力係單一抗原決定子與於抗體上之單一組合位點之間反應的強度。其係於抗原決定子與抗體之組合位點之間操作之吸引及排斥力的總和。
於兩個實體間之特異性結合意謂以至少1 X 107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、或1011M-1之平衡常數(KA或KA)結合。片語「特異性(或選擇性)結合」抗體(例如，BMP6-結合抗體)係指決定同源抗原(例如，人類BMP6蛋白質)存在於蛋白質及其他生物製劑之異質群體中的結合反應。除上述之平衡常數(KA)外，本發明BMP6-結合抗體通常亦具有約1 X 10-2s-1、1 X 10-3s-1或更低之解離速率常數(Kd或KD或KD)，及以比其針對結合非特異性抗原(例如，BMP2、BMP5或BMP7)之親和力大至少兩倍之親和力結合BMP6。片語「抗體識別抗原」及「特異性針對抗原之抗體」可與「特異性結合抗原之抗體」在本文相互交換使用。
於兩個實體間之特異性結合意謂以以下平衡常數(KA)(kon/koff)結合：至少102M-1、至少5 X 102M-1、至少103M-1、至少5 X 103M-1、至少104M-1、至少5 X 104M-1、至少105M-1、至少5 X 105M-1、至少106M-1、至少5 X 106M-1、至少107M-1、至少5 X 107M-1、至少108M-1、至少5 X 108M-1、至少109M-1、至少5 X 109M-1、至少1010M-1、至少5 X 1010M-1、至少1011M-1、至少5 X 1011M-1、至少1012M-1、至少5 X 1012M-1、至少1013M-1、至少5 X 1013M-1、至少1014M-1、至少5 X 1014M-1、至少1015M-1或至少5 X 1015M-1。
術語「嵌合抗體」(或其抗原結合片段)係抗體分子(或其抗原結合片段)，其中(a)恆定區或其部分經改變、置換或交換使得抗原結合位點(可變區)係連接至不同或經修改之種類、效應功能及/或物種的恆定區或賦予新性質給嵌合抗體的完全不同分子，例如酵素、毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區或其部分經具有不同或經修改之抗原特異性的可變區改變、置換或交換。例如，小鼠抗體可藉由自人類免疫球蛋白之恆定區置換其恆定區來修飾。由於經人類恆定區置換，相較於原始小鼠抗體，嵌合抗體可保留其識別抗原之特異性同時具有於人類中減少之抗原性。
術語「經保守修飾之變體」適用於胺基酸及核酸序列二者。就特定核酸序列而言，經保守修飾之變體係指彼等編碼相同或基本上相同胺基酸序列之核酸，或在不編碼胺基酸序列之核酸情況下，係指基本上相同序列。由於遺傳密碼之簡併性，大量功能上相同核酸編碼任何給定蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU全部編碼胺基酸丙胺酸。因此，於丙胺酸係藉由密碼子指定之每個位置處，密碼子可經改變至所述任何對應密碼子而不改變所編碼之多肽。該等核酸變異係「隱性變異」，其係經保守修飾之變異的一物種。本文編碼多肽之每個核酸序列亦描述核酸之每個可能隱性變異。熟練技術者應知曉核酸中之每個密碼子(除通常係甲硫胺酸之唯一密碼子的AUG及通常係色胺酸之唯一密碼子的TGG外)可經修飾以產生功能相同分子。因此，編碼多肽之核酸之每個隱性變異係隱含於每個所述序列中。
針對多肽序列，「經保守修飾之變體」包括多肽序列之個別取代、缺失或添加，其導致胺基酸經化學上相似胺基酸取代。提供功能相似胺基酸之保守取代表係為此項技術中所熟知。該經保守修飾之變體係另外且不排除本發明多態變體、種間同系物及對偶基因。以下八 組含有經彼此保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如Creighton,Proteins(1984))。於一實施例中，術語「保守序列修飾」係用於指示不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體之結合特徵的胺基酸修飾。
如本文所用之術語「阻斷」係指停止或防止相互作用或過程，例如停止配位體依賴或配位體獨立性訊號。
如本文所用之術語「識別」係指發現其構形抗原決定基並與其相互作用(例如結合)的抗體及其抗原結合片段。
術語「交叉阻斷(cross-block/cross-blocked/cross-blocking)」、「競爭」、「交叉競爭」及相關術語於本文中可相互交換使用以意謂於標準競爭結合測定中抗體或其他抗原結合劑干擾其他抗體或結合劑與BMP6之結合的能力。
抗體或其他結合劑之能力或程度能夠干擾另一抗體或結合分子與BMP6之結合，及因此無論可謂為根據本發明之交叉阻斷，其可使用標準競爭結合測定法來測定。一合適測定涉及使用Biacore技術(例如藉由使用BIAcore 3000儀器(Biacore,Uppsala,Sweden))，其可使用表面電漿共振技術來測量相互作用的程度。用於測量交叉阻斷之另一測定使用ELISA-基方法。
術語「中和」意謂抗體於結合其靶時減少靶之活性、含量或穩定性；例如，BMP6抗體於結合BMP6時藉由至少部分減少BMP6之活性、含量或穩定性(諸如信號傳遞或其於鐵調節素含量及貧血中之作用)來中和BMP6。
術語「抗原決定基」意謂能特異性結合抗體之蛋白質決定子。 抗原決定基通常由化學活性表面分組之分子(諸如胺基酸或糖側鏈)組成及通常具有特異三維結構特徵以及特異電荷特徵。構形及非構形抗原決定基之區別之處在於針對前者而非後者之結合性於變性溶劑之存在下喪失。
術語「抗原決定基」包括能特異性結合免疫球蛋白或以其他方式與分子相互作用之任何蛋白質決定子。抗原決定基決定子通常由化學活性表面分組之分子(諸如胺基酸BMP6或碳水化合物或糖側鏈)組成且可具有特異三維結構特徵以及特異電荷特徵。抗原決定基可係「線性」或「構形」。
術語「線性抗原決定基」係指於蛋白質與相互作用分子(諸如抗體)之間之相互作用的所有點線性地沿著蛋白質之一級胺基酸序列發生(繼續)的抗原決定基。
如本文所用，針對IgG抗體之術語「高親和力」係指針對靶抗原(例如，BMP6)具有10-8M或更小、10-9M或更小或10-10M、或10-11M或更小之KD的抗體。然而，「高親和力」結合性針對其他抗體同型物可改變。例如，針對IgM同型物之「高親和力」結合性係指具有10-7M或更小、或10-8M或更小之KD的抗體。
如本文所用之術語「人類抗體」(或其抗原結合片段)意欲包括具有其中框架及CDR區二者係衍生自人類源序列之可變區的抗體(或其抗原結合片段)。還有，若抗體含有恆定區，則恆定區亦係衍生自該人類序列，例如人類生殖系序列或人類生殖系序列之突變版本。本發明人類抗體及其抗原結合片段可包括未由人類序列編碼的胺基酸殘基(例如，隨機或活體外定點突變誘發或活體內體細胞突變所引入之突變)。
如本文所用之片語「單株抗體」或「單株抗體組合物」(或其抗原結合片段)係指包括抗體、抗體片段、雙特異性抗體等之多肽，其 具有實質上相同之胺基酸序列或係衍生自相同遺傳來源。此術語亦包括單分子組合物之抗體分子的製劑。單株抗體組合物顯示針對特定抗原決定基之單結合特異性及親和力。
術語「人類單株抗體」(或其抗原結合片段)係指具有其中框架及CDR區二者係衍生自人類序列之可變區的顯示單結合特異性的抗體(及其抗原結合片段)。於一實施例中，人類單株抗體係藉由包括與永生細胞融合之自具有人類重鏈轉基因及輕鏈轉基因之基因組的轉基因非人類動物(例如，轉基因小鼠)獲得之B細胞的融合瘤來產生。
如本文所用之片語「重組人類抗體」(或其抗原結合片段)包括以重組方式製備、表現、產生或單離之所有人類抗體(及其抗原結合片段)，諸如自針對人類免疫球蛋白基因為轉基因或轉染色體的動物(例如，小鼠)或由此製備之融合瘤單離之抗體，自經轉形以表現人類抗體之宿主細胞(例如，自轉染瘤)單離之抗體，自重組、組成人類抗體庫單離之抗體及以涉及將所有或部分人類免疫球蛋白基因、序列與其他DNA序列拼接之任何其他方式製備、表現、產生或單離的抗體。該等重組人類抗體具有其中框架及CDR區係衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。於一實施例中，該等重組人類抗體可接受活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之轉基因動物時，活體內體細胞突變誘發)及因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列係雖然衍生自人類生殖系VH及VL序列且與其等相關但可能非自然存在於活體內人類抗體生殖系基因譜內的序列。
如本文所用之「人源化」抗體(或其抗原結合片段)係保留非人類抗體之反應性同時於人類中具有較低免疫原性的抗體(或其抗原結合片段)。此可係(例如)藉由保留非人類CDR區及用其之人類相對物(即，恆定區以及可變區之框架部分)置換抗體之剩餘部分來達成。參見例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855, 1984；Morrison及Oi,Adv.Immunol.,44：65-92,1988；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28：489-498,1991；及Padlan,Molec.Immun.,31：169-217,1994。人類工程改造技術之其他實例包括(但不限於)揭示於美國專利第5,766,886號之Xoma技術。
於兩或多種核酸或多肽序列之語境中之術語「相同」或「一致性」百分率係指相同的兩或多種序列或子序列。當如使用以下序列比較算法中之一者或藉由手動比對及目視檢查所測量，來比較及比對在比較窗口或指定區內之最大對應時，若兩種序列具有指定百分率之相同胺基酸殘基或核苷酸(即，於指定區內或當未指定時於整個序列內60%一致性，視情況65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性)，則兩種序列係「實質上相同」。視情況，一致性存在於長度上係至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區內，或更佳於長度上係100至500或1000或更多個核苷酸(或20、50、200或更多個胺基酸)之區內。視情況，一致性存在於長度上係至少50個核苷酸(或10個胺基酸)之區內，或更佳於長度上係100至500或1000或更多個核苷酸(或20、50、200或更多個胺基酸)之區內。
針對序列比較，通常一序列作為參考序列，測試序列係與其進行比較。當使用序列比較算法時，將測試及參考序列輸入電腦，指定子序列坐標(若必要)，並指定序列算法程式參數。可使用系統默認程式參數或可指定置換參數。然後序列比較算法基於程式參數，相對於參考序列計算測試序列之序列一致性百分率。
如本文所用之「比較窗口」包括參考選自由20至600，通常約50至約200，更通常約100至約150組成之群之任一數量的連續位置的片段，其中於兩序列經最佳比對後，序列可與相同數量之連續位置的參考序列進行比較。用於比較之序列的比對方法係此項技術中所熟知。 用於比較之序列的最佳比對可藉由以下進行：例如，Smith及Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源算法，Needleman 及Wunsch,J.Mol.Biol.48：443,1970之同源比對算法，Pearson及Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444,1988之相似性方法之搜索，藉由該等算法之電腦上實現(於Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)，或藉由手動比對及目視檢測(參見例如Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(ringbou編輯，2003))。
適於測定序列一致性百分率及序列相似性之算法的兩個實例係BLAST及BLAST 2.0算法，其係分別描述於Altschul等人，Nuc.Acids Res.25：3389-3402,1977；及Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410,1990中。進行BLAST分析之軟體係經由國家生物技術資訊中心(the National Center for Biotechnology Information)公開獲得。該算法涉及首先藉由在查詢序列中確定長度為W的短字串來確定高計分序列對(HSP)，當於資料庫序列中之相同長度的字串比對時，其匹配或滿足一些正值臨限得分T。T係稱為鄰字串得分臨限值(Altschul等人，以上)。此等初始鄰字串命中用作引發搜索來發現含有其之較長HSP的種子。字串命中係欲沿著每個序列之兩個方向擴展，只要累積比對得分可增加。針對核苷酸序列，使用參數M(一對匹配殘基之獎勵得分；通常>0)及N(不匹配殘基之處罰得分；通常<0)來計算累積得分。針對胺基酸序列，使用得分矩陣來計算累積得分。當：累積比對得分自其最大達成值減少數量X；由於一或多個負得分殘基比對之積累使得累積得分趨於0或以下；或到達任一序列之末端時，於每個方向中之字串命中之延伸停止。BLAST算法參數W、T及X確定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(針對核苷酸序列)使用11之字串長度 (N)、10之期望值(E)、M=5、N=-4及兩股之比較作為默認值。針對胺基酸序列，BLASTP程式使用3之字串長度、及10之期望值(E)作為默認值，及BLOSUM62得分矩陣(參見Henikoff及Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915,1989)使用50之比對(B)、10之期望值(E)、M=5、N=-4及兩股之比較。
BLAST算法亦進行兩個序列間之相似性的統計分析(參見例如，Karlin及Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787,1993)。藉由BLAST算法提供之相似性的一種量度係最小總概率(P(N))，其提供概率的指示，藉此兩個核苷酸或胺基酸序列間之匹配將偶然發生。例如，若測試核酸與參考核酸之比較中之最小總概率係小於約0.2，更佳小於約0.01，及最佳小於約0.001，則認為核酸與參考序列相似。
兩個胺基酸序列間之一致性百分率亦可使用已併入使用PAM120權數殘基表、12之空位長度罰分及4之空位罰分的ALIGN程式(版本2.0)之E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17,1988)的算法來測定。此外，兩個胺基酸序列間之一致性百分率可使用已併入使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣及16、14、12、10、8、6或4之空位加權及1、2、3、4、5或6之長度加權的GCG軟體套件中之GAP程式中(於www.gcg.com可得)之Needleman及Wunsch(J.Mol,Biol.48：444-453,1970)算法來測定。
除上述序列一致性的百分率以外，兩個核酸序列或多肽係實質上相同之另一指示係如下所述之藉由第一核酸編碼之多肽係與抗藉由第二核酸編碼之多肽而產生之抗體進行免疫交叉反應。因此，多肽通常係實質上與第二多肽相同，例如，兩個肽僅因保守取代而不同。兩個核酸序列係實質上相同之另一指示係如下所述之兩個分子或其補體於嚴格條件下彼此雜交。兩個核酸序列係實質上相同之又一指示係可使用相同引物擴增序列。
如本文所用之術語「單離抗體」(或其抗原結合片段)係指實質上係不含其他具有不同抗原特異性之抗體(或其抗原結合片段)(例如，特異性結合BMP6之單離抗體實質上係不含特異性結合除BMP6外之抗原的抗體)。此外，單離抗體實質上可能不含其他細胞物質及/或化學物質。
術語「同型物」係指藉由重鏈恆定區基因提供之抗體種類(例如，IgM、IgE、IgG諸如IgG1或IgG4)。同型物亦包括該等種類之一的修飾版本，其中修飾已於Fc功能後進行，例如增強或減少效應功能或結合Fc受體。
如本文所用之術語「Kassoc」、「Ka」、「KA」、「KA」係欲指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，然而如本文所用之術語「Kdis」、「Kd」係欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率，於一實施例中，如本文所用之術語「KD」係欲指解離常數，其係自Kd與Ka之比率(即Kd/Ka)而得及係表示為莫耳濃度(M)。抗體之KD值可使用此項技術中良好建立之方法測定。測定抗體之KD之方法係藉由使用表面電漿共振或使用生物感測器系統(諸如Biacore®系統)。
如本文所用之術語「單株抗體」(或其抗原結合片段)或「單株抗體(或其抗原結合片段)組合物」係指單分子組合物之抗體分子(或其抗原結合片段)的製劑。單株抗體組合物顯示針對特定抗原決定基之單結合特異性及親和力。
本文中術語「核酸」可與術語「聚核苷酸」相互交換使用及係指以單或雙股形式之脫氧核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經修飾主鏈殘基或鏈接之核酸，其係合成、自然存在或非自然存在，其具有與參考核酸相似的結合性質且其係以與參考核苷酸相似之方式代謝。該類似物之實例包括(但不限於)：硫代磷酸酯、磷醯胺酯、磷酸甲酯、對掌性磷酸甲酯、2-O-甲 基核醣核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另有指示，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變體(例如，簡併密碼子取代物)及互補序列以及明確指示之序列。如下文中明確描述，簡併密碼子取代物可係藉由生成其中一或多個選定之(或全部)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代之序列來達成(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081,1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608,1985；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98,1994)。
術語「以可操作方式連接」係指於兩或多種聚核苷酸(例如，DNA)片段之間的功能關係。通常，其係指轉錄調節序列與經轉綠之序列的功能關係。例如，啟動子或增強子序列係以可操作方式連接編碼序列，若其刺激或調節於適當宿主細胞或其他表現系統中之編碼序列之轉綠。一般而言，以可操作方式連接經轉綠之序列的啟動子轉錄調節序列係物理上鄰接經轉綠之序列，即，其係順式作用。然而，一些轉錄調節序列(諸如增強子)不需要物理上鄰接或位於靠近增強其之轉綠的編碼序列。
如本文所用，術語「最佳化」意謂核苷酸序列已經改變以使用優選於生產細胞或生物(一般而言真核細胞，例如畢赤酵母細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞)中較佳之密碼子來編碼胺基酸序列。最佳化之核苷酸序列經改造以完全或儘可能多地保留最初藉由起始核苷酸序列(亦稱為「親代」序列)編碼之胺基酸序列。本文中最佳化之序列經改造以具有哺乳動物細胞中較佳之密碼子。然而，本文亦設想該等序列於其他真核細胞或原核細胞中之最佳化表現。藉由最佳化之核苷酸序列編碼之胺基酸序列亦係稱為經最佳化。
本文中術語「多肽」及「蛋白質」可相互交換使用以表示胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基係相應自 然存在胺基酸之人造化學模擬物的胺基酸聚合物以及自然存在胺基酸聚合物及非自然存在胺基酸聚合物。除非另有指示，否則特定多肽序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變體。
如本文所用之術語「重組人類抗體」(或其抗原結合片段)包括以重組方式製備、表現、產生或單離之所有人類抗體(及其抗原結合片段)，諸如自針對人類免疫球蛋白基因係轉基因或轉染色體的動物(例如，小鼠)或由此製備之融合瘤單離之抗體，自經轉形以表現人類抗體之宿主細胞(例如，自轉染瘤)單離之抗體，自重組、組成人類抗體庫單離之抗體及以包括將所有或部分人類免疫球蛋白基因、序列與其他DNA序列拼接的任何其他方式製備、表現、產生或單離之抗體。該等重組人類抗體具有其中框架及CDR區係衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，於一實施例中，該等重組人類抗體可接受活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之轉基因動物時，活體內體細胞突變誘發)及因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列係雖然衍生自人類生殖系VH及VL序列且與其等相關但可能非自然存在於活體內人類抗體生殖系基因譜內的序列。
術語「重組宿主細胞」(或簡單地「宿主細胞」)係指重組表現載體已引入至其中之細胞。應瞭解，該等術語不僅欲指特定主體細胞而且指該細胞之子代。因為由突變或環境影響所致之某些修飾可能出現於繼代中，故該子代可能(事實上)與親代細胞不同，然仍含於如本文所用之術語「宿主細胞」的範疇內。
術語「個體」包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類、綿羊、犬、乳牛、雞、兩棲類及爬蟲類。除非另有說明，否則本文中術語「患者」或「個體」可相互交換使用。
術語「治療」包括向患者投與組合物或抗體以預防或延遲疾病 (例如貧血)之症狀、併發症或生化指標的開始，緩解症狀或控制或抑制疾病、病況或病症之進一步發展。治療可係預防性(以預防或延遲疾病的開始或預防其臨床或亞臨床症狀的表現)或治療性(於疾病表現後抑制或減輕症狀)。
術語「載體」欲指能將另一聚核苷酸運輸至其已連接之聚核苷酸的聚核苷酸分子。載體之一種類型係「質粒」，其係指環狀雙股DNA環，其內可拼接入另外DNA片段。載體之另一種類型係病毒載體，其中另外DNA片段可經拼接至病毒基因組中。某些載體係能夠於其所引入之宿主細胞內自發複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離基因哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離基因哺乳動物載體)可於引入至宿主細胞中時經整合至宿主細胞之基因組，並藉此連同宿主基因組複製。此外，某些載體係能直接表現其以可操作方式連接之基因。本文中該等載體係稱為「重組表現載體」(或簡單地「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體通常係呈質粒之形式。於本說明書中，「質粒」及「載體」可相互交換使用，因為質粒係最常用載體之形式。然而，本發明希望包括該等其他形式的表現載體(諸如起到等效功能之病毒載體(例如，複製不全逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒))。
如本文所用之術語「血容比(hematocrit/haematocrit)」亦係稱為紅血球容積(PCV)或紅血球容積比(EVF)及係血液中之紅血球的容積(%)。此正常針對男性為約45%及針對女性為約50%。該血容比被認為係人類完整血液計數結果之組成部分，連同血紅素濃度、白血球計數及血小板計數。於一實施例中，貧血係指異常低之血容比，正與係異常高血溶比之紅血球過多症相反。
圖1A顯示於報道基因測定中藉由拮抗劑抗體5、6及7對BMP活 性之抑制。顯示抗BMP2、BMP5、BMP6及BMP7之活性。圖1B顯示測試抗體7結合人類BMP6、人類BMP7、人類BMP5、小鼠BMP6、hBaffR、BSA及Neu之ELISA結合測定。於此圖及各其他圖中，及於說明書之別處，Ab 5=抗體5；Ab 6=抗體6；及Ab 7=抗體7。
圖2顯示單次劑量大鼠分類PK研究之藥效動力學曲線。使用抗體5、6及7。血清鐵調節素及鐵含量係於給藥(10mg/kg，IV)後1hr、6hr、1、2、4、8、16天測量。
圖3顯示BMP6抗體對鐵代謝之血清生物標記的劑量相依性效應。上：於指定劑量下之抗體6之單IV注射後隨時間的血清hIgG濃度。下：左圖係於注射單一抗體6或對照人類IgG後血清鐵調節素濃度之定量分析，然而右圖係血清鐵濃度。
圖4顯示於ESA-耐藥性發炎貧血小鼠模型中之BMP6抗體的治療處理。上：BA誘導之ESA-耐藥性發炎貧血模型的實驗時間表。下：於BA處理後13天時之紅血球生成參數。HGB：血紅素；HCT：血容比；RETA：網織紅血球計數；RET-HE：網織紅血球血紅素等效物。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001，相對BA+EPO+hIgG1。
圖5顯示藉由HDxMS(氫/氘交換耦合質譜法)繪製之線性抗原決定基圖。顯示由抗體7結合之BMP6之抗原決定基(人類BMP6之殘基88-102(QTLVHLMNPEYVPKP))。使用HDxMS，發現抗體676(一種市售BMP6抗體的人源化版本)結合由人類BMP6之殘基23-35(VSSASDYNSSELK)組成之抗原決定基。
圖6顯示研究BMP6抗體之安全性及療效之臨床程序之第1部分的協定。
圖7顯示研究BMP6抗體之安全性及療效之臨床程序的劑量調整決策樹。
圖8顯示研究BMP6抗體之安全性及療效之臨床程序之第2部分的協定。
圖9顯示雄性大鼠中之單次劑量抗體7之藥代動力學曲線。
圖10顯示抗體7對大鼠中之鐵代謝之血清生物標記的劑量相依性效應。顯示以指定劑量單次注射抗體7或對照(媒劑)後，血清鐵調節素濃度的定量分析。左圖顯示投藥後首個24小時內該等效應的擴展視圖。
圖11顯示抗體7對大鼠中之血清鐵的相依效應。顯示以指定劑量注射單一抗體7或對照(媒劑)後，血清鐵調節素濃度的定量分析。左圖顯示投藥後首個24小時內該等效應的擴展視圖。
圖12顯示於食蟹猴中抗體7之單次劑量IV注射(3mg/kg)的濃度-時間曲線。繪製總抗體7濃度(游離及BMP6-結合二者)。
圖13顯示於抗體7以3mg/kg之劑量之單次IV注射後於雄性食蟹猴中之血清鐵調節素及Fe濃度。顯示來自三隻不同猴之資料(連同平均值)。
本發明提供特異性結合BMP6蛋白質之抗體及其抗原結合片段，及醫藥組合物、生產方法，及使用該等抗體及組合物之方法。
BMP6抗體及其抗原結合片段
本發明提供特異性結合人類BMP6之抗體及其抗原結合片段。
BMP6(一種分泌的BMP家族生長因子配位體)已經確定為鐵代謝激素鐵調節素之肝表現的關鍵內源性調節子。在不受任何特定理論之束縛下，本發明提出，作為降鐵調節素療法之BMP6拮抗劑抗體係期望藉由克服對實質上增加潛在疾病之發病率及通常係不良結果之預測者的紅血球生成刺激劑(ESA)耐藥性而有益於限鐵性貧血患者。
該等抗人類BMP6抗體之實例係抗體3、5、6及7，其之序列係列 於表1中。
抗體5、6及7全部以高親和力結合人類BMP6，其相對人類BMP7、人類BMP5及人類BMP2具有高選擇性(參見圖1A)。該等抗體亦全部證實大鼠中之血清鐵調節素減少及血清鐵增加(參見圖2)。
為了提供靶向此路徑可賦予功能終點之改良的其他證據，吾人測試BMP6特異性抗體，抗體5至7調節正常小鼠及大鼠之鐵代謝之血清生物標記，及逆轉發炎貧血小鼠模型之ESA-耐藥性貧血的能力。吾人發現經BMP6抗體單次注射之動物產生持續增加之血清鐵含量，伴隨循環鐵調節素之強效抑制。還有，遭受經發炎誘導之貧血之小鼠的治療處理顯著改良對並行促紅血球生成素處理反應的紅血球生成參數。
於本發明中，發炎貧血小鼠模型中之BMP6訊號的抑制實質上改良鐵依賴性紅血球參數。
本文揭示之BMP6拮抗劑抗體代表一種安全地改良促紅血球生成素低反應性貧血之新穎治療方法。不受任何特定理論束縛下，本發明提出此可經由鐵儲備之動員及可用性至紅血球隔室之需求來發生。
於一實施例中，本發明提供於針對人類BMP6蛋白質比相對於人類BMP5或人類BMP7蛋白質之任一者高100-、500-或1000-倍之親和力下結合的單離抗體或其抗原結合片段。重要的是對於BMP6之特異性而不結合BMP7，因為BMP6之基因剔除不會使小鼠致死。然而，BMP7之基因剔除小鼠於腎、眼及骨缺陷下出生後死亡。任一基因之個別基因剔除不改變心臟發育，然BMP6及BMP7之雙基因剔除證實心臟中之若干缺陷及延遲；胚胎因心臟功能不全而死亡。BMP7對於預防與纖維化相關之慢性心臟疾病之進展係重要的。因此，不希望抗-BMP6抗體與BMP7交叉反應。本文所提供之抗體係針對BMP6具特異性超過BMP7；參見例如，表4A。圖1B亦顯示針對人類BMP6之結合 特異性超過人類BMP2、BMP5及BMP7蛋白質的證據。相比之下，例如自R&D System購得之BMP6抗體係於報導基因測定中顯示與BMP7具有強烈交叉反應性及抑制BMP6及BMP7兩者。
本發明抗體包括(但不限於)：於實例中之如所述單離的人類單株抗體(參見以下第6節)。
該等抗-人類BMP6抗體之實例係抗體3、5、6及7，其之序列係列於表1中。
成熟抗體7係衍生自NOV0442_VL(YGQ)生殖系化(Germlining)/PTM移除，該NOV0442_VL(YGQ)生殖系/PTM移除係衍生自親代IgG命中NOV0442(VH3_3-15，Vl1_1e)。於ELISA結合測定中抗體7以高親和力結合人類BMP6，其中相對人類BMP7的選擇性超過500-倍(即，針對人類BMP6之親和力比針對人類BMP7大超過500-倍)。此抗體亦無抗人類BMP2或BMP5之可偵測活性。藉由親代IgG NOV0442及抗體7識別之BMP6肽係顯示於圖5。肽包括人類BMP6之胺基酸QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO：92)。與IgG NOV0442及抗體7相比，人源化mAb507(R&D System)結合人類BMP6之序列VSSASDYNSSELK(SEQ ID NO：95)。因此，藉由IgG NOV0442及抗體7識別之抗原決定基表示新穎BMP6抗原決定基。抗體7亦抑制活體外BMP6結合受體。BMP6與BMPR1A之結合受最大抑制59%；BMP6與BMPR1B之結合受最大抑制85%；及BMP6與RGM-c之結合受最大抑制72%。於大鼠中之單次10mg/kg處理導致循環鐵調節素之持續抑制。於小鼠中之經估算之最小有效劑量係小於或等於0.1mg/kg。於猴中之3mg/kg單次抗體劑量後，血清鐵亦顯示增加及鐵調節素顯示減少。於小鼠中，其中使用流產布魯氏菌(brucella abortus)抗原以模擬貧血，抗體7(2mg/kg)之治療效果係與對慢性EPO治療反應之臨床顯著紅血球生成一致，其中血紅素逐漸自基線增加>2.0g/dL。
於抗體7中，潛在轉譯後修飾位點係藉由於LCDR2內之N51Q突變移除以增加隨後產物同種性。衍生自VH3/λ1框架之抗體經以下改造以匹配最接近之人類生殖系序列：於VH中藉由V40A突變，於VL中藉由D1Q、I2S突變及引入胺基酸Y49及G50以修復其中此等2個殘基最初丟失之框架。
此工作形成抗體7(=NOV0958=NOV0806_VH[V40A]_VL[D1Q、I2S、Y49、G50、N51Q])。
抗體3、5、6及7全部顯示相較於人類BMP2、BMP5或BMP7蛋白質針對人類BMP6蛋白質之高特異性。所有此等抗體之抗原決定基經預測為相同，因為其係於親和力成熟前全部衍生自單一親代Fab。例如，於HCDR2之親和力成熟前抗體3與抗體5及7共享相同Fab純系。抗體5係衍生自NOV0442(VH3_3-15，VI1_1e)→NOV0442_VL(YGQ)→(HCDR2親和力成熟)→抗體5。抗體3係衍生自NOV0442(VH3_3-15，VI1_1e)→NOV0442_VL(YGS)→(HCDR2親和力成熟)→抗體3。關於生成本文所述之抗體的另外詳述係提供於實例中。
本發明提供特異性結合BMP6(例如，人類BMP6蛋白質)之抗體，該等抗體包括列於表1中之VH域。本發明亦提供特異性結合BMP6蛋白質之抗體，該等抗體包括具有列於表1中之VH CDR中之任一者的胺基酸序列的VH CDR。特定言之，本發明提供特異性結合BMP6蛋白質之抗體，該等抗體包括(或由其組成)具有列於表1中之任何VH CDR的胺基酸序列的一、二、三、四、五或更多種VH CDR。
本發明亦提供特異性結合BMP6之抗體及其抗原結合片段，該等抗體及其抗原結合片段包括(或由其組成)列於表1中之VH胺基酸序列，其中於框架序列(例如，不係CDR之序列)中不多於約10個胺基酸已突變(其中突變係(作為各個非限制實例)添加、取代或缺失)。本發明亦提供特異性結合BMP6之抗體及其抗原結合片段，該等抗體及其 抗原結合片段包括(或由其組成)列於表1中之VH胺基酸序列，其中於框架序列(例如，不係CDR之序列)中不多於10個胺基酸已突變(其中突變係(作為各個非限制實例)添加、取代或缺失)。
本發明亦提供特異性結合BMP6之抗體及其抗原結合片段，該等抗體及其抗原結合片段包括(或由其組成)列於表1中之VH胺基酸序列，其中於框架序列(例如，不係CDR之序列)中不多於約20個胺基酸已突變(其中突變係(作為各個非限制實例)添加、取代或缺失)。本發明亦提供特異性結合BMP6之抗體及其抗原結合片段，該等抗體及其抗原結合片段包括(或由其組成)列於表1中之VH胺基酸序列，其中於框架序列(例如，不係CDR之序列)中不多於20個胺基酸已突變(其中突變係(作為各個非限制實例)添加、取代或缺失)。
本發明亦提供特異性結合BMP6之抗體及其抗原結合片段，該等抗體及其抗原結合片段包括(或由其組成)列於表1中之VL胺基酸序列，其中於框架序列(例如，不係CDR之序列)中不多於約10個胺基酸已突變(其中突變係(作為各個非限制實例)添加、取代或缺失)。本發明亦提供特異性結合BMP6之抗體及其抗原結合片段，該等抗體及其抗原結合片段包括(或由其組成)列於表1中之VL胺基酸序列，其中於框架序列(例如，不係CDR之序列)中不多於10個胺基酸已突變(其中突變係(作為各個非限制實例)添加、取代或缺失)。
本發明亦提供特異性結合BMP6之抗體及其抗原結合片段，該等抗體及其抗原結合片段包括(或由其組成)列於表1中之VL胺基酸序列，其中於框架序列(例如，不係CDR之序列)中不多於約20個胺基酸已突變(其中突變係(作為各個非限制實例)添加、取代或缺失)。本發明亦提供特異性結合BMP6之抗體及其抗原結合片段，該等抗體及其抗原結合片段包括(或由其組成)列於表1中之VL胺基酸序列，其中於框架序列(例如，不係CDR之序列)中不多於20個胺基酸已突變(其中突 變係(作為各個非限制實例)添加、取代或缺失)。
本發明提供特異性結合BMP6蛋白質之抗體及其抗原結合片段，該等抗體及其抗原結合片段包括列於表1中之VL域。本發明亦提供特異性結合BMP6蛋白質之抗體及其抗原結合片段，該等抗體及其抗原結合片段包括具有列於表1中VL CDR中之任一者的胺基酸序列的VL CDR。特定言之，本發明提供特異性結合BMP6蛋白質之抗體及其抗原結合片段，該等抗體及其抗原結合片段包括(或由其組成)具有列於表1中之任何VL CDR的胺基酸序列的一、二、三、四、五或更多種VL CDR。
本發明其他抗體及其抗原結合片段包括已突變之胺基酸，且於CDR區中與於表1中所述之序列中描繪之CDR區具有至少60%、70%、80%、90%或95%一致性。於一實施例中，其包括突變胺基酸序列，其中當相較於表1中所述之序列中描繪之CDR區時，於CDR區中不多於1、2、3、4或5個胺基酸已突變。
本發明亦提供編碼特異性結合BMP6蛋白質之抗體及其抗原結合片段的VH、VL、全長重鏈及全長輕鏈之核酸序列。該等核酸序列可於哺乳動物細胞中經最佳化來表現(例如，圖1顯示針對抗體3、5、6及7之重鏈及輕鏈的實例核酸序列)。
Figure 104142804-A0305-02-0047-1
Figure 104142804-A0305-02-0048-2
Figure 104142804-A0305-02-0049-3
Figure 104142804-A0305-02-0050-4
Figure 104142804-A0305-02-0051-5
Figure 104142804-A0305-02-0052-6
Figure 104142804-A0305-02-0053-7
Figure 104142804-A0305-02-0054-8
Figure 104142804-A0305-02-0055-9
Figure 104142804-A0305-02-0056-10
Figure 104142804-A0305-02-0057-11
本發明其他抗體及其抗原結合片段包括彼等其中胺基酸或編碼胺基酸之核酸已突變，且與表1中所述之序列具有至少60%、70%、80%、90%或95%一致性者。於一實施例中，包括其中當相較於表1中所述之序列中描繪之可變區時，於可變區中不多於1、2、3、4或5個胺基酸已突變，同時保留實質上相同治療活性的突變胺基酸序列。
於另一具體實施例中，本發明提供一種單離抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP6及包括分別如SEQ ID NO：9、10及11之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：19、20及21之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於另一具體實施例中，本發明提供一種單離抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP6及包括分別如SEQ ID NO：12、13及14之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：22、23及24之 LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於另一具體實施例中，本發明提供一種單離抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP6及包括分別如SEQ ID NO：29、30及31之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：39、40及41之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於另一具體實施例中，本發明提供一種單離抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP6及包括分別如SEQ ID NO：32、33及34之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：42、43及44之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於另一具體實施例中，本發明提供一種單離抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP6及包括分別如SEQ ID NO：49、50及51之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：59、60及61之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於另一具體實施例中，本發明提供一種單離抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP6及包括分別如SEQ ID NO：52、53及54之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：62、63及64之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於另一具體實施例中，本發明提供一種單離抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP6及包括分別如SEQ ID NO：69、70及71之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：79、80及81之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
於另一具體實施例中，本發明提供一種單離抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP6及包括分別如SEQ ID NO：72、73及74之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別如SEQ ID NO：82、83及84之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
因為每個此等抗體可結合BMP6，故VH、VL、全長輕鏈及全長 重鏈序列(胺基酸序列及編碼胺基酸序列之核苷酸序列)可經「混合及匹配」以產生本發明其他BMP6-結合抗體及其抗原結合片段。該等「混合及匹配」BMP6-結合抗體可使用於此項技術中已知之結合測定(例如，ELISA及實例部分中所述之其他測定)來測試。當此等鏈經混合及匹配時，來自特定VH/VL配對之VH序列應經結構上相似VH序列置換。同樣來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長重鏈序列應經結構上相似全長重鏈序列置換。同樣地，來自特定VH/VL配對之VL序列應經結構上相似VL序列置換。同樣自特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長輕鏈序列應經結構上相似全長輕鏈序列置換。
於另一態樣中，本發明提供包括如表1中所述之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3之BMP6-結合抗體或其組合。CDR區係使用Kabat系統(Kabat等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生及公共服務部，NIH出版物第91-3242號)或使用Chothia系統(Chothia等人，1987 J.Mol.Biol.196：901-917；及Al-Lazikani等人，1997 J.Mol.Biol.273：927-948)來刻繪。
考慮到每個此等抗體可結合BMP6，且抗原結合特異性係主要藉由CDR1、2及3區提供，儘管每個抗體必須含有VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3以產生本發明其他結合BMP6之結合性分子，然而VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列仍可經「混合及匹配」(即，自不同抗體之CDR可經混合及匹配)。該等「混合及匹配」之BMP6結合性抗體可使用於此項技術中已知及彼等實例中所述之結合性測定法(例如，ELISA)測試。當VH CDR序列經混合及匹配時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上相似CDR序列置換。同樣地，當VL CDR序列經混合及匹配時，來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上相似CDR序列置換。一般技術者容易明了，新穎VH及VL序列可藉由用自本發明單株抗體之 本文所示之CDR序列的結構上相似序列使一或多種VH及/或VL CDR區突變序列來產生。
因此，本發明提供一種單離單株抗體或其抗原結合區，其包括以下：包括選自任一SEQ ID NO：29、49、69、12、32、52、72或9之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包括選自任一SEQ ID NO：10、30、50、70、13、33、53或73之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包括選自任一SEQ ID NO：11、31、51、71、14、34、54或74之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包括選自任一SEQ ID NO：19、39、59、79、22、42、62或82之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包括選自任一SEQ ID NO：20、40、60、80、23、43、63或83之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；包括選自任一SEQ ID NO：21、41、61、81、24、44、64或84之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；其中該抗體特異性結合BMP6。
於一實施例中，特異性結合BMP6之抗體係表1中所述之抗體。
如本文所用，若該等抗體之可變區或全長鏈係自使用人類生殖系免疫球蛋白基因之系統獲得，則人類抗體包括係特定生殖系序列「之產物」或「衍生自其」之重鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈。該等系統包括使攜帶具有受關注抗原之人類免疫球蛋白基因或篩選顯示於具有受關注抗原之噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫的轉基因小鼠免疫。為人類生殖系免疫球蛋白序列「之產物」或「衍生自其」之人類抗體可如此藉由比較人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列並選擇序列最接近(即最大%一致性)人類抗體之序列的人類生殖系免疫球蛋白序列來確定。特定人類生殖系免疫球蛋白序列「之產物」或「衍生自其」之人類抗體可例如由於自然存在體細胞突變或有意引入之定點突變而含有與生殖系序列比較的胺基酸差異。然而，當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如，鼠生殖系序列)相較時，於VH或VL框架區中，選定之人類抗體之胺基酸 序列通常係與藉由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少90%相同並該抗體含有確定該人類抗體為人類之胺基酸殘基。於某些情況下，人類抗體之胺基酸序列可係與藉由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少60%、70%、80%、90%或至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%相同。通常，於VH或VL框架區中，重組人類抗體將顯示與藉由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列相差不多於10個胺基酸。於某些情況下，人類抗體可顯示與藉由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列相差不多於5個或甚至不多於4、3、2或1個胺基酸。
BMP家族成員及鐵調節素
於一實施例中，本發明提供一種特異性結合BMP6之抗體或其抗原結合片段。於一實施例中，該抗體或其抗原結合片段描述於表1中。
於一實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合BMP6且不結合其他BMP蛋白質(諸如BMP2、BMP5或BMP7)。
BMP6(一種分泌的BMP家族生長因子配位體)以其成熟活化形式係30kDa二硫鍵連接之同源二聚體。該蛋白質係TGF-β超家族之成員。已知骨形態生成蛋白誘導骨及軟骨生長之能力。BMP6能誘導間葉幹細胞中之所有成骨標記。
骨形態生成蛋白(BMP)係可誘導異位骨生長之分泌訊號分子之家族。BMP係轉變生長因子-β(TGF-β)超家族之部分。BMP最初係藉由脫礦骨提取物誘導活體內於骨外位點中之軟骨內成骨之能力來識別。基於其於胚胎形成早期表現，藉由此基因編碼之BMP具有於早期發育中之所提出的作用。此外，事實上此BMP係與BMP5緊密相關及BMP7已產生可能骨誘導活性的推測。BMP6之另外功能已確定為如於Nature Genetics April；41[4]：386-8中所述。
BMP6基因剔除小鼠可養活且能生育，及顯示正常骨及軟骨發育。
BMP6係鐵調節素之關鍵調節因子，鐵調節素為作為哺乳動物之鐵代謝之主要調節者的肝臟分泌的小型肽。鐵調節素控制十二指腸內吸收之膳食鐵及藉由網狀內皮細胞釋放之鐵的量。鐵調節素係藉由各種刺激(包括發炎及鐵超載)而上調，及藉由貧血、缺氧症及缺鐵症而下調。
不受任何特定理論之束縛，本發明提出，作為降鐵調節素療法之BMP6拮抗劑抗體係期望藉由克服對實質上增加潛在疾病之發病率及通常係不良結果之預測者的紅血球生成刺激劑(ESA)耐藥性而有益於缺鐵貧血患者。經由其與BMPR1及BMPR2受體之相互作用，其誘導受體二聚作用及鐵調節素之轉綠。BMP6亦結合肝臟及肌細胞中之HJV共受體。
因此，已知BMP6增加鐵調節素之表現。已知鐵調節素為涉及鐵體內平衡之關鍵激素。高鐵調節素含量係與ACD中之限鐵紅血球生成相關。
WO 2010/056981揭示向小鼠投與針對BMP6之抗體減少鐵調節素及增加鐵。
BMP6係進一步描述於此項技術中，例如，Hahn等人，1992 Genomics 14：759-62；Sauermann等人，1993 J.Neurosci.Res.33：142；Celeste等人，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：9843；Schluesener等人，1995 Atherosclerosis 113：153；Gitelman等人，1994 J.Cell Biol.126：1595；Barnes等人，1997 W.J.Urol.13：337；及Hamdy等人，1997 Cancer Res.57：4427。
BMP2如同其他骨形態生成蛋白於骨及軟骨之發育中發揮重要作用。其參與刺猬(hedgehog)路徑、TGF-β訊號路徑及細胞因子-細胞因 子受體相互作用。其亦參與心臟細胞分化及上皮至間葉表型轉化。BMP2具有許多基本作用，如藉由Kishimoto等人，1997 Dev.124：4457；Ma等人，2005 Dev.132：5601；Wang等人，Bone 48：524；及Rosen 2009 Cyt.Growth Fact.Rev.20：475所述。因此較佳係BMP6抗體不結合BMP2。
BMP2係進一步描述於尤其以下中：Sampath等人，1990 J.Biol.Chem.265：13198；Chen等人，2004 Growth Factors 22：233；Marie等人，2002 Histol.Histopath.17：877；Nickel等人，2001 J.Bone Joint Surg.83-A Supp.1：S7-14；Kirsch等人，2000 FEBS Lett.468：215；Kirsch等人，2000 EMBO J.19：3314；Gilboa等人，2000 Mol.Biol.Cell 11：1023。
BMP5亦係TGF-β超家族之成員。如同其他BMP，已知其誘導骨及軟骨發育之能力。BMP5係於小梁組織網及視神經頭中表現及可具有在發育及正常功能方面之作用。其亦於肺及肝臟中表現。
BMP5之另外資訊係於此項技術中已知，例如Hahn等人，1992 Genomics 14：759；Beck等人，2003 BMC Neurosci.2：12；Celeste等人，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：9843；及Sakaue等人，1996 Biochem.Biophys.Res.Comm.221：768。
BMP7亦係TGF-β超家族之成員。如同蛋白質之BMP家族之其他成員，其於間業細胞轉化至骨及軟骨中發揮關鍵作用。其誘導SMAD1及SMAD5之磷酸化作用，繼而誘導多個成骨基因轉錄。
如以上所說明，BMP6基因剔除之小鼠可養活且能生育，及顯示正常骨及軟骨發育。然而，BMP7基因剔除之小鼠於腎、眼及骨缺陷下出生後死亡。任一基因之個別基因剔除不改變心臟發育，然BMP6及BMP7之雙基因剔除證實心臟中之若干缺陷及延遲；胚胎因心臟功能不全而死亡。BMP7對於預防與纖維化相關之慢性心臟疾病之進展 係重要的。因此，不希望抗-BMP6抗體與BMP7交叉反應。
與BMP7相關之額外資訊係於此項技術中提供，例如，Hahn等人，1992 Genomics 14：759；Chen等人，2004 Growth Factors 22：233；Itoh等人，2001 EMBO J.20：4132；Zeisberg等人，2003 Am.J.Physiol.Renal Physiol.285：F1060；Kallui等人，2009 J.Clin.Invest.119：1420；及Wang等人，2001 J.Am.Soc.Neph.12：2392。
鐵調節素係亦稱為HAPM(鐵調節素抗菌蛋白質或肽)之肽激素。
小鼠演變中之近期基因複製事件已導致小鼠中存在兩個相似鐵調節素基因(鐵調節素1及鐵調節素2)。Ilyin等人，2003 FEBS Lett.542：22-26。小鼠鐵調節素2缺乏發現於哺乳動物鐵調節素中之幾個保守殘基。Lou等人，2004 Blood 103：2816-2821。
鐵調節素基因產物係涉及鐵體內平衡之維持，及其針對巨噬細胞中之鐵儲備之調節及針對腸道鐵吸收係必要的。該等肽顯示抗菌活性。
前蛋白原(或前激素原或前鐵調節素原)(84 aa)及蛋白原(或激素原或鐵調節素原)(60 aa)係加工成20、22及25個胺基酸之成熟肽。25-aa肽主要係藉由肝臟分泌及被視為鐵代謝之「主要調節者」。20-及22-aa代謝物存在於尿液中。鐵調節素之N端區係功能所需要；5N端胺基酸之缺失導致功能喪失。
活性鐵調節素肽富含半胱胺酸，其形成使其β片狀結構穩定的分子內鍵。
鐵調節素主要係於肝臟中合成，其中發現於其他組織中合成較少量。Bekri等人，2006 Gastroent.131：788-96。
25-aa鐵調節素肽主要係藉由肝臟分泌及被視為鐵代謝之「主要調節者」。鐵調節素藉由結合位於腸上皮細胞之底外側表面及網狀內皮細胞(巨噬細胞)之質膜上的鐵運輸通道鐵轉運蛋白來抑制鐵轉運。 藉由抑制鐵轉運蛋白，鐵調節素防止腸道之腸上皮細胞分泌鐵至肝門系統中，藉此功能上減少鐵吸收。自巨噬細胞之鐵釋放亦係受鐵轉運蛋白抑制而防止；因此，鐵調節素維持鐵體內平衡。鐵調節素活性亦係部分導致慢性發炎貧血(諸如發炎性腸病、慢性心臟衰竭、癌、類風濕性關節炎及腎衰竭)中所見之鐵螯合的原因。
鐵調節素基因中之突變導致2B型血色沉著病，亦係稱為幼年型血色沉著病，該疾病係由會導致心肌病、硬化、及內分泌衰竭之嚴重鐵超載所致。大多數幼年型血色沉著病病例係歸因於鐵調節素調節蛋白(鐵調節素產生之調節者)中之突變。
經改造以過度表現鐵調節素之基因改造小鼠於在嚴重缺鐵症下出生短期後死亡，其表明鐵調節之中心及非冗餘作用。鐵調節素與發炎之貧血相關的第一證據係當研究者檢查自兩個具有嚴重小紅血球性貧血之肝腫瘤患者的組織時，其對鐵補充劑無反應。腫瘤組織過度產生鐵調節素，及外科手術移除腫瘤治癒貧血。
存在許多疾病，其中不足以吸收鐵造成缺鐵症及缺鐵性貧血。治療將取決於鐵調節素含量，因為若鐵調節素係阻斷腸內吸收，則口服治療將會無效。
於一實施例中，投與針對BMP6之抗體或其抗原結合片段減少鐵調節素之活性及/或含量及因此可用於治療貧血。於一實施例中，本發明係關於一種減少有此需要之患者之鐵調節素之活性或含量的方法，該方法包括向該患者投與針對BMP6之抗體或其抗原結合片段之步驟。於一實施例中，鐵調節素之活性及/或含量係減少至少50%。
鐵調節素之抑制劑(諸如BMP6抗體)可用於治療鐵調節素相關之疾病。此包括與鐵調節素及/或野生型及/或突變體鐵調節素之突變及/或過度表現相關之任何疾病，及/或其中疾病進展係藉由存在鐵調節素及/或野生型及/或突變體鐵調節素之突變及/或過度表現，及/或減 少經由尿液之鐵調節素的腎臟消除而增強或預後惡化的疾病。鐵調節素相關之疾病的非限制性實例包括：貧血、缺鐵性紅血球生成、血糖過少症、受損膳食鐵攝取、鐵螯合、發炎之貧血(AI)、動脈粥樣硬化、糖尿病及多種神經退化性疾病諸如阿茲海默氏(Alzheimer’s)症、帕金森氏(Parkinson’s)症及弗里德里希(Friedrich’s)共濟失調、心臟衰竭、慢性腎病、心腎-貧血症候群、感染、失血、溶血、維生素B12或葉酸缺乏症、副甲狀腺機能亢進、血紅素病及惡性腫瘤、癌症、AIDS、外科手術、生長停滯及/或脫髮。於一實施例中，個體係透析患者。於一實施例中，鐵調節素相關之疾病係貧血及個體係透析患者。於慢性血液透析群體中鐵及ESA-難治性貧血之患病率係高的。
貧血包括(尤其)慢性疾病貧血(ACD)、慢性腎病(CKD)貧血、癌症貧血、紅血球生成刺激劑(ESA)耐藥性貧血、及/或限鐵性貧血。
CKD之貧血係常見及慢性腎病之早期併發症。癌症貧血係由血液性惡性疾病及一些實體腫瘤導致。如本文所定義，此術語亦包括化學治療誘導之貧血，其係由化學治療劑導致之貧血。慢性腎病貧血可使糖尿病性神經病變、心血管病、視網膜病及其他問題惡化。癌症相關之貧血係與增加之死亡風險相關聯。
一些慢性疾病諸如癌症、腎病及自體免疫性疾病可導致貧血。過度活化發炎細胞因子可導致鐵體內平衡之調節異常，紅血球生成之減少及紅血球壽命減少。一些針對貧血之治療包括投與ESA、促紅血球生成素、鐵(作為膳食補充劑)或輸血。
鐵調節素係參與鐵體內平衡之關鍵激素。於ACD中高含量之鐵調節素已與缺鐵性紅血球生成相關。已知BMP6增加鐵調節素之表現。
各種類型之針對BMP6的抗體及其抗原結合片段係描述於下文中。
同源抗體
於又一實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其包括與表1中所述之序列同源之胺基酸序列及該抗體結合BMP6及保留彼等表1中所述之抗體的所需功能性質。
例如，本發明提供一種單離單株抗體(或其功能抗原結合片段)，其包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括與選自由SEQ ID NO：16；36；56；或76組成之群的胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%相同的胺基酸序列；其中該輕鏈可變區包括與選自由SEQ ID NO：26；46；66；或86組成之群的胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%相同的胺基酸序列；該抗體特異性結合BMP6蛋白質及該抗體於溶血測定中可抑制紅血球溶解，其中溶血測定係此項技術中已知。於一具體實例中，當使用經100 pM人類BMP6重構之人類BMP6-耗儘血清時，該等抗體具有20至200 pM之溶血測定中之IC50值。
於一實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可係與表1中闡述之序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。於一實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可係相同的，除於不多於1、2、3、4或5個胺基酸位置中之胺基酸取代外。具有與彼等表1中所述之VH及VL區具有高度(即80%或更大)一致性的VH及VL區之抗體可藉由核酸分子之突變誘發(例如，定點或PCR-介導突變誘發)獲得，該核酸分子分別編碼SEQ ID NO：16；36；56或76；及26；46；66或86，接著使用本文所述之功能測定測試經編碼改變之抗體的保留功能。
於一實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈胺基酸序列可係與表1闡述之序列為50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。具有分別地與任一SEQ ID NO：18；38；58或78之全長重鏈及任一SEQ ID NO：28；48；68或88之全長輕鏈具有高度(即80%或 更大)一致性的全長重鏈及全長輕鏈之抗體可藉由核酸分子之突變誘發(例如，定點或PCR-介導突變誘發)獲得，該核酸分子分別編碼此等多肽，接著使用本文所述之功能測定測試經編碼改變之抗體的保留功能。
於一實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈核苷酸序列可係與表1闡述之序列為60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
於一實施例中，重鏈及/或輕鏈核苷酸序列之可變區可係與表1闡述之序列為60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
如本文所用，於兩個序列間之一致性百分率係藉由序列共享之相同位置的數量的函數(即一致性%等於相同位置之數量/總位置數量X 100)，考慮到空位之數量及每個空位之長度，其需要引入兩個序列之最佳比對。序列之比較及兩個序列間之一致性百分率之測定可使用數學算法(如描述於以下非限制性實例中)完成。
另外或或者，本發明蛋白質序列可進一步用作「查詢序列」以對公用文庫進行搜索來(例如)確定相關序列。例如，該等搜索可使用Altschul等人，1990 J.Mol.Biol.215：403-10之BLAST程式(版本2.0)進行。
具有保守修飾之抗體
於一實施例中，本發明抗體具有包括CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包括CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中一或多種該等CDR序列具有基於本文所述之抗體的指定胺基酸序列或其保守修飾，及其中抗體保留本發明BMP6-結合抗體及其抗原結合片段之所需功能性質。因此，本發明提供一種單離單株抗體或其功能抗原結合片段，其由包括CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包 括CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區組成，其中：重鏈可變區CDR1包括選自任一SEQ ID NO：29、49、69、12、32、52、72或9之胺基酸序列或其保守變體；重鏈可變區CDR2包括選自任一SEQ ID NO：10、30、50、70、13、33、53或73之胺基酸序列或其保守變體；重鏈可變區CDR3包括選自任一SEQ ID NO：11、31、51、71、14、34、54或74之胺基酸序列或其保守變體；輕鏈可變區CDR1包括選自任一SEQ ID NO：19、39、59、79、22、42、62或82之胺基酸序列或其保守變體；輕鏈可變區CDR2包括選自任一SEQ ID NO：20、40、60、80、23、43、63或83之胺基酸序列或其保守變體；及輕鏈可變區CDR3包括選自任一SEQ ID NO：21、41、61、81、24、44、64或84之胺基酸序列或其保守變體；該抗體或其抗原結合片段特異性結合BMP6及於溶血測定中抑制紅血球溶解。
於一實施例中，於哺乳動物細胞中最佳化表現之本發明抗體具有全長重鏈序列及全長輕鏈序列，其中一或多種該等序列具有基於本文所述之抗體之指定胺基酸序列或其保守修飾，及其中抗體保留本發明BMP6-結合抗體及其抗原結合片段之所需功能性質。因此，本發明提供一種於哺乳動物細胞中最佳化表現之單離單株抗體，其由全長重鏈及全長輕鏈組成，其中：全長重鏈具有選自由SEQ ID NO：18；38；58；或78組成之群的胺基酸序列及其保守修飾；及全長輕鏈具有選自由SEQ ID NO：28；48；68或88組成之群的胺基酸序列及其保守修飾；抗體特異性結合BMP6；及抗體於本文所述之溶血測定中抑制紅血球溶解。於一具體實施例中，當於溶血測定中使用經100 pM人類BMP6重構之人類BMP6-耗儘血清時，該等抗體具有20至200 pM之IC50值。
結合相同抗原決定基之抗體
本發明提供如表1中所列之BMP6-結合抗體般之結合相同抗原決 定基的抗體。藉由抗體7結合之抗原決定基係顯示於圖5。因此於BMP6結合測定中，另外抗體可基於其與本發明其他抗體及其抗原結合片段交叉競爭(例如，以統計上顯著之方式競爭地抑制結合)之能力而確定。測試抗體抑制本發明抗體及其抗原結合片段與BMP6蛋白質結合之能力證實，測試抗體可與該等抗體競爭結合BMP6；根據非限制性理論，該抗體可如與其競爭之抗體般結合於BMP6上之相同或相關(例如，結構相似或空間近接)抗原決定基。於一特定實施例中，如本發明抗體及其抗原結合片段般結合於BMP6上之相同抗原決定基之抗體係人類單株抗體。該人類單株抗體可如本文所述進行製備及單離。
一旦於抗原上之所需抗原決定基經確定，則有可能(例如)使用本發明所述之技術生成針對該抗原決定基之抗體。或者，於發現製程期間，抗體之生成及表徵可闡明關於所需抗原決定基的資訊。然後可能自此資訊競爭地篩選結合相同抗原決定基的抗體。達成此之一方法係進行交叉競爭研究以發現彼此競爭結合之抗體，例如抗體競爭以結合抗原。基於其交叉競爭之「分級」抗體之高產量製程係描述於國際專利申請案第WO 2003/48731號。如熟習此項技術者應理解，實際上抗體可特異性結合之任何物質可係抗原決定基。抗原決定基可包括抗體結合之彼等殘基。
一般而言，於蛋白質及/或大分子之複合混合物中針對特定靶抗原之抗體特異性將優先識別靶抗原上之抗原決定基。
包括抗原決定基之給定多肽之區可使用此項技術中熟知之任何數量之抗原決定基繪圖技術來確定。參見例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris編輯，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。例如，線性抗原決定基可藉由(例如)於固體載體上同時合成大量肽來測定，該等肽對應於 蛋白質分子之部分，及使該等肽與抗體反應同時該等肽仍附接至載體。該等技術係此項技術中已知且描述於(例如)美國專利第4,708,871號；Geysen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8：3998-4002；Geysen等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：78-182；Geysen等人，(1986)Mol.Immunol.23：709-715中。相似地，構形抗原決定基係容易地藉由測定胺基酸BMP6之空間構形(諸如藉由(例如)氫/氘交換、X射線晶體繞射法及二維核磁共振)來確定。參見例如，Epitope Mapping Protocols，同上。蛋白質之抗原區亦可係使用標準抗原性及親水性分析(諸如彼等使用例如自Oxford Molecular Group獲得之Omiga版本1.0軟體程式計算者)來確定。此電腦程式使用Hopp/Woods方法，Hopp等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：3824-3828來測定抗原性曲線及Kyte-Doolittle技術，Kyte等人，(1982)J.MoI.Biol.157：105-132來進行親水性分析。
改造及修飾抗體
本發明抗體進一步可使用具有本文所示之一或多種VH及/或VL序列之抗體作為起始物質以改造經修飾之抗體來製備，該經修飾之抗體可具有自起始抗體改變之性質。抗體可藉由修飾於一或兩種可變區(即VH及/或VL)內(例如於一或多種CDR區內及/或於一或多個框架區內)之一或多個殘基來進行改造。另外或或者，抗體可係藉由修飾於恆定區內之殘基進行改造(例如)以改變抗體之效應功能。
可進行之一種類型的可變區改造係CDR接枝。抗體主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)內之胺基酸殘基與靶抗原相互作用。因此，於CDR內之胺基酸序列比CDR外的序列於個別抗體間更多樣化。因為CDR序列係導致大部分抗體-抗原相互作用的原因，故有可能藉由構造包括自接枝於自具有不同性質之不同抗體之框架序列上的特異性自然存在抗體的CDR序列之表現載體來表現模擬特異性自然 存在抗體之性質的重組抗體(參見例如，Riechmann,L.等人，1998 Nature 332：323-327；Jones,P.等人，1986 Nature 321：522-525；Queen,C.等人，1989 Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86：10029-10033；Winter之美國專利第5,225,539號及Queen等人之美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號及第6,180,370號)。
該等框架序列可自包括生殖系抗體基因序列的公用DNA文庫或公開參考文獻獲得。例如，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可發現於「VBase」人類生殖系序列文庫(自www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase互聯網上獲得)中，以及於Kabat,E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生及公共服務部，NIH公開案第91-3242號；Tomlinson,I.M.等人，1992 J.fol.Biol.227：776-798；及Cox,J.P.L.等人，1994 Eur.J Immunol.24：827-836中；其等之內容係以引用之方式明確地併入本文中。
用於本發明抗體及其抗原結合片段之框架序列之一實例係彼等結構上相似於本發明之選定抗體及其抗原結合片段所用的框架序列，例如，本發明單株抗體所用之共有序列及/或框架序列。VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可接枝於具有與框架序列衍生自其中之生殖系免疫球蛋白基因中所發現者相同序列的框架區上，或CDR序列可經接枝至含有相較於生殖系序列之一或多種突變的框架區上。例如，已發現在某些情況下，於框架區內使殘基突變係有利於維持或增強抗體之抗原結合能力(參見例如，Queen等人之美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號及第6,180,370號)。
可變區修飾之另一類型係於VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內使胺基酸殘基突變，藉此改良受關注抗體之一或多種結合性質(例如，親和力)，稱為「親和力成熟」。可進行定點突變誘發或PCR-介導突變誘發以引入突變及對抗體結合的影響或其他受關注功 能性質，可以如本文所述及於實例中提供之活體外或活體內測定來評估。可引入保守修飾(如以上所討論)。突變可係胺基酸取代、添加或缺失。此外，於CDR區內通常不多於一、二、三、四或五個殘基經改變。
接枝至置換框架或支架中之抗原結合域
可使用多種抗體/免疫球蛋白框架或支架，只要所得多肽包括至少一個特異性結合BMP6之結合區。該等框架或支架包括人類免疫球蛋白之5種主要個體基因型、其抗原結合片段，及包括其他動物種類之免疫球蛋白，較佳具有人源化態樣。單一重鏈抗體諸如彼等於駱駝中確定者係於此方面尤其受關注。新穎框架、支架及片段連續由熟習此項技術者發現及開發。
於一態樣中，本發明係關於一種使用本發明CDR可經接枝至其上之非免疫球蛋白支架生成基於非免疫球蛋白之抗體之方法。可使用已知或未來非免疫球蛋白框架及支架，只要其包括特異性針對靶BMP6蛋白質之結合區。已知非免疫球蛋白框架或支架包括(但不限於)：纖連蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,Mass.)、錨蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、域抗體(Domantis,Ltd.,Cambridge,Mass.及Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂質攜帶蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模組免疫藥物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,Wash.)、maxybodies(Avidia,Inc.,Mountain View,Calif.)、蛋白質A(Affibody AG,Sweden)及人泛素(γ-晶體蛋白或泛素)(SciI Proteins GmbH,Halle,Germany)。
纖連蛋白支架係基於III型纖連蛋白域(例如，III型纖連蛋白之第十模組(10Fn3域))。III型纖連蛋白域具有分佈於兩個β片之間的7或8條β鏈，該兩個β片自身相對彼此包裹以形成蛋白質之核心及進一步含有將β鏈彼此連接且係溶劑曝露的環(與CDR類似)。於每個β片夾心之 邊緣處存在至少三個該等環，其中邊緣係垂直於β鏈之方向上的蛋白質的邊界(參見美國專利第6,818,418號)。該等纖連蛋白基支架不係免疫球蛋白，儘管全部折疊係緊密地與包括駱駝及美洲駝IgG中之全部抗原識別單元之最小功能抗體片段(重鏈之可變區)之折疊相關。由於此結構，非免疫球蛋白抗體模擬抗原結合性質，其特性及親和力類似於抗體之彼等。該等支架可用於環隨機化及類似於活體內抗體之親和力成熟過程之活體外混排策略。該等纖連蛋白基分子可用作分子環區可使用標準選殖技術經本發明CDR置換之支架。
錨蛋白技術係基於使用具有衍生重複模組作為承載可用於結合不同靶之可變區的支架之錨蛋白的蛋白質。錨蛋白重複模組係由兩個反向平行α-螺旋及β-轉彎組成之33個胺基酸多肽。可變區之結合主要係藉由使用核糖體展示最佳化。
高親和力多聚體(Avimers)係衍生自含自然A-域之蛋白質諸如LRP-1。此等域係藉由蛋白質-蛋白質相互作用之特性使用及於人類中超過250種蛋白質結構上係基於A-域。高親和力多聚體由許多經由胺基酸連接子連接之不同「A-域」單體(2-10)組成。可結合靶抗原之高親和力多聚體可使用描述於例如美國專利申請公開案第20040175756號；第20050053973號；第20050048512號；及第20060008844號中之方法產生。
親和體(Affibody)親和力配位體係由基於蛋白質A之IgG-結合域中之一者的支架的三個螺旋束組成之小型簡單蛋白質。蛋白質A係來自細菌金黃色葡萄球菌之表面蛋白質。此支架域由58個胺基酸組成，其中13個係隨機的以生成具有大量配位體變體之親和體庫(參見例如，美國專利第5,831,012號)。親和體分子模擬抗體，相較於抗體的分子量(係150kDa)，其具有6kDa的分子量。儘管其之小尺寸，親和體分子之結合位點係類似於抗體之結合位點。
抗攜帶蛋白係由Pieris ProteoLab AG公司開發的產品。其係衍生自脂質攜帶蛋白，一廣泛群之通常涉及化學上敏感或不溶化合物之生理運輸或儲存之小型及健壯型蛋白質。若干自然脂質攜帶蛋白存在於人類組織或體液中。蛋白質架構聯想到免疫球蛋白，具有剛性框架頂部上之超變量環。然而，對比抗體或其重組片段，脂質攜帶蛋白係由僅略大於單一免疫球蛋白域之具有160至180個胺基酸殘基之單一多肽鏈組成。構成結合口袋之四環之組顯示明顯地結構可塑性及容許各種側鏈。因此結合位點可於專有過程中再成形以識別具有高親和力及特異性的不同形狀之規定靶分子。脂質攜帶蛋白家族之一種蛋白質(歐洲粉蝶之膽汁-結合蛋白(BBP))已用於藉由誘變處理四環之組來開發抗攜帶蛋白。描述抗攜帶蛋白之專利申請案之一實例係於PCT公開案第WO 199916873號。
人泛素分子係經設計以對蛋白質及小分子具有特異性親和力之小型非免疫球蛋白蛋白質。新穎人泛素分子可係非常快速地選自各自係基於不同人類衍生支架蛋白質的兩個文庫。人泛素分子針對免疫球蛋白蛋白質不顯示任何結構同源性。當前，使用兩個人泛素支架，其中之一者係γ結晶，人類結構眼晶狀體蛋白質及另一者係「泛素」超家族蛋白質。兩個人類支架係非常小，顯示高溫穩定性及係幾乎耐pH變化及變性劑。此高穩定性主要係歸因於蛋白質之擴展的β片狀結構。γ結晶型衍生蛋白質之實例係描述於WO200104144中及「泛素樣」蛋白質之實例係描述於WO2004106368中。
蛋白質抗原決定基模擬物(PEM)係模擬蛋白質之β發卡狀二級結構的中型環狀肽樣分子(分子量1至2kDa)，該主要二級結構涉及蛋白質-蛋白質相互作用。
人類BMP6-結合抗體可使用此項技術中已知的方法生成。例如，用於將非人類抗體轉化成經改造之人類抗體的人類工程化技術。美國 專利公開案第20050008625號描述用抗體之人類可變區置換非人類抗體可變區，同時相對於非人類抗體維持相同或提供更佳的結合特徵的活體內方法。該方法依賴抗原決定基引導的用完全人類抗體置換非人類參考抗體之可變區。所得人類抗體通常係與參考非人類抗體結構上不相關，然與參考抗體一樣於相同抗原上結合相同抗原決定基。簡而言之，連續抗原決定基引導的互補置換方法係可藉由在對測試抗體與抗原之結合反應之報導系統存在下，針對結合限制數量的抗原於「競爭者」及參考抗體(測試抗體)之多樣化雜交庫之間的細胞中設立競爭來達成。競爭者可係參考抗體或其衍生物諸如單鏈Fv片段。競爭者亦可係與參考抗體結合相同抗原決定基之抗原的天然或人造配位體。競爭者之唯一要求係其與參考抗體結合相同抗原決定基及其針對抗原結合與參考抗體競爭。測試抗體具有通常自非人類參考抗體之一個抗原結合V-區及隨機選自各種來源(諸如人類抗體之譜庫)的另一個V-區。自參考抗體之常見V-區充當指導，將測試抗體定位於抗原之相同抗原決定基上及於相同定向中使得選擇係偏向相對參考抗體之最高抗原結合逼真度。
許多類型之報導系統可用於偵測於測試抗體與抗原間之所需相互作用。例如，互補報導片段可分別地連接抗原及測試抗體，使得藉由片段互補之報導活化僅發生於測試抗體結合抗原時。當測試抗體-及抗原-報導片段融合係與競爭者共同表現時，報導活化變成取決於測試抗體與競爭者競爭的能力，其係與測試抗體針對抗原之親和力成正比。可使用之其他報導系統包括如揭示於美國專利申請案序號10/208,730(公開案第20030198971號)中之自抑制報導再活化系統(RAIR)之再活化因子，或揭示於美國專利申請案序號10/076,845(公開案第20030157579號)中之競爭活化系統。
在連續抗原決定基引導之互補置換系統下，做出選擇來確定細 胞表現單一測試抗體連同競爭者、抗原及報導組分。於此等細胞中，每個測試抗體針對結合限制數量的抗原以一對一形式與競爭者競爭。報導子之活性係與結合測試抗體之抗原數量成正比，其繼而係與測試抗體針對抗原之親和力及測試抗體之穩定性成正比。測試抗體最初係於當表現為測試抗體時其相對於參考抗體之活性的基礎上進行選擇。第一輪選擇的結果係一組「雜交」抗體，其各自係由来自參考抗體之相同非人類V-區及来自庫之人類V-區組成及其各自如同參考抗體結合於抗原上之相同抗原決定基。第一輪中所选择之雜交抗體中之一或多者針對抗原將具有可比擬或高於參考抗體之親和力。
於第二V-區置換步驟中，第一步驟中所选择之人類V-區係用作指導以選擇具有多樣化同源人類V-區庫之剩餘非人類參考抗體V-區的人類置換者。第一輪中所选择之雜交抗體亦可用作第二輪選擇的競爭者。第二輪選擇的結果係一組結構上不同於參考抗體之完全人類抗體，然其與參考抗體針對結合相同抗原競爭。一些選定之人類抗體如同參考抗體結合相同抗原上之相同抗原決定基。於該等選定之人類抗體中，一或多者以可比擬或高於參考抗體之親和力結合相同抗原決定基。
使用上述之小鼠或嵌合BMP6-結合抗體中之一者作為參考抗體，此方法可容易地使用以生成具有相同結合特異性及相同或更佳結合親和力之結合人類BMP6的人類抗體。此外，該人類BMP6-結合抗體亦可自通常生產人類抗體之公司(例如KaloBios,Inc.(Mountain View,Calif.))購得。
駱駝抗體
自包括新世界成員諸如美洲駝種(喇嘛羊駝、大羊駝及喇嘛小羊駝屬)的駱駝及單峰駱駝(雙峰駱駝及單峰駱駝Calelus dromaderius))家族之成員獲得的抗體蛋白質已就大小、結構複雜性及針對人類個體之 抗原性進行表徵。來自如發現於自然中之此哺乳動物家族的某些IgG抗體缺乏輕鏈，及因此結構上與來自其他動物之抗體的具有兩條重鏈及兩條輕鏈之典型四鏈四級結構不同。參見PCT/EP93/02214(公開於1994年3月3日之WO 94/04678)。
駱駝抗體之一區(係確定為VHH之小型單一可變域)可藉由基因改造而獲得以產生針對靶具有親和力之小型蛋白質，從而形成稱為「駱駝奈米抗體」的低分子量抗體衍生之蛋白質。參見頒佈於1998年6月2日之美國專利第5,759,808號；亦參見Stijlemans,B.等人，2004 J Biol Chem 279：1256-1261；Dumoulin,M.等人，2003 Nature 424：783-788；Pleschberger,M.等人，2003 Bioconjugate Chem 14：440-448；Cortez-Retamozo,V.等人，2002 Int J Cancer 89：456-62；and Lauwereys,M.等人，1998 EMBO J 17：3512-3520。駱駝抗體及抗體片段之經改造之庫係例如自Ablynx、Ghent、Belgium購得。如同非人類起源之其他抗體及其抗原結合片段，駱駝抗體之胺基酸序列可經重組改變以獲得更接近於人類序列之序列，即奈米抗體可「人源化」。因此駱駝抗體針對人類之天然低抗原性可進一步減少。
駱駝奈米抗體具有人類IgG分子之分子量的約十分之一的分子量，及該蛋白質具有僅幾奈米之物理直徑。小尺寸之一結果係駱駝奈米抗體結合相對於較大抗體蛋白質係功能上不可見的抗原位點的能力，即駱駝奈米抗體可用作偵測抗原(否則使用經典免疫學技術為隱蔽)的試劑，及用作可能的治療劑。因此小尺寸之又另一結果係駱駝奈米抗體可抑制作為結合靶蛋白質之凹槽或窄裂縫中之特異性位點的結果，及因此可具有相比於經典抗體之功能更密切類似經典低分子量藥物的功能的能力。
低分子量及緊湊尺寸進一步導致駱駝奈米抗體極其熱穩定，於極端pH及分解蛋白消化下穩定且導致不良抗原性。另一結果係駱駝 奈米抗體容易地自循環系統移動至組織中且甚至穿過血腦障壁及可治療影響神經組織之病症。奈米抗體可進一步促進藥物穿過血腦障壁運輸。參見公開於2004年8月19日之美國專利申請案20040161738。結合針對人類之低抗原性之該等特徵表明巨大治療潛力。另外，該等分子可係完全表現於原核細胞諸如大腸桿菌中及表現為具有噬菌體之融合蛋白質及係功能性的。
因此，本發明之一特徵係針對BMP6具有高親和力之駱駝抗體或奈米抗體。於本文之一實施例中，駱駝抗體或奈米抗體係自然產生於駱駝科動物中，即係藉由經BMP6或其肽片段免疫接種後之駱駝使用本文所述之用於其他抗體之技術來產生。或者，BMP6-結合駱駝奈米抗體經改造，即，藉由例如選自顯示適當誘變處理之駱駝奈米抗體蛋白質之噬菌體庫如本文中實例所述使用BMP6作為靶之淘選程序產生。經改造之奈米抗體可進一步藉由遺傳工程定制以於接受個體中具有45分鐘至兩週的半衰期。於一具體實施例中，駱駝抗體或奈米抗體係藉由將本發明人類抗體之重鏈及輕鏈的CDR序列接枝至奈米抗體或單域抗體框架序列中而獲得，如例如描述於PCT/EP93/02214中。
雙特異性分子及多價抗體
於另一態樣中，本發明特徵為包括本發明BMP6-結合抗體或其片段之雙特異性及多特異性分子。本發明抗體或其抗原結合區可衍生或連接至另一功能分子(例如，另一肽或蛋白質(例如，受體之另一抗體或配位體))以生成結合至少兩個不同結合位點或靶分子的雙特異性分子。本發明抗體可實際上衍生或連接至多於一個其他功能分子以生成結合多於兩個不同結合位點及/或靶分子的多特異性分子；該等多特異性分子亦係希望藉由如本文所用之術語「雙特異性分子」涵蓋。為了產生本發明雙特異性分子，本發明抗體可功能上連接(例如，藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他)一或多個其他結合分子， 諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物，使得形成雙特異性分子。
因此，本發明包括包含至少一個針對BMP6的第一結合特異性及針對第二靶抗原決定基的第二結合特異性的雙特異性分子。例如，第二靶抗原決定基係不同於第一靶抗原決定基的另一BMP6之抗原決定基。
另外，針對雙特異性性分子係多特異性的本發明，該等分子可進一步包括除第一及第二靶抗原決定基之外的第三結合特異性。
於一實施例中，本發明雙特異性分子包括作為結合特異性之至少一種抗體或其抗體片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或或單鏈Fv。抗體亦可係輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段諸如如Ladner等人，美國專利第4,946,778號中所構造之Fv或單鏈。
雙抗體係二價雙特異性分子，其中VH及VL域係表現於藉由連接子連接的單一多肽鏈中，該連接子太短而不允許於相同鏈中之兩個域間配對。VH及VL域與另一鏈的互補域配對，從而產生兩個抗原結合位點(參見例如，Holliger等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poijak等人，1994 Structure 2：1121-1123)。雙抗體可係藉由於相同細胞中表現具有結構VHA-VLB及VHB-VLA(VH-VL組態)或VLA-VHB及VLB-VHA(VL-VH組態)的兩條多肽鏈來產生。其大部分可係以可溶形式表現於細菌中。單鏈雙抗體(scDb)係藉由用約15個胺基酸殘基的連接子連接兩個形成雙抗體之多肽鏈來產生(參見Holliger及Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(3-4)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology,2(1)：21-36)。scDb可以可溶活性單體形式表現於細菌中(參見Holliger及Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(34)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology,2(1)：21-36；Pluckthun及Pack,1997 Immunotechnology,3(2)：83-105；Ridgway等人，1996 Protein Eng.,9(7)：617-21)。雙抗體可經融合至Fc以生成「雙-雙抗體」(參見Lu等人，2004 J.Biol.Chem.,279(4)：2856-65)。
可用於本發明雙特異性分子中之其他抗體係鼠科、嵌合及人源化單株抗體。
本發明雙特異性分子可係藉由使用此項技術中已知之方法共軛組分結合特異性來製備。例如，雙特異性分子之每個結合特異性可經單獨生成及然後彼此共軛。當結合特異性係蛋白質或肽時，各種偶合或交聯劑可用於共價共軛。交聯劑之實例包括蛋白質A、碳化二亞胺、N-琥珀醯亞胺-5-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰苯二馬來醯亞胺(oPDM)、N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)及4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(sulfo-SMCC)(參見例如，Karpovsky等人，1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu,M A等人，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括彼等描述於Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.第78期，118-132；Brennan等人，1985 Science 229：81-83)及Glennie等人，1987 J.Immunol.139：2367-2375)中。共軛劑係都自Pierce Chemical Co.(Rockford,Ill.)購得的SATA及sulfo-SMCC。
當結合特異性係抗體時，其可係藉由兩條重鏈之C-端鉸鏈區的疏基結合來共軛。於一特定實施例中，鉸鏈區經修飾以在共軛前含有奇數個疏基殘基，例如一個。
或者，兩個結合特異性可於相同載體中編碼及於相同宿主細胞中表現及裝配。此方法尤其於雙特異性分子係mAb X mAb、mAb X Fab、Fab X F(ab')2或配位體X Fab融合蛋白質的情況下適用。本發明雙特異性分子可係包括一個單鏈抗體及一個結合決定子之單鏈分子或包括兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包括至少 兩個單鏈分子。用於製備雙特異性分子之方法係描述(例如)於美國專利第5,260,203號；美國專利第5,455,030號；美國專利第4,881,175號；美國專利第5,132,405號；美國專利第5,091,513號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653號；美國專利第5,258,498號；及美國專利第5,482,858號。
雙特異性分子與其特異性靶之結合性可藉由(例如)酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定法(REA)、FACS分析、生物測定(例如，生長抑制)或西方墨點(Western blot)分析法來證實。每個此等測定通常藉由使用針對受關注複合物具特異性之標記試劑(例如，抗體)來偵測特定受關注蛋白質-抗體複合物的存在。
於另一態樣中，本發明提供包括本發明結合BMP6之抗體及其抗原結合片段之至少兩個相同或不同抗原結合部分的多價化合物。抗原結合部分可經由蛋白質融合或共價或非共價鍵連接在一起。或者，雙特異性分子之鍵結的方法已經描述。四價化合物可係(例如)藉由交聯本發明抗體及其抗原結合片段與結合本發明抗體及其抗原結合片段之恆定區(例如Fc或鉸鏈區)的抗體或抗原結合片段來獲得。
三聚化域係描述(例如)於Borean專利EP 1 012 280B1。五聚合(Pentamerizing)模組係描述(例如)於PCT/EP97/05897中。
具有延長半衰期之抗體
本發明提供具有活體內延長半衰期之特異性結合BMP6的抗體。
許多因素可影響活體內蛋白質之半衰期。例如，腎臟濾過、肝臟中之代謝、蛋白水解酶(蛋白酶)之降解及免疫原性反應(例如藉由抗體之蛋白質中和及藉由巨噬細胞及樹枝狀細胞之攝取)。各種策略可用於延長本發明抗體及其抗原結合片段的半衰期。例如，藉由與聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗體支架、聚唾液酸(PSA)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白-結合配位體及碳水化合物盾之化學鍵；藉由與結合血 清蛋白之蛋白質(諸如白蛋白、IgG、FcRn及轉移)的基因融合；藉由(基因上或化學上)偶合結合血清蛋白之其他結合部分，諸如奈米抗體、Fab、DARPin、高親和力多聚體、親和體及抗攜帶蛋白；藉由與rPEG、白蛋白、白蛋白之域、白蛋白-結合蛋白質及Fc的基因融合；或藉由併入奈米載體，減緩釋放調配物或醫療裝置。
為了延長活體內抗體之血清循環，惰性聚合物分子諸如高分子量PEG可在或不在多功能連接子下經由PEG與抗體之N-或C-端的位點特異性結合或經由存在於離胺酸殘基上之ε-胺基附接至抗體或其片段。為了聚乙二醇化抗體，抗體、其抗原-結合片段通常與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在其中一或多個PEG基團變成附接至抗體或抗體片段之條件下反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似的反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應進行。如本文所用之術語「聚乙二醇」係希望涵蓋已用於衍生化其他蛋白質之PEG的任何形式，諸如單(C1至C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。於一實施例中，待聚乙二醇化之抗體係無糖基化抗體。將使用導致最小生物活性損失的線性或分支聚合物衍生化。共軛的程度可藉由SDS-PAGE及質譜法嚴密監測以確保PEG分子與抗體之適當共軛。未反應之PEG可自抗體-PEG共軛物藉由尺寸排除或藉由離子交換層析法分離。PEG-衍生之抗體可使用熟習此項技術者熟知之方法(例如藉由本文所述之免疫測定法)測試其結合活性以及活體內療效。用於聚乙二醇化蛋白質之方法係此項技術中已知的及可應用於本發明抗體及其抗原結合片段。參見例如，Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
其他經修飾之聚乙二醇化技術包括重構化學正交引導之工程技術(ReCODE PEG)，其經由包括tRNA合成酶及tRNA的重構系統將化學上指定之側鏈併入生物合成蛋白質中。此技術能夠併入多於30個新 穎胺基酸至大腸桿菌、酵母菌及哺乳動物細胞中之生物合成蛋白質中。tRNA併入規範性胺基酸至琥珀密碼子位於之任何位置，將自終止密碼子之琥珀轉化為發訊號併入化學上指定胺基酸的琥珀。
重組聚乙二醇化技術(rPEG)亦可用於血清半衰期延長。此技術涉及300至600個胺基酸非結構化蛋白尾與現有醫藥蛋白質之基因融合。因為該非結構化蛋白鏈之表觀分子量係比其實際分子量高約15倍，故蛋白質之血清半衰期極大增加。相比於需要化學共軛及再純化之傳統聚乙二醇化，該製造過程係非常精簡及產物係同質的。
使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)以延長治療肽及蛋白質之活性壽命及改良其穩定性之聚唾液酸化(Polysialytion)係另一技術。PSA係唾液酸之聚合物(糖)。當用於蛋白質及治療肽藥物遞送時，聚唾液酸提供於共軛物上之保護微環境。此增加循環中之治療蛋白質的活性壽命及防止其免於由免疫系統識別。PSA聚合物係天然地發現於人體中。該PSA聚合物係藉由經數百萬年進化的某些細菌採用以用其覆蓋細菌壁。然後此等天然聚唾液化細菌能憑借分子擬晶來挫敗人體防禦系統。PSA(天然的終極隱形技術)可容易地自該細菌大量生產且具有預定之物理特徵。細菌PSA係完全非-免疫原性(甚至當偶合蛋白質時)，因為其與人體中之PSA化學上相同。
另一技術包括使用連接抗體之羥乙基澱粉(「HES」)衍生物。HES係衍生自糯玉米澱粉之改性天然聚合物及可係藉由人體酵素代謝。HES溶液通常經投與以取代缺陷血容量及改良血液的流變性質。抗體之羥乙基澱粉化(Hesylation)能夠藉由增加分子之穩定性以及藉由降低腎清除率來延長循環半衰期，從而導致增加的生物活性。藉由改變不同參數(諸如HES之分子量)，寬範圍之HES抗體共軛物可經定制。
具有活體內增加之半衰期的抗體亦可引入一或多種胺基酸修飾 (即取代、插入或缺失)至IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳Fc或鉸鏈Fc域片段)來生成。參見例如，國際公開案第WO 98/23289號；國際公開案第WO 97/34631號；及美國專利第6,277,375號。
另外，抗體可共軛至白蛋白以使抗體或抗體片段於活體內更穩定或具有較長活體內半衰期。該等技術為此項技術中所熟知，參見例如，國際公開案第WO 93/15199號、第WO 93/15200號及第WO 01/77137號；及歐洲專利第EP 413,622號。
增加半衰期之策略尤其適用於針對其等增加活體內半衰期係所需的奈米抗體、纖連蛋白基黏合劑及其他抗體或蛋白質。
抗體共軛物
本發明提供特異性結合BMP6之抗體或其抗原結合片段，其等以重組方式融合或化學上共軛(包括共價及非共價共軛)同質蛋白或多肽(或其抗原結合片段，較佳至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個胺基酸之多肽)以生成融合蛋白質。特定言之，本發明提供包括本文所述之抗體之抗原結合片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH域、VH CDR、VL域或VL CDR)及同質蛋白、多肽或肽的融合蛋白質。用於融合或共軛蛋白質、多肽或肽至抗體或抗體片段之方法係此項技術中已知。參見例如，美國專利第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號及第5,112,946號；歐洲專利第EP 307,434號及第EP 367,166號；國際專利第WO 96/04388號及第WO 91/06570號；Ashkenazi等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539；Zheng等人，1995,J.Immunol.154：5590-5600；及Vil等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341。
其他融合蛋白質可經由基因改組、基序改組、外顯子改組及/或密碼子改組(統稱為「DNA改組」)之技術來生成。DNA改組可用於改 變本發明抗體及其抗原結合片段的活性(例如具有較高親和力及較低解離速率之抗體及其抗原結合片段)。通常參見美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號；Patten等人，1997,Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson，等人，1999,J.Mol.Biol.287：265-76；及Lorenzo及Blasco,1998,Biotechniques 24(2)：308-313(此等專利及公開案各自係以全文引用之方式併入本文中)。抗體及其抗原結合片段或經編碼之抗體及其抗原結合片段可藉由經受在重組前由易錯PCR、隨機核苷酸插入或其他方法的隨機突變誘發而改變。編碼特異性結合BMP6之抗體及其抗原結合片段的聚核苷酸可與一或多個異源分子之一或多種組分、基元、區段、部分、域、片段等重組。
此外，抗體及其抗原結合片段可融合至標記序列(諸如肽)以促進純化。於一實施例中，標記胺基酸序列係六聚組胺酸肽，諸如pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)中所提供之標籤，其中許多係市售的。如Gentz等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所描述，(例如)六聚組胺酸提供融合蛋白質之方便純化。可用於純化之其他肽標籤包括(但不限於)：對應於衍生自流感病毒血凝素蛋白之抗原決定基的血凝素(「HA」)標籤(Wilson等人，1984,Cell 37：767)及「標記」標籤。
於一實施例中，本發明抗體及其抗原結合片段共軛至診斷或可偵測試劑。該等抗體可作為臨床測試程序之部分用於監測或預後疾病或病症之開始、發展、進展及/或嚴重度，諸如測定特定治療的療效。該等診斷及偵測可藉由偶合抗體與包括(但不限於)以下之可偵測物質來完成：各種酵素(諸如(但不限於)辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶)；輔基(諸如(但不限於)鏈黴抗生 物素蛋白/生物素及抗生物素蛋白/生物素)；熒光物質(諸如(但不限於)繖形銅、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺、丹磺醯氯或藻紅蛋白)；發光物質(諸如(但不限於)魯米諾(luminol))；生物性發光物質(諸如(但不限於)螢光素酶、螢光素及水母素)；放射性物質(諸如(但不限於)碘(131I、125I、123I及121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In及111In)、鍀(99Tc)、鈦(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin)；使用各種正電子發射斷層掃描及非放射性順磁金屬離子之正電子發射金屬。
本發明進一步涵蓋共軛治療部分之抗體及其抗原結合片段的用途。抗體及其抗原結合片段可共軛治療部分諸如細胞毒素(例如，細胞生長抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如，α-發射體)。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害的任何試劑。
另外，抗體及其抗原結合片段可共軛至改性給定生物反應之治療部分或藥物部分。治療部分或藥物部分不應解釋為限於經典的化學治療劑。例如，藥物部分可係擁有所需生物活性之蛋白質、肽或多肽。該等蛋白質可包括(例如)：毒素(諸如相思豆、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素)；蛋白質(諸如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生之生長因子、組織纖溶酶原激活劑、細胞凋亡劑、抗血管生成劑)；或生物反應調節劑諸如例如淋巴因子。
此外，抗體可共軛至治療部分諸如放射性金屬離子，諸如α-發射體(諸如213Bi)或用於共軛放射性金屬離子(包括(但不限於131In、131Lu、131Y、131Ho、131Sm))至多肽之大環螯合劑。於一實施例中，大 環螯合劑為1,4,7,10-四氮雜十二烷-N,N',N",N'''-四乙酸(DOTA)，其可經由連接子分子附接至抗體。該等連接子分子於此項技術中係公知的及描述於Denardo等人，1998,Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson等人，1999,Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；及Zimmerman等人，1999,Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50中，各自以全文引用之方式併入。
用於共軛治療部分至抗體之技術係熟知的，參見例如，Amon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」，在Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編輯)，第243至56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)中；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」，在Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等人(編輯)，第623至53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)中；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」，在Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編輯)，第475至506頁(1985)中；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」，在Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編輯)，第303至16頁(Academic Press 1985)中，及Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.62：119-58
抗體亦可附接至固體載體，其尤其適用於靶抗原之免疫測定及純化。該等固體載體包括(但不限於)：玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
本發明產生抗體之方法
編碼抗體之核酸
本發明提供編碼包括以上所述之BMP6-結合抗體鏈之鏈段或域的 多肽的實質上經純化之核酸分子。本發明一些核酸包括：編碼顯示於任何SEQ ID NO：16；36；56；或76之重鏈可變區的核苷酸序列，及/或編碼顯示於任何SEQ ID NO：26；46；66；或86之輕鏈可變區的核苷酸序列。於一具體實施例中，核酸分子係彼等表1中所確定者。本發明一些其他核酸分子包括與彼等表1中所確定之核苷酸序列實質上相同(例如，至少65%、80%、95%或99%)的核苷酸序列。當自適當表現載體表現時，藉由此等聚核苷酸編碼之多肽能夠展示BMP6抗原結合能力。
本發明亦提供編碼來自表1中所闡述之BMP6-結合抗體之重鏈或輕鏈的至少一個CDR區及通常所有三個CDR區的聚核苷酸。一些其他聚核苷酸編碼表1中所闡述之BMP6-結合抗體之重鏈及/或輕鏈的所有或實質上所有可變區序列。由於密碼之簡并性，各種核酸序列將編碼每個免疫球蛋白胺基酸序列。
本發明核酸分子可編碼抗體之可變區及恆定區兩者。本發明一些核酸序列包括編碼與於任何SEQ ID NO：16；36；56；或76中所闡述之成熟重鏈可變區序列實質上相同(例如，至少80%、90%或99%)之成熟重鏈可變區序列的核苷酸。一些其他核酸序列包括編碼與於任何SEQ ID NO：26；46；66；或86中所闡述之成熟輕鏈可變區序列實質上相同(例如，至少80%、90%或99%)之成熟輕鏈可變區序列的核苷酸。
聚核苷酸序列可藉由重新固相DNA合成或藉由編碼BMP6-結合抗體或其結合片段之現有序列(例如以下實例中所述之序列)的PCR突變誘發來產生。核酸之直接化學合成可藉由此項技術中已知之方法完成，諸如Narang等人，1979,Meth.Enzymol.68：90之磷酸三酯法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109,1979之磷酸二酯法；Beaucage等人，Tetra.Lett.,22：1859,1981之二乙基亞磷醯胺法；及美國專利第 4,458,066號之固體載體法。藉由PCR向聚核苷酸序列引入突變可如下述進行，例如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編輯)，Freeman Press,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編輯),Academic Press,San Diego,Calif.,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967,1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17,1991。
本發明亦提供產生上述BMP6-結合抗體之表現載體及宿主細胞。各種表現載體可用來表現編碼BMP6-結合抗體鏈或結合片段之聚核苷酸。病毒基及非病毒表現載體均可用於產生哺乳動物宿主細胞中之抗體。非病毒載體及系統包括質粒、附加體載體、通常具有用於表現蛋白質或RNA的表現盒及人類人造染色體(參見例如，Harrington等人，Nat Genet.15：345,1997)。例如，適用於在哺乳動物(例如，人類)細胞中表現BMP6-結合聚核苷酸及多肽的非病毒載體包括pThioHis A、B & C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B & C(Invitrogen,San Diego,Calif.)、MPSV載體及此項技術中已知之用於表現其他蛋白質的多種其他載體。有用病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒之載體，基於SV40、乳頭狀瘤病毒、HBP埃巴(Epstein Barr)病毒、痘苗病毒載體及Semliki森林病毒之載體(SFV)。參見Brent等人，同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49：807,1995；及Rosenfeld等人，Cell 68：143,1992。
表現載體之選擇取決於預期宿主細胞，其中載體有待表現。通常，表現載體含有以可操作方式連接編碼BMP6-結合抗體鏈之聚核苷酸的啟動子及其他調控序列(例如，增強子)。於一實施例中，可誘導啟動子用於防止插入序列除於誘導條件下外之表現。可誘導啟動子包括(例如)阿拉伯糖(arabinose)、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱休克啟 動子。轉形生物之培養可於非誘導條件下，在不偏向於編碼序列之群體下擴展，編碼序列之表現產物係更佳地耐受宿主細胞。除啟動子之外，其他調控元件可能亦需要或期望用於有效表現BMP6-結合抗體鏈抗原結合片段。此等元件通常包括ATG起始密碼子及相鄰核糖體結合位點或其他序列。此外，表現之效率可藉由包含入適合使用中細胞系統的增強子而增強(參見例如，Scharf等人，Results Prob1.Cell Differ.20：125,1994；及Bittner等人，Meth.Enzymol.,153：516,1987)。例如，SV40增強子或CMV增強子可用於增加於哺乳動物宿主細胞內之表現。
表現載體亦可提供分泌訊號序列位置以形成與藉由插入BMP6-結合抗體序列編碼之多肽的融合蛋白質。更常見地，插入BMP6-結合抗體序列在包含於載體中之前連接訊號序列。待用於接收編碼BMP6-結合抗體輕鏈及重鏈可變域之序列的載體有時亦編碼恆定區或其部分。該等載體允許可變區作為與恆定區之融合蛋白質進行表現，從而導致完整抗體或其抗原結合片段的產生。該等恆定區通常係人類。
包藏及表現BMP6-結合抗體鏈之宿主細胞可係原核或真核。大腸桿菌係適用於選殖及表現本發明聚核苷酸之一種原核宿主。其他適於使用之微生物宿主包括桿菌(諸如枯草桿菌)及其他腸桿菌(諸如沙門氏菌、沙雷氏菌及各假單胞菌種類)。於此等原核宿主中，通常含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如，複製起點)的原核宿主亦可作表現載體。此外，將存在任何數量之各種熟知啟動子(諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統、或自噬菌體λ的啟動子系統)。啟動子通常(視情況與操縱子序列一起)控制表現及具有核糖體結合位點序列等以引發或完成轉錄及轉譯。其他微生物諸如酵母亦可用於表現本發明BMP6-結合多肽。亦可使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體之組合。
於一實施例中，哺乳動物宿主細胞係用於表現及產生本發明BMP6-結合多肽。例如，其可係表現內源性免疫球蛋白基因之融合瘤細胞系(例如，如實例中所述之1D6.C9骨髓瘤融合瘤純系)或包藏外源表現載體之哺乳動物細胞系(例如，以下例示之SP2/0骨髓瘤細胞)。此等包括任何正常致死或正常或異常永生動物或人類細胞。例如，許多能夠分泌完整免疫球蛋白之合適宿主細胞系已經開發出，包括CHO細胞系。各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、轉化B細胞及融合瘤。使用哺乳動物組織細胞培養來表現多肽通常論述於例如Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子及增強子(參見例如，Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68,1986)及必要的處理資訊位點，諸如核糖體結合位點、RNA拼接位點、聚腺苷酸化位點及轉綠終止子序列。此等表現載體通常含有衍生自哺乳動物基因或自哺乳動物病毒之啟動子。合適啟動子可係組成型、細胞類型特異性、階段特異性、及/或可調節或可調控。有用啟動子包括(但不限於)：金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導型MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP poIIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素誘導型CMV啟動子(諸如人類即刻早期CMV啟動子)、組成型CMV啟動子及此項技術中已知之啟動子-增強子組合。
引入含有受關注聚核苷酸序列之表現載體之方法端視細胞宿主之類型而變化。例如，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主(一般參見Sambrook等人，同上)。其他方法包括例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導之轉化、注射及微注射、彈道方法、病毒體、免疫脂質體、聚陽離子：核酸共軛物、裸DNA、人造病毒體、融合至疱疹病毒結構蛋白VP22(Elliot及 O'Hare，Cell 88：223,1997)、DNA之藥劑增強攝取及離體轉導。針對長期高產率生產之重組蛋白，通常期望穩定的表現。例如，穩定表現BMP6-結合抗體鏈或結合片段之細胞系可使用含有病毒性複製起點或內源性表現元件及可選擇標記基因之本發明表現載體來製備。引入載體後，細胞可允許於營養強化之培養基生長1至2天後切換到選擇性培養基。可選擇標記之目的係賦予對選擇之抗性，及其之存在允許於選擇性培養基中成功地表現引入之序列的細胞的生長。抗性穩定轉染細胞可使用適於細胞類型之組織培養技術增殖。
本發明單株抗體之生成
單株抗體(mAb)可藉由各種技術(包括習知單株抗體方法學，例如Kohler及Milstein,1975 Nature 256：495之標準體細胞雜交技術)產生。可使用用於產生單株抗體之許多技術，例如B淋巴細胞之病毒性或致癌性轉化。
用於製備融合瘤之動物系統係鼠科系統。小鼠之融合瘤產生係良好建立的程序。用於單離融合之免疫脾細胞之免疫協定及技術係此項技術中已知的。融合搭檔(例如鼠科骨髓瘤細胞)及融合程序亦係已知的。
本發明嵌合或人源化抗體及其抗原結合片段可係基於如上所述製備之鼠科單株抗體之序列來製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可係自受關注鼠科融合瘤獲得及使用標準分子生物技術改造成含非鼠科(例如人類)免疫球蛋白序列。例如，為了產生嵌合抗體，鼠科可變區可係使用此項技術中已知之方法連接至人類恆定區(參見例如，Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為了產生人源化抗體，鼠科CDR區可係使用此項技術中已知之方法插入至人類框架中。參見例如，Winter之美國專利第5,225,539號及Queen等人之美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號及第6180370號。
於一特定實施例中，本發明抗體係人類單株抗體。針對抗BMP6之該等人類單株抗體可係使用帶有人類免疫系統而不是小鼠系統之部分的轉基因或轉染色體小鼠來生成。此等轉基因及轉染色體小鼠包括本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠且本文中統稱為「人類Ig小鼠」之小鼠。
HuMAb Mouse®(Medarex,Inc.)含有編碼未重排人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因小型位點，以及使內源性μ及κ鏈位點失活之靶向突變(參見例如，Lonberg等人，1994 Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠顯示減少之小鼠IgM或K之表現及對免疫反應，引入之人類重鏈及輕鏈轉基因經歷種類轉化及體細胞突變以生成高親和力人類IgG-κ單株(Lonberg,N等人，1994同上；在Lonberg,N.,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101中之評審；Lonberg,N.及Huszar,D.,1995 Intern.Rev.Immunol.13：65-93；及Harding,F.及Lonberg,N.,1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb小鼠之製備及使用，及由該等小鼠攜帶之基因修飾係進一步描述於Taylor,L.等人，1992 Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen,J.等人，1993International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等人，1993 Nature Genetics 4：117-123；Chen,J.等人，1993 EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人，1994 J.Immunol.152：2912-2920；Taylor,L.等人，1994 International Immunology 579-591；及Fishwild,D.等人，1996 Nature Biotechnology 14：845-851，其等之全部內容以全文引用之方式併入本文中。進一步參見全部頒予Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號及第5,770,429號；Surani 等人之美國專利第5,545,807號；全部頒予Lonberg及Kay之PCT公開案第WO 92103918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97113852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號；及Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。
於另一實施例中，本發明人類抗體可使用攜帶於轉基因及轉染色體中之人類免疫球蛋白之小鼠(諸如攜帶人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠)來培育。本文中稱為「KM小鼠」之該等小鼠詳細描述於Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
仍另外，表現人類免疫球蛋白基因之置換轉基因動物系統係此項技術中可得的及可用於培育本發明BMP6-結合抗體及其抗原結合片段。例如，可使用稱為Xenomouse(Abgenix,Inc.)之置換轉基因系統。該等小鼠描述於例如Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號；第6,075,181號；第6,114,598號；第6,150,584號及第6,162,963號。
此外，表現人類免疫球蛋白基因之置換轉染色體動物系統係此項技術中可得的及可用於培育本發明BMP6-結合抗體。例如，可使用稱為「TC小鼠」之攜帶人類重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染色體二者之小鼠；該等小鼠描述於Tomizuka等人，2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。還有，攜帶人類重鏈及輕鏈轉染色體之奶牛已經描述於此項技術(Kuroiwa等人，2002 Nature Biotechnology 20：889-894)中及可用於培育本發明BMP6-結合抗體。
本發明人類單株抗體亦可使用用於篩選人類免疫球蛋白基因之庫的噬菌體顯示方法來製備。用於單離人類抗體之該等噬菌體顯示方法係於此項技術中建立或描述於以下實例中。參見例如Ladner等人之美國專利第5,223,409號；第5,403,484號及第5,571,698號；Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；McCafferty等人之美國專 利第5,969,108號及第6,172,197號；及Griffiths等人之美國專利第5,885,793號；第6,521,404號；第6,544,731號；第6,555,313號；第6,582,915號及第6,593,081號。
本發明人類單株抗體亦可使用人類免疫細胞已經重構入其中使得於免疫時可生成人類抗體反應的SCID小鼠來製備。該小鼠描述(例如)於Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號。
框架或Fc改造
本發明經改造之抗體及其抗原結合片段包括彼等其中已對VH及/或VL內之框架殘基進行修飾(例如)以改良抗體之性質者。通常進行該等框架修飾來減少抗體之免疫原性。例如，一種方法為「回復突變」一或多個框架殘基至對應生殖系序列。更具體言之，已經歷體細胞突變之抗體可含有不同於衍生抗體的生殖系序列之框架殘基。該等殘基可藉由比較抗體框架序列與衍生抗體的生殖系序列來確定。為了返回框架區序列至其生殖系組態，體細胞突變可藉由(例如)定點突變誘發來「回復突變」至生殖系序列。該「回復突變」抗體亦希望涵蓋於本發明中。
框架修飾之另一類型涉及使框架區內或甚至於一或多個CDR區內之一或多個殘基突變以移除T細胞抗原決定基從而減少抗體之潛在免疫原性。此方法亦係稱為「脫免疫」及係進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號。
除於框架或CDR區內進行修飾外或作為其置換，本發明抗體可經改造以包括Fc區內之修飾，通常以改變抗體之一或多種功能性質，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合、及/或抗原依賴性細胞毒性。還有，本發明抗體可經化學上修飾(例如，一或多個化學部分可附接至抗體)或經修飾以改變其糖基化，再改變抗體之一或多種功能性質。每個此等實施例係進一步詳細描述於下文中。Fc區內之殘基之 編號係Kabat之EU索引之編號。
於一實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基之數量改變(例如增加或減少)。此方法係進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號。CH1之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基之數量經改變以(例如)促進輕鏈及重鏈之裝配或增加或減少抗體之穩定性。
於另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以減少抗體之生物半衰期。更具體言之，一或多種胺基酸突變經引入至Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區使得抗體具有相對於天然Fc鉸鏈域SpA結合性受損的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合性。此方法係進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號。
於另一實施例中，抗體經修飾以增加生物學半衰期。各種方法係可行的。例如，如Ward之美國專利第6,277,375號中所述，可引入一或多種以下突變：T252L、T254S、T256F。或者，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述，為了增加生物學半衰期，抗體可於CH1或CL區內改變以含有取自IgG之Fc區之CH2域的兩個環的補救受體結合抗原決定基。
於一實施例中，Fc區係藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基而改變以改變抗體之效應功能。例如，一或多個胺基酸殘基可用不同胺基酸殘基置換使得抗體針對效應配位體具有經改變之親和力且保留親代抗體之抗原結合能力。針對其改變親和力之效應配位體可係(例如)Fc受體或補體的C1組分。此方法係進一步詳細描述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號。
於另一實施例中，選自胺基酸殘基之一或多個胺基酸可用不同胺基酸殘基置換使得抗體具有經改變之C1q結合性及/或減少或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法係進一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號。
於另一實施例中，一或多個胺基酸殘基經改變，從而改變抗體固定補體之能力。此方法係進一步描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
於又另一實施例中，Fc區藉由修飾一或多個胺基酸經修飾以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或增加抗體針對Fc-γ受體之親和力。此方法係進一步描述於Presta之PCT公開案WO 00/42072中。此外，已描繪人類IgG1上針對Fc-γRI、Fc-γRII、Fc-γRIII及FcRn之結合位點且已描述具有經改良之結合性的變體(參見Shields,R.L.等人，2001 J.Biol.Chen.276：6591-6604)。
於仍另一實施例中，抗體之糖基化經修飾。例如，可製造非糖基化抗體(即，抗體缺乏糖基化)。糖基化可經改變以(例如)增加抗體針對「抗原」之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)改變抗體序列內之一或多個糖基化位點而完成。例如，可進行一或多種胺基酸取代，其導致一或多個可變區框架糖基化位點消除，從而消除於該位點之糖基化。該非糖基化可增加抗體針對抗原之親和力。該方法係進一步描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號。
另外或或者，可製造具有經改變之類型的糖基化的抗體，諸如具有減少量之岩藻糖殘基的低岩藻糖基化抗體或具有增加之等分GlcNac結構的抗體。該等經改變之糖基化模式已證實增加抗體的ADCC能力。該等碳水化合物修飾可係藉由(例如)在具有經改變之糖基化機制的宿主細胞中表現抗體來完成。具有經改變之糖基化機制的細胞已經描述於此項技術中及可用作其中表現本發明重組抗體從而產生具有經改變之糖基化的抗體的宿主細胞。例如，Hang等人之EP 1,176,195描述具有功能破壞之編碼岩藻糖基轉移酶的FUT8基因的細胞系，使得表現於該細胞系中之抗體顯示低岩藻糖基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835描述具有減少之附接岩藻糖至Asn(297)-連 接之碳水化合物之能力的變體CHO細胞系LecI3細胞，亦導致於該宿主細胞中表現之抗體之低岩藻糖基化(亦參見Shields,R.L.等人，2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述經改造以表現糖蛋白修飾糖基轉移酶(例如，β(1,4)--N乙醯葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII))之細胞系使得於經改造之細胞系中表現之抗體顯示增加之等分GlcNac結構，從而導致抗體之ADCC活性增加(亦參見Umana等人，1999 Nat.Biotech.17：176-180)。
改造經改變之抗體之方法
如上所討論，本文中顯示之具有VH及VL序列或全長重鏈及輕鏈序列之BMP6-結合抗體可用於藉由修飾全長重鏈及/或輕鏈序列、VH及/或VL序列，或與之附接的恆定區來產生新穎BMP6-結合抗體。因此，於本發明之另一態樣中，本發明BMP6-結合抗體之結構特徵係用以產生保留本發明抗體及其抗原結合片段之至少一種功能性質(諸如結合人類BMP6且亦抑制BMP6之一或多種功能性質(例如，於溶血測定中抑制紅血球溶解))的結構上相關的BMP6-結合抗體。
例如，本發明抗體及其抗原結合片段之一或多個CDR區，或其突變可重組地組合已知框架區及/或其他CDR以產生另外經重組改造之如以上討論之本發明BMP6-結合抗體及其抗原結合片段。修飾之其他類型包括彼等描述於先前部分者。改造方法之起始物質係本文中提供之一或多種VH及/或VL序列或其一或多個CDR區。為了產生經改造之抗體，事實上沒有必要製備(即作為蛋白質表現)具有本文中提供之一或多種VH及/或VL序列或其一或多個CDR區之抗體。而是，含於序列中之資訊係用作起始物質以產生衍生自起始序列之「第二代」序列及然後製備「第二代」序列及作為蛋白質表現。
經改變之抗體序列亦可係藉由篩選具有固定CDR3序列或如US20050255552中所述之最小必需結合決定子及CDR1及CDR2序列上 之多樣性的抗體庫來製備。篩選可係根據適於自抗體庫篩選抗體之任何篩選技術(諸如噬菌體顯示技術)來進行。
標準分子生物學技術可用於製備及表現經改變之抗體序列。藉由經改變之抗體序列編碼之抗體係保留本文所述之BMP6-結合抗體的一、一些或全部功能技術者，其功能性質包括(但不限於)：特異性結合人類BMP6蛋白質；且於溶血測定中該抗體抑制紅血球溶解。
經改變之抗體之功能性質可係使用此項技術中可得及/或本文所述之標準測定(諸如彼等闡述於實例中者(例如ELISA))來評估。
於本發明之改造抗體及其抗原結合片段之方法的一實施例中，突變可沿著BMP6-結合抗體編碼序列之全部或部分來隨機或選擇性引入及所得經修飾之BMP6-結合抗體可針對本文所述之結合活性及/或其他功能性質進行篩選。突變方法已經描述於此項技術中。例如，Short之PCT公開案WO 02/092780描述使用飽和突變誘發、合成拼接裝配或其組合來產生及篩選抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679描述使用電腦篩選方法來最佳化抗體之生理化學性質的方法。
本發明抗體之表徵
本發明抗體及其抗原結合片段可係藉由各種功能測定來表徵。例如，其可係藉由其抑制BMP6之能力來表徵。
抗體結合BMP6之能力可係藉由直接標記受關注抗體進行偵測，或抗體可不經標記及使用此項技術中已知之各種夾心測定形式間接偵測結合性。
於一實施例中，本發明BMP6-結合抗體及其抗原結合片段阻斷參考BMP6-結合抗體或與其等競爭結合BMP6多肽。此等可係上述之完全人類BMP6-結合抗體。其等亦可係如參考抗體結合相同抗原決定基之其他鼠源、嵌合或人源化BMP6-結合抗體。阻斷參考抗體或與其競 爭結合之能力表明，於測試下之BMP6-結合抗體結合與由參考BMP6-結合抗體所定義者相同或類似抗原決定基，或結合足夠接近由參考BMP6-結合抗體所結合之抗原決定基的抗原決定基。該等抗體尤其可能共享參考抗體所確定之優勢性質。阻斷參考抗體或與其競爭之能力可藉由(例如)競爭結合測定法來測定。在競爭結合測定下，檢測於測試下之抗體的抑制參考抗體特異性結合共同抗原(諸如BMP6多肽)之能力。若過量測試抗體實質上抑制參考抗體之結合，則測試抗體與參考抗體針對特異性結合抗原而競爭。實質上抑制意謂測試抗體減少參考抗體的特異性結合通常至少10%、25%、50%、75%或90%。
存在許多已知競爭結合測定可用於評定抗體與參考抗體針對結合特定蛋白質(於此情況下，BMP6)之競爭。此等包括(例如)固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242-253,1983)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland等人，J.Immunol.137：3614-3619,1986)；固相直接標記法、固相直接標記夾心測定(參見Harlow & Lane，同上)；使用I-125標記的固相直接標記RIA(參見Morel等人，Molec.Immunol.25：7-15,1988)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176：546-552,1990)；及直接標記之RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77-82,1990)。通常，該測定涉及使用結合帶有此等中之一者：未標記測試BMP6-結合抗體及標記參考抗體的固體表面或細胞的經純化之抗原。競爭抑制係藉由在測試抗體之存在下測定結合固體表面或細胞的標記的量來測量。通常測試抗體係過量存在。藉由競爭測定法確定之抗體(競爭抗體)包括與參考抗體結合相同抗原決定基之抗體及因為空間位阻發生而結合足夠接近由參考抗體結合之抗原決定基的相鄰抗原決定基的抗體。
為了測定選定BMP6-結合單株抗體是否結合獨特抗原決定基，則每個抗體可係使用市售試劑(例如，購自Pierce,Rockford,Ill.之試劑)生物素化。使用未標記單株抗體及生物素化單株抗體之競爭研究可使用BMP6多肽塗覆-ELISA板進行。生物素化MAb結合性可用鏈球菌-抗生物素蛋白-鹼性磷酸酶探針進行偵測。為了測定經純化之BMP6-結合抗體之同型物，可進行同型物ELISA。例如，微量滴定板之孔可於4攝氏度下經1μg/ml之抗-人類IgG塗覆過夜。於經1% BSA阻斷後，在環境溫度下將板與1μg/ml或更少之單株BMP6-結合抗體或經純化之同型物對照反應一至兩個小時。然後孔可與人類IgG1或人類IgM-特異性鹼性磷酸酶共軛探針反應。然後板經顯影及分析使得可確定經純化之抗體的同型物。
為了證實單株BMP6-結合抗體結合表現BMP6多肽之活細胞，可使用流式細胞術。簡而言之，可將表現BMP6之細胞系(於標準生長條件下生長)與各種濃度之BMP6-結合抗體於含有0.1% BSA及10%胎牛血清之PBS中混合並於37攝氏度下培養1小時。清洗後，將細胞與熒光素標記之抗人類IgG抗體於與初級抗體染色相同的條件下進行反應。可藉由FACScan儀器使用對單細胞閘控的光及側向散射性質來分析樣品。流式細胞分析(另外或或者)，可使用利用熒光顯微鏡之置換測定。可恰好如上述般使細胞著色及藉由熒光顯微鏡檢測。此方法允許個別細胞之可視化，然取決於抗原之密度可具有減弱之靈敏度。
本發明BMP6-結合抗體及其抗原結合片段可係進一步藉由西方墨點法來測試與BMP6多肽或抗原片段之反應性。簡而言之，可製備經純化之BMP6多肽或融合蛋白質，或自表現BMP6之細胞的細胞提取物並接受十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。於電泳後，將經分離之抗原轉移至硝酸纖維素膜，用10%胎牛血清阻斷並用待測試單株抗體探測。人類IgG結合性可使用抗-人類IgG鹼性磷酸酶來偵測並用 BCIP/NBT底物片劑(Sigma Chem.Co.,St.Louis,Mo.)顯影。
功能測定之實例亦描述於下文中實例部分中。
預防及治療用途
本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之本發明抗體及其抗原結合片段來治療與增加之BMP6活性相關的疾病或病症的方法。於一具體實施例中，本發明提供一種藉由向有此需要之個體投與有效量之本發明抗體及其抗原結合片段來治療貧血之方法。
本發明抗體及其抗原結合片段可尤其用於預防貧血之進展。其亦可用來與其他療法組合以治療貧血患者。
於一實施例中，本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之本發明抗體及其抗原結合片段來治療與BMP6相關之疾病或病症的方法。已知與BMP6相關之疾病或病症之實例包括：貧血，包括(作為非限制實例)：慢性疾病貧血(ACD)、慢性腎病(CKD)(例如，與其相關)之貧血、癌症貧血、發炎貧血、紅血球生成刺激劑(ESA)耐藥性貧血(例如紅血球生成素(EPO)耐藥性貧血)、ESA低反應性貧血(例如，EPO低反應性貧血)、功能性缺鐵性貧血、及/或限鐵性貧血。
於一具體實施例中，本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之本發明抗體及其抗原結合片段來治療與BMP6相關之疾病或病症的方法，其中該疾病或病症係貧血。於一實施例中，貧血係慢性疾病貧血。於一實施例中，慢性疾病係慢性腎病。於一實施例中，慢性疾病係癌症。於一實施例中，慢性疾病係發炎。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係ESA(例如，EPO)-耐藥性貧血。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係ESA(例如，EPO)-低反應性貧血。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係限鐵性貧血。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體係慢性血液透析(HD)個體。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體具有腎臟疾病，例如，晚期腎病。
於一具體實施例中，本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之本發明抗體及其抗原結合片段來治療與BMP6相關之疾病或病症的方法，其中該疾病或病症係功能缺鐵性貧血。於一實施例中，個體係經ESA(例如，EPO)治療之慢性血液透析患者。於一實施例中，個體係經ESA(例如，EPO)治療之具有慢性腎病之慢性血液透析患者。
於一具體實施例中，本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之包括本發明抗體之組合物來治療貧血的方法。於一實施例中，貧血係ESA(例如，EPO)-耐藥性貧血。於一實施例中，貧血係ESA(例如，EPO)-低反應性貧血。於一實施例中，貧血係限鐵性貧血。於一實施例中，貧血係與腎病(例如，慢性腎病)相關之貧血。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體係慢性血液透析(HD)個體。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體具有腎病，例如，晚期腎病。
於一具體實施例中，本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之包括本發明抗體之組合物來治療與BMP6相關之疾病或病症的方法，其中該疾病或病症係功能缺鐵性貧血。於一實施例中，個體係經ESA(例如，EPO)治療之慢性血液透析患者。於一實施例中，個體係經ESA(例如，EPO)治療之具有慢性腎病之慢性血液透析患者。
於一具體實施例中，本發明提供治療貧血之方法。
於一具體實施例中，本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段來減少個體之ESA(例如，EPO)劑量需求的方法。於一實施例中，貧血係慢性疾病貧血。於一實施例中，慢性疾病係慢性腎病。於一實施例中，慢性疾病係癌症。於一實施例中，慢性疾病係發炎。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係ESA(例如，EPO)-耐藥性貧血。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係ESA(例如，EPO)-低反應性貧血。於一實施例中，貧血 (例如，慢性疾病貧血)係限鐵性貧血。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體係慢性血液透析(HD)個體。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體具有腎病，例如，晚期腎病。
於一具體實施例中，本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段來減少個體之ESA(例如，EPO)劑量需求的方法，其中該個體具有功能缺鐵性貧血。於一實施例中，個體係經ESA(例如，EPO)治療之慢性血液透析患者。於一實施例中，個體係經ESA(例如，EPO)治療之具有慢性腎病之慢性血液透析患者。
於一具體實施例中，本發明提供一種藉由向有此需要之個體投與有效量之包括本發明抗體之組合物來減少個體之ESA(例如，EPO)劑量需求的方法。於一實施例中，個體具有貧血。於一實施例中，貧血係慢性疾病貧血。於一實施例中，慢性疾病係慢性腎病。於一實施例中，慢性疾病係癌症。於一實施例中，慢性疾病係發炎。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係ESA(例如，EPO)-耐藥性貧血。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係ESA(例如，EPO)-低反應性貧血。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係限鐵性貧血。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體係慢性血液透析(HD)個體。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體具有腎病，例如，晚期腎病。
於一具體實施例中，本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之包括本發明抗體之組合物來減少個體之ESA(例如，EPO)劑量需求的方法，其中該個體具有功能缺鐵性貧血。於一實施例中，個體係經ESA(例如，EPO)治療之慢性血液透析患者。於一實施例中，個體係經ESA(例如，EPO)治療之具有慢性腎病之慢性血液透析患者。
於一具體實施例中，本發明提供一種藉由向有此需要之個體投 與有效量之本發明抗體及其抗原結合片段來減少個體之鐵(例如，IV鐵劑)劑量需求的方法。於一實施例中，個體具有貧血。於一實施例中，貧血係慢性疾病貧血。於一實施例中，慢性疾病係慢性腎病。於一實施例中，慢性疾病係癌症。於一實施例中，慢性疾病係發炎。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係ESA(例如，EPO)-耐藥性貧血。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係ESA(例如，EPO)-低反應性貧血。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係限鐵性貧血。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體係慢性血液透析(HD)個體。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體具有腎病，例如，晚期腎病。
於一具體實施例中，本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之本發明抗體及其抗原結合片段來減少個體之鐵(例如，IV鐵劑)劑量需求的方法，其中該個體具有功能缺鐵性貧血。於一實施例中，個體係經ESA(例如，EPO)治療之慢性血液透析患者。於一實施例中，個體係經ESA(例如，EPO)治療之具有慢性腎病之慢性血液透析患者。
於一具體實施例中，本發明提供一種藉由向有此需要之個體投與有效量之包括本發明抗體之組合物來減少個體之鐵(例如，IV鐵劑)劑量需求的方法。於一實施例中，個體具有貧血。於一實施例中，貧血係慢性疾病貧血。於一實施例中，慢性疾病係慢性腎病。於一實施例中，慢性疾病係癌症。於一實施例中，慢性疾病係發炎。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係ESA(例如，EPO)-耐藥性貧血。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係ESA(例如，EPO)-低反應性貧血。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係限鐵性貧血。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體係慢性血液透析(HD)個體。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體具有腎病，例如，晚期 腎病。
於一具體實施例中，本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之包括本發明抗體之組合物來減少個體之鐵(例如，IV鐵劑)劑量需求的方法，其中該個體具有功能缺鐵性貧血。於一實施例中，個體係經ESA(例如，EPO)治療之慢性血液透析患者。於一實施例中，個體係經ESA(例如，EPO)治療之具有慢性腎病之慢性血液透析患者。
於一具體實施例中，本發明提供一種減少個體之鐵(例如，IV鐵劑)劑量需求及減少個體之ESA(例如，EPO)劑量需求的方法，其包括投與本發明抗體或抗原結合片段或包括該抗體或抗原結合片段之組合物。於一實施例中，貧血係慢性疾病貧血。於一實施例中，慢性疾病係慢性腎病。於一實施例中，慢性疾病係癌症。於一實施例中，個體具有貧血。於一實施例中，慢性疾病係發炎。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係ESA(例如，EPO)-耐藥性貧血。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係ESA(例如，EPO)-低反應性貧血。於一實施例中，貧血(例如，慢性疾病貧血)係限鐵性貧血。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體係慢性血液透析(HD)個體。於實施例(包括任何以上實施例)中，個體具有腎病，例如，晚期腎病。
於一實施例中，本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之本發明抗體及其抗原結合片段來動員螯合鐵的方法。
於一實施例中，本發明提供藉由向有此需要之個體投與有效量之包括本發明抗體之組合物來動員螯合鐵的方法。
於一實施例中，本發明提供一種改善(例如，增加)貧血個體中之血紅素含量，同時減少促紅血球生成素及/或鐵(例如，IV鐵劑)之劑量需求的方法，該方法包括向有此需要之個體投與本發明抗體或其抗原結合片段。於一實施例中，貧血係與慢性疾病相關之貧血。於一實施例中，血紅素含量之改善包括改善該含量至如臨床實踐指南(例如腎 病：改善整體結果(KDIGO)貧血工作小組。針對慢性腎病中之貧血的KDIGO臨床實踐指南(Kidney Disease：Improving Global Outcomes(KDIGO)Anemia Work Group.KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease)。Kidney inter.,Suppl.2012；2：279-335，其全部內容以全文引用之方式併入本文中)所指定之含量。於一實施例中，血紅素含量之改善包括改善血紅素含量至至少約11.0g/dL，例如，至約11.0g/dL至約12.5g/dL。於一實施例中，血紅素含量之改善包括改善血紅素含量至至少11.0g/dL，例如，至11.0g/dL至12.5g/dL。
於一實施例中，本發明提供一種改善(例如，增加)貧血個體中之血紅素含量，同時減少促紅血球生成素及/或鐵(例如，IV鐵劑)之劑量需求的方法，該方法包括向有此需要之個體投與包括本發明抗體之組合物。於一實施例中，貧血係與慢性疾病相關之貧血。於一實施例中，血紅素含量之改善包括改善該含量至如臨床實踐指南(例如腎病：改善整體結果(KDIGO)貧血工作小組。針對慢性腎病中之貧血的KDIGO臨床實踐指南(Kidney Disease：Improving Global Outcomes(KDIGO)Anemia Work Group.KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease)。Kidney inter.,Suppl.2012；2：279-335，其全部內容以全文引用之方式併入本文中)所指定之含量。於一實施例中，血紅素含量之改善包括改善血紅素含量至至少約11.0g/dL，例如，至約11.0g/dL至約12.5g/dL。於一實施例中，血紅素含量之改善包括改善血紅素含量至至少11.0g/dL，例如，至11.0g/dL至12.5g/dL。
於一實施例中，本發明提供一種維持貧血個體中之血紅素含量，同時減少促紅血球生成素及/或鐵(例如，IV鐵劑)之劑量需求的方法，該方法包括向有此需要之個體投與本發明抗體或其抗原結合片段。於 一實施例中，貧血係與慢性疾病相關之貧血。於一實施例中，血紅素含量之改善包括改善該含量至如臨床實踐指南(例如腎病：改善整體結果(KDIGO)貧血工作小組。針對慢性腎病中之貧血的KDIGO臨床實踐指南(Kidney Disease：Improving Global Outcomes(KDIGO)Anemia Work Group.KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease)。Kidney inter.,Suppl.2012；2：279-335，其全部內容以全文引用之方式併入本文中)所指定之含量。於一實施例中，血紅素含量之改善包括改善血紅素含量至至少約11.0g/dL，例如，至約11.0g/dL至約12.5g/dL。於一實施例中，血紅素含量之改善包括改善血紅素含量至至少11.0g/dL，例如，至11.0g/dL至12.5g/dL。
於一實施例中，本發明提供一種維持貧血個體中之血紅素含量，同時減少促紅血球生成素及/或鐵(例如，IV鐵劑)之劑量需求的方法，該方法包括向有此需要之個體投與包括本發明抗體之組合物。於一實施例中，貧血係與慢性疾病相關之貧血。於一實施例中，血紅素含量之改善包括改善該含量至如臨床實踐指南(例如腎病：改善整體結果(KDIGO)貧血工作小組。針對慢性腎病中之貧血的KDIGO臨床實踐指南(Kidney Disease：Improving Global Outcomes(KDIGO)Anemia Work Group.KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease)。Kidney inter.,Suppl.2012；2：279-335，其全部內容以全文引用之方式併入本文中)所指定之含量。於一實施例中，血紅素含量之改善包括改善血紅素含量至至少約11.0g/dL，例如，至約11.0g/dL至約12.5g/dL。於一實施例中，血紅素含量之改善包括改善血紅素含量至至少11.0g/dL，例如，至11.0g/dL至12.5g/dL。
於一實施例中，表1中所述之單離抗體或其抗原結合片段可連同治療方法或程序(諸如描述於本文中或此項技術中已知者)向有此需要之患者投與。該方法或程序包括(作為非限制性實例)：投與治療上有 效量之ESA(例如EPO)、促紅血球生成素或鐵及輸血。治療通常在一週、一個月、三個月、六個月或一年時期之間隔下持續。於一些患者中，投與治療長達患者餘生。
當本發明治療劑與另一藥劑共同投與時，二者可以任一順序循序或同時投與。於一些態樣中，將本發明抗體投與給亦接受第二藥劑或方法(例如ESA、促紅血球生成素、鐵、輸血)之療法的個體。於其他態樣中，結合外科手術治療投與結合分子。
用於與BMP6-結合抗體組合治療之合適藥劑包括會抑制或減少BMP6之表現、含量、穩定性及/或活性之此項技術中已知的藥劑。該等藥劑包括針對BMP6之抗體、siRNA及小分子。
針對BMP6之各種抗體係此項技術中已知，尤其包括彼等描述於以下中者：Andriopoulos等人，2009 Nat.Genet.41：482-487；Arndt等人，2010 Gastroent.138：372-382；Bames等人，1995 World J.Urol.13：337-343；Camaschella等人，2009 Nat.Genet.41：386-388；Celement等人，1999 Int.J.Cancer 80：250-256；Corradini等人，2011 Hepatol.54：273-284；Crews等人，2010 J.Neuro.30：12252-12262；Dai等人，2005 Cancer Res.65：8274；Darby等人，2007 J.Pathol.214：394-404；Hadziahmetovic等人，2011 179：335-348；Hamdy等人，1997 Cancer Res.57：4427；Haudenschild等人，2004 Cancer Res.64：8276；Hee等人，2008 J.Orth.Res.27：162-168；Herrera等人，2009 BMC Cell Biol.10：20； Inagaki等人，2005 Endocrin.147：2681-2689；Jung等人，2008 Stem Cells 26：2042-2051；Kaiser等人，1998 J.Invest.Derm.111：1145-1152；Kautz等人，2011 Haematol.96：199-203；Khalaf等人，2012 Eur.J.Endocrin.168：437-444；Kochanowska等人，2002 Exp.Biol.Med.227：57-62；Li等人，2006 Int.J.Med.Sci.3：97-105；Meynard等人，2011 Blood 118：747-756；Pederson等人，2008 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：20764-69；Plant等人，2002 J.Bone Min.Res.17：782-790；Schluesener等人，1994 Atheroscl.113：153-156；Schluesener等人，2004 GLIA 12：161-164；Shi等人，2009 Fert.Steril.92：1794-1798；Varley等人，1996 Exp.Neur.140：84-94；Wang等人，2007 Mol.Cell.Neurosci.34：653-661；及Zhang等人，2006 Neurosci.138：47-53；美國專利第8,795,665號；及WO 2010/056981；針對BMP6之另外抗體係此項技術中已知的。許多係市售的。
針對BMP6之各種siRNA係此項技術中已知的，尤其包括彼等描述於以下中者：He等人，2003 Cell.Signal.25：1372-1378；Ikeda等人，2012 PLoS 0040465；Kautz等人，2008 Blood 112：1503；Mi等人，2011 J.Cancer Res.Clin.Oncol.137：245；Xia等人，2007 J.Biol.Chem.282：18129-18140； Xia等人，2008 Blood 111：5195；及Yang等人，2009 Int.J.Bioch.Cell Biol.41：853-861。
BMP6之其他抑制劑係已知的。任何此等可與本文所揭示之任何抗體或其抗原結合片段組合使用。
組合治療方案可係加成或其可產生協同結果(例如，兩種藥劑之組合使用使BMP6活性之減少比預期更多)。於一實施例中，本發明提供用本發明BMP6-結合抗體及抗貧血藥劑或方法(諸如ESA、促紅血球生成素、鐵或輸血)來預防及/或治療如上所述之貧血或另一與BMP6相關之疾病的組合療法。
診斷用途
於一態樣中，本發明涵蓋用於在生物樣本(例如，血液、血清、細胞、組織)之情境中或自受疾病或病症折磨或處於發展與貧血相關之病症的風險中的個體測定BMP6及/或核酸表現以及BMP6功能的診斷測定。
診斷測定(諸如競爭測定)依賴標記類似物(「示蹤物」)與測試樣本分析物競爭共同結合搭檔上之限制數量之結合位點的能力。結合搭檔於競爭前後通常不溶解及然後結合至結合搭檔之示蹤物及分析物自未結合示蹤物及分析物分離。此分離係藉由傾析(其中結合搭檔係預不溶的)或藉由離心(其中結合搭檔於競爭反應後沉澱)來完成。如藉由標記物質之量的測量，測試樣本分析物之量係與結合示蹤物之量呈反比。已知量之分析物的劑量反應曲線經製作並與測試結果相比較以定量測定存在於測試樣本中之分析物的量。當酵素係用作可偵測標記時，此等測定被稱為ELISA系統。於此形式之測定中，於抗體與BMP6-結合抗體之間的競爭性結合產生結合之BMP6(較佳本發明BMP6抗原決定基)成為血清樣本中抗體的量度，最特別係中和血清樣本中之抗體。
該測定之顯著優點係直接中和抗體進行測量(即彼等干擾BMP6特異性結合抗原決定基者)。該測定，尤其ELISA測試之形式在臨床環境及常規血樣篩查中具有重要應用。
於具有與貧血相關之病症的患者之臨床診斷或監測中，相較於自正常個體之對應生物樣本中之含量，BMP6蛋白質之偵測指示具有與貧血相關之病症的患者。
活體內診斷或成像係描述於US2006/0067935中。簡而言之，此等方法通常包括向患者投與或引入診斷上有效量之以操作方式附接至可藉由非侵入性方法偵測之標記或標籤的BMP6結合分子。允許抗體標記共軛物經足夠時間來局部化及結合BMP6。然後患者暴露於偵測裝置以識別可偵測標記，因此形成患者之組織中之BMP6結合分子的位置的影像。BMP6結合抗體或其抗原結合片段之存在係藉由測定抗體標記是否結合組織之組分來偵測。相較於未患貧血之正常個體，BMP6蛋白質或蛋白質組合之增加含量的偵測係指示與貧血相關之病症之傾向及/或發作。本發明之此等態樣亦係用於組織成像方法及經組合之診斷及治療方法。
本發明亦關於預測醫學領域，其中診斷測定、預後測定、藥物基因組學及監測臨床試驗係用於預後(預測)目的，從而預防性治療個體。
本發明亦提供預後(或預測)測定以測定個體是否係處於發展與BMP6路徑活性失調相關之病症的風險中。例如，BMP6基因中之突變可於生物樣本中進行測定。該等測定可用於預後或預測目的，從而於由BMP6、核酸表現或活性表徵或與其等相關之病症發作前預防性治療個體。
本發明之另一態樣提供用於測定個體中之BMP6核酸表現或BMP6活性的方法，從而為該個體選擇合適治療或預防藥劑(本文中稱 為「藥物基因組學」)。藥物基因組學允許基於個體之基因型(例如檢測個體之基因型以測定個體對特定藥劑的反應能力)來選擇用於治療或預防性治療個體的藥劑(例如藥物)。
本發明之又另一態樣提供一種臨床試驗中監測藥劑(例如藥物)對BMP6之表現或活性之影響的方法。
醫藥組合物
本發明提供醫藥組合物，其包括與醫藥上可接受之載劑一起調配之BMP6-結合抗體或其抗原結合片段。組合物另外可含有適於治療或預防BMP6相關疾病(例如貧血)之一或多種其他治療劑。醫藥載劑增強或穩定組合物，或促進組合物之製備。醫藥上可接受之載劑包括生理上相容之溶劑、分散介質、塗層、抗菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑及類似者。
本發明醫藥組合物可藉由此項技術中已知之多種方法投與。投與途徑及/或模式端視所需結果而變化。投與可係靜脈內、肌內、腹膜內、或皮下、或靶位點之近端投與。醫藥上可接受之載劑應適於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊柱或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。取決於投與途徑，活性化合物(即抗體、雙特異性及多特異性分子)可以材料塗覆以保護化合物免受可能使化合物失活之酸及其他自然條件的作用。
組合物應係無菌及流體。適當流體性可(例如)藉由使用塗層(諸如卵磷脂)，藉由於分散液情況下維持所需粒度，及藉由使用表面活性劑來維持。於許多情況下，較佳於組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇或山梨糖醇)及氯化鈉。可注射組合物之長期吸收可藉由於組合物中包括延遲吸收之試劑(例如，單硬脂酸鋁或明膠)達成。
本發明醫藥組合物可依據此項技術中熟知且常規實踐之方法來 製備。參見例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.，第20版，2000；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。醫藥組合物較佳係於GMP條件下製造。通常，BMP6-結合抗體之治療上有效劑量或有效劑量係用於本發明醫藥組合物中。BMP6-結合抗體係藉由熟習此項技術者已知之習知方法調配成醫藥上可接受之劑型。劑量方案經調整以提供最佳所需反應(例如治療反應)。例如，可投與單次大劑量，可隨時間投與若干分次劑量或劑量可隨治療情況之緊急性指示來按比例減少或增加。尤其有利的是以單位劑型來調配非經腸組合物以易於投與及劑量之均勻性。如本文所用之單位劑型係指適於待治療個體之單位劑量的物理離散單元；各單位含有與所需醫藥載劑結合之經計算以產生所期望治療效果之活性化合物的預定量。
於本發明醫藥組合物中之活性成分之實際劑量程度可經改變以便獲得在對患者無毒之情況下，針對特定患者、組合物及投與模式有效達成所需治療反應之活性成分的量。選定之劑量程度取決於包括以下之多種藥代動力學因素：所用之本發明特定組合物、或其酯、鹽或醯胺之活性、投藥途徑、投藥時間、所用之特定化合物之排泄速率、治療之持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、經治療之患者的年齡、性別、重量、病況、一般健康及先前病史及類似因素。
醫生或獸醫可在低於達成所期望治療效果所需之程度下開始用於醫藥組合物中之本發明抗體及其抗原結合片段的劑量且逐漸增加劑量直到達成所期望效果。一般而言，針對治療本文所述之過敏炎症性疾病，本發明組合物之有效劑量端視許多不同因素而變化，包括投藥之方式、靶位點、患者之生理狀態、患者是否係人類或動物、投與之 其他藥物及治療是否係預防性或治療性的。治療劑量需經滴定以最佳化安全性及療效。針對抗體之全身投與，劑量範圍係於約0.0001至100mg/kg，及更通常0.01至15mg/kg之主體體重內。例示性治療方案必需每兩週一次或1個月一次或每3至6個月一次全身投與。針對抗體之玻璃體腔內投與，劑量範圍係於約0.0001至約10mg內。例示性治療方案必需每兩週一次或1個月一次或每3至6個月一次全身投與。
抗體係通常於多種情況下進行投與。於單次劑量間之間隔可係每週、每月或每年。如藉由測量患者之BMP6-結合抗體之血液含量所指示，間隔亦可係無規律的。於全身投與之一些方法中，劑量經調整以達成1至1000μg/ml之血漿抗體濃度及於一些方法中25至500μg/ml。或者，抗體可作為持續釋放調配物投與，於此情況下需要較低頻率之投與。劑量及頻率端視抗體於患者中之半衰期而變化。一般而言，人源化抗體比嵌合抗體及非人類抗體顯示較長半衰期。投與之劑量及頻率可端視治療是否係預防性或治療性的而變化。於預防性應用中，相對低劑量係於一段長時間內以相對不頻繁間隔投與。一些患者餘生繼續接受治療。於治療性應用中，有時需要於相對短間隔下之相對高劑量直到疾病之進展減輕或終止，及較佳直到患者顯示部分或完全改善疾病的症狀。其後，患者可投與預防性方案。
於一具體實施例中，包括本發明抗體或抗原結合片段之組合物係以於0.001mg/kg與0.1mg/kg之間的劑量(抗體或其抗原結合片段)投與。於一具體實施例中，包括本發明抗體或抗原結合片段之組合物係於以約0.001mg/kg與約0.1mg/kg之間的劑量投與。於一具體實施例中，包括本發明抗體或抗原結合片段之組合物係以以下劑量投與：0.001mg/kg、0.0016mg/kg、0.0025mg/kg、0.0040mg/kg、0.0063mg/kg、0.01mg/kg、0.016mg/kg、0.025mg/kg、0.040mg/kg、0.063mg/kg、或0.1mg/kg。於一具體實施例中，包括本發明抗體或抗原結 合片段之組合物係以以下劑量投與：約0.001mg/kg、約0.0016mg/kg、約0.0025mg/kg、約0.0040mg/kg、約0.0063mg/kg、約0.01mg/kg、約0.016mg/kg、約0.025mg/kg、約0.040mg/kg、約0.063mg/kg、或約0.1mg/kg。於一實施例中，包括本發明抗體或抗原結合片段之組合物係以包括例如以上引述之任何劑量靜脈內投與。於實施例中，靜脈內投與係靜脈內輸注。於實施例中，輸注於30至60分鐘內進行。於實施例中，輸注於約30至60分鐘內進行。
實例
提供以下實例以進一步闡明本發明但不限制其範疇。本發明之其他變型對於一般技術者而言將顯而易見且涵蓋於隨附專利申請範圍中。
實例1
該等實例尤其描述抗體3、5、6及7。
此描述此等及親代抗體之間的關係：
Figure 104142804-A0305-02-0117-12
所有純系係人類IgG1抗體。
Figure 104142804-A0305-02-0117-13
Figure 104142804-A0305-02-0118-14
Figure 104142804-A0305-02-0119-15
概述
於此工作中，吾人已藉由應用使用人類噬菌體顯示庫之噬菌體 顯示成功地確定特異性抗-人類BMP6抗體。
引言
貧血係於慢性腎病(CKD)患者中普遍存在及係與較低生活品質及較高不良結果(包括心血管疾病及死亡)之風險相關。
BMP6抗體之目標係藉由同時增加血紅素並減少對紅血球生成刺激劑(諸如促紅血球生成素及靜脈內鐵)之需求來作為降鐵調節素療法以有益於限鐵性貧血患者。降鐵調節素劑可係用於改善此患者群體中之ESA-低反應性貧血及以其他形式之藉由鐵限制表徵的慢性疾病貧血(ACD)的有效策略。
該方案之總體目標係確定及開發能夠降低鐵調節素含量之抗BMP6抗體，並因此藉由減少對紅血球生成刺激劑(ESA)之需求來有益於限鐵性貧血患者。於此工作中，吾人應用噬菌體顯示來確定BMP6特異性結合劑。
較佳BMP6抗體滿足大部分或所有以下所列之標準：Fab片段對人類BMP6之解離常數(KD值)低於1nM。
對獼猴BMP6抗原之KD值比針對人類BMP6之KD值弱不超過5倍。
對小鼠BMP6抗原之KD值比針對人類BMP6之KD值弱不超過5倍。
針對人類BMP6相對人類BMP5及人類BMP7之選擇性具有大於100倍的差異。
於HEP3B-BRE-Luc報導基因測定中，結合並中和BMP6訊號活性之能力。穩定地經BRE2-luc2報導基因轉染之HEP3B細胞可經hBMP蛋白質(R&D)誘導及用抗-BMP6抗體處理。BrightGlo測定係處理24h後進行。
於肝細胞系及初代人類肝細胞中抑制BMP6誘導之鐵調節素表現的能力。
低到中等可顯影性風險。一種最終抗體形式為人類IgG1。
抗體係使用如先前所述之市售噬菌體顯示庫(Knappik等人，2000 J.Mol.Biol.296：57-86,Prassler等人，2011 J.Mol.Biol.413：261-278)生成並採用顯示於噬菌體表面上之Fab的技術(Rothe等人，2008 J.Mol.Biol.376：1182-1200)。對自R&D Systems之hBMP6進行淘選及初始ELISA篩選。蛋白質結合命中之ELISA篩選導致識別hBMP6-特異性結合劑。抗體Fab片段係進一步針對與小鼠BMP6同源之物種交叉反應性並測定其針對人類BMP6之結合親和力進行表徵。Fab之特異性亦於ELISA中使用hBMP2、hBMP5及hBMP7蛋白質來核檢。Fab之BMP6-特異性活性亦於報導基因測定中進行評估。
基於此初始表徵，若干純系經轉化為人類IgG1形式且使用相同結合、特異性及活性測定來表徵。此功能表徵之結果組合由可顯影性評估所產生之曲線導致選擇3種用於親和力成熟之純系(NOV0429、NOV0441及NOV0442)。
將純系於其LCDR3內或於其HCDR2內隨機化，每個親代純系產生2種新穎Fab庫。使用來自Peprotech之hBMP6進行固相篩選，以及使用來自Peprotech之隨機生物素化hBMP6進行液相淘選。大腸桿菌Fab溶胞產物之MSD-SET篩選組合對hBMP5及hBMP7蛋白質之特異性ELISA導致識別相較於親代純系具有經改良之親和力的hBMP6-特異性結合劑。然後將此等經改良之衍生物轉化成人類IgG1形式及進一步於ELISA及RGA中表徵以評估其hBMP6-特異性活性。
選擇18種具有所需性質及良好可顯影性曲線之成熟抗體純系以改造(潛在PTM位點的移除及生殖系化)。28種所得變體係作為於微尺度表現中之hIgG1產生及如先前所述進行表徵。
此功能表徵之結果組合由可顯影性評估所產生之曲線導致選擇前導候選。
對直接塗覆之抗原之ELISA篩選
使用ELISA篩選，單一Fab純系係自針對結合靶抗原之淘選運輸中確定。使用含有Fab之大腸桿菌粗溶胞產物來測試Fab片段(參見第2.3.3節)。
初級篩選係使用經1.5μg/mL之濃度之hBMP6_RD於50mM檸檬酸鹽緩衝液pH 4.7中，在4℃下過夜塗覆的Maxisorp 384孔板進行。
初級命中之第二篩選係針對特異性核檢使用塗覆hBMP6_RD(1.5μg/mL含於50mM檸檬酸鹽緩衝液pH 4.7)之Maxisorp 96孔板，以及塗覆hBMP7(3μg/mL含於50mM檸檬酸鹽緩衝液pH 4.7)之Maxisorb 96孔板進行。
清洗後，板係用含於PBS之5%脫脂乳阻斷2h。添加含Fab之大腸桿菌溶胞產物及允許在RT下結合2h。為偵測結合之Fab片段，用TBST清洗板5次並以1/5000稀釋添加AP-抗人類F(ab')2抗體。於RT下培養2h後，用TBST清洗板5次並根據製造商說明書添加AttoPhos底物。添加底物10分鐘後，於ELISA讀數器中讀取板。
親和力成熟後之SET篩選
原則上如下述進行親和力分選。針對藉由基於由(Haenel等人，2005)描述之原理的溶液平衡滴定法分選成熟結合劑，將恆定量之經稀釋之BEL提取物用不同濃度之抗原平衡過夜。
然後將混合物轉移至先前已塗覆抗原之MSD板，及培養及清洗後，添加合適MSD-Sulfo-標籤標記之偵測抗體。
隨後，未結合Fab之濃度係經由ECL偵測使用Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD,USA)定量。
使用XLfit(IDBS)軟體，應用相應擬合模型(第2.6.2.2節)處理結果以估計親和力及因此確定由親和力成熟改良最多之純系。
活體外測定法
藉由ELISA評估選擇性及交叉反應性
為了測定抗-BMP6抗體之物種交叉反應性，將重組人類及小鼠BMP6蛋白質結合至板及抗體結合重組蛋白質之能力係藉由ELISA測定。為了評估選擇性，結合最接近同源物人類BMP5及BMP7之能力亦經評估。
將抗原試劑藉由以3至5μg/mL直接固定，於4℃下過夜而塗覆至ELISA板。將hBMP6(Peprotech)於50mM Tris pH 8.0中稀釋以塗覆。將hBMP6、mBMP6及hBMP5(R&D System)於50mM檸檬酸鹽緩衝液pH 4.7中稀釋。將hBMP7(Peprotech)於50mM檸檬酸鹽緩衝液pH 4.7中稀釋。作為不相關抗原，hDKK1-His係以含於PBS中之5μg/mL塗覆。
第二天，丟棄抗原溶液並用100uL TBST清洗板3次。隨後用含於TBST中之100uL 5%乳在RT下阻斷每塊板2h。於隨後實驗中，阻斷係用100uL之Superblock阻斷緩衝液進行。
於用100uL TBST清洗板3次後，分別用以1uM及0.2uM之濃度的40uL經純化之Fab或IgG樣本(於PBST緩衝液中)培養每個抗原。
於RT下培養2h後，將板再次清洗3次及藉由添加40uL 1：5000稀釋之第二AP共軛抗-人類IgG F(ab2)抗體來偵測結合的Fab/IgG。於RT下1h後，藉由根據製造商之方案添加40uL AttoPhos底物而顯影訊號及立即使用430nm之激發波長及535nm之發射波長以ELISA板讀數器來分析板。
親和力評估
ELISA結合曲線
將hBMP6(Peprotech)抗原藉由於50mM Tris緩衝液pH 8.0中以1.5μg/mL直接固定並於4℃下培養過夜來塗覆至ELISA板。第二天，棄除抗原溶液及用100uL TBST清洗板3次。然後將每個孔用含於TBST中之100uL 5%乳在RT下阻斷2h。於隨後實驗中，使用Superblock阻斷 緩衝液進行阻斷。
於用100uL TBST清洗板3次後，用30uL經純化之Fab或IgG樣本稀釋系列(針對Fab含於PBST中始自1uM至0.03nM，針對IgG含於PBST中始自0.5uM至0.01nM)培養抗原。
於RT下培養2h後，再次清洗板3次及藉由添加30uL 1：5000稀釋之第二AP共軛抗-人類IgG F(ab2)抗體來偵測結合的Fab/IgG。於RT下1h後，藉由根據製造商之方案添加30uL AttoPhos底物而顯影訊號及立即使用430nm之激發波長及535nm之發射波長以ELISA板讀數器來分析板。
使用Sector Imager 6000(MSD)之用於K D 測定的溶液平衡滴定(SET)方法
溶液中之親和力測定基本上係如文獻(Friquet等人，1985)中所述般進行。為了改良SET方法之靈敏性及精確度，其係自經典ELISA轉變成ECL-基技術(Haenel等人，2005)。
將1mg/mL山羊抗-人類IgG(Fab)2片段特異性抗體根據製造商之說明用MSD Sulfo-TAGTM NHS-Ester(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD,USA)標記。
該等實驗係於聚丙烯微量滴定板中進行且含有0.5%(w/v)BSA及0.02%(v/v)Tween 20之PBS作為測定緩衝液。未標記之抗原係以2n系列稀釋，以至少10倍高於所期望KD之濃度開始。無抗原之孔係用於測定Bmax值；僅含測定緩衝液之孔係用於測定背景。於添加適量之結合劑(抗體濃度類似於或低於所期望KD，60μL最終體積)後，將混合物於RT下培養過夜。
將MSD板用抗原(30μL/孔)塗覆。於用含0.05%(v/v)Tween20之PBS清洗板後，將經平衡之樣本轉移至彼等板(30μL/孔)並培養20min。於清洗後，添加30μL/孔之MSD-Sulfo-標籤標記之偵測抗體(抗- 人類(Fab)2，最終稀釋通常為1：2000)至MSD板中並於RT下，在微量離心振動器(700rpm)上培養30min。
於清洗MSD板及添加30μL/孔之具有表面活性劑的MSD讀取緩衝液T後，使用Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD,USA)偵測電化學發光訊號。
應用定制擬合模型，用XLfit(IDBS)軟體評估資料。針對Fab分子之KD測定，使用以下擬合模型(根據(Haenel等人，2005)，根據(Abraham等人，1996)修正)：
Figure 104142804-A0305-02-0125-16
[Fab]t：應用之總Fab濃度
x：應用之總可溶性抗原濃度(結合位點)
Bmax：無抗原Fab之最大訊號
KD：親和力
針對IgG分子之KD測定，使用以下針對IgG之擬合模型(根據(Piehler等人，1997)修正)：
Figure 104142804-A0305-02-0125-17
[IgG]：應用之總IgG濃度
x：應用之總可溶性抗原濃度(結合位點)
Bmax：無抗原IgG之最大訊號
KD：親和力
實驗設置
Fab之KD測定基本上係如下進行：將MSD板用10uL/孔之以含於10mM Tris緩衝液pH 8中之1至3μg/mL的hBMP6，在4℃下過夜來塗 覆。隨後，將板用含5% BSA之PBS阻斷1h。hBMP6抗原係用於滴定游離Fab片段。將抗原儲備溶液於10mM Tris緩衝液pH 8中預稀釋1：40至475nM，然後用測定緩衝液調整至用於滴定之所希望起始濃度。
ForteBio Octet動力學測量
藉由測定動力學參數之親和力評估係經由生物層干涉量度技術進行。
使用鏈黴親和素浸劑(Streptavidin Dip)及讀取生物感測器來測量經純化之Fab樣本。將板置於Octet QK儀器(ForteBio)中及允許於恆溫室中平衡至25℃。藉由將感測器置於含15μg/mL生物素化之hBMP6抗原之孔中600s而引發運行。然後將感測器置於含0、200、400、800、1600nM經純化之Fab樣本的孔中。0nM Fab濃度係用於背景測定。藉由全部於電腦控制下，在每800s之時間下測量層厚度(以奈米(nm)為單位)之變化而記錄各Fab締合及解離。使用Octet用戶軟體版本3.0自動處理資料。
Biacore動力學測量
測量係使用經純化之Fab及IgG樣本，及人類BMP6及BMP7抗原來進行。
藉由ELISA之抗原決定基分級
進行藉由競爭ELISA之抗原決定基分級以將抗體分類為相同或顯著重疊抗原決定基組(即能夠抑制彼此結合之抗體)。
將20uL以含於PBS中之66nM的抗-BMP6 IgG塗覆至Maxisorp 384-孔板。將板於4℃下培養過夜。於用TBST清洗2次後，用100uL/孔之Superblock阻斷緩衝液於RT下阻斷板2.5h，然後用TBST清洗2次。
於板阻斷期間，將含於PBST中之66nM的Peprotech hBMP6與含於PBST中之300nM的經純化之抗-BMP6 Fab(Flag-His標記)在微量離 心管中預混合(混合物之最終濃度經提及)。於RT下培養2h後，將20uL預混合之hBMP6/Fab添加至經阻斷之經抗-BMP6 IgG塗覆的孔中，根據板佈局及於RT下培養最多20min。
將板用TBST清洗4次並將於PBST中稀釋1/1000之抗-His6-POD抗體共軛物添加至板中。於RT下培養1h後，將板用TBST清洗5次。將化學發光ELISA底物溶液添加至每個孔中，及使用Tecan板讀取器在無培養時間下讀取發光。
於報導基因測定(RGA)中之活體外效能
抗體純系係作為經純化之Fab片段及/或IgG樣本於報導基因測定(RGA)中進行測試。
簡而言之，將HEP3B肝癌細胞系穩定地經pGL4-BRE2-Luc2慢病毒載體轉染，該載體於驅動螢火蟲螢光素酶之啟動子中含有BMP-反應元件BRE。自R&D System之BMP蛋白質係用於誘導訊號。處理24h後進行BrightGlo測定。
脫靶活性之評估
Progen UNIchip® AV-VAR EP含有384種於大腸桿菌中表現為N-端His-標籤融合蛋白質之經純化之細胞外或分泌蛋白。
用抗-hBMP6抗體以5μg/mL培養後，藉由使用DyLight649共軛之F(ab’)2-山羊抗hIgG F(ab’)2片段特異性抗體來偵測結合之抗體。內部對照hIgG之訊號設置為100%；脫靶活性標準化為hIgG；當訊號等於或高於4%(截止對應於於背景上測量之m+3)時命中經認為陽性。
小鼠模型之活體內療效
抗體5、抗體6及抗體7純化之抗體已於ESA-耐藥性貧血小鼠模型中進行測試。
結果
抗-BMP6抗體之表徵
經改造之IgG之特異性評估
將28種抗-hBMP6改造之IgG(生殖系化及PTM移除)於微尺度下產生及以0.2uM濃度於特異性ELISA中進行測試。
選擇相較於未經改造之成熟純系，保留與其他BMP蛋白質的受限交叉反應性及與hBMP6之強親和力的經改造之變體以供進一步表徵。
．所有NOV0429改造之IgG變體顯示高度增加之與BSA的非特異性結合。
．NOV0441改造之IgG變體相較於其成熟親代顯示略增加與hBMP5之交叉反應性。
．NOV0442改造之IgG變體保留其與hBMP7及hBMP5的受限交叉反應性。
Figure 104142804-A0305-02-0128-22
Figure 104142804-A0305-02-0129-23
報導基因測定(RGA)中之活性
如先前所述，測試28種微尺度產生之抗-hBMP6改造之IgG(生殖系化及PTM移除)。結果係匯總於表3中。
．NOV0429改造之IgG變體顯示3至5倍改良之BMP6活性，然作為回報獲得與所有其他BMP之對抗活性。
．NOV0441改造之IgG變體獲得與所有三種其他BMP之一些交叉反應性。
．NOV0442改造之IgG變體顯示經改良之BMP-活性，但是亦顯示以25μg/ml之最高濃度一定程度抑制BMP7-誘導之系統。
表3.於RGA中經改造之IgG抗體純系的活性；IC 50 值係以(μg/mL)為單位。選擇NOV0951、NOV0954及NOV0958作為前導抗體。
Figure 104142804-A0305-02-0130-151
可顯影性評估S-DAS 3
於生殖系化及PTM移除後，使18種成熟純系的23種抗-hBMP6改造之變體接受第三可顯影性評估。
發現除2個純系(NOV0429之HCDR2衍生物NOV0942；NOV0441之LCDR3-衍生物NOV0944)由於高聚集程度而顯示高風險外，抗體具有有利的風險可顯影性曲線。
由於其其生產率效價，2個其他純系(NOV0957及NOV0960，NOV0442親代抗體之HCDR2-衍生物)係用中等風險曲線來標記。
Figure 104142804-A0305-02-0131-25
關鍵PTM基序
是 建議移除之PTM基序(NG、NS、DG、N-Glyc、Cys、H-N30X)針對歸因於理化性質之可顯影性的總風險
低 低風險
中 中等風險
高 高風險；建議-不要以此候選物繼續進行，此候選物不滿足通用DAS標準
聚集
低 IgG之單體含量係至少95%
中 IgG之單體含量係於90與95%之間
高 IgG之單體含量係低於90%；此候選物不滿足通用DAS標準(
Figure 104142804-A0305-02-0131-152
90%)
生產率
低 於瞬時表現系統中之IgG之生產率係至少10mg/L
中 於瞬時表現系統中之IgG之生產率係於5與10mg/L之間
高 於瞬時表現系統中之IgG之生產率係低於5mg/L；此候選物不滿足通用DAS標準(
Figure 104142804-A0305-02-0132-153
5mg/L)
pI
Figure 104142804-A0305-02-0132-154
8.2
<8.2；表明特定風險；可能出現聚集/調配問題
Tm(pH 7.4)
Figure 104142804-A0305-02-0132-155
68℃
<68℃；表明穩定性之特定風險；可能出現聚集/調配問題
疏水性
Figure 104142804-A0305-02-0132-156
0.8M(NH 4 ) 2 SO 4
<0.8M(NH 4 ) 2 SO 4 ；表明針對可能出現聚集/調配問題、高黏度、沉澱之特定風險
脫靶活性之評估
3個前導候選NOV0951、NOV0954及NOV0958係作為經純化之hIgG1來測試於塗覆上述之384種經純化之細胞外或分泌蛋白之Protagen UNIchip上的脫靶結合。其全部允許低脫靶活性(
Figure 104142804-A0305-02-0132-157
10命中)，其可視為沒有問題。
Figure 104142804-A0305-02-0132-26
前導及備份抗體之選擇
基於RGA中之蛋白質結合資料、活性及特異性資料以及可顯影 性評估，決定選擇經改造之候選NOV0951、NOV0954及NOV0958作為前導抗體。此外，相較於抗體抗體676，其全部顯示針對hBMP6之特異性的卓越窗口。經改造之候選NOV0961、NOV0943、NOV0945被視為係備份抗體。表6概括最終候選之家族樹。
Figure 104142804-A0305-02-0133-27
結果與討論
此項目之目標係揭示抑制BMP6訊號之抗體及因此適於治療慢性疾病貧血。
因此，應用3種基於不同蛋白質之淘選策略。初級ELISA命中主要係自固相淘選池中發現，然而於RGA中之活性測試後，12種抗體顯示抑制hBMP6-訊號。衍生自淘選子代碼2023.5之3種抗體純系(NOV0429、NOV0441及NOV0442)顯示BMP6-特異活性及良好可顯影性質，及因此選擇用於親和力成熟。
針對每個抗體純系生成2個庫，其或LCDR3或HCDR2隨機化。應用3個不同成熟淘選策略。於SET篩選、特異性ELISA及測序後，發現18種成熟抗體純系於RGA中特異性抑制BMP6訊號及選擇用於改造。
來自NOV0442家族之成熟純系接受於LCDR2中之潛在去醯胺化位點的移除、框架修復及生殖系化。此導致抗體NOV0951、 NOV0954、NOV0958及NOV0961，其顯示具有與其各自非突變成熟親代類似的結合性質。
來自NOV0441家族之成熟純系接受生殖系化，其導致抗體NOV0943、NOV0945及NOV0946，其顯示相較於其各自非突變成熟親代具有增加之與BMP5的交叉反應性。
基於其在與其他BMP蛋白質的受限交叉反應性下抑制BMP6-訊號之能力及其有利的可顯影性曲線，NOV0951、NOV0954及NOV0958係以較高量產生及遞送以進一步評估其作為EPO-耐藥性(限鐵)貧血之治療藥物的效用。ESA-耐藥性貧血小鼠模型係用於測定其活體內療效。
3種前導抗體NOV0951、NOV0954及NOV0958接受最終可顯影性評估。3種前導抗體之活體內適應性係藉由測定其於大鼠中之PK曲線來評估。
表7匯總滿足項目開始時限定之抗體需求的最終前導候選的性質。
Figure 104142804-A0305-02-0134-28
Figure 104142804-A0305-02-0135-29
實例2-抗-BMP6抗體之活體外及活體內活性、及PK/PD
材料
測試化合物係以~8mg/ml之濃度含於50mM檸檬酸鹽緩衝液、pH7.0，150mM NaCl中之抗體5、6及7(表8)並於動物投藥前於PBS中稀釋。使用雄性C56BL/6小鼠或斯普拉格-杜勒(Sprague Dawley)大鼠(表9)。
Figure 104142804-A0305-02-0135-30
Figure 104142804-A0305-02-0135-31
針對BMP報導基因測定，慢病毒載體經構造成於驅動衍生自pGL4-BRE2-Luc2之螢火蟲螢光素酶的啟動子中含有BMP反應元件BRE(Korchynskyi等人，2002.J.Biol.Chem.277：4882-91)。慢病毒載體係用於穩定轉染HEP3B肝癌細胞系。該細胞系係維持於具有10%胎牛血清、1%青黴素/鏈黴素及5μg/ml殺稻瘟菌素之EMEM中。重組人類BMP蛋白係自R&D System購得。
於60ml瓶中之流產布魯氏菌環測試抗原(品系1119-3)係自美國農業部動植物衛生檢查署，國家獸醫服務實驗室，Ames,Iowa購得。布魯氏菌環測試抗原含有含於石炭酸化緩衝液中之殺死染色流產布魯氏菌品系1119-3細胞之懸浮液。每個60mL瓶之濃度係大約109個粒子/ml。以以下方式清洗並製備5 X 109儲備液。首先，將60mL瓶自冰箱取出並完全混合。然後將500ml BA轉移至500mL離心瓶中。然後將此等用超速離心機以10,000rpm離心15分鐘。移除上清液並再懸浮於100mL PBS中，得到5 X 109個粒子/ml儲備液，其經等分並於-80℃下冷凍。
動物維護條件
於適應及研究時期期間，將動物群居地圈養於微隔離板實心底部籠中。動物係維持於如下之標準光週期下：於室溫21至23℃及濕度30至70%下，12小時暗，12小時光(亮燈：6：30 AM，關燈：6：30 PM)。於適應及研究時期期間，動物係可隨意(沒有限制地)得到齧齒動物飼料及水。
實驗條件
於BMP報導基因測定中測定抗體活性
於典型測定中，將0.6 X 104 BRE-Luc2 HEP3B細胞接種於384-孔板中之25ul除血清係減少至2%外的基本培養基中。第二天添加於PBS中稀釋之抗體，接著添加BMP6至10ng/ml之最終濃度。體積經無任何血清之EMEM培養基變為50ul，使得最終血清濃度1%。如計數器測定法，平行進行以BMP2/4/7之活化。根據製造商說明，使用Envision平板讀取器(PerkinElmer)，於抗體添加24小時後進行BrighGlo測定(Promega)。將數據計算為相較於藉由對照抗體之全報導活化每個抗體之抑制百分率。
大鼠中之單次劑量抗體藥代動力學研究
大鼠PK分流研究係不希望以限定統計確定性測定經典PK參數，而是提供測試抗體之血清半衰期的評估。對3種動物注射抗體之單次IV劑量。
針對小鼠劑量反應PK/PD研究，將動物分為2個相等數量之單獨小組。每個小組包括經媒劑及經化合物處理之小鼠。於注射抗體後，一個小組係在第2、4天接受分析而第二小組係在第6、8天分析。分離小組之原因係減少對連續出血之需求，使得對血清鐵參數的影響保持最小。動物組係顯示於表10中。
Figure 104142804-A0305-02-0137-32
小鼠之發炎貧血的確立及治療處理
以以下方式製備用於注射之5 X 108 BA粒子(針對10個小鼠之實例)。因為將注射200μl/小鼠，故起始濃度需要為2.5 X 109個粒子/ml。使用PBS稀釋儲備液2倍。例如，需要10個小鼠×0.200μl=2ml+20%平均=2.2mL 2.5 X 109粒子/ml。1.1ml BA儲備液+1.1mL PBS。顯示於ESA處理前投與BA 1至8天導致6至7天後遲鈍之HGB反應。
對C57BL/6小鼠注射BA(3 X 108個粒子/小鼠)及血清IL6含量係藉由ELISA(KMC0061,Life Technologies)在5小時後測量以確定發炎反應。研究中排除IL6濃度低於針對所有BA-處理之動物之平均值的95%置信區間的動物，導致一些組少於5至6個小鼠。進行此排除過程以減少藉由包括沒有足夠發炎以使ESA反應遲鈍之動物所產生之假陽性結果的可能性。於排除過程後，小鼠於第6天經IV注射如所指示之抗體，及相對於BA處理在第7天以100mg/kg投與EPO(100g/kg皮下達貝泊汀α(darbepoetin alfa)，Amgen)。對ESA及抗體治療之反應係於6天後測量。
藥代動力學、藥效動力學及療效終點之分析
針對小鼠及大鼠PK/PD研究，於抗體注射後之指定時間點處收集血清樣本。血清之等分試樣係用於經由具有生物素化抗人類IgG作為初級捕獲抗體之自動化高通量免疫測定系統(Gyros)測定循環抗體濃度。各樣本之第二血清等分試樣係用於定量比色鐵測定(Quntichrom,DIFE-250,Bioassay Systems)。第三等分試樣經加工用於大鼠或小鼠鐵調節素-25肽之LC-MS定量分析，即在前述之修飾程序後。Li等人，2009.J.Pharm.Tox.Meth.59：171-80。
針對BA-誘導之貧血及抗體治療研究，於EDTA塗覆之BD Microtainer管中之最終出血係於經由心臟穿刺之終端處獲得。全血用於XT-2000iV血液分析儀上之完全血液計數分析。療效終點包括HGB、HCT、RETA及RET-HE。
統計分析
邦費羅尼(Bonferroni)事後試驗後進行單因數方差分析(ANOVA)以分析於血液學參數中之組間差異(其中p<0.05被視為顯著)。數據係報導為平均值±SEM。
結果
於細胞BMP-依賴性轉綠測定中之BMP6拮抗劑抗體之生物活性
所有三種BMP6拮抗劑抗體5、6及7完全抑制於人類肝癌細胞系Hep3B中之重組人類BMP6誘導之BMP報導子(BRE-luc)活性的生物活性(IC50=0.4nM，針對0.3nM rhBMP6)及因此係於1：1 Ag/mAb莫耳比或更佳下具活性。抗體證實對相關BMP家族蛋白質(包括BMP2、5及7)以500倍或更大之窗口之良好選擇性。參見圖1。
大鼠之BMP6拮抗劑抗體之快照藥代動力學及藥效動力學曲線
於斯普拉格-杜勒大鼠中之單次劑量分流藥代動力學研究係針對BMP6抗體5、6及7經由頸靜脈導管以10mg/kg體重之IV注射來進行。比較具有標準曲線之三種抗體於血清中之總抗體濃度與時間的關係(尤其t1/2、MRT)，顯示特徵與典型人類IgG(參見圖2及表11)一致。不存在靶介導之藥物傾向的證據。於此劑量下，所有BMP6抗體在注射後第1天時抑制血清鐵調節素至低於檢出程度。鐵調節素表現之持續強烈抑制直到第16天仍明顯，此表明活性的長持續時間。相應地，可於抗體注射後第2天觀察到循環鐵濃度之瞬時峰值出現且該等含量維持升高直到第16天。
血清抗體濃度係於單抗體注射後之時間內測量。樣本係於給藥(10mg/kg，IV)後1hr、6hr、1、2、4、8、16、28天收集。
Figure 104142804-A0305-02-0139-33
同樣，抗體7(游離及BMP6-結合二者)之總血清濃度係於單次IV注射抗體7(於大鼠中，以10、3、1、0.3、0.1及0.03mg/kg之劑量；於猴中以3mg/kg之劑量)後的大鼠及食蟹猴中，在指定時間藉由ELISA 測量，其中大鼠之LLOQ為46ng/mL(虛線)及猴之LLOQ為0.2μg/mL(虛線)。結果係顯示於圖9(大鼠)及12(猴)中。
小鼠及食蟹猴於BMP6抗體處理後的血清鐵參數中之劑量依賴性反應
為了進一步定義針對BMP6抗體處理之鐵代謝的劑量依賴性反應，對天然C57BL/6小鼠注射如指示之0.02至0.5mg/kg範圍內的遞增劑量之抗體6。選擇抗體6為3種抗體之代表，此乃因其共享類似框架、齧齒動物PK曲線及活體外活性。0.5或0.1mg/kg之單次劑量顯著抑制血清鐵調節素及因此於處理後第2天增加血清鐵濃度。然而，於注射後長至8天觀察到僅於0.5mg/kg下對鐵代謝具有強烈維持效應。參見圖3。此等結果表明劑量依賴性、可飽和靶中和可使用強效BMP6拮抗劑抗體容易地達成。
參見圖3，BMP6抗體對鐵代謝之血清生物標記的劑量依賴性效應，上：於抗體6以指定劑量之單次IV注射後隨時間的血清hIgG濃度。下：左圖係於單次抗體6或對照人類IgG注射後之血清鐵調節素濃度的定量分析，而右圖係血清鐵濃度。
用抗體7進行類似實驗。於雄性斯普拉格-杜勒大鼠中測試藉由抗體7之循環血清鐵調節素之劑量及時間-依賴性抑制。於以0.03mg/kg至10mg/kg範圍內的劑量藉由IV注射投與抗體7之單劑量後，在給藥後0.25、1、2、6hr及1、2、4、7及14 d收集血清樣本。藉由LC/MS測量血清鐵調節素含量，其中LLOQ=9ng/mL。於相同動物中，亦測量血清鐵含量。結果報導於圖11中。
此等結果表明本發明抗-BMP6抗體能夠導致血清鐵之劑量依賴性增加。該等效應係穩健且於抗體投與後持續至少2週。
亦於食蟹猴中測試對於抗-BMP6抗體反應之血清鐵參數之效應。對雄性食蟹猴提供以3mg/kg劑量之單次靜脈內注射抗體7。於注射後 之指定天，收集血清樣本並分析總血清鐵(Fe)及鐵調節素濃度。結果係顯示於圖13中。呈現來自3隻個別動物之資料(相對給藥前基線含量繪製)。平均值係由「x」線指示。於抗體投與後24hr觀察到血清鐵增加及血清鐵調節素之抑制且直至28天研究結束該等效應保持(相對於給藥前含量)。此等結果表明本發明BMP6抗體強效誘導非人靈長類之鐵調節素表現及減少循環鐵濃度。
BMP6抗體對發炎驅動，ESA耐藥性貧血小鼠之紅血球參數之效應
進行實驗以評估發炎貧血小鼠模型中之抗-BMP6抗體之治療效用。參見圖4。用流產布魯氏菌抗原(BA)處理之小鼠於6天後發展出貧血。用於相隔一天時開始之抗-BMP6加上抗體重組促紅血球生成素(EPO)處理貧血動物，及第13天時相對於BA監測抗體治療對貧血進展之效應係。HGB及HCT值於開始處理與第13天之間減少，其對EPO單獨處理具有耐藥性。經組合之BMP6抗體與EPO處理有效地恢復EPO反應及顯著提高HGB及HCT含量。如藉由以RETA持續增加以及恢復網織紅血球血紅素含量所反映，此效應係與促紅血球生成素活性之伴隨刺激相關，這表明由於紅血球生成隔間中之功能性缺鐵而致之血紅素合成之糾正。
參見圖4，於ESA-耐藥性發炎貧血之小鼠模型中BMP6抗體之治療處理。上：BA誘導之ESA-耐藥性發炎貧血模型的實驗方案。下：於BA處理後第13天之紅血球生成參數。HGB：血紅素；HCT：血容比；RETA：網織紅血球計數；RET-HE：網織紅血球血紅素當量。
* p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001，相對BA+EPO+hIgG1。
實例3-於人類中測試BMP6抗體之臨床計劃
臨床試驗計劃：使用結合人類BMP6之抗體或其抗原結合片段之治療的評估
具有晚期腎病(ESRD)之患者產生很少(若有的話)促紅血球生成素(EPO)且一般需要定期投與外源EPO及靜脈內(IV)輸注鐵而使EPO-誘導合成Hgb。多達三分之一的慢性血液透析(HD)患者對EPO沒有足夠反應，這主要係由於鐵之胞內螯合。鐵調節素主要係藉由腎臟清除，然藉由透析之移除係不足的。因此，慢性HD患者傾向於具有顯著提高之鐵調節素含量，其阻斷用於紅血球生成之鐵動員。一旦體內鐵儲備達到臨界含量(藉由高血清鐵蛋白含量指示)，則IV鐵劑治療係不再有效或推薦。當前指南推薦對具有高鐵蛋白含量之貧血透析患者反對提供IV鐵，及此等患者可能因此接受甚至更高EPO劑量，處於EPO低反應性貧血之潛在相關風險下(腎病改良整體結果(KDIGO)貧血工作小組2012)。EPO低反應性貧血賦予血液透析(Kilpatrick等人2008，Lopez-Gomez等人2008，Fukuma等人2012)及腹膜透析患者(Suttorp等人2013)之顯著增加之與貧血及較高EPO劑量二者相關之全因死亡率的風險。本發明結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段可藉由改良血紅素(Hgb)含量同時減少EPO及IV鐵劑量需求來有益於具有限鐵性貧血之慢性腎病患者。較低EPO耐藥性指數(EPO劑量對比Hgb含量之比率)係與較低死亡率風險相關。
綜上所述，使用本發明結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段治療之目標係動員螯合鐵，然後其可減少EPO及鐵劑量需求及改良Hgb含量，預期所有將改良患者結果。此係使用結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段之療法的初次人類單次劑量研究。此研究將評估慢性血液透析患者群體之安全性、耐受性、藥代動力學、藥效動力學及療效。此研究之目的係評估使用結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段的療法是否保證於與慢性腎病相關之貧血之進一步臨床發展。
調查計劃
研究設計
此係對結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段之初次人類兩部分單次劑量非驗證性研究以評估慢性血液透析患者群體之安全性、耐受性、PK、PD及療效。第1部分係初次人類單次劑量開放標籤劑量探索研究。第2部分係將比較結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段之兩劑量程度的隨機雙盲安慰劑對照單次劑量研究。
安全性評估將包括身體檢查、心電圖(ECG)、生命體徵、標準臨床實驗室評估(血液學、血液化學、血清鐵指數)不良事件及嚴重不良事件監測。
第1部分
第1部分之目的係(a)評估單次劑量安全性、PK、PD及耐受性及(b)測定結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段之最低PAD，該PAD定義為於第1部分中所測試導致於給藥後29天時Hgb之增加(自基線之中值變化為0.5g/dL)的最低劑量。
於第1部分期間，將進行篩選訪問，其中將確定患者參加研究之資格(圖6)。合格患者將接納到研究地點及於基線訪問期間重新評估合格標準。所有基線安全性評估結果必須係可用的且於給藥前審查。
圖6提供針對第1部分之研究設計的概述。患者將被要求於第1天抵達研究地點，直接接著對其進行例行透析訪問。然後患者將接受結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段(精確劑量將取決於小組)之輸注。若可能，則給藥應較佳於兩透析間天前的透析天(例如週五或週六)進行，及將於當天透析期後發生。然而，若不可能，則給藥可發生於不在前述之兩透析間天後的透析天。給藥後，於第1部分之前兩例患者將定居至少48小時以進行安全性及PK/PD評估。患者將於第4天及第6天返回研究地點以進行PK/PD評估，及然後持續共29天每週一次進行PK評估，及進行共12週每週一次的安全性評估，其中研 究結束訪問大約在第85天。包括除透析後PK評估外之所有實驗室測試的研究訪問應於患者預定透析訪問之前進行。
第1部分將以預測為無藥理活性之劑量起始。該劑量將如統計考慮部分所討論及圖7所顯示基於每個小組之於結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段之單次劑量後的Hgb的中值變化及轉鐵蛋白飽和度(TSAT)程度來對每個後續第1部分小組進行調整。本決策樹之目的係確定誘導鐵動員(如藉由於給藥一週後之6例患者小組中之至少4例患者中觀察到轉鐵蛋白飽和度(TSAT)程度>50%所指示)及增加Hgb之最低可行劑量。若於給藥後29天鐵被動員然Hgb沒有增加至少0.5g/dL，則臨床資料將經分析以評估潛在混雜因素(例如，由於過度非研究性放血所致之失血)。可適用之研究者及來自贊助者之代表將審查每個小組之不良事件並將在以下情境中評估此等事件：(a)與慢性腎衰竭相關聯之已知醫學問題及(b)非臨床毒理學發現。後續小組將不給藥直到研究者及贊助者表明繼續進行係安全的。
圖7提供用於調整第1部分中之劑量的算法。包括Hgb測量之血液處理將於透析前發生。起始劑量將為0.01mg/kg。於第1部分，患者將分配到各至多6例患者之至多6個開放標籤小組中的一組。如以上所定義之結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段之最低PAD將係第2部分所選擇的較低劑量組。如圖7所顯示，每個後續小組之劑量可經調整為更高或更低。若最低可行劑量(0.001mg/kg)導致Hgb之中值增加
Figure 104142804-A0305-02-0144-158
0.5g/dL，其將係最低PAD及第2部分所選擇之較低劑量及於第1部分所評估之下一最高劑量將係針對第2部分之較高劑量組。若於第1部分所評估之最高劑量(0.1mg/kg)係最低PAD，則第2部分將僅進行2組：安慰劑及最低PAD。於第1部分需要額外劑量小組的情況下，如本文中所述將添加此等小組。
每個第1部分將包括6例患者。第1部分之第一小組的首2例患者 將經至少隔7天給藥。後續第1部分小組患者劑量之時機將會因針對各自地點安排及保障資源係可行的而進行。將隨訪所有第1部分患者持續給藥後12週。
第2部分
第2部分之目的係(a)評估安全性、PK、PD及耐受性及(b)測定基於對單次劑量之結合人類BMP6之抗體對比安慰劑之反應的Hgb變化的療效。第2部分將包括至多3組：至多兩Ab劑量組及一安慰劑組(圖8)。兩Ab劑量組將衍生自第1部分所生成之資料。第2部分將包括大約60例患者，其隨機地以1：1：1分為三組。若於第1部分，最低PAD亦係所評估之最高劑量(0.1mg/kg)，則第2部分僅具有兩組：最低PAD及安慰劑。於此情況下，40例患者將隨機地以1：1之隨機比分為兩組。第2部分之樣本量可基於自第1部分中之Hgb基線的變化的可變性來調整。
圖8提供針對第2部分之研究設計。於第2部分期間，將進行篩選訪問，將確定患者參加研究之資格(圖8)。於基線訪問期間，按照合格標準對合格患者重新評估。所有基線安全性評估結果必須係可用的且於給藥前審查。
患者將被要求於第1天抵達研究地點，直接接著對其進行例行透析訪問。然後患者將接受如藉由隨機分配確定之Ab或安慰劑的輸注。若可能，則給藥應較佳於兩透析間天前的透析天(例如週五或週六)進行，及將於當天透析期後發生。然而，若不可能，則給藥可發生於不在前述兩透析間天後的透析天。患者將於第4天及第6天返回研究地點，然後每週一次進行隨訪評估。於隨訪期間患者將經歷例行安全性評估及PK資料亦將經收集85天。研究訪問可於患者預定透析訪問後進行以配合患者之透析日程。將隨訪於第2部分募集的所有患者持續於Ab(或安慰劑)之給藥後12週。
EPO劑量管理(兩部分)
於兩部分期間之個別EPO劑量調整將按護理理協定之每一透析地點的標準來管理。地點協定將作為地點評估之部分來審查，及將檢查用護理標準指南(針對慢性腎病貧血工作小組中之貧血之KDIGO臨床實踐指南2012)之順服性。於研究期間之任何時間點達成
Figure 104142804-A0305-02-0146-159
13g/dL之Hgb含量的患者可在研究者之判定下除管理超過目標含量之Hgb值的位點特異性指南外進行放血治療來管理。
靜脈內鐵管理(兩部分)
接受IV鐵劑之負載劑量(100mg/週)之患者將自研究排除。接受每週一次維護IV鐵(<100mg/週)之患者可包含於此研究中。每週一次維護IV鐵劑量將於Ab給藥之第1週的起始時保持。鐵指數將於Ab給藥後之第一週期間進行監測，及救援鐵劑治療及維護IV鐵劑管理將按照管理血液透析單位之協定遵循護理標準指南。地點協定將作為地點評估之部分來審查，及將檢查用護理標準指南(針對慢性腎病貧血工作小組中之貧血之KDIGO臨床實踐指南2012)之順服性。
研究設計之基本原理
兩部分研究設計之基本原理
於相同患者群體中之兩部分的基本原理係安全地及有效地確定最低PAD，旨在最小化曝露於潛在低於治療劑量之患者及小組的數量。第2部分將評估相較於安慰劑組最低PAD，及高於最低PAD之一劑量程度(如第1部分中所測定)之療效。
第1部分經設計以評估於開放標籤研究中Ab之單次劑量安全性、耐受性、PK/PD以及最低PAD。最低PAD將基於Ab給藥後第29天每個劑量小組之Hgb中值變化來測定。PAD測定標準之基本原理係對EPO之臨床有意義的反應可能需要EPO劑量變化後長至4週。若Ab動員目標群體中之鐵，則可能使患者當前EPO劑量發揮更強大的促紅血球生 成作用。列於PAD測定標準中之29天Hgb範圍係基於對EPO劑量反應之Hgb之增加(~0.5g/dL，29天內)的臨床顯著及安全速率。針對尋求最低PAD而不是最大效應之基本原理係過度強大之Hgb反應係此患者群體中之安全性風險，如藉由於當前護理標準指南(腎病改良整體結果(KDIGO)貧血工作小組2012)之目標Hgb範圍所反映。於第1部分之安全性及耐受性評估之目標係(a)確定安全性訊號，及(b)報告劑量調整決策，確保針對第2部分所選擇之劑量(最低PAD+1較高劑量)係適於進一步評估相對於安慰劑之安全性及療效。雖然第1部分不足以提供無偏安全性評估，但於第2部分之安慰劑組及較大樣本量將能夠於最低PAD及一較高劑量下進行無偏安全性評估。除安全性、耐受性及PK/PD外，第2部分經設計以於雙盲研究中評估對比安慰劑之療效。療效評估將主要係基於Hgb，其中EPO耐藥性指數(ERI=每週一次體重調整之EPO劑量除以Hgb)作為關鍵第二終點。ERI提供達成給定Hgb值所需EPO之量的定量量度，及因此提供除單獨Hgb外臨床上重要資訊。
於透析患者中之FIH的基本原理
初次人類(FIH)研究將於慢性血液透析(HD)患者而不是健康志願者(HV)中進行。HV中對抗-人類BMP6 Ab反應之安全性、耐受性及PK/PD之評估係由於以下幾個原因可能不能轉至慢性HD患者：與HV不同，具有貧血、高血清鐵蛋白及低TSAT之慢性HD患者具有慢性累積之細胞內鐵儲備。因此，與對低劑量之Ab反應的鐵動員相關之安全性、耐受性及藥理效應最適宜係於慢性HD患者中進行評估。於具有正常腎功能之HV中，鐵調節素(BMP6係其之關鍵調控因子)係藉由腎臟過濾及係有效地排泄於尿液中，從而導致低循環含量。相比之下，於慢性HD患者中，鐵調節素係藉由透析較低效或瞬時地過濾，從而導致較高循環含量(Zaritsky等人2010)。還有，正常腎臟將 動態地調整內源性EPO含量及對Ab反應之Hgb之變化可能不明顯。因此，與藉由BMP6路徑調節鐵調節素相關的安全性及耐受性及Ab對Hgb之效應最合適於慢性HD患者中進行評估。
目標患者群體之基本原理
該研究經設計以於EPO低反應性限鐵性貧血情況下評估抗-人類BMP6 Ab。經建立之臨床指南(針對慢性腎病貧血工作小組中之貧血之KDIGO臨床實踐指南2012)定義EPO低反應性為需要兩次增加EPO劑量(上至穩定劑量以上50%)以維持穩定Hgb濃度。所提出之合格標準經設計以選擇具有貧血及鐵限制之臨床指標之穩定慢性HD患者：增加之鐵蛋白及低TSAT(TSAT=血清鐵/總鐵結合能力；TSAT與血清鐵非常密切相關)。還有，EPO及IV鐵劑量之調整將堅持針對Hgb、TSAT及鐵蛋白之護理目標的嚴格標準。此設計減少過調所需Hgb目標之風險，此乃因鐵及血液參數之變化將繼續按照護理標準管理所致。還有，於基線前1週內接受IV鐵之負載劑量的患者將排除。接受維護IV鐵之患者可包含(若滿足所有其他合格標準)。包括此等患者之基本原理係於美國之當前護理標準中規定Hgb及TSAT係維持於狹窄的範圍內，並因此出於滿足較低TSAT合格標準之目的完全取消維護鐵治療將使患者處在低於25%之TSAT的風險中，從而迫使按照護理標準進行一系列IV鐵負載劑量。然而，維護IV鐵之合格患者將具有於Ab給藥週開始時保持的每週一次的IV鐵劑量，並將僅基於監測之鐵指數，藉由地點護理標準協定所確定來恢復維護IV鐵治療。
治療之劑量/方案、持續時間的基本原理
起始劑量基本原理
最大推薦起始劑量(MRSD)係基於自對大鼠及食蟹猴進行之13週(14劑量)GLP毒理學研究的無不良影響量(NOAEL)來計算。動物接受每週一次0.1、1、10及100mg/kg之IV大劑量。1及100mg/kg劑量組 (僅)於結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段之末次劑量後係隨後跟縱大鼠16週或食蟹猴24週。MRSD係藉由首先計算針對自此等研究之NOAEL(0.1mg/kg)的人類等效劑量(HED)(一種被視為適於分子量>100kDa之藥物的方法)及隨後應用10的安全倍數以考慮非臨床物種與患者之間的差異(諸如儲備鐵之量及對紅血球生成之需求)來估算。針對非臨床物種之PK參數係自於IND支持之毒理學研究期間收集之毒性動力學(TK)資料推測。然後患者之相應PK參數係使用異速生長尺度來估算，及此等參數係用於預測針對給定劑量患者中之游離的結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段成時間的函數關係。比較患者之自毒理學研究之TK資料與基於模型之Ab PK表明，10倍低於NOAEL/HED之劑量經預測產生基於Ab濃度之(最小)10倍餘量。
於動物研究中觀察到之對Ab反應之血清鐵之最高含量可能低估對Ab反應之預測人類鐵，此乃因已投與IV鐵治療之HD患者可能比健康動物具有更高組織鐵儲備所致。然而，與健康非貧血動物不同，預期HD患者利用釋放之血清鐵進行紅血球生成；因此動物模型可能高估鐵升高之持續時間。於13週之研究中觀察到肝臟病理係不能於4週之研究中觀察到，表明毒性歸因於血清鐵之累積曝露而不是對鐵之急性釋放的反應。
為考慮非臨床物種與患者之間儲備鐵的預期差異，亦基於血清鐵濃度之基於模型的分析來預測MRSD。導致毒理學發現之血清鐵之累積曝露係表示為鐵曲線下面積(Fe AUC)。於此方法中，針對NOAEL劑量(0.1mg/kg)所計算之Fe AUC被認為係足夠安全的。然後預測患者的於所提出之MRSD下之Fe AUC並與在NOAEL下之非臨床物種的Fe AUC比較。由於患者的在MRSD下之模型預測之血清鐵曝露係比在NOAEL下之非臨床物種者小>10-倍，故乘以10之安全倍數減少NOAEL/HED被視為足夠用於估算MRSD。所提出之MRSD因此為 0.01mg/kg。
劑量調整基本原理
針對此研究，最大測試劑量(xmax)將係對應於每個2 IND-支持之毒理學研究中之NOAEL的HED：0.1mg/kg。最低可行測試劑量(xmin)係基於相容性研究之最低技術上可行劑量：0.001mg/kg。MRSD(x0)將根據安全性、TSAT及Hgb標準(圖7)評估。若x0導致相對於給藥前之Hgb的中值變化<0.5g/dL，則x+(圖7)之選擇將藉由於x0與xmax之間對自然對數刻度之線性外推(於S形劑量反應關係之預測下)來指導。針對此劑量增加之臨時劑量係於上文中提供。此等臨時劑量可基於在每小組之間的非正式中期分析期間之資料的審查而調整。此方法將繼續直到確定最低PAD或達到xmax。若xmax導致Hgb的中值變化<0.5g/dL，此等劑量之安全性將經評估及將做出基於安全性、PK及PD資料是否修改協定以添加於超過xmax之劑量下的額外小組之決策。若於第1部分測試之最高劑量導致Hgb的中值增加<0.5g/dL，TSAT增加不大於50%及劑量係低於xmax，則協定可經修改以添加額外小組。
若x0相反導致相對於給藥前之Hgb的中值變化
Figure 104142804-A0305-02-0150-161
0.5g/dL，則針對下一小組之劑量將經調整至xmin。若xmin亦導致Hgb的中值變化
Figure 104142804-A0305-02-0150-162
0.5g/dL，則xmin將被視為最低PAD，且xmin及x0將於第2部分進行評估。若xmin導致Hgb之中值變化<0.5g/dL及TSAT
Figure 104142804-A0305-02-0150-163
50%(圖7)，則劑量將係藉由於區間(xmin，x0)內之對自然對數刻度之線性外推來遞增直到確定最低PAD或直到已評估6個劑量(小組)。於區間(xmin，x0)內之臨時劑量係於上文中提供。此等臨時劑量可基於在每小組之間的非正式中期分析期間之資料的審查而調整。最低PAD將定義為導致相對於給藥前之Hgb的中值變化
Figure 104142804-A0305-02-0150-160
0.5g/dL的所測試之最小劑量。
Ab將經作為單劑量IV輸注來投與以確保血清鐵曝露(Fe AUC)小於與非臨床毒理學研究之不良發現相關者。Ab溶液將係於第1天之血 液透析期後立即輸注以最小化透析對PK或直接給藥後之鐵生物利用率之潛在影響。於透析後(僅於給藥天)之額外約30分鐘之給藥輸注預計不會對患者造成任何顯著風險或不適。
比較者之選擇的基本原理
安慰劑係用作第2部分之比較者以能夠無偏地評估臨床結果。
中期分析/設計調整之目的及時機
於第1部分中，於每小組之6例患者完成4週之給藥後評估後，將進行非正式中期分析以做出針對下一小組之劑量調整決策。安全性及PD標記將藉由包括可適用研究者及自贊助者之代表之劑量調整組之所有成員來審查。僅當於安全性及耐受性經確定及如圖7中所述般滿足PD條件時觸發新的小組。於第1部分存在至多5次非正式中期分析。於自第1部分之最後小組的所有患者完成4週給藥後評估後計劃正式中期分析以評估所研究劑量之臨床效應，及潛在觸發額外非臨床研究及可能報告後續臨床研究。將包括至於第1部分中進行之最後小組的第29天所收集的體溫、血壓、脈搏率、ECG評估、血液化學、血液學鐵指數、EPO耐藥性指數及不良事件。
將選擇最低PAD及高於最低PAD之劑量程度用於第2部分。若最低可能所測試之劑量誘導
Figure 104142804-A0305-02-0151-164
0.5g/dL之Hgb增加，則將選擇所測試之兩種最低劑量用於第2部分。
風險及效益
參加此研究之患者的潛在效益可包括於治療時間期間及一段時間以後減少之EPO及IV鐵需求及經改良之Hgb含量。
於此試驗中之患者的風險將藉由堅持合格標準，及投與Ab後之首個48小時對所有患者(及使於第1部分之前兩例患者定居)之密切臨床監測而最小化。
與鐵動員相關聯之潛在風險包括(a)鐵再分配至組織及器官(諸如 脾臟、肝臟、心臟、胰臟及垂體)，及(b)小幅增加之對細菌感染之易感性，尤其具有留置血管導管之患者。若干合格標準減少併發症之風險。可見肝功能測試的增加之程度與鐵再分配相關聯。肝功能將與血液學及鐵參數並行進行監測。Hgb目標之護理標準的過調可能導致紅血球增多症。可進行Hgb、EPO治療及鐵治療之管理。
已投與IV鐵治療之HD患者可具有比健康動物更高之組織鐵儲備；因此於經結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段治療之患者中觀察到之血清鐵的最高含量可能超過彼等於動物研究中所見者。然而，與健康動物不同，預期HD患者利用經釋放之血清鐵進行紅血球生成；因此動物模型可能高估鐵升高之持續時間。預期於MRSD下模型預測之對於Ab之曝露(例如，Cmax，AUC)比在NOAEL下之非臨床研究中所觀察到者低10倍。不期望此曝露會導致與於臨床前研究中所觀測到之肝臟中升高之肝轉胺酶及單細胞壞死相關聯之血清鐵曝露(AUC)程度。於所述安全性評估後，相對NOAEL之Ab劑量的增加將會發生。具有慢性鐵超載之患者以及彼等接受非經腸鐵者的臨床經驗可能不必要預測可自藉由Ab誘導之細胞內鐵的急性增加而發生的效應。因此Ab誘導之急性鐵毒性之潛在風險很可能係低的。急性鐵毒性可影響心臟、肝臟及/或胰臟。急性鐵毒性之臨床表現可包括心臟傳導缺陷、升高之肝轉胺酶及葡萄糖耐受不良/高血糖。嚴重急性鐵毒性亦可包括代謝性酸中毒、電解質紊亂及神經系統表現。於急性鐵毒性發生之情況下，患者可緊急地經鐵螯合治療(諸如與血液透析組合之去鐵胺)處理。134mL(第1部分)及172mL(第2部分)之最大量血液係計劃自作為研究之部分的每個患者於115天之時間內收集。用於監測任何安全性發現之另外樣本應係除此之外。據認為此不會係此群體之風險。
迄今為止未進行用抗-人類BMP6抗體之生殖毒性研究。對雄性或 雌性生殖器官之潛在效應已藉由於食蟹猴中之13週的毒性研究中的卵巢及睾丸及附生殖器官之仔細標準組織病理學檢查來評估。未觀察到治療相關效應。BMP6基因剔除小鼠顯示延遲之胸骨骨化及鐵超載(Meynard等人2009)。
顯著胎兒及產婦發病率及死亡率係與慢性血液透析相關聯。於一比較處於慢性血液透析之婦女(267例出生)與接受腎移植之婦女(264例出生)之回顧性小組研究中，處於血液透析之婦女證實胎盤早剝、輸血、早產兒、胎兒死亡及孕婦死亡率更高(Saliem等人2015)。因此，育齡婦女應使用高度有效的避孕以防止於結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段投與期間及最後劑量後之125天內懷孕。
群體
研究群體將係由需要至少兩次/週之慢性血液透析治療的晚期腎病患者，及具有功能缺鐵性貧血(定義為於明顯足夠鐵儲備之存在下如藉由鐵蛋白及轉鐵蛋白飽和度測定之貧血)的臨床證據者組成。第1部分包括評估最初於6小組中之至多36例患者(6例患者/小組)的計劃。若於6小組評估後，未見對TSAT及Hgb之效應，且不存在安全問題(如藉由可適用研究者及自贊助者之代表來確定)，則可添加至多2個額外6例患者小組(於第1部分共48例患者)。第2部分由至多3組(針對自第1部分之進一步評估所選擇之2個劑量程度及安慰劑組)組成，其中至多約20例患者/組(於第2部分中共60例患者)。因此，計劃募集共約96例患者(至多最大108例)，其中約60例將於第2部分隨機化。預期約60例患者(於第1部分中12例，於第2部分中48例)完成研究。研究者須確保經考慮用於研究之所有患者滿足以下合格標準。研究者不應應用額外標準以使研究群體將代表所有合格患者。
患者選擇係藉由通過於篩選及第一基線下之所有合格標準檢查而確立。合格標準之相關記錄(例如檢查表)必須以源碼文檔儲存於研 究地點處。
與任何進入標準之偏差排除患者募集入研究中。
納入標準(兩部分)
納入本研究中合格的患者必須滿足所有以下標準：
1.於進行任何評估之前，必須獲得書面知情同意書。若同意書不能以書面形式表現，須理想地經由獨立可信之證人的正式記錄及見證。
2.篩選時年齡
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18歲。
3.於篩選前依賴血液透析至少2個月。
4.針對晚期腎病接受充分血液透析至少2次/週；充分定義為於篩選前在大部分最近月度評估中Kt/V
Figure 104142804-A0305-02-0154-165
1.2。
5.按照透析地點之貧血管理協定接受慢性促紅血球生成素(EPO)治療。EPO劑量於基線前之14天期間不會增加50%或更多。EPO治療應僅係短效調配物(非達貝泊汀)及IV投與(非SC)。
6.Hgb
Figure 104142804-A0305-02-0154-167
8.5，包括Hgb
Figure 104142804-A0305-02-0154-168
8.5及<11.5g/dL，且於對比14天前之基線下不會增加
Figure 104142804-A0305-02-0154-170
0.5g/dL。
7.於基線前至少28天(可包括篩選)之鐵蛋白為200至2000ng/mL(包含)。
8.於基線前之90天期間之一時間點最小處TSAT
Figure 104142804-A0305-02-0154-169
30%，及於基線時TSAT
Figure 104142804-A0305-02-0154-171
30%。
排除標準(兩部分)
滿足任何以下標準之患者係不符合納入本研究。研究者無需應用額外排除以確保研究群體將代表所有合格患者。
1.於募集之5個半衰期內或直到預期藥理效應已回至基線時(以較長者為準)使用其他研究藥物。
2.對研究藥物或治療抗體有過敏症史。
3.已知診斷之血色沉著病。
4.已知之骨髓惡性腫瘤、淋巴惡性腫瘤或骨髓增生異常症候群。
5.篩選前2個月內透析AV瘺血栓病史，或篩選前6個月內2次或多次AV瘺血栓發作。
6.嚴重共患肝病/功能不全(Child-Pugh評分
Figure 104142804-A0305-02-0155-172
6)或肝移植之前。
7.心臟衰竭(紐約心臟協會(NYHA)功能III級或IV級)。
8.於過去2個月之篩選中需要干預之胃腸道出血。若滿足所有其他肝功能之合格標準，則可包括具有C型肝炎病毒(HCV)感染的患者。
9.於基線前之4週內ALT、AST或膽紅素
Figure 104142804-A0305-02-0155-174
1.5x ULN。
10.定義為於篩選時完整PTH
Figure 104142804-A0305-02-0155-173
750pg/mL之失控的腎性骨病。
11.預診為增加風險之嚴重感染之狀況，諸如於篩選前2週期間的任何時間處需要抗生素治療之留置血管導管(中樞靜脈線或血液透析導管)或活動性感染。
12.於基線前之4週內投與輸血。
13.於基線前之1週內接受負載劑量(100mg/週)IV鐵。
14.給藥之前的12個月內之藥物或酒精濫用史，或如藉由於篩選期間進行的實驗室測定所表明之該濫用的證據。
15.陽性B型肝炎表面抗原測試結果。
16.免疫缺陷病史，包括陽性HIV(ELISA及西方墨點法)測試結果。
17.若經結合人類BMP6之抗體或其抗原結合片段給藥後持續最少125天使用高效避孕，則育齡婦女可募集入本研究中。高效避孕係定義為以下中之一者：a.完全禁欲(當此係符合患者之較佳及平常生活方式時。週期性禁欲(例如，日歷、排卵、症狀體溫、排卵後方法) 並撤銷係不可接受之避孕方法)b.雄性/雌性絕育法。c.使用口服、注射或植入激素之避孕方法或放置宮內節育器(IUD)或宮內節育系統(IUS)或具有可比擬療效(失敗率<1%)的其他形式之激素避孕(例如激素陰道環或透皮激素避孕)。
處理
研究性處理
於本研究中之研究性療法係結合人類BMP6之抗體或抗原結合片段，例如抗-BMP6 IgG1、全人類抗體。抗體係於液體溶液中提供。原液濃度將根據待投與劑量在現場稀釋。輸注時間將以約30分鐘在小組間維持相對恆定。與匹配安慰劑(媒劑對照)相比，第1部分將係開放標籤單次劑量及第2部分將係雙盲單次劑量。抗-人類BMP6 Ab活性物質及安慰劑將呈瓶中之液體提供。於活性物及安慰劑中之賦形劑相同。
處理組
於第1部分，患者將指派給各由6例患者組成之至多6個劑量小組之一組。第1部分係開放標籤處理。起始劑量、最高劑量及劑量調整基本原理係於上文中描述。第1部分之臨時劑量係提供於表12(於MRSD下之Hgb<0.5g/dL)及表13(於MRSD下之Hgb
Figure 104142804-A0305-02-0156-175
0.5g/dL)中。
Figure 104142804-A0305-02-0156-34
此表希望僅作為指導第1部分劑量調整之一實例。可使用中間或較高劑量程度及一些劑量程度可基於各小組間之非正式中期分析期間 的資料評估而略過。實際劑量程度將以書面方式藉由Novartis確定及於新的小組中之患者處理前提供給所有參與研究地點。
Figure 104142804-A0305-02-0157-35
此表希望僅作為指導第1部分劑量調整之一實例。可使用中間或較高劑量程度及一些劑量程度可基於各小組間之非正式中期分析期間的資料評估而略過。
研究處理係定義為：
˙A：單次劑量之安慰劑。
˙B：如於第1部分中測定之最低PAD下之單次劑量之抗-人類BMP6 Ab。
˙C：大於如於第1部分中測定之最低PAD之一劑量程度下之單次劑量之抗-人類BMP6 Ab。
合併治療
於開始研究之前入選標準中所定義之時間框內及於研究期間所投與或採取之所有處方藥、非處方藥及顯著非藥物治療(包括物理治療及輸血)須經記錄於CRF之合併用藥/顯著非藥物治療中。用藥條目應特定於商品名、單次劑量及單位、投與頻率及途徑、開始及停止日期及治療的原因。
療效/藥效動力學
療效評估係於下文中指定。將於各個時間點收集用於療效評估之樣本。將評估血液學實驗室。Hgb及Fe指數將於作為於研究之第1 部分期間之劑量調整評估之部分的各小組間之非正式中期分析期間進行審查。若最初設置之樣本收集時間被認為針對理解鐵與PK之間的關係為不理想的，則於第1部分之後續小組中可改變樣本收集時間。
鐵指數圖
預期抗-人類BMP6 Ab動員自身體儲備中之鐵，從而導致包括以下之血清Fe參數變化：血清Fe、轉鐵蛋白飽和度(TSAT)、未結合Fe之結合能力(UIBC)、總Fe結合能力(TIBC)、鐵蛋白及網織紅血球血紅素含量(CHr)。此等將使用驗證測定於血清中進行測量。
安全性
安全評估係於下文中指定。
身體檢查
完整身體檢查將包括整體外觀、皮膚、頸部(包括甲狀腺)、眼、耳、鼻、喉、肺、心臟、腹部、背部、淋巴結、四肢、血管及神經之檢查。若基於病史及/或症狀所表明，則可進行直腸、外生殖器、乳及/或骨盆檢查。
於開始研究藥物之前存在之顯著發現須包含於患者之eCRF上之相關病史/當前醫學狀況熒幕中。於開始研究藥物後進行之滿足不良事件定義的顯著發現須記錄於患者之eCRF的不良事件熒幕上。
生命體徵
˙體溫
˙血壓(BP)
˙脈搏
身高及體重
˙身高
˙體重
˙身體質量指數(BMI)將經計算(體重(kg)/[身高(m)]2)
實驗室評估
實驗室測試結果之臨床相關偏差將針對定義不良事件之標準進行評估且若滿足標準則如此報告。重複評估係強制性的直到結果正常化或直到變化不再臨床相關。
血液學
將測量血紅素、血溶比、紅血球計數、具有差分之白血球計數及血小板計數。將監測鐵指數。
臨床化學
將監測鈉、鉀、肌酸酐、尿素、氯化物、白蛋白、鈣、鹼性磷酸酶、總膽紅素、LDH、GGT、AST及ALT。若總膽紅素濃度比正常上限增加1.5倍以上，則應差分直接及間接反應膽紅素。
心電圖(ECG)
PR間隔、QRS持續時間、心率、RR、QT、QTc
應使用白線蚓(Fridericia)QT校正公式(QTcF)供臨床決策。
妊娠及生育力評估
所有女性患者要求妊娠試驗，不論報告之生殖/絕經狀態。
針對本研究將進行血清妊娠試驗。若為陽性，則患者必須自試驗中止。
當篩選及基線時進行，本試驗之結果必須於患者可能給藥之前接收。
藥物動力學
將收集PK樣本。PK資料將於作為於研究之第1部分期間之劑量調整評估之部分的各小組間之非正式中期分析期間進行審查。若最初設置之樣本收集時間被認為不充分或不適於表徵PK曲線，則可改變後續小組中之樣本收集時間。採血次數及所收集總血體積將不超過彼等於方案中說明者。
將於在所有劑量程度下之所有患者中收集及評估PK樣本。游離抗-人類BMP6 Ab之濃度將使用ELISA測定法來測定。預期定量下限(LLOQ)係10pg/mL。
未經處理之(安慰劑)樣本將不進行分析。
游離抗-人類BMP6 Ab濃度將以μg/mL表示。低於LLOQ之所有濃度或缺失數據將於濃度資料清單中如此標記。低於LLOQ的濃度在摘要統計量(summary statistic)中將被處理成零，其僅作為濃度數據。其將不會於計算PK參數中考慮。
於測定游離抗-人類BMP6 Ab後殘餘之PK樣本可用於探索性評估或其他生物分析目的(例如不同位點之間的交叉檢查，穩定性評估)。
將使用非隔室方法以Phoenix WinNonlin(版本6.2或更高)測定(若可行)以下藥代動力學參數：基於血清濃度-時間資料之Cmax、tmax、AUC(0至t)、AUC(0至t最後)、Cmax/D及AUC/D。線性梯形法將用於AUC計算。若基於資料可行，則亦將估算結合人類BMP6之抗體或抗原結合片段之終末半衰期(t1/2)。
其他評估
免疫原性
ELISA測定將用於偵測抗-人類BMP6抗體。於免疫原性分析後殘餘之IG樣本可用於探索性評估或其他生物分析目的(例如，於不同位點之間的交叉檢查)。
探索性評估
生物標記係正常生物過程、致病過程或對治療性干預之藥物反應的客觀地測量及評估指標(生物標記定義工作小組2001)。
BMP6-鐵調節素路徑係如下：於肝細胞中之BMP6訊號係誘導之鐵調節素表現所需要，其抑制腸上皮細胞鐵吸收及巨噬細胞鐵運輸。作為降鐵調節素治療之BMP6-中和抗體應藉由減少EPO需求及增加達 到目標Hgb含量之患者數量來有益於限鐵性貧血患者。
基於以上述生物學，探索性生物標記評估包括(但不限於)鐵調節素(使用LC-MS測定法測得)。
額外探索性評估可研究骨吸收標記物之潛在作用以及解決作為促進作用機制之因素的發炎。
探索性目標係如下：˙為了評估鐵調節素含量與若干關鍵量度(諸如ERI及鐵指數)之間的關係；˙為了研究於主要及次要端點與縱向探索性生物標記之間的動力學；˙為了評估遺傳藥理學；˙為了評估免疫原性。
將於各個時間點處收集樣本。
對樣品收集、編號、加工及裝運之其他細節將提供於中心實驗室手冊中。
DNA
計劃探索性DNA調查研究以確定遺傳因素之目的作為本研究之部分，該遺傳因素可能(1)與經促紅血球生成素治療之具有功能缺鐵性貧血的慢性血液透析患者相關，(2)預測對經抗-人類BMP6 Ab治療之反應或(3)預測副作用之遺傳傾向。
另外，近期於基因分型技術中之進步已使全基因組方法成為可能。全基因組方法亦可於如上所述之此等研究之限制範疇中進行。
可溶性生物標記
鐵調節素將於血漿中定量為潛在PD/生物標記。
測定法之詳細描述將包含於生物分析資料報告中。
其他生物標記
沒有預設之假設平台可用於理解疾病異質性、作用模式及/或分層標記之潛在識別。將於各個時間點收集免疫原性(IG)樣本。抗人類BMP6 Ab之免疫原性將藉由測量識別抗人類BMP6抗體之抗體來評估。
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除非另有定義，否則本文中所用之技術及科學術語具有如藉由熟習本發明之所屬領域之專家所通常理解之相同含義。
除非另有指示，否則將如熟練技術人員明了以本身已知的方式可進行及已進行未具體詳細描述之所有方法、步驟、技術及操作。再次參考(例如)本文提及之標準手冊及一般背景技術及於其中所引述之其他參考文獻。除非另有指示，否則本文所引述之每個參考文獻係以全文引用之方式併入。
本發明之申請專利範圍係非限制性及係於下文中提供。
儘管特定態樣及申請專利範圍已詳細地揭示於本文中，此已以實例方式僅出於說明性目的進行，及不欲就隨附申請專利範圍之範疇，或任何相應未來應用之申請專利範圍的標的之範疇而言為限制性。特定言之，本發明者設想，可對本發明進行各種取代、改變及改良而不脫離由申請專利範圍所定義之本發明的精神及範疇。據信核酸起始物質、受關注純系或庫類型之選擇係對於具有本文所述之態樣之知識的一般技術者而言的常規問題。其他態樣、優點及改良視為係於以下申請專利範圍之範疇內。熟習此項技術者將知曉或能夠使用不多於常規實驗確定本文所述之本發明具體態樣之多種等效物。該等等效物係欲由以下申請專利範圍涵蓋。於以後申請之相應申請案中之申請專利範圍範疇之重擬可歸因於各國專利法之限制且不應解釋為放棄申請專利範圍之標的。
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<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 44
Figure 104142804-A0305-02-0182-79
<210> 45
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 45
Figure 104142804-A0305-02-0182-80
Figure 104142804-A0305-02-0183-81
<210> 46
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 46
Figure 104142804-A0305-02-0183-82
<210> 47
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 47
Figure 104142804-A0305-02-0183-83
Figure 104142804-A0305-02-0184-84
<210> 48
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 48
Figure 104142804-A0305-02-0184-85
Figure 104142804-A0305-02-0185-86
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 49
Figure 104142804-A0305-02-0185-87
<210> 50
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 50
Figure 104142804-A0305-02-0185-88
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 51
Figure 104142804-A0305-02-0185-89
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 52
Figure 104142804-A0305-02-0186-90
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 53
Figure 104142804-A0305-02-0186-91
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 54
Figure 104142804-A0305-02-0186-92
<210> 55
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 55
Figure 104142804-A0305-02-0186-93
Figure 104142804-A0305-02-0187-94
<210> 56
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 56
Figure 104142804-A0305-02-0187-95
<210> 57
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 57
Figure 104142804-A0305-02-0188-96
Figure 104142804-A0305-02-0189-97
Figure 104142804-A0305-02-0190-98
<210> 58
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 58
Figure 104142804-A0305-02-0190-99
Figure 104142804-A0305-02-0191-100
<210> 59
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 59
Figure 104142804-A0305-02-0191-101
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 60
Figure 104142804-A0305-02-0191-102
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 61
Figure 104142804-A0305-02-0191-103
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 62
Figure 104142804-A0305-02-0191-104
<210> 63
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 63
Figure 104142804-A0305-02-0192-105
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 64
Figure 104142804-A0305-02-0192-106
<210> 65
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 65
Figure 104142804-A0305-02-0192-107
Figure 104142804-A0305-02-0193-108
<210> 66
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 66
Figure 104142804-A0305-02-0193-109
<210> 67
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 67
Figure 104142804-A0305-02-0193-110
Figure 104142804-A0305-02-0194-111
<210> 68
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 68
Figure 104142804-A0305-02-0194-112
Figure 104142804-A0305-02-0195-113
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 69
Figure 104142804-A0305-02-0195-114
<210> 70
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 70
Figure 104142804-A0305-02-0195-115
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 71
Figure 104142804-A0305-02-0196-116
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 72
Figure 104142804-A0305-02-0196-117
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 73
Figure 104142804-A0305-02-0196-118
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 74
Figure 104142804-A0305-02-0196-119
<210> 75
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 75
Figure 104142804-A0305-02-0196-120
Figure 104142804-A0305-02-0197-121
<210> 76
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 76
Figure 104142804-A0305-02-0197-122
<210> 77
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 77
Figure 104142804-A0305-02-0198-123
Figure 104142804-A0305-02-0199-124
Figure 104142804-A0305-02-0200-125
<210> 78
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 78
Figure 104142804-A0305-02-0200-126
Figure 104142804-A0305-02-0201-127
<210> 79
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 79
Figure 104142804-A0305-02-0201-128
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 80
Figure 104142804-A0305-02-0201-129
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 81
Figure 104142804-A0305-02-0201-130
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 82
Figure 104142804-A0305-02-0202-131
<210> 83
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 83
Figure 104142804-A0305-02-0202-132
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 84
Figure 104142804-A0305-02-0202-133
<210> 85
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 85
Figure 104142804-A0305-02-0202-134
Figure 104142804-A0305-02-0203-135
<210> 86
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 86
Figure 104142804-A0305-02-0203-136
<210> 87
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 87
Figure 104142804-A0305-02-0203-137
Figure 104142804-A0305-02-0204-138
<210> 88
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 88
Figure 104142804-A0305-02-0204-139
Figure 104142804-A0305-02-0205-140
<210> 89
<211> 139
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Figure 104142804-A0305-02-0205-141
<210> 90
<211> 139
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Figure 104142804-A0305-02-0206-142
<210> 91
<211> 138
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Figure 104142804-A0305-02-0206-143
Figure 104142804-A0305-02-0207-144
<210> 92
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Figure 104142804-A0305-02-0207-145
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Figure 104142804-A0305-02-0207-146
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Figure 104142804-A0305-02-0207-147
<210> 95
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Figure 104142804-A0305-02-0208-148
<210> 96
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成6xHis標記
<400> 96
Figure 104142804-A0305-02-0208-149

Claims (59)

  1. 一種單離抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP6並包括：(a)分別為SEQ ID NO：69、70及71之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別為SEQ ID NO：79、80及81之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或(b)分別為SEQ ID NO：72、73及74之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別為SEQ ID NO：82、83及84之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
  2. 如請求項1之單離抗體或其抗原結合片段，其包括：SEQ ID NO：75之VH序列。
  3. 如請求項1之單離抗體或其抗原結合片段，其包括：SEQ ID NO：85之VL序列。
  4. 如請求項1之單離抗體或其抗原結合片段，其包括：SEQ ID NO：75之VH序列；及SEQ ID NO：85之VL序列。
  5. 如請求項1之單離抗體或其抗原結合片段，其包括：SEQ ID NO：77之重鏈序列。
  6. 如請求項1之單離抗體或其抗原結合片段，其包括：SEQ ID NO：87之輕鏈序列。
  7. 如請求項1之單離抗體或其抗原結合片段，其包括：SEQ ID NO：77之重鏈序列；及SEQ ID NO：87之輕鏈序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以
    Figure 104142804-A0305-02-0209-176
    1nM之KD結合人類BMP6。
  9. 如請求項1至7中任一項之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段針對人類BMP6之親和力比針對人類BMP2、人類BMP5或人類BMP7之親和力高至少約100倍。
  10. 如請求項1至7中任一項之單離抗體或其抗原結合片段，其中該單離抗體或其抗原結合片段減少活體外肝臟細胞株或初級人類肝臟細胞中BMP6所誘導之鐵調節素(hepcidin)表現。
  11. 如請求項1至7中任一項之單離抗體或其抗原結合片段，其中該單離抗體或其抗原結合片段包括選自IgM及IgG之架構(scaffold)。
  12. 如請求項1至7中任一項之單離抗體或其抗原結合片段，其中該單離抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2及IgG3或IgG4。
  13. 如請求項1至7中任一項之單離抗體或其抗原結合片段，其中該單離抗體或其抗原結合片段係選自由單株抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab及scFv組成之群。
  14. 如請求項1至7中任一項之單離抗體或其抗原結合片段，其中該單離抗體或其抗原結合片段係免疫共軛物之組分。
  15. 如請求項1至7中任一項之單離抗體或其抗原結合片段，其具有經由Fc區之突變改變之效應功能。
  16. 一種組合物，其包括如請求項1至7中任一項之單離抗體或其抗原結合片段。
  17. 如請求項16之組合物，其包含醫藥上可接受之載劑。
  18. 如請求項17之組合物，其包含額外治療劑。
  19. 如請求項18之組合物，其中該額外治療劑減少BMP6之活性。
  20. 如請求項19之組合物，其中該額外治療劑係siRNA、抗體或其抗原結合片段或小分子。
  21. 如請求項18之組合物，其中該額外治療劑係紅血球生成刺激劑(ESA)或鐵。
  22. 一種單離聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至7中任一項之結合人類BMP6之單離抗體或其抗原結合片段的序列。
  23. 一種單離聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至7中任一項之結合人類BMP6之抗體或其抗原結合片段的VH或VL序列的序列。
  24. 一種單離聚核苷酸，其包含編碼針對人類BMP6之抗體或其抗原結合片段之VH或VL序列的序列，其中該抗體或其抗原結合片段包括：(a)分別為SEQ ID NO：69、70及71之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別為SEQ ID NO：79、80及81之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或(b)分別為SEQ ID NO：72、73及74之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別為SEQ ID NO：82、83及84之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
  25. 一種編碼針對BMP6之抗體或其抗原結合片段之重鏈或輕鏈的單離聚核苷酸，該聚核苷酸包括以下之任一序列：(a)SEQ ID NO：78之重鏈序列；(b)SEQ ID NO：76之VH序列；(c)SEQ ID NO：88之輕鏈序列；或(d)SEQ ID NO：86之VL序列。
  26. 一種載體，其包含如請求項22至25中任一項之聚核苷酸。
  27. 一種宿主細胞，其包含如請求項26之載體或如請求項22至25中任一項之聚核苷酸。
  28. 如請求項27之宿主細胞，其中該細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
  29. 一種如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項16至21中任一項之組合物的用途，其用於製造用來減少細胞中BMP6之活性的藥物。
  30. 一種如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求 項16至21中任一項之組合物的用途，其用於製造為有此需要之患者抑制BMP6的藥物。
  31. 如請求項30之用途，其中該患者罹患貧血。
  32. 如請求項31之用途，其中該貧血係慢性疾病貧血(ACD)、慢性腎病(CKD)之貧血、癌症之貧血、發炎之貧血、抗紅血球生成刺激劑(ESA)性貧血、限鐵性貧血或功能缺鐵性貧血。
  33. 如請求項30之用途，其中該患者係曾接受或正接受投與紅血球生成刺激劑(ESA)。
  34. 如請求項33之用途，其中該ESA係促紅血球生成素(EPO)。
  35. 一種如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項16至21中任一項之組合物的用途，其用於製造用來增加血清鐵含量、轉鐵蛋白飽和度(TAST)、網織紅血球血紅素含量(CHr)、網織紅血球計數、紅血球計數、血紅素及/或血容比的藥物。
  36. 一種如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項16至21中任一項之組合物的用途，其用於製造為有此需要之患者減少鐵調節素活性或含量的藥物。
  37. 如請求項36之用途，其中該鐵調節素活性或含量係減少至少50%。
  38. 一種如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項16至21中任一項之組合物的用途，其用於製造為有此需要之患者治療貧血的藥物。
  39. 一種如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項16至21中任一項之組合物的用途，其用於製造用來增加或維持患者之血紅素含量的藥物。
  40. 如請求項39之用途，其中該治療進一步包括在相對於在沒有如 請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項16至21中任一項之組合物治療之EPO劑量需求及/或鐵劑量需求下，減少患者之鐵劑量需求、減少患者之EPO劑量需求、或同時減少患者之鐵劑量需求與患者之EPO劑量需求。
  41. 如請求項39至40中任一項之用途，其中該患者罹患貧血。
  42. 如請求項38之用途，其中該貧血係與慢性疾病相關聯之貧血。
  43. 如請求項42之用途，其中該慢性疾病係慢性腎病、癌症或發炎。
  44. 如請求項38之用途，其中該患者係正在或曾經接受紅血球生成刺激劑(ESA)治療。
  45. 如請求項44之用途，其中該ESA係促紅血球生成素(EPO)。
  46. 如請求項38之用途，其中該貧血係EPO低反應性貧血。
  47. 如請求項38之用途，其中該貧血係限鐵性貧血或功能缺鐵性貧血。
  48. 如請求項38之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係以0.01mg/kg至15mg/kg範圍內之劑量投與。
  49. 如請求項38之用途，其中該抗體或其抗原結合片段係靜脈內或皮下投與。
  50. 一種如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項16至21中任一項之組合物、如請求項22至25中任一項之聚核苷酸、如請求項26之載體、或如請求項27至28中任一項之宿主細胞的用途，其用於製造藥劑。
  51. 如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用作藥劑。
  52. 如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於醫療。
  53. 如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用來增加或維持患者之血紅素含量。
  54. 如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用來治療貧血患者。
  55. 如請求項54之抗體或其抗原結合片段，其中該貧血係慢性疾病貧血。
  56. 如請求項55之抗體或其抗原結合片段，其中該慢性疾病係慢性腎病、癌症或發炎。
  57. 如請求項54之抗體或其抗原結合片段，其中該患者係正在或曾經接受紅血球生成刺激劑(ESA)治療。
  58. 如請求項57之抗體或其抗原結合片段，其中該ESA係促紅血球生成素(EPO)。
  59. 如請求項54之抗體或其抗原結合片段，其中該貧血為功能缺鐵性貧血。
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