JP6802796B2 - Ｂｍｐ６を標的とする抗体のための組成物および方法 - Google Patents

Ｂｍｐ６を標的とする抗体のための組成物および方法 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、２０１４年１２月１９日に出願された、米国特許出願第６２／０９４，７１６号、および２０１５年６月１９日に出願された、米国特許出願第６２／１８１，８０３号に対する優先権を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにより電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。２０１５年１２月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５６５９９−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、６８，３０１バイトのサイズである。
序説
本発明は、ヒトＢＭＰ６に対する抗体およびそれらの抗原結合性断片、ならびにそれらの組成物および使用法に関する。
発明の背景
貧血は、慢性腎疾患（ＣＫＤ）を伴う患者における有病率が高く、生活の質の低下、ならびに循環器疾患および死を含む転帰不良の危険性の増大と関連する。ＣＫＤを伴う患者における貧血管理のいくつかの方式は、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）、経口鉄および静脈内鉄の補充、ならびに輸血の使用を伴う。しかし、多くの患者は、これらの処置に十分に応答せず、より高用量のＥＳＡおよび／または鉄を必要とする。高用量の鉄はまた、酸素ラジカルおよびアレルギー反応の発生と関連する毒性も引き起こしうる。これらの処置は、貧血の基礎原因、すなわち、体内貯蔵部からの鉄吸収および鉄移動の機能障害に十分に対処しないため、有効性を欠く場合がある。
エリスロポエチン抵抗性を管理しようとする試みは、現在、高用量の非経口鉄の共投与により実施されている。しかし、静脈内調製物に由来する大半の鉄は、マクロファージによりまず処理され、赤血球生成のためのその活用は、フェロポルチンにより媒介される鉄移出に依存する。
多くの貧血患者では、フェロポルチンにより媒介される鉄移出は、高レベルのヘプシジンにより抑制される。さらなる証拠は、ヘプシジンレベルの増大が、血液透析時の、ＥＳＡ応答性の不良と相関することを示唆する。したがって、ヘプシジン降下剤は、この患者集団、および鉄欠乏により特徴付けられる慢性疾患性貧血（ＡＣＤ）の他の形態におけるＥＳＡ不応性貧血を改善するために、有効な戦略でありうる。
したがって、循環ヘプシジンレベルを低下させる方法は、鉄吸収を増強し、隔離された鉄の放出を容易にし、慢性腎疾患患者に存在する、ＥＳＡ不応性貧血における赤血球生成を促進するはずである。
貧血と関連する疾患および障害を処置するための、現行の処置選択肢にも拘わらず、貧血の処置のための、改善された組成物であって、有効であり、かつ、良好に忍容される組成物が、依然として必要とされている。
発明の概要
本発明は、単離ＢＭＰ６結合性分子（例えば、ＢＭＰ６結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片）、このような分子を含む医薬組成物、このような分子および組成物を作製する方法、ならびにヘプシジンレベルを低下させること、および貧血を処置することにおけるその使用法を提供する。
一態様では、本発明は、ＢＭＰ６に対する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、表１における抗体のうちのいずれかの、任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一態様では、本発明は、ＢＭＰ６に対する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、表１に記載される抗体３の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一態様では、本発明は、ＢＭＰ６に対する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、表１に記載される抗体５の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一態様では、本発明は、ＢＭＰ６に対する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、表１に記載される抗体６の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一態様では、本発明は、ＢＭＰ６に対する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、表１に記載される抗体７の、６つのＣＤＲを含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
それぞれ、配列番号９、１０、および１１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１９、２０、および２１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
それぞれ、配列番号１２、１３、および１４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
それぞれ、配列番号２９、３０、および３１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３９、４０、および４１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
それぞれ、配列番号３２、３３、および３４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号４２、４３、および４４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
それぞれ、配列番号４９、５０、および５１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５９、６０、および６１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
それぞれ、配列番号５２、５３、および５４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号６２、６３、および６４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
それぞれ、配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
それぞれ、配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
配列番号１５のＶＨ（重鎖可変ドメイン）配列；
配列番号３５のＶＨ配列；
配列番号５５のＶＨ配列；または
配列番号７５のＶＨ配列
を含む。
本発明の一実施形態では、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片は、上記で記載したＶＨ配列のうちの１つに対する、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
配列番号２５のＶＬ（軽鎖可変ドメイン）配列；
配列番号４５のＶＬ配列；
配列番号６５のＶＬ配列；または
配列番号８５のＶＬ配列
を含む。
本発明の一実施形態では、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片は、上記で記載したＶＬ配列のうちの１つに対する、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
配列番号１５のＶＨ配列；および配列番号２５のＶＬ配列；
配列番号３５のＶＨ配列；および配列番号４５のＶＬ配列；
配列番号５５のＶＨ配列；および配列番号６５のＶＬ配列；または
配列番号７５のＶＨ配列；および配列番号８５のＶＬ配列
を含む。
本発明の一実施形態では、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片は、上記で記載したＶＨ配列のうちの１つに対する、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、上記で記載したＶＬ配列のうちの１つに対する、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。一実施形態では、ＶＨとＶＬとは、表１に列挙される、同じ抗体に由来する。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
配列番号１７の重鎖配列；
配列番号３７の重鎖配列；
配列番号５７の重鎖配列；または
配列番号７７の重鎖配列
を含む。
本発明の一実施形態では、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片は、上記で記載した重鎖配列のうちの１つに対する、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性を有する重鎖配列を含む。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、
配列番号２７の軽鎖配列；
配列番号４７の軽鎖配列；
配列番号６７の軽鎖配列；または
配列番号８７の軽鎖配列
を含む。
本発明の一実施形態では、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片は、上記で記載した軽鎖配列のうちの１つに対する、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性を有する軽鎖配列を含む。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に結合し、重鎖および軽鎖を含み、重鎖および軽鎖は、
配列番号１７の重鎖配列；および配列番号２７の軽鎖配列；
配列番号３７の重鎖配列；および配列番号４７の軽鎖配列；
配列番号５７の重鎖配列；および配列番号６７の軽鎖配列；または
配列番号７７の重鎖配列；および配列番号８７の軽鎖配列
からなる群から選択される配列を含む。
本発明の一実施形態では、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片は、上記で記載した重鎖配列のうちの１つに対する、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性を有する重鎖配列を含み、上記で記載した軽鎖配列のうちの１つに対する、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性を有する軽鎖配列を含む。一実施形態では、重鎖と、軽鎖とは、表１に列挙される、同じ抗体に由来する。
一実施形態では、本発明は、ＢＭＰ６に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、
それぞれ、配列番号９、１０、および１１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１９、２０、および２１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号１２、１３、および１４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号２９、３０、および３１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３９、４０、および４１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号３２、３３、および３４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号４２、４３、および４４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号４９、５０、および５１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５９、６０、および６１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号５２、５３、および５４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号６２、６３、および６４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；または
それぞれ、配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
のうちのいずれか１つまたは複数に対する、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、少なくとも１つの相補性決定（ＣＤＲ）配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明の一実施形態では、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ６に特異的に結合し、
それぞれ、配列番号９、１０、および１１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１９、２０、および２１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号１２、１３、および１４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号２９、３０、および３１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３９、４０、および４１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号３２、３３、および３４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号４２、４３、および４４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号４９、５０、および５１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５９、６０、および６１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号５２、５３、および５４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号６２、６３、および６４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；または
それぞれ、配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
のうちのいずれか１つまたは複数と同一な、少なくとも１つの相補性決定（ＣＤＲ）配列を含む。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ＢＭＰ６に特異的に結合し、前記抗体は、
配列番号１２、１３、および１４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列；
配列番号２９、３０、および３１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列；
配列番号３２、３３、および３４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列；
配列番号４９、５０、および５１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列；
配列番号５２、５３、および５４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列；
配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列；
配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列；ならびに
配列番号９、１０、および１１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列
からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ配列を含む。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ＢＭＰ６に特異的に結合し、前記抗体は、
それぞれ、配列番号１９、２０、および２１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号２２、２３、および２４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号３９、４０、および４１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号４２、４３、および４４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号５９、６０、および６１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号６２、６３、および６４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；ならびに
それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
からなる群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
複数の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。
一実施形態では、本発明は、ＢＭＰ６に特異的に結合する、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供し、前記抗体は、少なくとも約１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、または１０１１Ｍ−１のアフィニティー定数（ＫＡ）を有する。一実施形態では、本発明は、ＢＭＰ６に特異的に結合する、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供し、前記抗体は、少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、または１０１１Ｍ−１のアフィニティー定数（ＫＡ）を有する。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ６に特異的に結合し、前記抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ６に、約１ｎＭ以下または約０．１ｎＭ以下のＫｄで結合する。本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ６に特異的に結合し、前記抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ６に、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下のＫｄで結合する。本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ６に特異的に結合し、前記抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ６に、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下のＫｄで結合する。一実施形態では、Ｋｄは、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定される通りである。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ６に特異的に結合し、ＢＭＰ６活性を阻害する。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ６に特異的に結合し、下記の表１に記載される抗体と交差競合する（これを交差遮断する）。本発明の一実施形態では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、下記の表１に記載される抗体の同じＢＭＰ６エピトープに結合し、これと交差競合する。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ５、またはヒトＢＭＰ７のうちのいずれかに対するアフィニティーの、少なくとも約１００、５００、または１０００倍のアフィニティーを有する。本発明の一実施形態では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ５、またはヒトＢＭＰ７のうちのいずれかに対するアフィニティーの、少なくとも１００、５００、または１０００倍のアフィニティーを有する。複数の実施形態では、ＢＭＰ６に対する特異性は、ＥＬＩＳＡにより測定される通りである。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ２に対するアフィニティーの、少なくとも約１００、５００、または１０００倍のアフィニティーを有する。本発明の一実施形態では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ２に対するアフィニティーの、少なくとも１００、５００、または１０００倍のアフィニティーを有する。複数の実施形態では、ＢＭＰ６に対する特異性は、ＥＬＩＳＡにより測定される通りである。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ５に対するアフィニティーの、少なくとも約１００、５００、または１０００倍のアフィニティーを有する。本発明の一実施形態では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ５に対するアフィニティーの、少なくとも１００、５００、または１０００倍のアフィニティーを有する。複数の実施形態では、ＢＭＰ６に対する特異性は、ＥＬＩＳＡにより測定される通りである。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ７に対するアフィニティーの、少なくとも約１００、５００、または１０００倍のアフィニティーを有する。本発明の一実施形態では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ７に対するアフィニティーの、少なくとも１００、５００、または１０００倍のアフィニティーを有する。複数の実施形態では、ＢＭＰ６に対する特異性は、ＥＬＩＳＡにより測定される通りである。
本発明の一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ２またはヒトＢＭＰ５に対する、検出可能な結合を有さない（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて）。
本発明の一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ２に対する、検出可能な活性を有さない（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて）。
本発明の一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＢＭＰ５に対する、検出可能な活性を有さない（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて）。
一実施形態では、ＢＭＰ６に特異的に結合する、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、単離モノクローナル抗体である。一実施形態では、ＢＭＰ６に特異的に結合する、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、単離ヒトモノクローナル抗体である。一実施形態では、ＢＭＰ６に特異的に結合する、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、ヒト化モノクローナル抗体である。一実施形態では、ＢＭＰ６に特異的に結合する、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、単離キメラ抗体である。一実施形態では、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含む。
本発明の一実施形態では、ＢＭＰ６に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、単鎖抗体である。
本発明の一実施形態では、ＢＭＰ６に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片である。
本発明の一実施形態では、ＢＭＰ６に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、ｓｃＦｖである。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＭまたはＩｇＧである。本発明の一実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。一実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１である。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、アミノ酸を、それぞれのヒトＶＨ生殖細胞系列配列またはヒトＶＬ生殖細胞系列配列に由来する抗体フレームワークへと置換したフレームワークを含む。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、免疫コンジュゲートの成分である。一実施形態では、免疫コンジュゲートは、単離抗体またはその抗原結合性断片、および、非限定的な例として、以下：酵素、毒素、ホルモン、成長因子、または薬物のうちのいずれかを含みうる。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、Ｆｃ領域の突然変異を介して、エフェクター機能が改変されている。
本発明の一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、表１に列挙される単離抗体またはその抗原結合性断片を交差遮断する。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、肝細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける肝細胞株および／または初代ヒト肝細胞）内の、ＢＭＰ６に誘導されるヘプシジン発現を阻害する。本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、肝細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける肝細胞株および／または初代ヒト肝細胞）内の、ＢＭＰ６に誘導されるヘプシジン発現を、少なくとも約５０％阻害する。例えば、単離抗体またはその抗原結合性断片は、肝細胞内の、ＢＭＰ６に誘導されるヘプシジン発現を、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、または１００％阻害する。ヘプシジン発現は、非限定的な例として、ヘプシジンｍＲＮＡの量またはタンパク質レベルを測定することにより測定することができる。本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、肝細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける肝細胞株および／または初代ヒト肝細胞）内の、ＢＭＰ６に誘導されるヘプシジン発現を、少なくとも５０％阻害する。例えば、単離抗体またはその抗原結合性断片は、肝細胞内の、ＢＭＰ６に誘導されるヘプシジン発現を、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、または１００％阻害する。ヘプシジン発現は、非限定的な例として、ヘプシジンｍＲＮＡの量またはタンパク質レベルを測定することにより測定することができる。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ヒトＢＭＰ６の活性を低減する。本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＨＥＰ３Ｂ−ＢＲＥ−Ｌｕｃレポーター遺伝子アッセイにおいて測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ヒトＢＭＰ６の活性を低減する。
一態様では、本発明は、ＢＭＰ６に特異的に結合し、配列ＱＴＬＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰ（配列番号９２、または配列番号８９のアミノ酸８８〜１０２）を含む、ヒトＢＭＰ６のエピトープに結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本発明は、ＢＭＰ６に特異的に結合し、配列ＱＴＬＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰ（配列番号９２、または配列番号８９のアミノ酸８８〜１０２）からなる、ヒトＢＭＰ６のエピトープに結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列ＱＴＬＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰ（配列番号９２、または配列番号８９のアミノ酸８８〜１０２）からなるヒトＢＭＰ６エピトープに対して、（ａ）配列ＱＴＬＶＨＦＩＮＰＥＴＶＰＫＰ（配列番号９３、または配列番号９０のアミノ酸８８〜１０２）からなるヒトＢＭＰ７エピトープ、または（ｂ）配列ＱＴＬＶＨＬＭＦＰＤＨＶＰＫＰ（配列番号９４、または配列番号９１のアミノ酸８７〜１０１）からなるヒトＢＭＰ５エピトープに対するアフィニティーの、少なくとも約１００倍のアフィニティーを有する。本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列ＱＴＬＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰ（配列番号９２、または配列番号８９のアミノ酸８８〜１０２）からなるヒトＢＭＰ６エピトープに対して、（ａ）配列ＱＴＬＶＨＦＩＮＰＥＴＶＰＫＰ（配列番号９３、または配列番号９０のアミノ酸８８〜１０２）からなるヒトＢＭＰ７エピトープ、または（ｂ）配列ＱＴＬＶＨＬＭＦＰＤＨＶＰＫＰ（配列番号９４、または配列番号９１のアミノ酸８７〜１０１）からなるヒトＢＭＰ５エピトープに対するアフィニティーの、少なくとも１００倍のアフィニティーを有する。このような単離抗体またはその抗原結合性断片は、非限定的例として、（ａ）それぞれ、配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、または（ｂ）それぞれ、配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含みうる。本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７５のＶＨ配列；および配列番号８５のＶＬ配列を含む。一実施形態では、アフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定される通りである。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列ＱＴＬＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰ（配列番号９２、または配列番号８９のアミノ酸８８〜１０２）からなるヒトＢＭＰ６エピトープに対して、（ａ）配列ＱＴＬＶＨＦＩＮＰＥＴＶＰＫＰ（配列番号９３、または配列番号９０のアミノ酸８８〜１０２）からなるヒトＢＭＰ７エピトープ、または（ｂ）配列ＱＴＬＶＨＬＭＦＰＤＨＶＰＫＰ（配列番号９４、または配列番号９１のアミノ酸８７〜１０１）からなるヒトＢＭＰ５エピトープに対するアフィニティーの、少なくとも約５００倍のアフィニティーを有する。このような単離抗体またはその抗原結合性断片は、非限定的な例として、（ａ）それぞれ、配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、または（ｂ）それぞれ、配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含みうる。本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７５のＶＨ配列；および配列番号８５のＶＬ配列を含む。一実施形態では、アフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定される通りである。
別の態様では、本発明は、前出の態様または実施形態のうちのいずれかの、単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
一実施形態では、組成物は、さらなる治療剤をさらに含む。
本発明の一実施形態では、さらなる治療剤は、ＢＭＰ６の活性を低減する。
本発明の一実施形態では、さらなる治療剤は、ｓｉＲＮＡ、抗体もしくはその抗原結合性断片、または低分子である。
本発明の一実施形態では、さらなる治療剤は、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）および鉄（例えば、栄養補助食の鉄またはＩＶ鉄）からなる群から選択される。
本発明の一実施形態では、さらなる治療剤は、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）、例えば、ＥＰＯである。
一実施形態では、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を、それを必要とする患者に、本明細書で記載されているか、または当技術分野で公知の治療法または手順などの治療法または手順と共に投与することができる。表１に記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、方法または手順の前に、この後で、またはこれと同時に投与することができる。
一実施形態では、治療法または手順は、輸血である。一実施形態では、治療法または手順は、透析である。一実施形態では、治療法または手順は、ＥＳＡ、例えば、ＥＰＯの投与である。一実施形態では、治療法または手順は、鉄、例えば、ＩＶ鉄の投与である。一実施形態では、治療法または手順は、ＥＳＡ、例えば、ＥＰＯの投与、および鉄、例えば、ＩＶ鉄の投与である。一実施形態では、治療法または手順は、前出のうちのいずれかの組合せである。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される抗体のうちのいずれかまたはそれらの抗原結合性断片をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を含む。一実施形態では、本発明は、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合性断片であって、
それぞれ、配列番号９、１０、および１１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１９、２０、および２１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号１２、１３、および１４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号２９、３０、および３１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３９、４０、および４１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号３２、３３、および３４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号４２、４３、および４４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号４９、５０、および５１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５９、６０、および６１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号５２、５３、および５４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号６２、６３、および６４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
それぞれ、配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；または
それぞれ、配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
のうちのいずれか１つまたは複数を含む単離抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸を提供する。
一実施形態では、本発明は、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合性断片であって、
配列番号１７の重鎖配列；
配列番号１５のＶＨ配列；
配列番号２７の軽鎖配列；
配列番号２５のＶＬ配列；
配列番号３７の重鎖配列；
配列番号３５のＶＨ配列；
配列番号４７の軽鎖配列；
配列番号４５のＶＬ配列；
配列番号５７の重鎖配列；
配列番号５５のＶＨ配列；
配列番号６７の軽鎖配列；
配列番号６５のＶＬ配列；
配列番号７７の重鎖配列；
配列番号７５のＶＨ配列；
配列番号８７の軽鎖配列；および
配列番号８５のＶＬ配列
からなる群から選択される配列を含むアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。
一実施形態では、本発明は、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合性断片であって、
配列番号１７の重鎖配列；
配列番号１５のＶＨ配列；
配列番号２７の軽鎖配列；
配列番号２５のＶＬ配列；
配列番号３７の重鎖配列；
配列番号３５のＶＨ配列；
配列番号４７の軽鎖配列；
配列番号４５のＶＬ配列；
配列番号５７の重鎖配列；
配列番号５５のＶＨ配列；
配列番号６７の軽鎖配列；
配列番号６５のＶＬ配列；
配列番号７７の重鎖配列；
配列番号７５のＶＨ配列；
配列番号８７の軽鎖配列；および
配列番号８５のＶＬ配列
からなる群から選択される配列に対する、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。
一実施形態では、本発明は、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸（ポリヌクレオチド）であって、
配列番号１８の重鎖配列；
配列番号３８の重鎖配列；
配列番号５８の重鎖配列；
配列番号７８の重鎖配列；
配列番号２８の軽鎖配列；
配列番号４８の軽鎖配列；
配列番号６８の軽鎖配列；
配列番号８８の軽鎖配列；
配列番号１６のＶＨ配列；
配列番号３６のＶＨ配列；
配列番号５６のＶＨ配列；
配列番号７６のＶＨ配列；
配列番号２６のＶＬ配列；
配列番号４６のＶＬ配列；
配列番号６６のＶＬ配列；および
配列番号８６のＶＬ配列
からなる群から選択される配列を含む核酸を提供する。
別の態様では、本発明はまた、このような核酸またはポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。
別の態様では、本発明はまた、このような核酸またはポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供する。一実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。本発明の一実施形態では、単離宿主細胞は、このような核酸またはポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
一実施形態では、本発明は、（１）本発明の抗体の重鎖をコードする換え核酸セグメントと、（２）本発明の抗体の軽鎖をコードする、第２の換え核酸セグメントとを含み、前記ＤＮＡセグメントがそれぞれ、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターに作動可能に連結され、前記宿主細胞内で発現することが可能な、単離宿主細胞を提供する。別の実施形態では、本発明の、単離宿主細胞は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれをコードする組換えＤＮＡセグメントを含み、前記ＤＮＡセグメントは、プロモーターに作動可能に連結され、前記宿主細胞内で発現することが可能である。一実施形態では、宿主細胞は、非ヒト哺乳動物細胞株である。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片である。
本発明は、本明細書で記載される、ＢＭＰ６に対する抗体もしくはその抗原結合性断片、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の、医薬の製造における使用を提供する。本発明は、医薬としての使用のための、本明細書で記載される抗体およびその抗原結合性断片を提供する。本発明は、治療における使用のための、本明細書で記載される抗体およびその抗原結合性断片を提供する。本発明は、貧血、例えば、慢性疾患性貧血の処置における使用のための、本明細書で記載される抗体およびその抗原結合性断片を提供する。一実施形態では、慢性疾患は、慢性腎疾患である。一実施形態では、慢性疾患は、がんである。一実施形態では、慢性疾患は、炎症である。複数の実施形態では、貧血を伴う患者は、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）で処置されたことがあるか、または処置されている。
別の態様では、本発明は、抗体およびそれらの抗原結合性断片を使用する方法、ならびに本明細書で記載される、このような抗体およびそれらの抗原結合性断片を含む組成物を提供する。一態様では、本発明は、それを必要とする患者における、ヘプシジンの活性またはレベルを低減する方法であって、患者に、本明細書で記載される、ＢＭＰ６に対する抗体またはその抗原結合性断片を投与するステップを含む方法を提供する。この方法の一実施形態では、ヘプシジン（Hepicidin）の活性またはレベルを、少なくとも５０％低減する。一実施形態では、患者は、貧血を有する。複数の実施形態では、貧血は、慢性疾患性貧血（ＡＣＤ）、例えば、慢性腎疾患（ＣＫＤ）性貧血、がん性貧血、または炎症性貧血である。一実施形態では、貧血は、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）抵抗性貧血または鉄欠乏性貧血である。
本発明は、それを必要とする患者における、貧血を処置する方法であって、患者に、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を投与するステップを含む方法を提供する。複数の実施形態では、貧血は、慢性疾患性貧血（ＡＣＤ）、例えば、慢性腎疾患（ＣＫＤ）性貧血、がん性貧血、または炎症性貧血である。一実施形態では、貧血は、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）抵抗性貧血または鉄欠乏性貧血である。複数の実施形態では、患者は、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）で処置されているか、または処置されたことがある。複数の実施形態では、貧血は、ＥＰＯ低応答性貧血である。複数の実施形態では、貧血は、鉄欠乏性貧血である。複数の実施形態では、患者は、慢性血液透析患者である。
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者における、ＢＭＰ６を阻害する方法であって、患者に、有効量の、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。複数の実施形態では、患者は、貧血を有する。複数の実施形態では、貧血は、慢性疾患性貧血（ＡＣＤ）、例えば、慢性腎疾患（ＣＫＤ）性貧血、がん性貧血、または炎症性貧血である。一実施形態では、貧血は、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）抵抗性貧血または鉄欠乏性貧血である。複数の実施形態では、患者は、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）で処置されているか、または処置されたことがある。複数の実施形態では、貧血は、ＥＰＯ低応答性貧血である。複数の実施形態では、貧血は、鉄欠乏性貧血である。複数の実施形態では、患者は、慢性血液透析患者である。
本発明はまた、細胞内のＢＭＰ６の活性を低減する方法であって、細胞を、本発明の抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップを含む方法も提供する。
本発明はさらに、それを必要とする患者における、血清鉄レベル、トランスフェリン飽和度（ＴＳＡＴ）、網状赤血球ヘモグロビン含量（ＣＨｒ）、網状赤血球カウント、赤血球カウント、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを上昇させる方法であって、患者に、有効量の、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を投与するステップを含む方法も提供する。
本発明はさらに、患者におけるヘモグロビンレベルを上昇させるか、または維持する方法であって、患者に、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を投与するステップを含む方法も提供する。複数の実施形態では、患者は、貧血を有する。複数の実施形態では、貧血は、慢性疾患性貧血（ＡＣＤ）、例えば、慢性腎疾患（ＣＫＤ）性貧血、がん性貧血、または炎症性貧血である。一実施形態では、貧血は、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）抵抗性貧血または鉄欠乏性貧血である。複数の実施形態では、患者は、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）で処置されているか、または処置されたことがある。複数の実施形態では、貧血は、ＥＰＯ低応答性貧血である。複数の実施形態では、貧血は、鉄欠乏性貧血である。複数の実施形態では、患者は、慢性血液透析患者である。複数の実施形態では、方法は、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片による処置の非存在下におけるＥＰＯ要求用量および／または鉄要求用量と比べて、患者の鉄要求用量を低減するか、患者のＥＰＯ要求用量を低減するか、または患者の鉄要求用量および患者のＥＰＯ要求用量の両方を低減するステップをさらに含む。複数の実施形態では、ヘモグロビンレベルを、少なくとも約１０．０、少なくとも約１１．０、または少なくとも約１２．０ｇ／ｄＬのレベルまで上昇させるか、またはこのレベルに維持する。複数の実施形態では、ヘモグロビンレベルを、少なくとも１０．０、少なくとも１１．０、または少なくとも１２．０ｇ／ｄＬのレベルまで上昇させるか、またはこのレベルで維持する。
前述の方法のうちのいずれかでは、患者に、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を投与するステップは、患者に、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む。
前述の方法のうちのいずれかでは、抗体またはその抗原結合性断片は、０．００１〜０．１ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００１６ｍｇ／ｋｇ、０．００２５ｍｇ／ｋｇ、０．００４０ｍｇ／ｋｇ、０．００６３ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１６ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４０ｍｇ／ｋｇ、０．０６３ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。前述の方法のうちのいずれかでは、抗体またはその抗原結合性断片は、約０．００１〜約０．１ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１６ｍｇ／ｋｇ、約０．００２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００４０ｍｇ／ｋｇ、約０．００６３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１６ｍｇ／ｋｇ、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０６３ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
複数の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片を、静脈内投与する。複数の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片を、皮下投与する。複数の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片を、約３０〜約６０分間にわたる注入により投与する。
別の態様では、本発明は、表１に列挙されるＣＤＲを含む、ＢＭＰ６に対する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。本発明は、表１に列挙される、ＢＭＰ６に対する単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。本発明は、表１に列挙されるＣＤＲを含む、ＢＭＰ６に対する抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、単離されている。本発明の一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、単離されている。
定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書で使用される「ＢＭＰ６」とは、タンパク質である骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）、またはＢＭＰ６をコードする遺伝子もしくは核酸を意味する。Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759-62；Sauermann et al. 1993 J. Neurosci. Res. 33: 142-7；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：６５４。ＢＭＰ６はまた、ＢＭＰ−６；ＶＧＲ；ＶＧＲ１；Ｅｘｔｅｒｎａｌ ＩＤ：ＯＭＩＭ：１１２２６６；ＭＧＩ：８８１８２；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：１３００；ＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＢＭＰ６ Ｇｅｎｅとしても公知である。オーソログ：種：ヒト：Ｅｎｔｒｅｚ：６５４；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１５３１６２；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２２００４；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１７１８；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿００１７０９；場所（ＵＣＳＣ）：第６染色体：７．７３〜７．８８Ｍｂ；種：マウス：Ｅｎｔｒｅｚ：１２１６１；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３９００４；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２０７２２；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００７５５６；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿０３１５８２；場所（ＵＣＳＣ）：第１３染色体：３８．３５〜３８．５Ｍｂ。本明細書で記載される通り、ＢＭＰ６に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ６タンパク質に結合する。
本明細書で使用される「ＢＭＰ２」とは、タンパク質である骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、またはＢＭＰ２をコードする遺伝子もしくは核酸を意味する。ＢＭＰ２はまた、ＢＤＡ２；およびＢＭＰ２Ａ；Ｅｘｔｅｒｎａｌ ＩＤ：ＯＭＩＭ：１１２２６１；ＭＧＩ：８８１７７；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：９２６；ＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＢＭＰ２ Ｇｅｎｅとしても公知である。種：ヒト：Ｅｎｔｒｅｚ：６５０；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２５８４５；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１２６４３；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１２００；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿００１１９１；場所（ＵＣＳＣ）：第２０染色体：６．７５〜６．７６Ｍｂ。種：マウス：Ｅｎｔｒｅｚ：１２１５６；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２７３５８；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２１２７４；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００７５５３；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿０３１５７９；場所（ＵＣＳＣ）：第２染色体：１３３．５５〜１３３．５６Ｍｂ。本明細書で記載される通り、ＢＭＰ２に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ２タンパク質に結合する。
本明細書で使用される「ＢＭＰ５」とは、タンパク質である骨形成タンパク質５（ＢＭＰ５）、またはＢＭＰ５をコードする遺伝子もしくは核酸を意味する。ＢＭＰ５はまた、ＭＧＣ３４２４４；Ｅｘｔｅｒｎａｌ ＩＤ：ＯＭＩＭ：１１２２６５；ＭＧＩ：８８１８１；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２２４１２；ＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＢＭＰ５ Ｇｅｎｅとしても公知である。種：ヒト：Ｅｎｔｒｅｚ：６５３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１２１７５；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２２００３；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０２１０７３；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿０６６５５１；場所（ＵＣＳＣ）：第６染色体：５５．６２〜５５．７４Ｍｂ。種：マウス：Ｅｎｔｒｅｚ：１２１６０；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３２１７９；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ４９００３；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００７５５５；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿０３１５８１；場所（ＵＣＳＣ）：第９染色体：７５．７８〜７５．９Ｍｂ。本明細書で記載される通り、ＢＭＰ５に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ５タンパク質に結合する。
本明細書で使用される「ＢＭＰ７」とは、タンパク質である骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、またはＢＭＰ７をコードする遺伝子もしくは核酸を意味する。ＢＭＰ７はまた、ＯＰ−１（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）；ＯＰ−１；Ｅｘｔｅｒｎａｌ ＩＤ：ＯＭＩＭ：１１２２６７；ＭＧＩ：１０３３０２；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２０４１０；ＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＢＭＰ７ Ｇｅｎｅとしても公知である。種：ヒト：Ｅｎｔｒｅｚ：６５５；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０１１４４；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１８０７５；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１７１９；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿００１７１０；場所（ＵＣＳＣ）：第２０染色体：５５．７４〜５５．８４Ｍｂ。種：マウス：Ｅｎｔｒｅｚ：１２１６２；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＭＵＳＧ０００００００８９９９；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２３３５９；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００７５５７；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿０３１５８３；場所（ＵＣＳＣ）：第２染色体：１７２．８７〜１７２．９４Ｍｂ。本明細書で記載される通り、ＢＭＰ７に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、ＢＭＰ７タンパク質に結合する。
「ヘプシジン」とは、ペプチドホルモンである、遺伝子ヘプシジンまたはタンパク質ヘプシジンを意味する。ヘプシジンはまた、ＨＡＭＰ（ヘプシジン抗微生物タンパク質またはヘプシジン抗微生物ペプチド）；ＨＥＰＣ；ＨＦＥ２Ｂ；ＬＥＡＰ１（ＬＥＡＰ−１）；ＰＬＴＲ；ＯＭＩＭ：６０６４６４；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：８１６２３；ＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＨＡＭＰ Ｇｅｎｅ；Ｅｎｔｒｅｚ：５７８１７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０５６９７；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ８１１７２；ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０２１１７５；ＲｅｆＳｅｑ（タンパク質）：ＮＰ＿０６６９９８；場所（ＵＣＳＣ）：第１９染色体：３５．７７〜３５．７８Ｍｂとしても公知である。Krause et al. FEBS Lett. 480: 147-150；およびPigeon et al. 2001 J. Biol. Chem. 276: 7811-9。また、Ganz 2003 Blood 102: 783-8；Roy et al. 2005 Curr. Opin. Hemat. 12: 107-111；Fleming et al. 2006 Semin. Liver Dix. 25: 411-9；Park et al. 2001 J. Biol. Chem. 276: 7806-10；Majore et al. 2002 Haematologica 87: 221-2；Kluver et al. 2002 J. Pept. Res. 59 : 241-8；Hunter et al. 2002 J. Biol. Chem. 277 : 37597-603；Weinstein et al. 2003 Blood 100 : 3776-81；Nemeth et al. 2003 Blood 101: 2461-3；Roetto et al. 2003 Nat. Genet. 33: 21-2；Strausberg et al. 2003 Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-903；Gehrke et al. 2003 Blood 102: 371-6；Merryweather-Clarke et al. 2004 Human Mol. Genet. 12:2241-7；Clark et al. 2003 Genome Res. 13: 2265-70；Roetto et al. 2004 Blood 103: 2407-9；Jacolot et al. 2004 Blood 103: 2835-40；およびOta et al. 2004 Nat. Genet. 36: 40-45も参照されたい。
本明細書で使用される「貧血」とは、血液中の赤血球の数の減少、またはヘモグロビンもしくは鉄の量の減少を意味し、血液の、酸素を保有する能力の低下を伴う。
貧血は、非限定的な例として、男性では、約１３０〜１４０ｇ／Ｌ（１３〜１４ｇ／ｄＬ）未満のヘモグロビンに基づき、女性では、約１２０〜１３０ｇ／Ｌ（１２〜１３ｇ／ｄＬ）未満のヘモグロビンに基づく方法を含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して診断することができる。Janz et al. 2013 Emerg. Med. Pract. 15: 1-15；およびSmith 2010 Am. J. Man. Care 16 Supp. S59-66。
本明細書で使用される「ＢＭＰ６抗体」、「抗ヒトＢＭＰ６抗体」、「ＢＭＰ６結合性抗体」、「ＢＭＰ６アンタゴニスト抗体」（およびこれらの抗原結合性断片）などの用語は、タンパク質であるＢＭＰ６に結合する抗体（およびそれらの抗原結合性断片）を含む。
本明細書で使用される「抗体」、「その抗原結合性断片」、「抗原結合性部分」などの用語は、全抗体および任意のその抗原結合性断片（すなわち、「抗原結合性部分」）または単鎖を含む。天然の「抗体」とは、ジスルフィド結合により相互接続された、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と、２つの軽（Ｌ）鎖とを含む、糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存的な領域を散在させた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよび各ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４からなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性断片」、「その抗原結合性断片」、「抗原結合性部分」などの用語は、所与の抗原（例えば、ＢＭＰ６）に特異的に結合する能力を保持する、インタクト抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能は、インタクトな抗体の断片により果たされうる。抗体の「抗原結合性部分」という用語内に包含される結合性断片の例は、Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；ならびに単離相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬドメインおよびＶＨドメインは、個別の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖として作製することを可能とする人工のペプチドリンカーにより付着することができ、この場合、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であり、例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426；およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照されたい）を形成する。このような単鎖抗体は、抗体の１つまたは複数の「抗原結合性部分」を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片も、インタクトな抗体と同じ形で有用性についてスクリーニングされる。
抗原結合性部分はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖ（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136を参照されたい）へと組み込むこともできる。抗体の抗原結合性部分は、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチド（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）に基づく足場へとグラフトすることができる。
抗原結合性部分は、相補的な軽鎖ポリペプチドと併せて抗原結合性領域の対を形成する、タンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む単鎖分子へと組み込むことができる（Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062；および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
本明細書で使用される「アフィニティー」という用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位において、弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用し、相互作用が大きいほど、アフィニティーは強くなる。
本明細書で使用される「アビディティー」という用語は、抗体−抗原複合体の、全体的な安定性または強度についての有益な尺度を指す。アビディティーは、３つ主要な因子：抗体エピトープのアフィニティー；抗原および抗体の両方の価数；ならびに相互作用部分の構造的配置により制御される。最終的に、これらの因子は、抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が、正確な抗原エピトープに結合する可能性を規定する。
「アミノ酸」という用語は、自然発生のアミノ酸および合成アミノ酸のほか、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体も指す。自然発生のアミノ酸とは、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のほか、後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンでもある。アミノ酸類似体とは、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したアルファ炭素を有する化合物を指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、１つの抗原決定基だけと反応する個別の抗原結合部位の能力を指す。抗体の結合性部位は、分子のＦａｂ部分内に位置し、重鎖および軽鎖の超可変領域から構築される。抗体の結合アフィニティーは、単一の抗原決定基と、抗体上の単一の結合性部位との反応の強度である。結合特異性とは、抗原決定基と、抗体の結合性部位との間に作用する引力および斥力の合計である。
２つの実体の間の特異的結合とは、平衡定数（ＫＡまたはＫＡ）が少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、または１０１１Ｍ−１である結合を意味する。抗体（例えば、ＢＭＰ６結合性抗体）に「特異的に（または選択的に）結合する」という語句は、タンパク質および他の生体物質の異質な集団内の、コグネイト抗原（例えば、ヒトＢＭＰ６タンパク質）の存在を決定する結合反応を指す。上記で言及した平衡定数（ＫＡ）に加えて、本発明のＢＭＰ６結合性抗体はまた典型的に、約１×１０−２秒−１、１×１０−３秒−１以下の解離速度定数（ＫｄまたはＫＤまたはＫＤ）も有し、ＢＭＰ６に、非特異的抗原（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５またはＢＭＰ７）への結合についてのそのアフィニティーの、少なくとも２倍のアフィニティーで結合する。本明細書では、「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という語句を、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用する。
２つの実体の間の特異的結合とは、平衡定数（ＫＡ）（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）が、少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１、または少なくとも５×１０１５Ｍ−１である結合を意味する。
「キメラ抗体」（またはその抗原結合性断片）という用語は、（ａ）抗原結合性部位（可変領域）を、クラス、エフェクター機能、および／もしくは種が異なるか、またはクラス、エフェクター機能、および／もしくは種を改変された定常領域、あるいはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などへと連結するように、定常領域またはその一部を、改変するか、置きかえるか、または交換した抗体分子（またはその抗原結合性断片）；あるいは（ｂ）可変領域またはその一部を、抗原特異性が異なるか、または抗原特異性を改変された可変領域により改変するか、置きかえるか、またはこれと交換した抗体分子（またはその抗原結合性断片）を指す。例えば、マウス抗体は、その定常領域を、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域で置きかえることにより修飾することができる。ヒト定常領域による置きかえに起因して、キメラ抗体は、ヒトにおける抗原性を、元のマウス抗体と比較して低減しながら、抗原の認識におけるその特異性を保持しうる。
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列のいずれにも適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一なアミノ酸配列もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために、多数の機能的に同一な核酸が、所与の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンであるＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵのいずれも、アミノ酸であるアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを改変せずに、コドンを、記載された対応するコドンのうちのいずれかへと改変することができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異のうちの１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書のあらゆる核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても記載する。当業者は、核酸内の各コドン（通常メチオニンだけのコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンだけのコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一な分子をもたらしうることを認識するであろう。したがって、記載される各配列内では、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が含意されている。
ポリペプチド配列では、「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸による置換を結果としてもたらす、ポリペプチド配列への個別の置換、欠失、または付加を含む。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換表が周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。以下の８つの群：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含有する（例えば、Creighton, Proteins(1984)を参照されたい）。一実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴にそれほど大きな影響を及ぼしたりこれを改変したりしないアミノ酸修飾を指すのに使用する。
本明細書で使用される「〜を遮断する」という用語は、相互作用または過程を停止させるか、または阻止すること、例えば、リガンド依存的なシグナル伝達またはリガンド非依存的なシグナル伝達を停止させることを指す。
本明細書で使用される「〜を認識する」という用語は、そのコンフォメーショナルエピトープを見出し、これと相互作用する（例えば、結合する）、抗体またはその抗原結合性断片を指す。
本明細書では、「〜を交差遮断する」、「交差遮断された」、「〜を交差遮断すること」、「競合する」、「交差競合する」という用語、および類縁の用語は、標準的な競合的結合アッセイにおいて、他の抗体または結合剤の、ＢＭＰ６への結合に干渉する、抗体または他の結合剤の能力を意味するように、互換的に使用される。
抗体または他の結合剤が、別の抗体または結合性分子の、ＢＭＰ６への結合に干渉することが可能な能力または程度は、標準的な競合結合アッセイを使用して決定することができ、したがって、本発明に従い、抗体または他の結合剤が、交差遮断すると言いうるのかどうかも、標準的な競合結合アッセイを使用して決定することができる。１つの適切なアッセイは、表面プラズモン共鳴技術を使用して、相互作用の程度を測定することができる、Ｂｉａｃｏｒｅ技術の使用を伴う（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することにより）。交差遮断を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースの手法を使用する。
「〜を中和する」という用語は、抗体が、その標的に結合すると、標的の活性、レベル、または安定性を低減すること；例えば、ＢＭＰ６抗体が、ＢＭＰ６に結合すると、シグナル伝達、またはヘプシジンレベルおよび貧血におけるその役割など、ＢＭＰ６の活性、レベル、または安定性を少なくとも部分的に低減することにより、ＢＭＰ６を中和することを意味する。
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的な結合が可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは通例、アミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からなり、通例、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有する。コンフォメーショナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープとは、前者への結合は、変性溶媒の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンへの特異的な結合が可能であるか、または分子と他の形で相互作用することが可能な、任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は一般に、アミノ酸であるＢＭＰ６または炭水化物もしくは糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からなり、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有しうる。エピトープは、「直鎖状」エピトープの場合もあり、「コンフォメーショナル」エピトープの場合もある。
「直鎖状エピトープ」という用語は、タンパク質と、相互作用分子（抗体など）との、相互作用点の全てを伴うエピトープが、タンパク質の一次（連続）アミノ酸配列に沿って、直鎖状に生じることを指す。
本明細書で使用される、ＩｇＧ抗体に対する「高アフィニティー」という用語は、標的抗原、例えば、ＢＭＰ６に対するＫＤが、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、または１０−１０Ｍ、または１０−１１Ｍ以下である抗体を指す。しかし、他の抗体アイソタイプに対する「高アフィニティー」結合は、変化しうる。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高アフィニティー」結合は、ＫＤが、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下である抗体を指す。
本明細書で使用される「ヒト抗体」（またはその抗原結合性断片）という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域のいずれもが、ヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体（およびそれらの抗原結合性断片）を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列またはヒト生殖細胞系列配列の突然変異させたバージョンに由来する。本発明のヒト抗体およびそれらの抗原結合性断片は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異により導入された突然変異）を含みうる。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」（またはその抗原結合性断片）という語句は、実質的に同一なアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝子供給源に由来する、抗体、抗体断片、二特異性抗体などを含むポリペプチドを指す。この用語はまた、単一の分子組成による抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。
「ヒトモノクローナル抗体」（またはその抗原結合性断片）という用語は、単一の結合特異性を提示する抗体（およびそれらの抗原結合性断片）であって、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域のいずれもが、ヒト配列に由来する可変領域を有する抗体（およびそれらの抗原結合性断片）を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞へと融合させた、ヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックの非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより作製する。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」（またはその抗原結合性断片）という語句は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させるように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、他の任意の手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される抗体など、組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される全てのヒト抗体（およびそれらの抗原結合性断片）を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。一実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は、ｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、これらに関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内で天然には存在しない可能性がある配列である。
本明細書で使用される「ヒト化」抗体（またはその抗原結合性断片）とは、ヒトにおける免疫原性は小さいが、非ヒト抗体の反応性を保持する抗体（またはその抗原結合性断片）である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分を、それらのヒト対応物（すなわち、可変領域の定常領域ならびにフレームワーク部分）で置きかえることにより達成することができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991；およびPadlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994を参照されたい。ヒト操作技術の他の例は、米国特許第５，７６６，８８６号明細書において開示されているＸｏｍａ技術を含むがこれらに限定されない。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一な」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の配列または部分配列が同じであることを指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手作業のアライメントおよび目視により測定される比較域または指定領域にわたり、最大の対応性について比較され、配列決定された場合の、２つの配列の、指定された百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じであれば（すなわち、指定される領域にわたる、または、指定されない場合は、配列全体にわたる、６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有すれば）、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の長さの領域にわたり、またはより好ましくは、１００〜５００、または１０００ヌクレオチド以上（または２０、５０、または２００アミノ酸以上）の長さの領域にわたり存在する。任意選択で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の長さの領域にわたり、またはより好ましくは、１００〜５００、または１０００ヌクレオチド以上（または２０、５０、または２００アミノ酸以上）の長さの領域にわたり存在する。
配列比較では、１つの配列が、それに照らして被験配列を比較する基準配列として働くことが典型的である。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および基準配列をコンピュータへと入力し、必要な場合は、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもでき、代替的なパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づき、被験配列について、基準配列と比べた配列同一性パーセントを計算する。
本明細書で使用される「比較域」は、２つの配列を最適に配列決定した後で、配列を、同じ数の連続的な位置による基準配列と比較しうる、２０〜６００、通例約５０〜約２００、より通例では、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続的な位置の数のうちのいずれか１つによるセグメントに対する言及を含む。当技術分野では、比較のための配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、SmithおよびWaterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cによる局所相同性アルゴリズムにより行うこともでき、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970による相同性アライメントアルゴリズムにより行うこともでき、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988による類似性検索法により行うこともでき、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により行うこともでき、手作業のアライメントおよび目視（例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.（ringbou ed., 2003）を参照されたい）により行うこともできる。
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの２つの例は、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990において記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードで配列決定したときに、ある正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたはこれを満たす、クエリー配列内の短いワード長Ｗを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを伴う。Ｔを、隣接ワードスコア閾値（Altschul et al., 前出）と称する。これらの初期の隣接ワードヒットが、これらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして働く。累積アライメントスコアが増大しうる限りにおいて、ワードヒットを、各配列に沿っていずれの方向にも拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、達成されたその最大値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたは複数の負スコア残基のアライメントの累積のために、累積スコアが、ゼロ以下に低下した場合；または配列のいずれかの末端に達した場合は、各方向へのワードヒットの拡張を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、１１のワード長（Ｎ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムでは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性についての統計学的解析（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照されたい）も実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチングが偶然に生じる確率の指標をもたらす最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、被験核酸を基準核酸に照らして比較したときの最小合計確率が約０．２未満であり、より好ましくは、約０．０１未満であり、最も好ましくは、約０．００１未満であれば、核酸は基準配列と類似すると考えられる。
２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれた、E. Meyers and W. Miller(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで入手可能である）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、Needleman and Wunsch(J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。
上記で言及した配列同一性百分率以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけによって異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一なことが典型的である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、２つの分子またはそれらの相補体が、厳密な条件下で、互いとハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅しうることである。
本明細書で使用される「単離抗体」（またはその抗原結合性断片）という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（またはその抗原結合性断片）を指す（例えば、ＢＭＰ６に特異的に結合する単離抗体は、ＢＭＰ６以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離抗体は、他の細胞内物質および／または化学物質を実質的に含まない場合もある。
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によりもたらされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＧ）を指す。アイソタイプはまた、これらのクラスのうちの１つの修飾バージョンも含み、その修飾は、Ｆｃ機能を改変する、例えば、エフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を増強または低減するように施されている。
本明細書で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」または「ＫＡ」または「ＫＡ」という用語が、特定の抗体−抗原間相互作用の会合速度を指すことを意図するのに対し、本明細書で使用される「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用の解離速度を指すことを意図する。一実施形態では、本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指すことを意図し、モル濃度（Ｍ）として表す。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用するか、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（またはその抗原結合性断片）または「モノクローナル抗体（またはその抗原結合性断片）組成物」という用語は、単一の分子組成による抗体分子（またはその抗原結合性断片）の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。
本明細書では、「核酸」という用語が、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖形態または二本鎖形態におけるポリマーを指す。「核酸」という用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは修飾連結を含有する核酸であって、合成の核酸、自然発生の核酸、および非自然発生の核酸であり、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌクレオチドと同様の形で代謝される核酸を包含する。このような類似体の例は、限定なしに述べると、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
別段に指し示されない限りにおいて、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も暗示的に包含するほか、明示的に指し示される配列も包含する。とりわけ、下記で詳述される通り、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作り出すことにより達成することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985；およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメントの間の機能的関係を指す。それは転写調節配列の、転写される配列に対する機能的関係を指すことが典型的である。例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞内または他の発現系内のコード配列の転写を刺激またはモジュレートするとき、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列と物理的に隣接する、すなわち、シス作用型である。しかし、エンハンサーなど、一部の転写調節配列は、その転写をそれらが増強するコード配列に物理的に隣接する必要も、近接して配置される必要もない。
本明細書で使用される「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列を、産生細胞または産生生物、一般に、真核細胞、例えば、ピキア（Pichia）属細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように改変していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としてもまた公知の出発ヌクレオチド配列により本来コードされるアミノ酸配列を、完全に、または可能な限り多く保持するように操作する。本明細書の最適化された配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。しかし、本明細書ではまた、他の真核細胞または原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現も企図される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されていると称する。
本明細書では、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語が、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生のアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーのほか、自然発生のアミノ酸ポリマーおよび非自然発生のアミノ酸ポリマーにも適用される。別段に指し示されない限りにおいて、特定のポリペプチド配列はまた、保存的に修飾されたその変異体も暗示的に包含する。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」（またはその抗原結合性断片）という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させるように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、他の任意の手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される抗体など、組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される全てのヒト抗体（およびそれらの抗原結合性断片）を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、一実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は、ｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、これらに関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内で天然には存在しない可能性がある配列である。
「組換え宿主細胞」（または、簡単に、「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターを導入した細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけを指すことを意図するものではなく、このような細胞の子孫細胞も指すことを意図するものであることを理解されたい。後続する世代では、突然変異または環境的影響に起因して、ある種の修飾が生じうるため、このような子孫細胞は、実のところ、親細胞と同一ではない可能性もあるが、やはり本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物および非哺乳動物）を含む。特記される場合を除き、本明細書では、「患者」または「対象」という用語が互換的に使用される。
「〜を処置すること」という用語は、疾患（例えば、貧血）の症候、合併症、もしくは生化学的徴標の発症を防止するか、もしくは遅延させるか、症候を緩和するか、または疾患、状態、もしくは障害のさらなる進行を停止させるか、もしくは阻害する組成物または抗体の投与を含む。処置は、予防的な（疾患の発症を防止するか、もしくは遅延させるか、またはその臨床症候もしくは亜臨床症候の症状を防止する）場合もあり、疾患の発症の後における、症候の治療的抑制または緩和の場合もある。
「ベクター」という用語は、それが連結された別のポリヌクレオチドを輸送することが可能なポリヌクレオチド分子を指すことを意図する。ベクターのうちの１つの種類は、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなるＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノムへとライゲーションしうる、ウイルスベクターである。ある種のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）は、それらが導入された宿主細胞における自己複製が可能である。他のベクター（例えば、非哺乳動物のエピソームベクター）は、宿主細胞へと導入すると、宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿主ゲノムと共に複製する。さらに、ある種のベクターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」（または簡単に、「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」とを互換的に使用することができる。しかし、本発明は、同等な機能をもたらすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、発現ベクターの他の形態も含むことを意図する。
本明細書で使用される「ヘマトクリット（hematocrit）」または「ヘマトクリット（haematocrit）」という用語はまた、充填細胞体積（ＰＣＶ）または赤血球体積分率（ＥＶＦ）としても公知であり、血液中の赤血球の体積（％）である。ヘマトクリットは、男性では、約４５％が正常であり、女性では約５０％が正常である。ヘマトクリットは、ヘモグロビン濃度、白血球数、および血小板数と共に、ある人の全血球算定結果の不可欠な部分であると考えられる。一実施形態では、貧血は、ヘマトクリットの異常な上昇である多血症と対照的に、ヘマトクリットの異常な低下を指す。
図１Ａは、レポーター遺伝子アッセイにおける、アンタゴニストである、抗体５、抗体６、および抗体７による、ＢＭＰ活性の阻害を示す図である。ＢＭＰ２、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ７に対する活性が示される。図１Ｂは、抗体７の、ヒトＢＭＰ６、ヒトＢＭＰ７、ヒトＢＭＰ５、マウスＢＭＰ６、マウスｈＢａｆｆＲ、マウスＢＳＡ、およびマウスＮｅｕへの結合について調べるＥＬＩＳＡ結合アッセイを示す図である。この図および他の多様な図、ならびに本明細書の他の箇所では、Ａｂ５＝抗体５；Ａｂ６＝抗体６；およびＡｂ７＝抗体７である。 前記の通り。 単回投与ラットトリアージＰＫ研究についての薬力学プロファイルを示す図である。抗体５、抗体６、および抗体７を使用した。血清ヘプシジンレベルおよび血清鉄レベルは、投与（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）の１時間、６時間、１、２、４、８、１６日後に測定した。 ＢＭＰ６抗体の、鉄代謝についての血清バイオマーカーに対する用量依存的効果を示す図である。上：表示の用量の、抗体６の単回ＩＶ注射後における、時間経過にわたる血清ｈＩｇＧ濃度である。下：左パネルが、単回の抗体６または対照ヒトＩｇＧ注射の後における、血清ヘプシジン濃度についての定量的解析を示す図であるのに対し、右パネルは、血清鉄濃度を示す図である。 ＥＳＡ抵抗性炎症性貧血マウスモデルにおける、ＢＭＰ６抗体の治療的処置を示す図である。上：ＢＡ誘導型ＥＳＡ抵抗性炎症性貧血モデルについて実験のスキームを示す図である。下：ＢＡ処理の１３日後における、赤血球生成パラメータを示す図である。ＨＧＢ：ヘモグロビン；ＨＣＴ：ヘマトクリット；ＲＥＴＡ：網状赤血球カウント；ＲＥＴ−ＨＥ：網状赤血球ヘモグロビン同等物である。ＢＡ＋ＥＰＯ＋ｈＩｇＧ１に対し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 ＨＤｘＭＳ（質量分析とカップリングした水素／重水素交換）による直鎖状エピトープマッピングを示す図である。抗体７が結合するＢＭＰ６のエピトープを示す（ヒトＢＭＰ６（ＱＴＬＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰ（配列番号９２））の残基８８〜１０２）。ＨＤｘＭＳを使用して、市販のＢＭＰ６抗体のヒト化バージョンである抗体６７６は、ヒトＢＭＰ６の残基２３〜３５（ＶＳＳＡＳＤＹＮＳＳＥＬＫ（配列番号９５））からなるエピトープに結合することが見出された。 ＢＭＰ６抗体の安全性および有効性について探査する臨床プログラムのパート１のためのプロトコールを示す図である。 ＢＭＰ６抗体の安全性および有効性について探査する臨床プログラムための用量調整決定木を示す図である。 ＢＭＰ６抗体の安全性および有効性について探査する臨床プログラムのパート２のためのプロトコールを示す図である。 雄ラットにおける単回投与抗体７の薬物動態プロファイルを示す図である。 抗体７の、ラットにおける鉄代謝についての血清バイオマーカーに対する用量依存的な効果を示す図である。表示の用量での、単回の、抗体７または対照（ビヒクル）の注射の後における、血清ヘプシジン濃度についての定量的解析が示される。左パネルは、投与後最初の２４時間にわたる効果についての拡大図を示す図である。 抗体７の、ラットにおける血清鉄に対する用量依存的な効果を示す図である。表示の用量の、単回の、抗体７または対照（ビヒクル）の注射の後における、血清鉄についての定量的解析が示される。左パネルは、投与後最初の２４時間にわたる効果についての拡大図を示す図である。 カニクイザルにおける、抗体７（３ｍｇ／ｋｇ）の、単回投与ＩＶ注射についての濃度−時間プロファイルを示す図である。総抗体７濃度（遊離抗体７およびＢＭＰ６に結合した抗体７の両方）がプロットされる。 ３ｍｇ／ｋｇの用量での、抗体７の単回静脈内注射の後の、雄カニクイザルにおける、血清ヘプシジン濃度および血清Ｆｅ濃度を示す図である。３匹の異なるサルに由来するデータを、平均値と併せて示す。
発明の詳細な記載
本発明は、ＢＭＰ６タンパク質に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片、ならびにこのような抗体および組成物の、医薬組成物、作製法、および使用法を提供する。
ＢＭＰ６抗体およびそれらの抗原結合性断片
本発明は、ヒトＢＭＰ６に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片を提供する。
ＢＭＰファミリー成長因子の分泌型リガンドであるＢＭＰ６は、鉄代謝ホルモンであるヘプシジンの肝臓における発現に対する、重要な内因性調節因子として同定されている。いかなる特定の理論にも束縛されないが、本開示は、ヘプシジン降下療法としてのＢＭＰ６アンタゴニスト抗体が、基礎疾患の罹患率を実質的に増加させ、転帰不良の予測因子であることが多い、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）に対する抵抗性を克服することにより、鉄欠乏性貧血を伴う患者に利益をもたらすと予測されることを示唆する。
このような抗ヒトＢＭＰ６抗体の例は、抗体３、抗体５、抗体６、および抗体７であり、これらの配列を、表１に列挙する。
抗体５、抗体６、および抗体７は全て、高アフィニティーで、ヒトＢＭＰ６に結合し、ヒトＢＭＰ７、ヒトＢＭＰ５、およびヒトＢＭＰ２に対する選択性を上回る高選択性を伴う（図１Ａを参照されたい）。これらの抗体はまた全て、ラットにおける、血清ヘプシジンの減少および血清鉄の増大も裏付ける（図２を参照されたい）。
この経路を標的とすることにより、機能的な評価項目の改善を付与しうるという、さらなる証拠をもたらすために、本発明者らは、ＢＭＰ６特異的抗体である抗体５〜７が、正常マウスおよび正常ラットにおける鉄代謝についての血清バイオマーカーをモジュレートし、炎症性貧血のマウスモデルにおけるＥＳＡ抵抗性貧血を転導する能力について調べた。本発明者らは、動物へのＢＭＰ６抗体の単回の注射が、循環ヘプシジンの強力な抑制を伴う、血清鉄レベルの持続的増大を結果としてもたらすことを見出した。さらに、炎症誘導性貧血下にあるマウスの治療的処置は、併用のエリスロポエチン処置に応答する赤血球生成パラメータを著明に改善した。
本開示では、炎症性貧血のマウスモデルにおけるＢＭＰ６シグナル伝達の阻害により、鉄依存的な赤血球パラメータが実質的に改善された。
本明細書で開示されるＢＭＰ６アンタゴニスト抗体は、エリスロポエチン低応答性を伴う貧血を安全に改善する、新規の治療法となる。いかなる特定の理論にも束縛さないが、本開示は、これが、赤血球系コンパートメントからの要求に対する、貯蔵鉄の移動およびアベイラビリティーを介して生じうることを示唆する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ６タンパク質に対して、ヒトＢＭＰ５タンパク質またはヒトＢＭＰ７タンパク質のうちのいずれかに対するアフィニティーの１００、５００、または１０００倍のアフィニティーで結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ＢＭＰ６のノックアウトは、マウスに対して致死性ではないので、ＢＭＰ７への結合を伴わない、ＢＭＰ６に対する特異性は重要である。しかし、ＢＭＰ７をノックアウトされたマウスは、腎臓、眼、および骨の欠損を伴い、生後に死亡する。一方の遺伝子の個別のノックアウトは、心臓発生を改変しないが、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７の二重ノックアウトは、心臓における何らかの欠損および遅延を裏付け、胎仔は、心不全で死亡した。ＢＭＰ７は、線維症と関連する慢性心疾患の進行を阻止するのに重要である。したがって、抗ＢＭＰ６抗体の、ＢＭＰ７との交差反応性は、所望されない。本明細書で提示される抗体は、ＢＭＰ７よりＢＭＰ６に特異的である（例えば、表４Ａを参照されたい）。図１Ｂはまた、ヒトＢＭＰ２、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ７ タンパク質に対する結合特異性を上回る、ヒトＢＭＰ６に対する結合特異性についての証拠も示す。これに対し、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから市販されているＢＭＰ６抗体は、例えば、レポーター遺伝子アッセイにおいて、ＢＭＰ７に対して強い交差反応性を有し、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７の両方を阻害することが明らかにされた。
本発明の抗体は、実施例（下記の６節を参照されたい）で記載される通りに単離された、ヒトモノクローナル抗体を含むがこれらに限定されない。
このような抗ヒトＢＭＰ６抗体の例は、抗体３、抗体５、抗体６、および抗体７であり、これらの配列を、表１に列挙する。
成熟抗体７は、親ＩｇＧヒットＮＯＶ０４４２（ＶＨ３＿３−１５、Ｖｌ１＿１ｅ）に由来する、生殖細胞系列化／ＰＴＭ除去体である、ＮＯＶ０４４２＿ＶＬ（ＹＧＱ）に由来する。抗体７は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、ヒトＢＭＰ６に、高アフィニティーで結合し、ヒトＢＭＰ７に対する選択性は、５００倍を超える（すなわち、ヒトＢＭＰ６に対する、ヒトＢＭＰ７に対するアフィニティーの５００倍を超えるアフィニティー）。この抗体はまた、ヒトＢＭＰ２またはＢＭＰ５に対しても、検出可能な活性を有さない。親ＩｇＧであるＮＯＶ０４４２および抗体７により認識されるＢＭＰ６ペプチドを、図５に示す。ペプチドは、ヒトＢＭＰ６のアミノ酸である、ＱＴＬＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰ（配列番号９２）を含む。ＩｇＧ ＮＯＶ０４４２および抗体７とは対照的に、ヒト化ｍＡｂ５０７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ヒトＢＭＰ６の配列ＶＳＳＡＳＤＹＮＳＳＥＬＫ（配列番号９５）に結合する。したがって、ＩｇＧ ＮＯＶ０４４２および抗体７により認識されるエピトープは、新規のＢＭＰ６エピトープを表す。抗体７はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＢＭＰ６の、受容体への結合も阻害する。ＢＭＰ６の、ＢＭＰＲ１Ａへの結合は、最大で５９％阻害され；ＢＭＰＲ１Ｂへの結合は、最大で８５％阻害され；ＲＧＭ−ｃへの結合は、最大で７２％阻害される。ラットにおける、単回の１０ｍｇ／ｋｇによる処置は、循環ヘプシジンの持続的抑制をもたらした。マウスにおける推定最小有効用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。サルにおける３ｍｇ／ｋｇの単回の抗体投与の後ではまた、血清鉄も増大を示し、ヘプシジンは減少を示した。ウシ流産菌（Brucella abortus）抗原を使用して、貧血を刺激したマウスでは抗体７（２ｍｇ／ｋｇ）の処置効果は、慢性ＥＰＯ治療に対する、臨床的に有意な赤血球生成応答と符合し、ベースラインからのヘモグロビンの段階的な増大は、２．０ｇ／ｄＬ超である。
抗体７では、ＬＣＤＲ２内のＮ５１Ｑ突然変異により、潜在的な翻訳後修飾部位を除去して、後続の生成物の均質性を増大させる。ＶＨ３／ラムダ１フレームワークに由来する最も近縁のヒト生殖細胞系列配列にマッチさせるために、ＶＨでは、Ｖ４０Ａ突然変異により、ＶＬでは、Ｄ１Ｑ突然変異、Ｉ２Ｓ突然変異により、かつ、これらの２つの残基が当初は逸失していたフレームワークを修復する、アミノ酸Ｙ４９およびＧ５０の導入により、抗体を操作した。
本研究は、抗体７（＝ＮＯＶ０９５８＝ＮＯＶ０８０６＿ＶＨ［Ｖ４０Ａ］＿ＶＬ［Ｄ１Ｑ、Ｉ２Ｓ、Ｙ４９、Ｇ５０、Ｎ５１Ｑ］）を結果としてもたらした。
抗体３、抗体５、抗体６、および抗体７は全て、ヒトＢＭＰ２タンパク質、ヒトＢＭＰ５タンパク質、またはヒトＢＭＰ７タンパク質と比較して、ヒトＢＭＰ６タンパク質に対する高特異性を示す。これらの全ての抗体のエピトープは、全てが、アフィニティー成熟の前における、単一の親Ｆａｂに由来するので、同じであると予測される。例えば、抗体３は、ＨＣＤＲ２のアフィニティー成熟の前における、抗体５および抗体７の両方と、同じＦａｂクローンを共有する。抗体５は、ＮＯＶ０４４２（ＶＨ３＿３−１５、ＶＩ１＿１ｅ）→ＮＯＶ０４４２＿ＶＬ（ＹＧＱ）→（ＨＣＤＲ２のアフィニティー成熟）→抗体５に由来する。抗体３は、ＮＯＶ０４４２（ＶＨ３＿３−１５、ＶＩ１＿１ｅ）→ＮＯＶ０４４２＿ＶＬ（ＹＧＳ）→（ＨＣＤＲ２のアフィニティー成熟）→抗体３に由来する。本明細書で記載される抗体の作出に関するさらなる詳細は、実施例に提示する。
本発明は、ＢＭＰ６（例えば、ヒトＢＭＰ６タンパク質）に特異的に結合する抗体であって、表１に列挙されるＶＨドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、ＢＭＰ６タンパク質に特異的に結合する抗体であって、表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、ＢＭＰ６タンパク質に特異的に結合する抗体であって、表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上のＶＨ ＣＤＲを含む（または代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
本発明はまた、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片であって、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の約１０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。本発明はまた、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片であって、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の１０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。
本発明はまた、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片であって、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の約２０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。本発明はまた、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片であって、表１に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の２０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。
本発明はまた、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片であって、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の約１０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。本発明はまた、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片であって、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の１０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。
本発明はまた、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片であって、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の約２０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。本発明はまた、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片であって、表１に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲでない配列）内の２０以下のアミノ酸を突然変異させた（この場合、突然変異は、多様な非限定的な例として、付加、置換、または欠失である）抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。
本発明は、ＢＭＰ６タンパク質に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片であって、表１に列挙されるＶＬドメインを含む抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。本発明はまた、ＢＭＰ６タンパク質に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片であって、表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む抗体またはそれらの抗原結合性断片も提供する。特に、本発明は、ＢＭＰ６タンパク質に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片であって、表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上のＶＬ ＣＤＲを含む（または代替的に、これらからなる）抗体およびそれらの抗原結合性断片を提供する。
本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、突然変異させているが、ＣＤＲ領域内の、表１に記載される配列に描示されるＣＤＲ領域との、少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。一実施形態では、本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５以下のアミノ酸を、表１に記載される配列に描示されるＣＤＲ領域と比較して突然変異させた、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、ＢＭＰ６タンパク質に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、および全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳動物細胞内の発現について最適化することができる（例えば、表１は、抗体３、抗体５、抗体６、および抗体７の、重鎖および軽鎖の例となる核酸配列を示す）。
本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸を突然変異させているが、表１に記載される配列との、少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセントの同一性を有する、抗体およびそれらの抗原結合性断片を含む。一実施形態では、本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、実質的に同じ治療的活性を保持しながら、可変領域内の１、２、３、４または５以下のアミノ酸を、表１に記載される配列に描示される可変領域と比較して突然変異させた、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ６に結合し、それぞれ、配列番号９、１０、および１１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１９、２０、および２１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ６に結合し、それぞれ、配列番号１２、１３、および１４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ６に結合し、それぞれ、配列番号２９、３０、および３１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３９、４０、および４１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ６に結合し、それぞれ、配列番号３２、３３、および３４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号４２、４３、および４４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ６に結合し、それぞれ、配列番号４９、５０、および５１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５９、６０、および６１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ６に結合し、それぞれ、配列番号５２、５３、および５４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号６２、６３、および６４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ６に結合し、それぞれ、配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ヒトＢＭＰ６に結合し、それぞれ、配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列を含む単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
これらの抗体の各々は、ＢＭＰ６に結合しうるので、ＶＨ配列、ＶＬ配列、全長軽鎖配列、および全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を、「混合し、マッチさせ」て、本発明の他のＢＭＰ６結合性抗体およびそれらの抗原結合性断片を創出することができる。このような「混合し、マッチさせた」ＢＭＰ６結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび実施例節で記載される他のアッセイ）を使用して調べることができる。これらの鎖を混合し、マッチさせる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長重鎖配列を、構造的に類似する全長重鎖配列で置きかえるものとする。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長軽鎖配列を、構造的に類似する全長軽鎖配列で置きかえるものとする。
別の態様では、本発明は、表１に記載される、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３、またはこれらの組合せを含むＢＭＰ６結合性抗体を提供する。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を使用して、またはＣｈｏｔｈｉａシステム［Chothia et al. 1987 J. Mol. Biol. 196: 901-917；およびAl-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 927-948］を使用して画定される。
これらの抗体の各々は、ＢＭＰ６に結合することが可能であり、抗原結合特異性は主に、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域によりもたらされることを踏まえれば、各抗体は、本発明の他のＢＭＰ６結合性分子を創出するのに、ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列を、「混合し、マッチさせる」ことができる（すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを、混合し、マッチさせることができる。但し、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含有しなければならない）。このような「混合し、マッチさせた」ＢＭＰ６結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイおよび実施例で記載される結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して調べることができる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。当業者には、新規のＶＨ配列およびＶＬ配列を、１つまたは複数のＶＨ ＣＤＲ領域配列および／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体のための、本明細書で示されるＣＤＲ配列に由来する、構造的に類似する配列で突然変異させることにより創出しうることがたやすく明らかであろう。
したがって、本発明は、配列番号２９、４９、６９、１２、３２、５２、７２、または９のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１０、３０、５０、７０、１３、３３、５３、または７３のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ２；配列番号１１、３１、５１、７１、１４、３４、５４、または７４のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ３；配列番号１９、３９、５９、７９、２２、４２、６２、または８２のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２０、４０、６０、８０、２３、４３、６３、または８３のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および配列番号２１、４１、６１、８１、２４、４４、６４、または８４のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含み、抗体が、ＢＭＰ６に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。
一実施形態では、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体は、表１に記載される抗体である。
抗体の可変領域または全長鎖が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、本明細書で使用されるヒト抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」、重鎖もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もしくは軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを、対象の抗原で免疫化するか、または対象の抗原を伴うファージ上で提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列がヒト抗体の配列と最も近似する（すなわち、同一性％が最大である）ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより、それ自体として同定することができる。特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生の体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較したアミノ酸の差異を含有しうる。しかし、ＶＨフレームワーク領域またはＶＬフレームワーク領域では、選択されたヒト抗体は、アミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一であり、ヒト抗体を、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較した場合に、ヒトとして同定するアミノ酸残基を含有することが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、アミノ酸配列が、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％、なおまたは、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。組換えヒト抗体は、ＶＨフレームワーク領域内またはＶＬフレームワーク領域内のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、１０アミノ酸以下の差異を提示することが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、５アミノ酸以下、なおまたは、４、３、２、または１アミノ酸以下の差異を提示しうる。
ＢＭＰファミリーメンバーおよびヘプシジン
一実施形態では、本発明は、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体またはその結合性断片を提供する。一実施形態では、抗体またはその結合性断片は、表１に記載されている。
一実施形態では、抗体またはその結合性断片は、ＢＭＰ６には特異的に結合するが、他のＢＭＰタンパク質（ＢＭＰ２、ＢＭＰ５またはＢＭＰ７など）には特異的に結合しない。
ＢＭＰファミリー成長因子の分泌型リガンドであるＢＭＰ６とは、その成熟活性形態において、３０ｋＤａのジスルフィド連結されたホモ二量体である。ＢＭＰ６タンパク質は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのメンバーである。骨形成タンパク質は、骨および軟骨の成長を誘導するそれらの能力について公知である。ＢＭＰ６は、間葉系幹細胞内の、全ての骨形成マーカーを誘導することが可能である。
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、異所性の骨成長を誘導しうる、分泌型シグナル伝達分子のファミリーである。ＢＭＰは、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーの一部である。ＢＭＰは元来、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、骨外部位の、軟骨内骨形成を誘導する、脱塩骨抽出物の能力により同定された。胚発生の初期におけるその発現に基づき、この遺伝子によりコードされるＢＭＰは、初期の発生における役割を提起している。加えて、このＢＭＰが、ＢＭＰ５およびＢＭＰ７と近縁であるという事実は、可能な骨誘導活性についての推論をもたらしている。Nature Genetics April; 41 [4]:386-8に記載されている通り、ＢＭＰ６のさらなる機能も同定されている。
ＢＭＰ６をノックアウトしたマウスは、生存可能かつ妊娠可能であり、正常な骨発生および軟骨発生を示す。
ＢＭＰ６は、哺乳動物における鉄代謝の主要な調節因子である肝臓により分泌される小型のペプチドであるヘプシジンの、鍵となる調節因子である。ヘプシジンは、十二指腸において吸収される食物中の鉄の量、および網内系細胞により放出される鉄の量の両方を制御する。ヘプシジンは、炎症および鉄過負荷を含む様々な刺激により上方調節され、貧血、低酸素症、および鉄欠損により下方調節される。
いかなる特定の理論にも束縛されないが、本開示は、ヘプシジン降下療法としてのＢＭＰ６アンタゴニスト抗体が、基礎疾患の罹患率を実質的に増加させ、転帰不良の予測因子となることが多い、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）に対する抵抗性を克服することにより、鉄欠乏性貧血を伴う患者に利益をもたらすと予測されることを示唆する。ＢＭＰＲ１受容体およびＢＭＰＲ２受容体とのその相互作用を介して、これは、受容体の二量体化およびヘプシジンの転写を誘導する。ＢＭＰ６はまた、肝臓内および筋肉細胞内のＨＪＶ共受容体にも結合する。
したがって、ＢＭＰ６は、ヘプシジンの発現を増大させることが公知である。ヘプシジンは、鉄ホメオスタシスに関与する、鍵となるホルモンであることが公知である。高ヘプシジンレベルは、ＡＣＤにおける、鉄欠乏赤血球生成と関連する。
国際公開第２０１０／０５６９８１号パンフレットは、マウスへの、ＢＭＰ６に対する抗体の投与により、ヘプシジンが低下し、鉄が増大することを開示した。
ＢＭＰ６は、当技術分野、例えば、Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759-62；Sauermann et al. 1993 J. Neurosci. Res. 33: 142；Celeste et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843；Schluesener et al. 1995 Atherosclerosis 113: 153；Gitelman et al. 1994 J. Cell Biol. 126: 1595；Barnes et al. 1997 W. J. Urol. 13: 337；およびHamdy et al. 1997 Cancer Res. 57: 4427において、さらに記載されている。
ＢＭＰ２は、他の骨形成タンパク質と同様に、骨および軟骨の発生において、重要な役割を果たす。ＢＭＰ２は、ヘッジホッグ経路、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路、およびサイトカイン−サイトカイン受容体間の相互作用に関与する。ＢＭＰ２はまた、心筋細胞分化および上皮間葉転換にも関与する。ＢＭＰ２は、Kishimoto et al. 1997 Dev. 124: 4457；Ma et al. 2005 Dev. 132: 5601；Wang et al. Bone 48: 524；およびRosen 2009 Cyt. Growth Fact. Rev. 20: 475により言及されている通り、多くの不可欠な役割を有する。したがって、ＢＭＰ６抗体は、ＢＭＰ２に結合しないことが好ましい。
ＢＭＰ２については、とりわけ、Sampath et al. 1990 J. Biol. Chem. 265: 13198；Chen et al. 2004 Growth Factors 22: 233；Marie et al. 2002 Histol. Histopath. 17: 877；Nickel et al. 2001 J. Bone Joint Surg. 83-A Supp. 1: S7-14；Kirsch et al. 2000 FEBS Lett. 468: 215；Kirsch et al. 2000 EMBO J. 19: 3314；Gilboa et al. 2000 Mol. Biol. Cell 11: 1023において、さらに記載されている。
ＢＭＰ５もまた、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのメンバーである。他のＢＭＰと同様に、ＢＭＰ５も、骨および軟骨の発生を誘導することが公知である。ＢＭＰ５は、小柱網および視神経頭において発現し、発生および正常な機能において役割を有する。ＢＭＰ５はまた、肺および肝臓においても発現する。
ＢＭＰ５についてのさらなる情報は、当技術分野、例えば、Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759；Beck et al. 2003 BMC Neurosci. 2: 12；Celeste et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843；およびSakaue et al. 1996 Biochem. Biophys. Res. Comm. 221: 768において公知である。
ＢＭＰ７もまた、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのメンバーである。タンパク質のＢＭＰファミリーの他のメンバーと同様に、ＢＭＰ７は、間葉系細胞の、骨および軟骨への形質転換において、鍵となる役割を果たす。ＢＭＰ７は、ＳＭＡＤ１およびＳＭＡＤ５のリン酸化を誘導し、これにより、多数の骨形成遺伝子の転写を誘導する。
上記で言及した通り、ＢＭＰ６をノックアウトしたマウスは、生存可能かつ妊娠可能であり、正常な骨発生および軟骨発生を示す。しかし、ＢＭＰ７についてノックアウトされたマウスは、腎臓、眼、および骨の欠損を伴い、生後に死亡する。一方の遺伝子の個別のノックアウトは、心臓発生を改変しないが、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７の二重ノックアウトは、心臓における何らかの欠損および遅延を裏付け、胎仔は、心不全で死亡した。ＢＭＰ７は、線維症と関連する慢性心疾患の進行を阻止するのに重要である。したがって、抗ＢＭＰ６抗体の、ＢＭＰ７との交差反応性は、所望されない。
ＢＭＰ７に関連するさらなる情報は、当技術分野、例えば、Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759；Chen et al. 2004 Growth Factors 22: 233；Itoh et al. 2001 EMBO J. 20: 4132；Zeisberg et al. 2003 Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285: F1060；Kallui et al. 2009 J. Clin. Invest. 119: 1420；およびWang et al. 2001 J. Am. Soc. Neph. 12: 2392において提示されている。
ヘプシジンは、ＨＡＭＰ（ヘプシジン抗微生物タンパク質またはペプチド）としてもまた公知のペプチドホルモンである。
マウス進化における最近の遺伝子複製イベントが、マウスにおける２つの類似するヘプシジン遺伝子である、ヘプシジン１およびヘプシジン２の存在をもたらした。Ilyin et al. 2003 FEBS Lett. 542: 22-26。マウスヘプシジン２は、哺乳動物ヘプシジンにおいて見出される、いくつかの保存的残基を欠く。Lou et al. 2004 Blood 103: 2816-2821。
ヘプシジン遺伝子生成物は、鉄ホメオスタシスの維持に関与し、マクロファージ内の鉄保存の調節、および腸による鉄吸収に必要である。これらのペプチドは、抗微生物活性を呈する。
プレプロタンパク質（またはプレプロホルモンまたはプレプロヘプシジン）（８４アミノ酸）およびプロタンパク質（またはプロホルモンまたはプロヘプシジン）（６０アミノ酸）は、２０、２２、および２５アミノ酸の成熟ペプチドへとプロセシングされる。２５アミノ酸のペプチドは、肝臓により主に分泌され、鉄代謝の「マスター調節因子」と考えられる。２０アミノ酸の代謝物および２２アミノ酸の代謝物は、尿中に存在する。ヘプシジンのＮ末端領域は、機能のために要求され、Ｎ末端の５つのアミノ酸の欠失は、機能の喪失を結果としてもたらす。
活性のヘプシジンペプチドは、それらのベータシート構造を安定化させる分子内結合を形成するシステインに富む。
ヘプシジンは主に、肝臓内で合成されるが、少量は、他の組織内でも合成されることが見出されている。Bekri et al. 2006 Gastroent. 131: 788-96。
２５アミノ酸のヘプシジンペプチドは、肝臓により主に分泌され、鉄代謝の「マスター調節因子」と考えられる。ヘプシジンは、消化管の腸細胞の基底外側表面上および網内系細胞（マクロファージ）の細胞膜上に位置する、鉄移出チャネルであるフェロポルチンへの結合により、鉄輸送を阻害する。フェロポルチンを阻害することにより、ヘプシジンは、腸の腸細胞が、鉄を、肝臓内門脈系へと分泌することを防止し、これにより、鉄吸収を機能的に低減する。フェロポルチン阻害は、マクロファージからの鉄放出もまた防止し、したがって、ヘプシジンは、鉄ホメオスタシスを維持する。ヘプシジン活性はまた部分的に、炎症性腸疾患、慢性心不全、癌腫、関節リウマチ、および腎不全などの慢性炎症性貧血において見られる鉄隔離の一因ともなる。
ヘプシジン遺伝子内の突然変異は、心筋症、肝硬変、および内分泌不全を結果としてもたらす、重度の鉄過負荷により引き起こされる疾患である、若年性ヘモクロマトーシスとしてもまた公知の、２Ｂ型ヘモクロマトーシスを引き起こす。若年性ヘモクロマトーシス症例の大部分は、ヘプシジン産生の調節因子である、ヘモジュベリン内の突然変異に起因する。
ヘプシジンを過剰発現させるように操作された遺伝子改変マウスは、重度の鉄欠損により、生後すぐに死亡することから、鉄調節における、中心的かつ非冗長的役割が示唆される。ヘプシジンを、炎症性貧血へと連関させる最初の証拠は、研究者らが、鉄補充物質に対して応答しない、重度の小球性貧血を伴う肝臓腫瘍を伴う２例の患者に由来する組織を検討したときに得られた。腫瘍組織は、ヘプシジンを過剰産生し、手術により腫瘍を除去したところ、貧血は治癒した。
鉄を十分に吸収できないことが、鉄欠損および鉄欠損性貧血に寄与する疾患は多い。ヘプシジンが腸内吸収を遮断する場合、経口処置は、無効となる可能性が高いので、処置は、ヘプシジンレベルに依存する。
一実施形態では、ＢＭＰ６に対する抗体またはその結合性断片の投与は、ヘプシジンの活性および／またはレベルを低減するので、貧血のための処置において有用である。一実施形態では、本発明は、それを必要とする患者における、ヘプシジンの活性またはレベルを低減する方法であって、患者に、ＢＭＰ６に対する抗体またはその抗原結合性断片を投与するステップを含む方法に関する。一実施形態では、ヘプシジンの活性またはレベルを、少なくとも５０％低減する。
ＢＭＰ６抗体など、ヘプシジンに対する阻害剤を使用して、ヘプシジン関連疾患を処置することができる。ヘプシジン関連疾患は、ヘプシジンならびに／または野生型ヘプシジンおよび／もしくは突然変異体ヘプシジンの突然変異および／もしくは過剰発現と関連する任意の疾患、ならびに／あるいはヘプシジンならびに／または野生型ヘプシジンおよび／もしくは突然変異体ヘプシジンの突然変異および／もしくは過剰発現の存在、ならびに／あるいは尿を介するヘプシジンの腎からの消失の低減により疾患の進行が増強されるか、または予後診断が増悪する疾患を含む。ヘプシジン関連疾患の非限定的な例は、貧血、鉄欠損赤血球生成、低鉄血症、食物中の鉄の取込み機能障害、鉄隔離、炎症性貧血（ＡＩ）、アテローム性動脈硬化、糖尿病、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、およびフリードライヒ運動失調症などの多発性神経変性障害、心不全、慢性腎疾患、心腎貧血症候群、感染、失血、溶血、ビタミンＢ１２欠損または葉酸塩欠損、副甲状腺機能亢進症、異常ヘモグロビン症および悪性腫瘍、がん、ＡＩＤＳ、手術、発育不全、ならびに／または脱毛を含む。一実施形態では、対象は、透析患者である。一実施形態では、ヘプシジン関連疾患は、貧血であり、対象は、透析患者である。慢性血液透析集団内の、鉄剤不応性貧血およびＥＳＡ不応性貧血の有病率は高い。
貧血は、とりわけ、慢性疾患性貧血（ＡＣＤ）、慢性腎疾患（ＣＫＤ）性貧血、がん性貧血、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）抵抗性貧血、および／または鉄欠乏性貧血を含む。
ＣＫＤ性貧血とは、慢性腎疾患の、一般的な初期の合併症である。がん性貧血は、血液悪性腫瘍および一部の充実性腫瘍により引き起こされる。本明細書で規定される通り、この用語はまた、化学療法剤により引き起こされる貧血である、化学療法誘導性貧血も含む。慢性腎疾患における貧血は、糖尿病性神経障害、心血管疾患、網膜症、および他の問題を増悪させうる。がん関連貧血は、死の危険性の増大と関連する。
がん、腎疾患、および自己免疫障害など、一部の慢性疾患は、貧血をもたらしうる。過剰反応性の炎症性サイトカインは、鉄ホメオスタシスの調節異常、赤血球生成の低減、および赤血球の寿命の短縮を引き起こしうる。貧血のための一部の処置は、ＥＳＡ、エリスロポエチン、鉄（食物中の補充物質としての）の投与、または輸血を含む。
ヘプシジンは、鉄ホメオスタシスに関与する、鍵となるホルモンである。高レベルのヘプシジンは、ＡＣＤにおける鉄欠乏赤血球生成と関連している。ＢＭＰ６は、ヘプシジンの発現を増大させることが公知である。
ＢＭＰ６に対する、多様な種類の抗体およびそれらの抗原結合性断片については、下記で記載する。
相同抗体
さらに別の実施形態では、本発明は、表１に記載される配列と相同なアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供し、前記抗体は、ＢＭＰ６に結合し、表１に記載される抗体の、所望の機能的な特性を保持する。
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が、配列番号１６、３６、５６、または７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域が、配列番号２６、４６、６６、または８６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み；抗体が、ＢＭＰ６タンパク質に特異的に結合し、抗体が、当技術分野で公知の溶血アッセイにおいて、赤血球溶解を阻害しうる、単離モノクローナル抗体（またはその機能的な抗原結合性断片）を提供する。具体例では、このような抗体は、１００ｐＭのヒトＢＭＰ６で再構成されたヒトＢＭＰ６枯渇血清を使用する場合、溶血アッセイにおいて、２０〜２００ｐＭのＩＣ５０値を有する。
一実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。一実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４、または５カ所以下のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除き同一でありうる。表１に記載されている抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域およびＶＬ領域を有する抗体は、配列番号１６、３６、５６、または７６、および配列番号２６、４６、６６、または８６のそれぞれをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
一実施形態では、全長重鎖アミノ酸配列および／または全長軽鎖アミノ酸配列は、表１に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。配列番号１８、３８、５８、または７８のうちのいずれかの全長重鎖、および配列番号２８、４８、６８、または８８のうちのいずれかの全長軽鎖と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
一実施形態では、全長重鎖ヌクレオチド配列および／または全長軽鎖ヌクレオチド配列は、表１に示される配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
一実施形態では、重鎖ヌクレオチド配列および／または軽鎖ヌクレオチド配列の可変領域は、表１に示される配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
本明細書で使用される、２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する配列により共有される、同一な位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、下記の非限定的な例で記載されている、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
加えて、または代替的に、本発明のタンパク質配列は、公表されたデータベースに照らして検索を実施する、例えば、関連の配列を同定するための「クエリー配列」としてさらに使用することもできる。例えば、このような検索は、Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10によるＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。
保存的修飾を伴う抗体
一実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを有し、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはその保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のＢＭＰ６結合性抗体およびそれらの抗原結合性断片の、所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とからなり、配列番号２９、４９、６９、１２、３２、５２、７２、もしくは９、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１０、３０、５０、７０、１３、３３、５３、もしくは７３、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ２；配列番号１１、３１、５１、７１、１４、３４、５４、もしくは７４、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ３；配列番号１９、３９、５９、７９、２２、４２、６２、もしくは８２、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２０、４０、６０、８０、２３、４３、６３、もしくは８３、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および配列番号２１、４１、６１、８１、２４、４４、６４、もしくは８４、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ３；抗体またはその抗原結合性断片が、ＢＭＰ６タンパク質に特異的に結合し、溶血アッセイにおいて、赤血球溶解を阻害する、単離モノクローナル抗体、またはその機能的な抗原結合性断片を提供する。
一実施形態では、哺乳動物細胞内の発現のために最適化された、本発明の抗体は、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有し、これらの配列のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはその保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のＢＭＰ６結合性抗体およびそれらの抗原結合性断片の、所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、哺乳動物細胞内の発現のために最適化された単離モノクローナル抗体であって、全長重鎖および全長軽鎖からなり、全長重鎖が、配列番号１８、３８、５８、または７８の群から選択されたアミノ酸配列、およびこれらの保存的修飾を有し；全長軽鎖が、配列番号２８、４８、６８、または８８の群から選択されたアミノ酸配列、およびこれらの保存的修飾を有し；抗体が、ＢＭＰ６タンパク質に特異的に結合し、抗体が、本明細書で記載される溶血アッセイにおいて、赤血球溶解を阻害する、単離モノクローナル抗体を提供する。具体的な実施形態では、このような抗体は、１００ｐＭのヒトＢＭＰ６で再構成されたヒトＢＭＰ６枯渇血清を使用する場合、溶血アッセイにおいて、２０〜２００ｐＭのＩＣ５０値を有する。
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１に列挙されているＢＭＰ６結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。抗体７が結合するエピトープを、図５に示す。したがって、ＢＭＰ６結合アッセイにおいて、本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合性断片と交差競合する（例えば、本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合性断片の結合を、統計学的に有意な形で競合的に阻害する）それらの能力に基づき、さらなる抗体を同定することができる。本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の、ＢＭＰ６タンパク質への結合を阻害する被験抗体の能力により、被験抗体が、その抗体と、ＢＭＰ６への結合について競合することが可能であり、このような抗体は、非限定的な理論によれば、ＢＭＰ６上の、それが競合する抗体と同じであるかまたは関連の（例えば、構造的に類似するか、または空間的に近接した）エピトープに結合しうることが裏付けられる。ある種の実施形態では、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片と同じ、ＢＭＰ６上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調製および単離することができる。
抗原上の所望のエピトープを決定したら、例えば、本発明で記載される技法を使用して、そのエピトープに対する抗体を作り出すことが可能である。代替的に、発見過程において、抗体の作出および特徴付けにより、所望のエピトープについての情報を解明することもできる。次いで、この情報から、抗体を、同じエピトープへの結合について、競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成する手法は、互いと競合的に結合する抗体、例えば、抗原への結合について競合する抗体を見出す交差競合研究を行うことである。それらの交差競合に基づき、抗体を「ビニング」するハイスループット過程については、国際公開第２００３／４８７３１号パンフレットにおいて記載されている。当業者により察知される通り、抗体が特異的に結合しうる、事実上いかなるものも、エピトープでありうるであろう。エピトープは、抗体が結合する残基を含みうる。
一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中の、標的抗原上のエピトープを優先的に認識するであろう。
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当技術分野で周知の、任意の数のエピトープマッピング法を使用して同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、固体支持体上で、タンパク質分子の部分に対応する、多数のペプチドを、共時的に合成し、ペプチドをなおも支持体へと接合させながら、ペプチドを、抗体と反応させることにより決定することができる。当技術分野では、このような技法が公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号明細書；Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002；Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182；Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715において記載されている。同様に、コンフォメーショナルエピトープは、例えば、水素／重水素交換、ｘ腺結晶構造解析、および二次元核磁気共鳴などにより、アミノ酸ＢＭＰ６の空間的コンフォメーションを決定することによりたやすく同定される。例えば、Epitope Mapping Protocols、前出を参照されたい。タンパク質の抗原性領域はまた、例えば、Ｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能な、Ｏｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されるプロットなど、標準的な抗原性／疎水性プロットを使用して同定することもできる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルを決定するためのホップ／ウッズ法、Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828、および疎水性プロットのためのカイト−ドゥーリトル法、Kyte-Doolittle technique, Kyte et al., (1982) J. MoI. Biol. 157:105-132を利用する。
操作抗体および修飾抗体
出発抗体から特性を改変した修飾抗体を操作する出発材料として、本明細書で示されるＶＨ配列および／またはＶＬ配列のうちの１つまたは複数を有する抗体を使用して、本発明の抗体をさらに調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内、および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を修飾することにより操作することができる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾して、例えば、抗体のエフェクター機能を改変することによっても操作することができる。
実施しうる可変領域操作のうちの１つの種類は、ＣＤＲグラフティングである。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由で、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個別の抗体の間の多様性が、ＣＤＲの外部の配列より大きい。ＣＤＲ配列は、大半の抗体−抗原間相互作用の一因となるため、異なる特性を伴う異なる抗体に由来するフレームワーク配列へとグラフトされた特異的自然発生抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L.et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P.et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029-10033；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
このようなフレームワーク配列は、ゲルミン抗体遺伝子配列を含む公表されたＤＮＡデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のゲルミンＤＮＡ配列は、ヒト生殖細胞系列の配列データベースである「ＶＢａｓｅ」（インターネットのwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能である）のほか、それらの各々の内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Kabat, E. A. et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M. et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798；およびCox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836においても見出すことができる。
本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片における使用のためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択された抗体およびそれらの抗原結合性断片により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似するフレームワーク配列である。ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域へとグラフトすることもでき、ＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して、１つまたは複数の突然変異を含有するフレームワーク領域へとグラフトすることもできる。例えば、ある種の場合には、フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、抗体の抗原結合能力を維持または増強することが有益であると見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
可変領域修飾の別の種類は、「アフィニティー成熟」として公知の、ＶＨ ＣＤＲ１領域内、ＶＨ ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＨ ＣＤＲ３領域内、ならびに／またはＶＬ ＣＤＲ１領域内、ＶＬ ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＬ ＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、これにより、対象の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、アフィニティー）を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、突然変異を導入することができ、本明細書で記載され、実施例でも提示される、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて、抗体結合性または他の対象の機能的特性に対する効果を査定することができる。保存的修飾（上記で論じた）を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換の場合もあり、付加の場合もあり、欠失の場合もある。さらに、ＣＤＲ領域内の、典型的には１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下の残基も改変する。
抗原結合性ドメインの、代替的なフレームワークまたは足場へのグラフティング
結果として得られるポリペプチドが、ＢＭＰ６に特異的に結合する少なくとも１つの結合性領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体／免疫グロブリンのフレームワークまたは足場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫グロブリン、それらの抗原結合性断片の５つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科動物において同定される単一重鎖抗体などの単一重鎖抗体は、特に対象である。当業者により、新規のフレームワーク、足場、および断片が、発見および開発され続けている。
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトしうる非免疫グロブリン足場を使用して、非免疫グロブリンベースの抗体を作り出す方法に関する。それらが、標的のＢＭＰ６タンパク質に特異的な結合性領域を含む限りにおいて、公知または将来の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場を援用することができる。公知の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場は、フィブロネクチン（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．；およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、低分子モジュラー免疫医薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（ＳｃｉＩ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むがこれらに限定されない。
フィブロネクチン足場は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンの第１０モジュール（１０ Ｆｎ３ドメイン））に基づく。ＩＩＩ型フィブロネクチンドメインは、それら自体が互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成し、ベータ鎖を互いへと接続し、溶媒へと露出されるループもさらに含有する（ＣＤＲと類似する）、２つのベータシートの間に分配された、７つまたは８つのベータ鎖を有する。ベータシートサンドイッチの各エッジには、少なくとも３つのこのようなループがあり、エッジは、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号明細書を参照されたい）。全体的なフォールドは、ラクダおよびラマＩｇＧ内の抗原認識単位全体を含む最小の機能的抗体断片である重鎖可変領域のフォールドと密接に関連するが、これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリンではない。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、性質およびアフィニティーが抗体の性質およびアフィニティーと類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体のアフィニティー成熟の工程と類似する、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるループのランダム化戦略およびシャフリング戦略において使用することができる。これらのフィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング法を使用して、分子のループ領域を本発明のＣＤＲで置きかえうる、足場として使用することができる。
アンキリン技術は、アンキリンに由来するリピートモジュールを伴うタンパク質を、異なる標的への結合に使用しうる可変領域を保有する足場として使用することに基づく。アンキリンリピートモジュールとは、２つのアンチパラレルのアルファ−ヘリックスおよびベータ−ターンからなる、３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用することにより大部分が最適化される。
アビマーは、ＬＲＰ−１など、天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらのドメインは、本来、タンパク質間相互作用に使用され、ヒトでは、２５０を超えるタンパク質が、構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結された多数の（２つ〜１０の）異なる「Ａドメイン」単量体からなる。標的抗原に結合しうるアビマーは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号明細書；同第２００５００５３９７３号明細書；同第２００５００４８５１２号明細書；および同第２００６０００８８４４号明細書において記載されている方法を使用して創出することができる。
アフィニティーリガンドであるアフィボディとは、プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメインのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルからなる、低分子の単純なタンパク質である。プロテインＡとは、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、それらのうちの１３が、多数のリガンド変異体を伴うアフィボディライブラリーを作り出す、ランダム化されている５８アミノ酸からなる（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号明細書を参照されたい）。アフィボディ分子は、抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、分子量が６ｋＤａである。その小サイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体の結合部位と同様である。
アンチカリンとは、Ｐｉｅｒｉｓ ＰｒｏｔｅｏＬａｂ ＡＧ社により開発された生成物である。アンチカリンは、通例、化学的に感受性の化合物または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に関与する、広範にわたる低分子の頑健なタンパク質群であるリポカリンに由来する。いくつかの天然リポカリンは、ヒト組織内またはヒト体液中で生じる。タンパク質のアーキテクチャーは、リジッドフレームワークの上部の超可変ループを伴う免疫グロブリンを連想させる。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、リポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりかろうじて大きい、１６０〜１８０アミノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖からなる。結合性ポケットを構成する４つのループのセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、異なる形状の規定の標的分子を、高度なアフィニティーおよび特異性で認識するために、結合性部位を独自の工程で再形成することができる。４つのループのセットを突然変異誘発することによりアンチカリンを開発するのには、リポカリンファミリーの１つのタンパク質である、オオモンシロチョウ（Pieris Brassicae）のビリン結合性タンパク質（ＢＢＰ）が使用されている。アンチカリンについて記載する特許出願の１つの例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９１６８７３号にある。
アフィリン分子とは、タンパク質および低分子に対する特異的なアフィニティーのためにデザインされた低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、それらの各々が、異なるヒト由来の足場タンパク質に基づく２つのライブラリーから非常に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対するいかなる構造相同性も示さない。現在、２つのアフィリン足場が援用されており、それらのうちの一方は、ヒト水晶体の構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒト足場も非常に小型で、高度な熱安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高度な安定性は主に、タンパク質のベータシート構造の展開に起因する。ガンマクリスタリンに由来するタンパク質の例は、国際公開第２００１０４１４４号パンフレットにおいて記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、国際公開第２００４１０６３６８号パンフレットにおいて記載されている。
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）とは、タンパク質間相互作用に関与する主要な二次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、中程度のサイズの環状ペプチド様分子（分子量：１〜２ｋＤａ）である。
ヒトＢＭＰ６結合性抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して作り出すことができる。例えば、非ヒト抗体を、操作ヒト抗体へと転換するのに使用されるヒト化技術である。米国特許出願公開第２００５０００８６２５号明細書は、非ヒト抗体の結合特徴と比べて、同じ結合特徴または良好な結合特徴を維持しながら、抗体内の非ヒト抗体の可変領域を、ヒト可変領域で置きかえるためのｉｎ ｖｉｖｏ法について記載している。方法は、非ヒト基準抗体の可変領域の、完全ヒト抗体による、エピトープ誘導型置換に依拠する。結果として得られるヒト抗体は一般に、基準非ヒト抗体と構造的に非類縁であるが、基準抗体と同じ抗原上の同じエピトープに結合する。略述すると、逐次的エピトープ誘導型相補性置換法は、被験抗体の、抗原への結合に応答するレポーター系の存在下で、限られた量の抗原への結合について、「競合体」と、基準抗体の多様なハイブリッド体のライブラリー（「被験抗体」）との、細胞内の競合を準備することにより可能となる。競合体は、単鎖Ｆｖ断片など、基準抗体またはその誘導体でありうる。競合体はまた、基準抗体と同じエピトープに結合する、抗原の天然リガンドまたは人工リガンドでもありうる。競合体の唯一の要件は、それが、基準抗体と同じエピトープに結合し、基準抗体と、抗原結合について競合することである。被験抗体は、非ヒト基準抗体に由来する、１つの共通の抗原結合性Ｖ領域と、ヒト抗体のレパートリーライブラリーなど、多様な供給源からランダムに選択される他のＶ領域とを有する。基準抗体に由来する共通のＶ領域は、選択に、基準抗体に対する最高の抗原結合性忠実度へのバイアスをかけるように、被験抗体を、抗原上の同じエピトープに、同じ配向性で配置するガイドとして用いられる。
多くの種類のレポーター系を使用して、被験抗体と抗原との所望の相互作用を検出することができる。例えば、相補的レポーター断片は、断片の相補性によるレポーターの活性化が、被験抗体が、抗原に結合する場合に限り生じるように、抗原および被験抗体のそれぞれへと連結することができる。被験抗体−レポーター断片と抗原−レポーター断片との融合体を、競合体と共発現させる場合、レポーターの活性化は、被験抗体が競合体と競合する能力であって、被験抗体の、抗原に対するアフィニティーと比例する能力に依存する。使用しうる他のレポーター系は、米国特許出願第１０／２０８，７３０号明細書（公開第２００３０１９８９７１号）において開示されている、自己阻害レポーター再活性化の再活性化因子（ＲＡＩＲ系）、または米国特許出願第１０／０７６，８４５号明細書（公開第２００３０１５７５７９号）において開示されている競合活性化系を含む。
逐次的エピトープ誘導型相補性置換系では、単一の被験抗体を、競合体、抗原、およびレポーター成分と共に発現する細胞を同定するように、選択を行う。これらの細胞内では、各被験抗体は、限られた量の抗原への結合について、競合体と一対一で競合する。レポーターの活性は、被験抗体に結合した抗原の量に比例し、被験抗体に結合した抗原の量は、被験抗体の、抗原に対するアフィニティーおよび被験抗体の安定性と比例する。被験抗体はまず、被験抗体として発現させる場合の基準抗体の活性と比べた、それらの活性に基づき選択する。選択の第１ラウンドの結果は、それらの各々が、基準抗体に由来する、同じ非ヒトＶ領域と、ライブラリーに由来するヒトＶ領域とから構成され、それらの各々が、抗原上の、基準抗体と同じエピトープに結合する、「ハイブリッド」抗体のセットである。第１ラウンドで選択されるハイブリッド抗体のうちの１つまたは複数は、抗原に対する、基準抗体のアフィニティー以上のアフィニティーを有するであろう。
第２のＶ領域置きかえステップでは、第１のステップで選択されたヒトＶ領域を、残りの非ヒト基準抗体Ｖ領域の、コグネイトヒトＶ領域の多様なライブラリーによるヒト置換体を選択するためのガイドとして使用する。第１ラウンドで選択されたハイブリッド抗体はまた、選択の第２ラウンドのための競合体としても使用することができる。選択の第２ラウンドの結果は、基準抗体と構造的に異なるが、同じ抗原への結合について、基準抗体と競合する、完全ヒト抗体のセットである。選択されたヒト抗体の一部は、基準抗体と同じ抗原上の同じエピトープに結合する。これらの選択されたヒト抗体の中で、１つまたは複数は、同じエピトープに、基準抗体のアフィニティー以上のアフィニティーで結合する。
上記で記載した、マウスＢＭＰ６結合性抗体またはキメラＢＭＰ６結合性抗体のうちの１つを、基準抗体として使用するこの方法は、ヒトＢＭＰ６に、基準抗体以上の結合特異性および基準抗体以上の結合アフィニティーで結合するヒト抗体を作り出すのに、たやすく利用することができる。加えて、このようなヒトＢＭＰ６結合性抗体はまた、ヒト抗体をカスタムで作製する企業、例えば、ＫａｌｏＢｉｏｓ，Ｉｎｃ．（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ）から購入することもできる。
ラクダ科動物抗体
ラマ種（アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vicugna））などの新世界メンバー含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（dromedary）（フタコブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Calelus dromaderius））ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの哺乳動物に由来するある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する抗体の場合の、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する、典型的な４つの鎖の四次構造とは構造的に異なっている。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に公表されたＷＯ９４／０４６７８）を参照されたい。
ＶＨＨとして同定される小型の単一の可変ドメインである、ラクダ科動物抗体の領域は、標的に対して高いアフィニティーを有する低分子タンパク質をもたらすことから、「ラクダ科動物ナノボディ」として公知の低分子量抗体由来タンパク質を結果としてもたらす遺伝子操作により得ることができる。１９９８年６月２日に取得された米国特許第５，７５９，８０８号明細書を参照されたい。また、Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279:1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424:783-788; Pleschberger, M. et al., 2003 Bioconjugate Chem 14:440-448; Cortez-Retamozo, V. et al., 2002 Int J Cancer 89:456-62；およびLauwereys, M. et al., 1998 EMBO J 17:3512-3520も参照されたい。ラクダ科動物抗体および抗体断片の操作ライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト由来の他の抗体および抗原結合性断片と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により酷似する配列を得るように、組換えにより改変することができる、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」することができる。したがって、ヒトに対するラクダ科動物抗体の天然の小さな抗原性を、さらに低減することができる。
ラクダ科動物ナノボディの分子量は、ヒトＩｇＧ分子の分子量の約１０分の１で、タンパク質の物理的直径は、数ナノメートルに過ぎない。サイズが小さいことの１つの帰結は、大型の抗体タンパク質には機能的に不可視である抗原性部位に結合するラクダ科動物ナノボディの能力である、すなわち、ラクダ科動物ナノボディは、古典的な免疫学的技法を使用するこれ以外の形では隠蔽されたままの抗原を検出する試薬として有用であり、可能な治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、標的タンパク質のグルーブ内または狭小なクレフト内の特異的部位に結合することの結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、よって、古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量の薬物の機能により酷似する能力において用いられうることである。
低分子量およびコンパクトなサイズはさらに、熱安定性が極めて大きく、極端なｐＨおよびタンパク質分解性消化に対して安定的であり、抗原性が小さいラクダ科動物ナノボディを結果としてもたらす。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、循環系から組織へとたやすく移動し、血液脳関門もなお越え、神経組織に影響を及ぼす障害も処置しうることである。ナノボディはさらに、血液脳関門を越える薬物輸送も容易としうる。２００４年８月１９日に公表された米国特許出願公開第２００４０１６１７３８号明細書を参照されたい。これらの特色を、ヒトに対する抗原性が小さいことと組み合わせることにより、大きな治療的可能性が指し示される。さらに、これらの分子は、大腸菌（E. coli）などの原核細胞内で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現させ、機能的である。
したがって、本発明の特色は、ＢＭＰ６に対して高いアフィニティーを有するラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディである。本明細書の一実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディは、天然ではラクダ科動物において産生される、すなわち、他の抗体について本明細書で記載される技法を使用する、ＢＭＰ６またはそのペプチド断片による免疫化の後で、ラクダ科動物により産生される。代替的に、ＢＭＰ６結合性ラクダ科動物ナノボディは、操作もされる、すなわち、例えば、本明細書の実施例において記載されている、標的としてのＢＭＰ６を伴うパニング手順を使用する、適切に突然変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタンパク質を提示するファージライブラリーからの選択によっても作製される。操作されたナノボディはさらに、遺伝子操作により、レシピエント対象における半減期が、４５分間〜２週間となるようにカスタマイズすることもできる。具体的な実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディを、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４において記載されている通り、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノボディまたは単一ドメイン抗体フレームワーク配列へとグラフトすることにより得る。
二特異性分子および多価抗体
別の態様では、本発明は、本発明のＢＭＰ６結合性抗体またはその断片を含む二特異性分子または多特異性分子を特色とする。本発明の抗体またはその抗原結合性領域は、少なくとも２つの異なる結合性部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）へと連結することもできる。本発明の抗体は実際、３つ以上の異なる結合性部位および／または標的分子に結合する多特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、他の２つ以上の機能的分子へと連結することもでき、このような多特異性分子はまた、本明細書で使用される「二特異性分子」という用語により包含されることも意図される。本発明の二特異性分子を創出するには、本発明の抗体を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合性模倣体など、１つまたは複数の他の結合性分子へと機能的に連結する（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら以外の形で）ことができる。
したがって、本発明は、ＢＭＰ６に対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子を含む。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープと異なる、ＢＭＰ６の別のエピトープである。
加えて、二特異性分子が多特異性である本発明では、分子は、第１の標的エピトープおよび第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性もさらに含みうる。
一実施形態では、本発明の二特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号明細書において記載されている、Ｆｖもしくは単鎖構築物など、その任意の最小断片でありうる。
ダイアボディとは、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーにより接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖上で発現させた、二価の二特異性分子である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対合し、これにより、２つの抗原結合性部位を創出する（例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poijak et al., 1994 Structure 2:1121-1123を参照されたい）。ダイアボディは、ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ構造（ＶＨ−ＶＬ立体配置）、またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ構造（ＶＬ−ＶＨ立体配置）を伴う２つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることにより作製することができる。ダイアボディの大半は、細菌内の可溶性形態で発現させることができる。単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を、約１５アミノ酸残基のリンカーで接続することにより作製する（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36を参照されたい）。ｓｃＤｂは、細菌内の可溶性で活性の単量体形態で発現させることができる（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2):83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21を参照されたい）。ダイアボディをＦｃへと融合させて、「ジダイアボディ」を作り出すことができる（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65を参照されたい）。
本発明の二特異性分子内で援用しうる他の抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体である。
本発明の二特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素である結合特異性をコンジュゲートさせることにより調製することができる。例えば、二特異性分子の各結合特異性は、個別に作り出し、次いで、互いとコンジュゲートさせることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合は、様々なカップリング剤または架橋剤を、共有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686； Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法は、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No.78、118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83；およびGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139:2367-2375において記載されている方法を含む。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれも、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ）から入手可能である。
結合特異性が、抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスルフヒドリル結合させることによりコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、コンジュゲーションの前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、１つのスルフヒドリル残基を含有するように、ヒンジ領域を修飾する。
代替的に、いずれの結合特異性も、同じベクター内でコードさせ、同じ宿主細胞内で発現およびアセンブルさせることができる。この方法は、二特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、２つの結合決定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含みうる。二特異性分子を調製する方法については、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８号明細書において記載されている。
それらの特異的な標的に対する二特異性分子の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害アッセイ）、またはウェスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイの各々では一般に、対象の複合体に特異的な、標識された試薬（例えば、抗体）を利用することにより、特に対象となるタンパク質−抗体複合体の存在が検出される。
別の態様では、本発明は、ＢＭＰ６に結合する、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の、少なくとも２つの、同一であるかまたは異なる抗原結合性部分を含む、多価化合物を提供する。抗原結合性部分は、タンパク質の融合または共有結合的連結もしくは非共有結合的連結を介して、互いに連結することができる。代替的に、二特異性分子のための連結法も記載されている。四価化合物は、例えば、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の定常領域に結合する抗体または抗原結合性断片、例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域と架橋することにより得ることができる。
三量体化ドメインについては、例えば、Ｂｏｒｅａｎによる特許である欧州特許第１０１２２８０号明細書において記載されている。五量体化モジュールについては、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７において記載されている。
半減期を延長した抗体
本発明は、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体であって、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体を提供する。
多くの因子が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるタンパク質の半減期に影響を及ぼしうる。例えば、腎臓における濾過、肝臓における代謝、タンパク質分解性酵素（プロテアーゼ）による分解、および免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質の中和ならびにマクロファージおよび樹状細胞による取込み）などの因子である。様々な戦略を使用して、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の半減期を延長することができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合性リガンド、および炭水化物シールドとの化学的連結により；アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎ、およびトランスフェリンなどの血清タンパク質に結合するタンパク質との遺伝子融合により；ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディ、およびアンチカリンなど、血清タンパク質に結合する他の結合部分とカップリングする（遺伝子的または化学的に）ことにより；ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合性タンパク質、およびＦｃとの遺伝子融合により；またはナノ担体、徐放製剤、もしくは医療デバイスへの組込みにより、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の半減期を延長することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体の血清中循環を延長するため、高分子量のＰＥＧなど、不活性のポリマー分子を、ＰＥＧの、抗体のＮ末端もしくはＣ末端への部位特異的コンジュゲーションを介して、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多官能性リンカーを伴うかまたは多官能性リンカーを伴わない、抗体またはそれらの断片へと付着することができる。抗体をＰＥＧ化するには、抗体、その抗原結合性断片を、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で反応させることが典型的である。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチレングリコールもしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態のうちのいずれかを包含することを意図するものである。一実施形態では、ＰＥＧ化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化であって、生物学的活性の喪失を結果として最小とする誘導体化が、使用されるであろう。コンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により緊密にモニタリングして、ＰＥＧ分子の抗体への適正なコンジュゲーションを確認することができる。反応しなかったＰＥＧは、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書で記載されるイムノアッセイにより、結合活性ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性について調べることができる。当技術分野では、タンパク質をＰＥＧ化するための方法が公知であり、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片に適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照されたい。
他の改変されたＰＥＧ化技術は、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系を介して、化学的に特定された側鎖を、生合成タンパク質へと組み込む、再構成化学的直交性直接操作技術（reconstituting chemically orthogonal directed engineering）（ＲｅＣＯＤＥ ＰＥＧ）を含む。この技術は、３０を超える新たなアミノ酸の、大腸菌（E. coli）細胞内、酵母細胞内、および哺乳動物細胞内の生合成タンパク質への組込みを可能とする。ｔＲＮＡは、規範的なアミノ酸を、アンバーコドンが配置される任意の位置へと組み込み、終止アンバーコドンから、化学的に特定されたアミノ酸の組込みシグナルを伝達するコドンへと転換する。
組換えＰＥＧ化技術（ｒＰＥＧ）はまた、血清半減期の延長にも使用することができる。この技術は、３００〜６００アミノ酸の非構造化タンパク質テールを、既存の医薬用タンパク質へと遺伝子融合させることを伴う。このような非構造化タンパク質鎖の見かけの分子量は、その実際の分子量の約１５倍であるため、タンパク質の血清半減期は、大きく増大する。化学的コンジュゲーションおよび再精製を要求する従来のＰＥＧ化とは対照的に、製造工程は大きく簡略化され、生成物は、均質である。
ポリシアリル化は、天然のポリマーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、活性寿命を延長し、治療用ペプチドおよび治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術である。ＰＳＡとは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチドの薬物送達に使用される場合、コンジュゲーション時に、ポリシアル酸は、保護的微小環境をもたらす。これは、循環内の治療用タンパク質の活性寿命を延長し、それが免疫系により認識されることを防止する。ＰＳＡポリマーは、天然では、ヒト体内で見出される。ＰＳＡは、数百万年にわたり、それらの壁をＰＳＡでコーティングするように進化したある種の細菌により採用された。次いで、これらの天然でポリシアリル化した細菌は、分子的模倣により、体内の防御系を失効化することが可能となった。自然の究極のステルス技術であるＰＳＡは、このような細菌から、大量に、かつ、所定の物理的特徴を伴って、容易に作製することができる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内ではＰＳＡと化学的に同一であるので、タンパク質へとカップリングさせた場合でもなお、完全に非免疫原性である。
別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用を含む。ＨＥＳとは、蝋状トウモロコシデンプンに由来する、修飾された天然ポリマーであり、体内の酵素により代謝されうる。ＨＥＳ溶液は通例、血液量不足を補い、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を増大させることのほか、腎クリアランスを低減することによっても、循環半減期の延長を可能とし、生物学的活性の増大を結果としてもたらす。ＨＥＳの分子量など、異なるパラメータを改変することにより、広範にわたるＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体はまた、１つまたは複数のアミノ酸修飾（すなわち、置換、挿入、または欠失）を、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合性断片（好ましくはＦｃドメイン断片またはヒンジＦｃドメイン断片）へと導入しても作り出すことができる。例えば、国際公開第９８／２３２８９号号パンフレット、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット；および米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参照されたい。
さらに、抗体または抗体断片を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてより安定的とするか、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長するために、抗体を、アルブミンへとコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、技法が周知であり、例えば、国際特許公開第９３／１５１９９号パンフレット、同第９３／１５２００号パンフレット、および同０１／７７１３７号パンフレット；ならびに欧州特許第４１３，６２２号明細書を参照されたい。
半減期を延長するための戦略は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の延長が所望される、ナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤、および他の抗体またはタンパク質においてとりわけ有用である。
抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプチドへと（またはその抗原結合性断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドへと）、組換えにより融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた（共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。特に、本発明は、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ ＣＤＲ）と、異種タンパク質、異種ポリペプチド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。当技術分野では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片と融合またはコンジュゲートさせる方法が知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、および同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書および同第３６７，１６６号明細書；国際公開第９６／０４３８８号パンフレットおよび同第９１／０６５７０号パンフレット；Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；およびVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて、「ＤＮＡシャフリング」と称する）の技法を介して作り出すことができる。ＤＮＡシャフリングを利用して、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の活性を改変する（例えば、アフィニティーが大きく、解離速度が小さい抗体およびそれらの抗原結合性断片）ことができる。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同第５，８３４，２５２号明細書、および同第５，８３７，４５８号明細書；Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2):76-82；Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；およびLorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2):308-313（これらの特許および刊行物の各々は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体およびそれらの抗原結合性断片、またはコードされた抗体およびそれらの抗原結合性断片は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法にかけることにより改変することができる。ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、区間、一部、ドメイン、断片などで組み換えることができる。
さらに、抗体およびそれらの抗原結合性断片は、精製を容易とするペプチドなどのマーカー配列へと融合させることもできる。一実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、それらのうちの多くが市販されている中でとりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ、９１３１１）において提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチド（配列番号９６）である。Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824において記載されている通り、例えば、ヘキサヒスチジン（配列番号９６）は、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープ（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）に対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ、および「フラッグ」タグを含むがこれらに限定されない。
一実施形態では、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を、診断剤または検出用薬剤へとコンジュゲートさせる。このような抗体は、疾患または障害の発生、発症、進行、および／または重症度を、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床検査手順の一部としてモニタリングまたは予後診断するのに有用でありうる。このような診断および検出は、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない多様な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなどであるがこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネシウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに限定されない放射性材料；ならびに多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属および非放射性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質へとカップリングすることにより達成することができる。
本発明は、治療用部分へとコンジュゲートさせた抗体およびそれらの抗原結合性断片の使用もさらに包含する。抗体およびその抗原結合性断片は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分へとコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。
さらに、抗体およびその抗原結合性断片は、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物部分へとコンジュゲートさせることもできる。治療用部分または薬物部分は、古典的化学的治療剤に限定されるとは見なされないものとする。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドでありうる。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤；または例えば、リンホカインなどの生体応答修飾剤などのタンパク質を含みうる。
さらに、抗体は、２１３Ｂｉなどのアルファ放射体などの放射性金属イオン、１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むがこれらに限定されない放射性金属イオンを、ポリペプチドへとコンジュゲートするのに有用な大環状キレート化剤などの治療用部分へとコンジュゲートさせることもできる。一実施形態では、大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体へと付着させうる、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、各々が参照によりそれらの全体において組み込まれる、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7；およびZimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50において記載されている。
治療用部分を、抗体へとコンジュゲートさせるための技法は周知であり、例えば、Amonet al., 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (ed), pp.243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., 「Antibodies For Drug Delivery」, Controlled Drug Delivery(2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp.623-53(Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」, Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.475-506(1985); 「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16(Academic Press 1985)；およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。
抗体はまた、特に、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に有用な固体支持体へと付着させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むがこれらに限定されない。
本発明の抗体を作製する方法
抗体をコードする核酸
本発明は、上記で記載したＢＭＰ６結合性抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、配列番号１６、３６、５６、もしくは７６のいずれかに示される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または配列番号２６、４６、６６、もしくは８６のいずれかに示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、核酸分子は、表１において同定される核酸分子である。本発明の他のいくつかの核酸分子は、表１において同定される核酸分子のヌクレオチド配列と実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％、または９９％）同一なヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現させるとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、ＢＭＰ６抗原結合能を呈示することが可能である。
本発明ではまた、表１で示したＢＭＰ６結合性抗体の重鎖または軽鎖に由来する少なくとも１つのＣＤＲ領域、および、通例３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドも提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは、表１で示したＢＭＰ６結合性抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコードする。コードの縮重性のために、様々な核酸配列は、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードするであろう。
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードしうる。本発明の核酸配列のうちのいくつかは、配列番号１６、３６、５６、または７６のいずれかに示される成熟重鎖可変領域配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な成熟重鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドを含む。他のいくつかの核酸配列は、配列番号２６、４６、６６、または８６のいずれかに示される成熟軽鎖可変領域配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な成熟軽鎖可変領域配列をコードするヌクレオチドを含む。
ポリヌクレオチド配列は、デノボの固相ＤＮＡ合成、またはＢＭＰ６結合性抗体またはその結合性断片をコードする既存の配列（例えば、下記の実施例で記載される配列）に対するＰＣＲによる突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接的な化学合成は、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90によるホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979によるホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981によるジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号明細書による固体支持体法など、当技術分野で公知の方法により達成することができる。ＰＣＲによる、突然変異の、ポリヌクレオチド配列への導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991；およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991において記載されている通りに実施することができる。
本発明ではまた、上記で記載したＢＭＰ６結合性抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。多様な発現ベクターを、援用して、ＢＭＰ６結合性抗体鎖または結合性断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターのいずれを使用しても、哺乳動物宿主細胞内で抗体を作製することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系は、プラスミド、典型的に、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを伴うエピソームベクター、およびヒト人工染色体を含む（例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞内のＢＭＰ６結合性ポリヌクレオチドおよびＢＭＰ６結合性ポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｂ、およびｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ｂ、およびｐＥＢＶＨｉｓ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための、当技術分野で公知の他の多数のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）を含む。Brent et al., 前出; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995；およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。
発現ベクターの選択は、その中でベクターを発現させる、意図される宿主細胞に依存する。発現ベクターは、ＢＭＰ６結合性の抗体鎖の抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有することが典型的である。一実施形態では、誘導条件下を除き、挿入された配列の発現を防止するのに、誘導的プロモーターを援用する。誘導的プロモーターは、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞により良好に許容されるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させることができる。プロモーターに加えて、他の調節的エレメントもまた、ＢＭＰ６結合性の、抗体鎖の抗原結合性断片の効率的な発現に要求または所望される可能性がある。これらのエレメントは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接のリボソーム結合性部位または他の配列を典型的に含む。加えて、発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れることにより増強することもできる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞内の発現を増大させることができる。
発現ベクターはまた、挿入されたＢＭＰ６結合性抗体配列によりコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列の位置ももたらしうる。挿入されたＢＭＰ６結合性抗体配列は、ベクター内に組み入れる前に、シグナル配列へと連結することが多い。ＢＭＰ６結合性抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するのに使用されるベクターは、場合によってまた、定常領域またはそれらの一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、これにより、インタクトな抗体およびそれらの抗原結合性断片の作製をもたらす。このような定常領域は、ヒト定常領域であることが典型的である。
ＢＭＰ６結合性抗体鎖を保有し、これを発現させるための宿主細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。大腸菌（E. coli）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし、発現させるのに有用な１つの原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主は、枯草菌（Bacillus subtilis）などの桿菌、およびサルモネラ（Salmonella）属種、セラチア（Serratia）属種、および多様なシュードモナス（Pseudomonas）属種など、他の腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主内ではまた、典型的に、宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターも作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由来するプロモーター系など、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在する。プロモーターは、任意選択で、オペレーター配列により発現を制御することが典型的であるが、転写および翻訳を開始して終結させるためのリボソーム結合性部位配列なども有する。本発明のＢＭＰ６結合性ポリペプチドを発現させるのに、酵母など、他の微生物もまた援用することができる。また、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。
一実施形態では、本発明のＢＭＰ６結合性ポリペプチドを発現させ、作製するのに、哺乳動物宿主細胞を使用する。例えば、哺乳動物宿主細胞は、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現させるハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例で記載される、１Ｄ６．Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン）の場合もあり、外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞系（例えば、下記で例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）の場合もある。哺乳動物宿主細胞は、任意の正常非不死化動物細胞または正常不死化動物細胞もしくは非正常不死化動物細胞またはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、多様なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞、およびハイブリドーマを含む、インタクトな免疫グロブリンを分泌することが可能な多数の適切な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発現させるための、哺乳動物組織細胞培養物の使用については、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において一般に論じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照されたい）、ならびにリボソーム結合性部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの、必要なプロセシング情報部位を含みうる。これらの発現ベクターは通例、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、および／またはモジュレート可能プロモーターもしくは調節可能プロモーターでありうる。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト即初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せを含むがこれらに限定されない。
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に活用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主に使用することができる（一般に、Sambrook et al., 前出を参照されたい）。他の方法は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介型形質転換、注射およびマイクロインジェクション、遺伝子銃法、ウィロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質であるＶＰ２２との融合体（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強型取込み、およびｅｘ ｖｉｖｏにおける形質導入を含む。組換えタンパク質の長期にわたる高収率作製のためには、安定的発現が所望されることが多い。例えば、ＢＭＰ６結合性抗体鎖または結合性断片を安定的に発現させる細胞系は、ウイルス複製起点または内因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含有する、本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターを導入した後、細胞は、強化培地中で１〜２日間にわたり成長させてから、選択培地へと切り替えることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与し、その存在により細胞の成長を可能とし、これにより、導入された配列を選択培地中で発現させることに成功することである。耐性で安定的にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適する組織培養法を使用して増殖させることができる。
本発明のモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含む様々な技法により作製することができる。例えば、Ｂリンパ球のウイルス性形質転換または発がん性形質転換など、モノクローナル抗体を作製するための多くの技法を援用することができる。
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの作製は、十分に確立された手順である。当技術分野では、融合体のための免疫化された脾臓細胞を単離するための免疫化プロトコールおよび免疫化法が公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順もまた公知である。
本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体およびそれらの抗原結合性断片は、上記で記載した通りに調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づき調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得、標準的な分子生物学の技法を使用して、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）を使用して、マウス可変領域を、ヒト定常領域へと連結することができる。ヒト化抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法を使用して、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワークへと挿入することができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号明細書；ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６１８０３７０号明細書を参照されたい。
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ＢＭＰ６を指向するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなく、ヒト免疫系の一部を保有する、トランスジェニックマウスまたはトランスクロモソームマウスを使用して作り出すことができる。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソームマウスは、本明細書で、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称するマウスを含み、本明細書ではまとめて、「ヒトＩｇマウス」と称する。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内因性ミュー鎖遺伝子座および内因性カッパ鎖遺伝子座を不活化する標的化突然変異と併せて、再配列されていないヒト重（ミューおよびガンマ）鎖免疫グロブリン配列およびカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する（例えば、Lonberg et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859を参照されたい）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはＫの発現の低減を呈示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を経て、高アフィニティーのヒトＩｇＧ−カッパモノクローナル抗体を作り出す（Lonberg, N. et al., 1994 前出; Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101において総説される; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93；ならびにHarding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用、ならびにこのようなマウスにより保有されるゲノムの修飾は、それらの全ての内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に具体的に組み込まれる、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591；ならびにFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851においてさらに記載されている。さらに、全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，８７７，３９７号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；および同第５，７７０，４２９号明細書；Suraniらによる、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２１０３９１８号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９４／２５５８５号、同第ＷＯ９７１１３８５２号、同第ＷＯ９８／２４８８４号、および同第ＷＯ９９／４５９６２号；ならびにＫｏｒｍａｎらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号も参照されたい。
別の実施形態では、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロモソームを保有するマウスなど、トランス遺伝子上およびトランスクロモソーム上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用してもたらすことができる。本明細書で「ＫＭマウス」と称するこのようなマウスは、ＩｓｈｉｄａらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０２／４３４７８号において詳細に記載されている。
当技術分野ではなおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる代替的なトランスジェニック動物系も入手可能であり、本発明のＢＭＰ６結合性抗体およびそれらの抗原結合性断片をもたらすのに使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称する代替的なトランスジェニック系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，１５０，５８４号明細書；および同第６，１６２，９６３号明細書において記載されている。
当技術分野ではさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる代替的なトランスクロモソーム動物系も入手可能であり、本発明のＢＭＰ６結合性抗体をもたらすのに使用することができる。例えば、「ＴＣマウス」と称する、ヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を保有するマウスを使用することができるが、このようなマウスは、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727において記載されている。当技術分野ではさらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソームを保有するウシも記載されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894）、本発明のＢＭＰ６結合性抗体をもたらすのに使用することができる。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。当技術分野では、ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法が確立されているか、または下記の実施例で記載する。例えば、Ｌａｄｎｅｒらによる米国特許第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；および同第５，５７１，６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒらによる米国特許第５，４２７，９０８号明細書；および同第５，５８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによる米国特許第５，９６９，１０８号明細書；および同第６，１７２，１９７号明細書；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらによる米国特許第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；および同第６，５９３，０８１号明細書を参照されたい。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化するとヒト抗体応答を作り出しうるようにヒト免疫細胞を再構成した、ＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。このようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらによる米国特許第５，４７６，９９６号明細書；および同第５，６９８，７６７号明細書において記載されている。
フレームワークまたはＦｃの操作
本発明の操作抗体およびそれらの抗原結合性断片は、例えば、抗体の特性を改善するように、ＶＨ内および／またはＶＬ内のフレームワーク残基へと、修飾が施された抗体およびそれらの抗原結合性断片を含む。このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるように施すことが典型的である。例えば、１つの手法は、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すには、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、本発明により包含されることを意図する。
フレームワーク修飾の別の種類は、１つもしくは複数のフレームワーク領域内の残基、なおまたは、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去して、これにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。この手法はまた、「脱免疫化」とも称し、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書においてさらに詳細に記載されている。
フレームワーク内またはＣＤＲ領域内に施された修飾に加えて、またはこれと代替的に、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内の修飾を含んで、典型的に、血清半減期、補体の結合、Ｆｃ受容体の結合、および／または抗原依存性細胞性細胞傷害など、抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように操作することもできる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾することもでき（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に付着することができる）、そのグリコシル化を改変して、ここでもまた、抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように修飾することもできる。これらの実施形態の各々については、下記でさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスである。
一実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を改変する、例えば、増大または減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易とするか、または抗体の安定性を増大もしくは低下させるように改変する。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌属プロテインＡ（ＳｐＡ）への結合が、天然Ｆｃ−ヒンジドメインのＳｐＡへの結合と比べて損なわれるように、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間界面領域へと導入する。この手法は、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。多様な手法が可能である。例えば、以下の突然変異：Ｗａｒｄによる米国特許第６，２７７，３７５号明細書において記載されている、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆのうちの１つまたは複数を導入することができる。代替的に、生物学的半減期を延長するために、抗体を、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書；および同第６，１２１，０２２号明細書において記載されている、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採取されたサルベージ受容体結合性エピトープを含有するように、ＣＨ１領域内またはＣＬ領域内で改変することもできる。
一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、抗体のエフェクター機能を改変する異なるアミノ酸残基で置きかえることにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対するアフィニティーを改変しているが、親抗体の抗原結合能は保持するように、１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。それに対するアフィニティーを改変するエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。この手法は、両方ともＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号明細書；および同第５，６４８，２６０号明細書においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体が、Ｃ１ｑへの結合を改変し、かつ／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を低減もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。この手法は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号明細書においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基を改変して、これにより、補体に結合する抗体の能力を改変する。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９３５１号においてさらに記載されている。
さらに別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させ、かつ／またはＦｃ−ガンマ受容体に対する抗体のアフィニティーを増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。この手法は、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号においてさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、Ｆｃ−ガンマＲＩ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対する結合性部位もマップされており、結合を改善させた変異体も記載されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604を参照されたい）。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、脱グリコシル化抗体（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）を作製することができる。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体のアフィニティーを増大させるように改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす、１つまたは複数のアミノ酸置換を作製して、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる。このような脱グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させることができる。このような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書；および同第６，３５０，８６１号明細書においてさらに詳細に記載されている。
加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体または二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体など、グリコシル化の種類を改変した抗体を作製することもできる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を増大させることが裏付けられている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を改変した宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成することができる。当技術分野では、グリコシル化機構を改変した細胞が記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、これにより、グリコシル化を改変した抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、このような細胞系内で発現させた抗体が、低フコシル化を呈示するように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊した細胞系について記載している。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）連結された炭水化物へと付着する能力を低減し、また、その宿主細胞内で発現させた抗体の低フコシル化も結果としてもたらす、変異体のＣＨＯ細胞系である、ＬｅｃＩ３細胞について記載している（また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４３４２号は、操作細胞系内で発現させた抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大を結果としてもたらす二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈示するように、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させるように操作された細胞系について記載している（また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照されたい）。
改変抗体を操作する方法
上記で論じた通り、本明細書で示されるＶＨ配列およびＶＬ配列または全長重鎖および全長軽鎖配列を有するＢＭＰ６結合性抗体は、全長重鎖配列および／もしくは全長軽鎖配列、ＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、またはこれらへと付着された定常領域を修飾することにより、新たなＢＭＰ６結合性抗体を創出するのに使用することができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明のＢＭＰ６結合性抗体の構造的特徴を使用して、構造的に類縁のＢＭＰ６結合性抗体であって、ヒトＢＭＰ６に結合し、また、ＢＭＰ６の、１つまたは複数の機能的特性も阻害すること（例えば、溶血アッセイにおいて、赤血球溶解を阻害する）など、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の、少なくとも１つの機能的特性を保持するＢＭＰ６結合性抗体を創出する。
例えば、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の、１つもしくは複数のＣＤＲ領域、またはそれらの突然変異を、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと、組換えにより組み合わせて、上記で論じた通り、さらなる、組換えにより操作された本発明のＢＭＰ６結合性抗体およびそれらの抗原結合性断片を創出することができる。他の種類の修飾は、前出の節で記載した修飾を含む。操作法のための出発材料は、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域である。操作抗体を創出するのに、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）ことは必要ではない。そうではなくて、配列内に含有される情報を、元の配列に由来する「第２世代の」配列を創出するための出発材料として使用し、次いで、「第２世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
改変抗体配列はまた、ＣＤＲ３配列、または米国特許出願公開第２００５０２５５５５２号明細書において記載されている、最小限の不可欠な結合決定基を固定し、ＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列には多様性を持たせた抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても調製することができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術など、抗体を、抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適切な任意のスクリーニング技術に従い実施することができる。
標準的な分子生物学の技法を使用して、改変抗体配列を調製し、発現させることができる。改変抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書で記載されるＢＭＰ６結合性抗体の機能的特性であって、ヒトＢＭＰ６タンパク質に特異的に結合することを含むがこれらに限定されない機能的特性のうちの１つ、一部、または全部を保持する抗体であり、溶血アッセイにおいて、赤血球溶解を阻害する。
改変抗体の機能的特性は、実施例において示されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）など、当技術分野において利用可能であり、かつ／または本明細書で記載される標準的なアッセイを使用して評価することができる。
本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を操作する方法についての一実施形態では、突然変異を、ＢＭＰ６結合性抗体をコードする配列の全部または一部に沿って、ランダムに、または選択的に導入することができ、結果として得られる修飾ＢＭＰ６結合性抗体を、本明細書で記載される結合活性および／または他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。当技術分野では、突然変異法が記載されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、またはこれらの組合せを使用して、抗体の突然変異を創出し、スクリーニングするための方法について記載している。代替的に、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０７４６７９号は、コンピュータによるスクリーニング法を使用して、抗体の生理化学的特性を最適化する方法について記載している。
本発明の抗体の特徴付け
本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、多様な機能的アッセイにより特徴付けることができる。例えば、それらは、ＢＭＰ６を阻害するそれらの能力により特徴付けることができる。
ＢＭＰ６に結合する抗体の能力は、対象の抗体を標識することにより、直接的に検出することもでき、抗体を標識せずに、当技術分野で公知の、多様なサンドイッチアッセイフォーマットを使用して、結合を間接的に検出することもできる。
一実施形態では、本発明のＢＭＰ６結合性抗体およびそれらの抗原結合性断片は、基準ＢＭＰ６結合性抗体の、ＢＭＰ６ポリペプチドへの結合を遮断するか、またはこれと競合する。これらは、上記で記載した、完全ヒトＢＭＰ６結合性抗体でありうる。それらはまた、基準抗体と同じエピトープに結合する、他のマウスＢＭＰ６結合性抗体、キメラＢＭＰ６結合性抗体、またはヒト化ＢＭＰ６結合性抗体でもありうる。基準抗体の結合を遮断するか、またはこれと競合する能力は、被験下のＢＭＰ６結合性抗体が、基準抗体により規定されるエピトープと同じであるかもしくは類似のエピトープ、または基準ＢＭＰ６結合性抗体が結合するエピトープと十分に近位のエピトープに結合することを指し示す。このような抗体は、とりわけ、基準抗体について同定される有利な特性を共有する可能性が高い。基準抗体を遮断するか、またはこれと競合する能力は、例えば、競合的結合アッセイにより決定することができる。競合的結合アッセイでは、被験下の抗体を、基準抗体の、ＢＭＰ６ポリペプチドなど、共通の抗原への特異的結合を阻害する能力について検討する。過剰量の被験抗体が、基準抗体の結合を実質的に阻害する場合、被験抗体は、抗原への特異的結合について、基準抗体と競合する。実質的な阻害とは、被験抗体が、基準抗体の特異的結合を、通例、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または９０％低減することを意味する。
抗体の、特定のタンパク質、この場合、ＢＭＰ６への結合についての、基準抗体との競合について評価するのに使用しうる、多数の公知の競合的結合アッセイが存在する。これらは、例えば、直接的固相イムノアッセイまたは間接的固相イムノアッセイ（ＲＩＡ）、直接的固相イムノアッセイまたは間接的固相イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983を参照されたい）；直接的固相ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986を参照されたい）；直接的固相標識アッセイ、直接的固相標識サンドイッチアッセイ（Harlow & Lane、前出を参照されたい）；Ｉ−１２５標識を使用する、直接的固相標識ＲＩＡ（Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988を参照されたい）；直接的固相ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990）；および直接的標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990）を含む。このようなアッセイは、非標識化被験ＢＭＰ６結合性抗体または標識化基準抗体のいずれかを保有する固体表面または細胞に結合させた精製抗原の使用を伴うことが典型的である。競合的阻害は、被験抗体の存在下で、固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定する。通例、被験抗体は、過剰に存在する。競合アッセイ（競合抗体）により同定される抗体は、基準抗体と同じエピトープに結合する抗体と、基準抗体が結合するエピトープと、立体障害が生じる程度に十分に近位の隣接エピトープに結合する抗体とを含む。
選択されたＢＭＰ６結合性モノクローナル抗体が、固有のエピトープに結合するかどうかを決定するために、市販の試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ製の試薬）を使用して、各抗体をビオチニル化することができる。非標識化モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を使用する競合研究は、ＢＭＰ６ポリペプチドでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して実施することができる。ビオチニル化ＭＡｂの結合は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブにより検出することができる。精製ＢＭＰ６結合抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを実施することができる。例えば、マイクロ滴定プレートのウェルを、４℃で一晩、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧによりコーティングすることができる。１％のＢＳＡによるブロッキングの後で、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の、ＢＭＰ６結合性モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と、雰囲気温度で、１〜２時間にわたり反応させる。次いで、ウェルを、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼコンジュゲートプローブと反応させることができる。次いで、精製抗体のアイソタイプを決定しうるように、プレートを、現像および解析する。
ＢＭＰ６結合性モノクローナル抗体の、ＢＭＰ６ポリペプチドを発現する生細胞への結合を裏付けるために、フローサイトメトリーを使用することができる。略述すると、ＢＭＰ６を発現する細胞株（標準的な成長条件下で成長させた）を、０．１％のＢＳＡおよび１０％のウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ中に多様な濃度のＢＭＰ６結合性抗体と共に混合し、３７℃で、１時間にわたりインキュベートすることができる。洗浄後、細胞を、一次抗体染色と同じ条件下で、フルオレセイン標識化抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。試料は、単一の細胞にゲートをかけるように、光特性および側方散乱特性を使用する、ＦＡＣＳｃａｎ装置により解析することができる。蛍光顕微鏡法を使用する代替的なアッセイを、フローサイトメトリーアッセイ（に加えて、またはこれの代わりに）使用することができる。細胞は、上記で記載した通りに正確に染色し、蛍光顕微鏡法により検討することができる。この方法は、個々の細胞の視覚化を可能とするが、抗原の密度に応じて、感度が低下する場合がある。
本発明のＢＭＰ６結合性抗体およびそれらの抗原結合性断片は、ウェスタンブロット法により、ＢＭＰ６ポリペプチドまたはＢＭＰ６抗原性断片との反応性について、さらに調べることができる。略述すると、精製ＢＭＰ６ポリペプチドもしくは融合タンパク質、またはＢＭＰ６を発現する細胞に由来する細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることができる。電気泳動の後、分離された抗原を、ニトロセルロース膜へと移し、１０％のウシ胎仔血清でブロッキングし、被験モノクローナル抗体でプローブする。抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して、ヒトＩｇＧ結合を検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）で現像することができる。
機能的アッセイの例はまた、下記の実施例節でも記載する。
予防的使用および治療的使用
本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を投与することにより、ＢＭＰ６活性の増大と関連する疾患または障害を処置する方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を投与することにより、貧血を処置する方法を提供する。
本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を使用して、とりわけ、貧血の進行を防止することができる。本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片はまた、貧血患者の処置のための他の療法と組み合わせて使用することもできる。
一実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を投与することにより、ＢＭＰ６関連疾患またはＢＭＰ６関連障害を処置する方法を提供する。公知のＢＭＰ６関連疾患またはＢＭＰ６関連障害の例は、非限定的な例として、慢性疾患性貧血（ＡＣＤ）、慢性腎疾患（ＣＫＤ）性（例えば、ＣＫＤと関連する）貧血、がん性貧血、炎症性貧血、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）抵抗性貧血（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）抵抗性貧血）、ＥＳＡ低応答性貧血（例えば、ＥＰＯ低応答性貧血）、機能的鉄欠損性貧血、および／または鉄欠乏性貧血を含む貧血を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を投与することにより、ＢＭＰ６関連疾患またはＢＭＰ６関連障害を処置する方法であって、前記疾患または障害が、貧血である、方法を提供する。一実施形態では、貧血は、慢性疾患性貧血である。一実施形態では、慢性疾患は、慢性腎疾患である。一実施形態では、慢性疾患は、がんである。一実施形態では、慢性疾患は、炎症である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）抵抗性貧血である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）低応答性貧血である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、鉄欠乏性貧血である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、慢性血液透析（ＨＤ）対象である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、腎疾患、例えば、末期腎疾患を有する。
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を投与することにより、ＢＭＰ６関連疾患またはＢＭＰ６関連障害を処置する方法であって、前記疾患または障害が、機能的鉄欠損性貧血である、方法を提供する。一実施形態では、対象は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）で処置されている慢性血液透析患者である。一実施形態では、対象は、慢性腎疾患を伴う、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）で処置されている慢性血液透析患者である。
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体を含む組成物を投与することにより、貧血を処置する方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体を含む組成物を投与することにより、貧血を処置する方法を提供する。一実施形態では、貧血は、慢性腎疾患性貧血である。一実施形態では、貧血は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）抵抗性貧血である。一実施形態では、貧血は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）低応答性貧血である。一実施形態では、貧血は、鉄欠乏性貧血である。一実施形態では、貧血は、腎疾患、例えば、慢性腎疾患と関連する貧血である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、慢性血液透析（ＨＤ）対象である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、腎疾患、例えば、末期腎疾患を有する。
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体を含む組成物を投与することにより、ＢＭＰ６関連疾患またはＢＭＰ６関連障害を処置する方法であって、前記疾患または障害が、機能的鉄欠損性貧血である、方法を提供する。一実施形態では、対象は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）で処置されている慢性血液透析患者である。一実施形態では、対象は、慢性腎疾患を伴う、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）で処置されている慢性血液透析患者である。
具体的な実施形態では、本発明は、貧血を処置する方法を提供する。
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を投与することにより、対象のＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）の投与の必要を低減するための方法を提供する。一実施形態では、貧血は、慢性疾患性貧血である。一実施形態では、慢性疾患は、慢性腎疾患である。一実施形態では、慢性疾患は、がんである。一実施形態では、慢性疾患は、炎症である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）抵抗性貧血である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）低応答性貧血である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、鉄欠乏性貧血である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、慢性血液透析（ＨＤ）対象である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、腎疾患、例えば、末期腎疾患を有する。
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を投与することにより、対象のＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）の投与の必要を低減する方法であって、前記対象が、機能的鉄欠損性貧血を有する、方法を提供する。一実施形態では、対象は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）で処置されている慢性血液透析患者である。一実施形態では、対象は、慢性腎疾患を伴う、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）で処置されている慢性血液透析患者である。
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体を含む組成物を投与することにより、対象のＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）の投与の必要を低減する方法を提供する。一実施形態では、対象は、貧血を有する。一実施形態では、貧血は、慢性疾患性貧血である。一実施形態では、慢性疾患は、慢性腎疾患である。一実施形態では、慢性疾患は、がんである。一実施形態では、慢性疾患は、炎症である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）抵抗性貧血である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）低応答性貧血である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、鉄欠乏性貧血である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、慢性血液透析（ＨＤ）対象である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、腎疾患、例えば、末期腎疾患を有する。
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体を含む組成物を投与することにより、対象のＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）の投与の必要を低減する方法であって、前記対象が、機能的鉄欠損性貧血を有する、方法を提供する。一実施形態では、対象は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）で処置されている慢性血液透析患者である。一実施形態では、対象は、慢性腎疾患を伴う、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）で処置されている慢性血液透析患者である。
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を投与することにより、対象の鉄（例えば、ＩＶ鉄）必要投与量を低減するための方法を提供する。一実施形態では、対象は、貧血を有する。一実施形態では、貧血は、慢性疾患性貧血である。一実施形態では、慢性疾患は、慢性腎疾患である。一実施形態では、慢性疾患は、がんである。一実施形態では、慢性疾患は、炎症である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）抵抗性貧血である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）低応答性貧血である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、鉄欠乏性貧血である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、慢性血液透析（ＨＤ）対象である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、腎疾患、例えば、末期腎疾患を有する。
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を投与することにより、対象の鉄（例えば、ＩＶ鉄）必要投与量を低減する方法であって、前記対象が、機能的鉄欠損性貧血を有する、方法を提供する。一実施形態では、対象は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）で処置されている慢性血液透析患者である。一実施形態では、対象は、慢性腎疾患を伴う、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）で処置されている慢性血液透析患者である。
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体を含む組成物を投与することにより、対象の鉄（例えば、ＩＶ鉄）必要投与量を低減するための方法を提供する。一実施形態では、対象は、貧血を有する。一実施形態では、貧血は、慢性疾患性貧血である。一実施形態では、慢性疾患は、慢性腎疾患である。一実施形態では、慢性疾患は、がんである。一実施形態では、慢性疾患は、炎症である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）抵抗性貧血である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）低応答性貧血である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、鉄欠乏性貧血である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、慢性血液透析（ＨＤ）対象である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、腎疾患、例えば、末期腎疾患を有する。
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体を含む組成物を投与することにより、対象の鉄（例えば、ＩＶ鉄）必要投与量を低減する方法であって、前記対象が、機能的鉄欠損性貧血を有する、方法を提供する。一実施形態では、対象は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）で処置されている慢性血液透析患者である。一実施形態では、対象は、慢性腎疾患を伴う、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）で処置されている慢性血液透析患者である。
具体的な実施形態では、本発明は、対象の鉄（例えば、ＩＶ鉄）必要投与量を低減し、対象のＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）の投与の必要を低減するための方法であって、本発明の抗体もしくは抗原結合性断片または前記抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、貧血は、慢性疾患性貧血である。一実施形態では、慢性疾患は、慢性腎疾患である。一実施形態では、慢性疾患は、がんである。一実施形態では、対象は、貧血を有する。一実施形態では、慢性疾患は、炎症である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）抵抗性貧血である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、ＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）低応答性貧血である。一実施形態では、貧血（例えば、慢性疾患性貧血）は、鉄欠乏性貧血である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、慢性血液透析（ＨＤ）対象である。上記の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、対象は、腎疾患、例えば、末期腎疾患を有する。
一実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を投与することにより、隔離された鉄を移動させる方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の、本発明の抗体を含む組成物を投与することにより、隔離された鉄を移動させる方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、エリスロポエチンおよび／または鉄（例えば、ＩＶ鉄）の投与に対する必要を軽減しながら、貧血を伴う対象におけるヘモグロビンのレベルを改善する（例えば、上昇させる）ための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、貧血は、慢性疾患と関連する貧血である。一実施形態では、ヘモグロビンのレベルの改善は、その内容が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、臨床実務ガイドライン、例えば、Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335により指定されるレベルへの、レベルの改善を含む。一実施形態では、ヘモグロビンのレベルの改善は、ヘモグロビンのレベルの、少なくとも約１１．０ｇ／ｄＬ、例えば、約１１．０ｇ／ｄＬ〜約１２．５ｇ／ｄＬへの改善を含む。一実施形態では、ヘモグロビンのレベルの改善は、ヘモグロビンのレベルの、少なくとも１１．０ｇ／ｄＬ、例えば、１１．０ｇ／ｄＬ〜１２．５ｇ／ｄＬへの改善を含む。
一実施形態では、本発明は、エリスロポエチンおよび／または鉄（例えば、ＩＶ鉄）の投与に対する必要を軽減しながら、貧血を伴う対象におけるヘモグロビンのレベルを改善する（例えば、上昇させる）ための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の抗体を含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、貧血は、慢性疾患と関連する貧血である。一実施形態では、ヘモグロビンのレベルの改善は、その内容が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、臨床実務ガイドライン、例えば、Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-33により指定されるレベルへの、レベルの改善を含む。一実施形態では、ヘモグロビンのレベルの改善は、ヘモグロビンのレベルの、少なくとも約１１．０ｇ／ｄＬ、例えば、約１１．０ｇ／ｄＬ〜約１２．５ｇ／ｄＬへの改善を含む。一実施形態では、ヘモグロビンのレベルの改善は、ヘモグロビンのレベルの、少なくとも１１．０ｇ／ｄＬ、例えば、１１．０ｇ／ｄＬ〜１２．５ｇ／ｄＬへの改善を含む。
一実施形態では、本発明は、エリスロポエチンおよび／または鉄（例えば、ＩＶ鉄）の投与に対する必要を軽減しながら、貧血を伴う対象におけるヘモグロビンのレベルを維持するための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、貧血は、慢性疾患と関連する貧血である。一実施形態では、ヘモグロビンのレベルの改善は、その内容が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、臨床実務ガイドライン、例えば、Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-33により指定されるレベルへの、レベルの改善を含む。一実施形態では、ヘモグロビンのレベルの改善は、ヘモグロビンのレベルの、少なくとも約１１．０ｇ／ｄＬ、例えば、約１１．０ｇ／ｄＬ〜約１２．５ｇ／ｄＬへの改善を含む。一実施形態では、ヘモグロビンのレベルの改善は、ヘモグロビンのレベルの、少なくとも１１．０ｇ／ｄＬ、例えば、１１．０ｇ／ｄＬ〜１２．５ｇ／ｄＬへの改善を含む。
一実施形態では、本発明は、エリスロポエチンおよび／または鉄（例えば、ＩＶ鉄）の投与に対する必要を軽減しながら、貧血を伴う対象におけるヘモグロビンのレベルを維持するための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の抗体を含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、貧血は、慢性疾患と関連する貧血である。一実施形態では、ヘモグロビンのレベルの改善は、その内容が、それらの全体において本明細書に組み込まれる、臨床実務ガイドライン、例えば、Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-33により指定されるレベルへの、レベルの改善を含む。一実施形態では、ヘモグロビンのレベルの改善は、ヘモグロビンのレベルの、少なくとも約１１．０ｇ／ｄＬ、例えば、約１１．０ｇ／ｄＬ〜約１２．５ｇ／ｄＬへの改善を含む。一実施形態では、ヘモグロビンのレベルの改善は、ヘモグロビンのレベルの、少なくとも１１．０ｇ／ｄＬ、例えば、１１．０ｇ／ｄＬ〜１２．５ｇ／ｄＬへの改善を含む。
一実施形態では、表１に記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を、それを必要とする患者に、本明細書で記載されているか、または当技術分野で公知の治療法または手順などの治療法または手順と共に投与することができる。このような方法または手順は、非限定的な例として、治療有効量のＥＳＡ（例えば、ＥＰＯ）、エリスロポエチン、または鉄の投与、および輸血を含む。処置は、１週間、１カ月間、３カ月間、６カ月間、または１年間にわたり、ある間隔で継続することが典型的である。一部の患者では、処置を、最長で、患者の余命にわたり投与する。
本発明の治療剤を、別の薬剤と併せて投与する場合、２つを、いずれかの順序で、逐次的に投与することもでき、同時に投与することもできる。一部の態様では、本発明の抗体を、第２の薬剤または方法（例えば、ＥＳＡ、エリスロポエチン、鉄、輸血）による治療もまた施される対象に投与する。他の態様では、結合性分子を、手術による処置と共に投与する。
ＢＭＰ６結合性抗体による組合せ処置に適する薬剤は、当技術分野で公知の薬剤であって、ＢＭＰ６の発現、レベル、安定性、および／または活性を阻害するか、または低減する薬剤を含む。このような薬剤は、ＢＭＰ６に対する、抗体、ｓｉＲＮＡ、および低分子を含む。
当技術分野では、ＢＭＰ６に対する多様な抗体であって、とりわけ、
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において記載されている抗体を含む抗体が公知である。
当技術分野では、ＢＭＰ６に対するさらなる抗体も公知であり、多くが市販されている。当技術分野では、ＢＭＰ６に対する、多様なｓｉＲＮＡであって、とりわけ、
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において記載されているｓｉＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡが公知である。
ＢＭＰ６のさらなる阻害剤も公知である。これらのうちのいずれかを、本明細書で開示される、任意の抗体またはその抗原結合性断片と組み合わせて使用することができる。
組合せ療法レジメンは、相加的結果をもたらす場合もあり、相乗結果（例えば、ＢＭＰ６活性の低減であって、２つの薬剤の組合せ使用について予測される低減を超える低減）をもたらす場合もある。一実施形態では、本発明は、貧血、または、上記で記載した、別のＢＭＰ６関連疾患を、本発明のＢＭＰ６結合性抗体と、ＥＳＡ、エリスロポエチン、鉄、または輸血などの抗貧血剤または方法とにより、阻止および／または処置するための組合せ療法を提供する。
診断的使用
一態様では、本発明は、生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）の文脈では、ＢＭＰ６および／または核酸発現、ならびにＢＭＰ６機能を決定するための診断アッセイ、あるいは個体が、貧血と関連する疾患もしくは障害に罹患しているのかどうか、または貧血と関連する障害を発症する危険性があるのかどうかを決定するための診断アッセイを包含する。
競合アッセイなどの診断アッセイは、共通の結合パートナー上の、限定的な数の結合部位について、被験試料解析物と競合する、標識化類似体（「トレーサー」）の能力に依拠する。一般に、結合パートナーを、競合の前または後に不溶化させ、次いで、結合パートナーに結合したトレーサーおよび解析物を、結合しなかったトレーサーおよび解析物から分離する。この分離は、デカントすること（結合パートナーを、あらかじめ不溶化させた場合）または遠心分離すること（結合パートナーを、競合反応の後で沈殿させた場合）により達せられる。被験試料解析物の量は、マーカー物質の量により測定される、結合したトレーサーの量に反比例する。被験試料中に存在する解析物の量を、定量的に決定するために、既知量の解析物による用量反応曲線を調製し、試験結果と比較する。酵素を検出可能マーカーとして使用する場合、これらのアッセイを、ＥＬＩＳＡ系と呼ぶ。この形態のアッセイでは、抗体と、ＢＭＰ６結合性抗体との競合的結合は、血清試料中の抗体、最も特に、血清試料中の中和抗体についての尺度である、結合したＢＭＰ６、好ましくは、結合した、本発明のＢＭＰ６エピトープを結果としてもたらす。
アッセイの著明な利点は、測定を、中和抗体（すなわち、ＢＭＰ６、具体的には、エピトープの結合に干渉するもの）について直接行うことである。特に、ＥＬＩＳＡ試験の形態における、このようなアッセイは、臨床環境およびルーチンの血液スクリーニングにおいて、無視できない適用を有する。
貧血と関連する障害を伴う患者についての臨床診断またはモニタリングでは、正常対象に由来する、対応する生物学的試料中のレベルと比較した、ＢＭＰ６タンパク質の検出は、貧血と関連する障害を伴う患者を示す。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける診断法またはイメージングは、米国特許出願公開第２００６／００６７９３５号明細書において記載されている。略述すると、これらの方法は一般に、患者に、非侵襲的方法により検出可能なマーカーまたは標識へと作動可能に接合させた、診断的有効量のＢＭＰ６結合性分子を、投与または導入するステップを含む。抗体−マーカーコンジュゲートに、局在化し、ＢＭＰ６に結合するのに十分な時間を与える。次いで、患者を、検出デバイスへと曝露して、検出可能マーカーを同定し、これにより、患者の組織内のＢＭＰ６結合性分子の画像を形成する。ＢＭＰ６結合性抗体またはその抗原結合性断片の存在は、抗体−マーカーが、組織の構成要素に結合するのかどうかを決定することにより検出する。貧血を伴わない正常個体と比較した、ＢＭＰ６タンパク質またはタンパク質の組合せのレベルの上昇の検出は、貧血と関連する障害に対する素因、および／またはこれらの発症を示す。本発明のこれらの態様はまた、組織イメージング法および診断法と処置法との組合せにおける使用のための態様でもある。
本発明はまた、診断アッセイ、予後診断アッセイ、薬理遺伝学、および臨床試験のモニタリングを、予後診断（予測）の目的で使用して、これにより、個体を予防的に処置する、予測医学の分野にも関する。
本発明はまた、個体が、ＢＭＰ６経路活性の調節異常と関連する障害を発症する危険性があるのかどうかを決定するための予後診断（予測）アッセイも提供する。例えば、ＢＭＰ６遺伝子内の突然変異については、生物学的試料中でアッセイすることができる。このようなアッセイを、予後診断または予測の目的で使用して、これにより、ＢＭＰ６、核酸の発現、または活性を特徴とするか、またはこれらと関連する障害が発症する前に、個体を予防的に処置することができる。
本発明の別の態様は、個体におけるＢＭＰ６核酸の発現またはＢＭＰ６の活性を決定し、これにより、その個体に適切な治療剤または予防剤を選択するための方法（本明細書では、「薬理遺伝学」と称する）を提供する。薬理遺伝学は、個体の遺伝子型（例えば、特定の薬剤に応答する個体の能力を決定するのに検討される、個体の遺伝子型）に基づく個体の治療的処置または予防的処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能とする。
本発明のさらに別の態様は、薬剤（例えば、薬物）の、ＢＭＰ６の発現または活性に対する影響を、臨床試験においてモニタリングする方法を提供する。
医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と併せて製剤化されたＢＭＰ６結合性抗体またはその結合性断片を含む医薬組成物を提供する。組成物は加えて、ＢＭＰ６関連疾患（例えば、貧血）の処置または防止に適する１つまたは複数の他の治療剤も含有しうる。薬学的な担体は、組成物を増強するかもしくは安定化させるか、または、組成物の調製を容易にする。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。投与経路および／または投与方式は、所望される結果に応じて変化する。投与は、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、もしくは皮下投与であるか、または標的部位に近接して投与することができる。薬学的に許容される担体は、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適するものとする。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、二特異性分子および多特異性分子である抗体は、化合物を、化合物を不活化しうる酸および他の天然の状態の作用から保護する材料でコーティングすることができる。
組成物は、滅菌であり、かつ、流体であるものとする。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持することができ、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用することにより維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知であり、日常的に実施されている方法に従い調製することができる。例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、Mack Publishing Co., 20th ed., 2000；およびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson ed, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造することが好ましい。本発明の医薬組成物中では、ＢＭＰ６結合性抗体の治療的に有効な用量または治療的に効果的な用量を援用することが典型的である。ＢＭＰ６結合性抗体は、当業者に公知の従来の方法により、薬学的に許容される剤形へと製剤化する。投与レジメンは、所望される最適応答（例えば、治療的応答）をもたらすように調整する。例えば、単一のボーラスを投与することもでき、複数に分割された用量をある期間にわたり投与することもでき、治療状況の要件により指し示されるのに応じて、用量を比例的に低減するかまたは増大させることもできる。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を、投与量単位形態で製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される投与量単位形態とは、処置される対象のための単位投与量として適する、物理的に個別の単位を指す。各単位は、要求される医薬担体との関連で、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性化合物を含有する。
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与方式に所望される治療的応答を達成するのに有効な量の有効成分を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、援用される本発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、援用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、援用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康、および医療既往歴などの因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
医師または獣医師は、医薬組成物中で利用される本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の投与を、所望の治療効果を達成するのに要求されるレベル未満のレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、投与量を漸増させることができる。一般に、本明細書で記載されるアレルギー性の炎症性障害を処置するために有効な、本発明の組成物の用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の薬物、および処置が予防的であるのか治療的であるのかを含む、多くの異なる因子に応じて変化する。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するように滴定することが必要である。抗体の全身投与では、投与量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇの範囲であり、より通例では、宿主の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１５ｍｇの範囲である。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与を伴う。抗体の硝子体内投与では、投与量は、約０．０００１ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲である。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与を伴う。
抗体は通例、複数回投与する。単回の投与の間の間隔は、毎週、毎月、または毎年でありうる。間隔はまた、患者におけるＢＭＰ６結合性抗体の血中レベルを測定することにより指し示される通り、不規則でもありうる。全身投与のいくつかの方法では、投与量は、抗体の血漿中濃度１〜１０００μｇ／ｍｌを達成するように調整し、いくつかの方法では、２５〜５００μｇ／ｍｌを達成するように調整する。代替的に、抗体は、持続放出製剤として投与することもでき、この場合は、低頻度の投与が要求される。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体の半減期より長い半減期を示す。投与量および投与頻度は、処置が予防的であるのか治療的であるのかに応じて変化しうる。予防的適用では、比較的低投与量を、比較的低頻度の間隔で、長期にわたり投与する。一部の患者には、彼らの余生にわたり処置を施し続ける。治療的適用では場合によって、比較的高投与量が、疾患の進行が軽減されるか終結するまで、比較的短い間隔で要求され、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで要求される。その後、患者には、予防的レジメを投与することができる。
具体的な実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇの間の用量（抗体またはその抗原結合性断片）で投与する。具体的な実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与する。具体的な実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００１６ｍｇ／ｋｇ、０．００２５ｍｇ／ｋｇ、０．００４０ｍｇ／ｋｇ、０．００６３ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１６ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４０ｍｇ／ｋｇ、０．０６３ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。具体的な実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１６ｍｇ／ｋｇ、約０．００２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００４０ｍｇ／ｋｇ、約０．００６３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１６ｍｇ／ｋｇ、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０６３ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を、例えば、上記で列挙した用量のうちのいずれかを含む用量で静脈内投与する。複数の実施形態では、静脈内投与は、静脈内注入である。複数の実施形態では、注入を、３０〜６０分間にわたり行う。複数の実施形態では、注入を、約３０〜６０分間にわたり行う。
実施例
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提示されるものであり、その範囲を限定するために提示されるものではない。当業者には、本発明の他の変形がたやすく明らかであろうし、付属の特許請求の範囲によっても包含される。
実施例では、とりわけ、抗体３、抗体５、抗体６、および抗体７について記載する。
これは、これらの抗体と、親抗体との間の関係について記載する。
全てのクローンは、ヒトＩｇＧ１抗体である。
概要
本研究において、本発明者らは、ヒトファージディスプレイライブラリーを使用して、ファージディスプレイを適用することにより、特異的な抗ヒトＢＭＰ６抗体を同定することに成功した。
序説
貧血は、慢性腎疾患（ＣＫＤ）を伴う患者における有病率が高く、生活の質の低下、ならびに循環器疾患および死を含む転帰不良の危険性の増大と関連する。
ＢＭＰ６抗体の目標は、エリスロポエチンおよび静脈内鉄など、赤血球生成刺激剤の要求を軽減しながら、同時に、ヘモグロビンを増大させることにより、鉄欠乏性貧血を伴う患者に利益をもたらす、ヘプシジン降下療法としてのＢＭＰ６抗体である。ヘプシジン降下剤は、この患者集団および鉄欠乏を特徴とする、慢性疾患性貧血（ＡＣＤ）の他の形態におけるＥＳＡ低応答性貧血を改善するために有効な戦略でありうる。
本研究計画の全体的な目標は、ヘプシジンレベルを低下させ、したがって、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）の要求を軽減することにより、鉄欠乏性貧血を伴う患者に利益をもたらすことが可能な、ＢＭＰ６に対する抗体を同定および開発することである。本研究では、本発明者らは、ファージディスプレイを適用して、ＢＭＰ６特異的結合剤を同定した。
好ましいＢＭＰ６抗体は、下記に列挙した基準の大半または全てを満たす：
Ｆａｂ断片の、ヒトＢＭＰ６に対する解離定数（ＫＤ値）が、１ｎＭより小さいこと；
カニクイザルＢＭＰ６抗原に対するＫＤ値が、ヒトＢＭＰ６に対する場合の５分の１以下であること；
マウスＢＭＰ６抗原に対するＫＤ値が、ヒトＢＭＰ６に対する場合の５分の１以下であること；
ヒトＢＭＰ６に対する、ヒトＢＭＰ５およびヒトＢＭＰ７に対する選択性を上回る選択性が、１００倍を超える差違を伴うこと；
ＨＥＰ３Ｂ−ＢＲＥ−Ｌｕｃレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＢＭＰ６に結合し、そのシグナル伝達活性を中和する能力。ＢＲＥ２−ｌｕｃ２レポーター遺伝子を安定的にトランスフェクトしたＨＥＰ３Ｂ細胞を、ｈＢＭＰタンパク質（Ｒ＆Ｄ）で誘導し、抗ＢＭＰ６抗体で処置した。ＢｒｉｇｈｔＧｌｏアッセイを、処置の２４時間後に行った；
肝細胞内および初代ヒト肝細胞内の、ＢＭＰ６に誘導されるヘプシジン発現系を阻害する能力；
開発可能性における危険性が、低度〜中程度であること。１つの最終的な抗体フォーマットは、ヒトＩｇＧ１であること。
抗体は、既に記載されている（Knappik et al. 2000 J. Mol. Biol. 296: 57-86、Prassler et al. 2011 J. Mol. Biol. 413: 261-278）通りに市販のファージディスプレイライブラリーを使用し、ファージ表面上でＦａｂを提示するための技術（Rothe et al. 2008 J. Mol. Biol. 376: 1182-1200）を利用して作り出した。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製のｈＢＭＰ６に対して、パニングおよび初期ＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。タンパク質結合ヒットについてのＥＬＩＳＡスクリーニングは、ｈＢＭＰ６特異的結合剤の同定を結果としてもたらした。抗体のＦａｂ断片を、マウスＢＭＰ６相同体に対する種間交差反応性についてさらに特徴付け、ヒトＢＭＰ６に対するそれらの結合アフィニティーを決定した。また、ＥＬＩＳＡにおいて、ｈＢＭＰ２タンパク質、ｈＢＭＰ５タンパク質、およびｈＢＭＰ７タンパク質を使用して、Ｆａｂの特異性も確認した。また、ＦａｂのＢＭＰ６特異的活性も、レポーター遺伝子アッセイにおいて評価した。
この初期の特徴付けに基づき、いくつかのクローンを、ヒトＩｇＧ１フォーマットへと転換し、同じ結合アッセイ、特異性アッセイ、および活性アッセイを使用して特徴付けた。開発可能性の評価から得られるプロファイルと組み合わせた、この機能的特徴付けのアウトカムにより、アフィニティー成熟についての３つのクローン（ＮＯＶ０４２９、ＮＯＶ０４４１、およびＮＯＶ０４４２）の選択をもたらした。
クローンを、それらのＬＣＤＲ３内またはそれらのＨＣＤＲ２内でランダム化させ、親クローン１つ当たり２つずつの新たなＦａｂライブラリーを得た。Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製のｈＢＭＰ６を使用する固相パニングのほか、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製のランダムビオチニル化ｈＢＭＰ６を使用する液相パニングも実施した。特異的ＥＬＩＳＡと組み合わせた、ｈＢＭＰ５タンパク質およびｈＢＭＰ７タンパク質に対する、大腸菌（E.coli）によるＦａｂ溶解物についてのＭＳＤ−ＳＥＴスクリーニングは、アフィニティーが親クローンと比較して改善された、ｈＢＭＰ６特異的結合剤の同定を結果としてもたらした。次いで、これらの改善された誘導体を、ヒトＩｇＧ１フォーマットへと転換し、ＥＬＩＳＡおよびＲＧＡにおいてさらに特徴付けして、それらのｈＢＭＰ６特異的活性について評価した。
所望の特性および良好な開発可能性プロファイルを伴う、１８の成熟抗体クローンを、操作（潜在的なＰＴＭ除去および生殖細胞系列化）のために選択した。結果として得られる２８の変異体を、マイクロスケールの発現により、ｈＩｇＧ１として作製し、既に記載されている通りに特徴付けした。
開発可能性の評価から得られるプロファイルと組み合わせた、この機能的特徴付けのアウトカムから、選択のためのリード候補物質がもたらされた。
直接コーティングされた抗原についてのＥＬＩＳＡスクリーニング
ＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して、単一のＦａｂクローンを、標的抗原への結合についてのパニング出力から同定した。Ｆａｂ断片は、粗大腸菌（E.coli）溶解物を含有するＦａｂを使用して調べた（２．３．３節を参照されたい）。
一次スクリーニングは、５０ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ４．７中に１．５μｇ／ｍＬの濃度で、４℃、ｈＢＭＰ６＿ＲＤで、一晩にわたりコーティングされた、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ウェルプレートを使用して実施した。
一次ヒットについての二次スクリーニングは、ｈＢＭＰ６＿ＲＤ（５０ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ４．７中に１．５μｇ／ｍＬ）でコーティングされた、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートのほか、特異性の確認のために、ｈＢＭＰ７（５０ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ４．７中に３μｇ／ｍＬ）でコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｂ ９６ウェルプレートも使用して実施した。
洗浄後、プレートを、ＰＢＳ中に５％のスキムミルクで、２時間にわたりブロッキングした。Ｆａｂを含有する大腸菌（E. coli）溶解物を添加し、ＲＴで２時間にわたり結合を可能とした。結合したＦａｂ断片を検出するために、プレートを、ＴＢＳＴで５回にわたり洗浄し、ＡＰ−抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体を、１／５０００の希釈で添加した。ＲＴで２時間にわたるインキュベーションの後、プレートを、ＴＢＳＴで５回にわたり洗浄し、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質を、製造元の指定に従い添加した。プレートは、基質を添加した１０分後に、ＥＬＩＳＡリーダーにより読み取った。
アフィニティー成熟の後のＳＥＴスクリーニング
アフィニティー評定は、原則として、下記で記載される通りに実施した。Haenel et al., 2005により記載されている原理に基づく溶液平衡滴定による成熟結合剤の評定のために、一定量の希釈ＢＥＬ抽出物を、異なる濃度の抗原で、一晩にわたり平衡化させた。
次いで、混合物を、抗原であらかじめコーティングされたＭＳＤプレートへと移し、インキュベーションおよび洗浄の後、適切なＭＳＤ−Ｓｕｌｆｏタグ標識化検出抗体を添加した。
その後、結合しなかったＦａｂの濃度を、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用するＥＣＬ検出を介して定量化した。
対応する当てはめモデル（２．６．２．２節）を適用して、アフィニティーを推定し、これにより、アフィニティー成熟により最も改善されたクローンを同定する、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソフトウェアを使用して、結果を処理した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ＥＬＩＳＡによる選択性および交差反応性の評価
抗ＢＭＰ６抗体の種間交差反応性を決定するため、組換えヒトＢＭＰ６タンパク質および組換えマウスＢＭＰ６タンパク質を、プレートへと結合させ、ＥＬＩＳＡにより、組換えタンパク質に結合する抗体の能力を決定した。選択性について評価するため、最も近縁の相同体である、ヒトＢＭＰ５およびＢＭＰ７への結合もまた評価した。
ＥＬＩＳＡプレートに、４℃、３〜５ｕｇ／ｍＬで一晩にわたる直接的な固定化により、抗原試薬をコーティングした。ｈＢＭＰ６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）は、コーティングのために、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０中で希釈した。ｈＢＭＰ６、ｍＢＭＰ６、およびｈＢＭＰ５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、５０ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ４．７中で希釈した。ｈＢＭＰ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、５０ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ４．７中で希釈した。非類縁抗原として、ＰＢＳ中５ｕｇ／ｍＬで、ｈＤＫＫ１−Ｈｉｓによるコーティングを施した。
翌日、抗原溶液を廃棄し、プレートを、１００ｕＬのＴＢＳＴで、３回にわたり洗浄した。その後、各ウェルを、ＲＴ、ＴＢＳＴ中５％ミルク１００ｕＬで、２時間にわたりブロッキングした。後続の実験では、ブロッキングは、１００ｕＬのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液で実施した。
１００ｕＬのＴＢＳＴで３回にわたるプレートの洗浄後、各抗原を、４０ｕＬの精製Ｆａｂ試料または精製ＩｇＧ試料と共に、それぞれ、１ｕＭおよび０．２ｕＭ（ＰＢＳＴ緩衝液中）の濃度でインキュベートした。
ＲＴで２時間にわたるインキュベーションの後、プレートを、再度３回にわたり洗浄し、ＡＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ２）二次抗体の、１：５０００希釈液４０ｕＬを添加することにより、結合したＦａｂ／ＩｇＧを検出した。ＲＴで１時間後、製造元のプロトコールに従い、４０ｕＬのＡｔｔｏＰｈｏｓ基質を添加することにより、シグナルを現像し、４３０ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの発光波長を使用して、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより、プレートを速やかに解析した。
アフィニティー評価
ＥＬＩＳＡ結合曲線
ＥＬＩＳＡプレートを、５０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ８．０中、１．５ｕｇ／ｍＬの直接的な固定化により、ｈＢＭＰ６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）抗原でコーティングし、４℃で一晩にわたりインキュベートした。翌日、抗原溶液を廃棄し、プレートを、１００ｕＬのＴＢＳＴで、３回にわたり洗浄した。次いで、各ウェルを、ＲＴ、ＴＢＳＴ中５％ミルク１００ｕＬで、２時間にわたりブロッキングした。後続の実験では、ブロッキングは、１００ｕＬのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液で実施した。
１００ｕＬのＴＢＳＴで３回にわたるプレートの洗浄後、抗原を、Ｆａｂについては、ＰＢＳＴ中、１ｕＭ〜０．０３ｎＭ、ＩｇＧについては、ＰＢＳＴ中、０．５ｕＭ〜０．０１ｎＭの、精製Ｆａｂ試料または精製ＩｇＧ試料の系列希釈液３０ｕＬと共にインキュベートした。
ＲＴで２時間にわたるインキュベーションの後、プレートを、再度３回にわたり洗浄し、ＡＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ２）二次抗体の、１：５０００希釈液３０ｕＬを添加することにより、結合したＦａｂ／ＩｇＧを検出した。ＲＴで１時間後、製造元のプロトコールに従い、３０ｕＬのＡｔｔｏＰｈｏｓ基質を添加することにより、シグナルを現像し４３０ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの発光波長を使用して、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより、プレートを速やかに解析した。
Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（ＭＳＤ）を使用して、ＫＤを決定するための溶液平衡滴定（ＳＥＴ）法
溶液中のアフィニティー決定は基本的に、文献（Friquet et al., 1985）中で記載されている通りに実施した。ＳＥＴ法の感度および精度を改善するために、ＳＥＴ法は、古典的なＥＬＩＳＡから、ＥＣＬベースの技術へと移行した（Haenel et al., 2005）。
１ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）２断片特異的抗体を、製造元の指示書に従い、ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ（商標）ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）で標識した。
実験は、ポリプロピレン製のマイクロ滴定プレート内の、アッセイ緩衝液としての、０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡおよび０．０２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中で実行した。標識されていない抗原を、予測ＫＤの、少なくとも１０倍の濃度で始まる、２ｎ系列で希釈した。抗原を伴わないウェルを使用して、Ｂｍａｘ値を決定し；アッセイ緩衝液だけを含有するウェルを使用して、バックグラウンドを決定した。適切な量の結合剤（抗体濃度が予測ＫＤと同様であるかまたはこれを下回り、最終容量を６０μＬとする）を添加した後で、混合物を、ＲＴで一晩にわたりインキュベートした。
ＭＳＤプレートを、抗原（ウェル１つ当たり３０μＬずつ）でコーティングした。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳによるプレートの洗浄後、平衡化させた試料を、これらのプレート（ウェル１つ当たり３０μｌずつ）へと移し、２０分間にわたりインキュベートした。洗浄後、ウェル１つ当たり３０μｌずつのＭＳＤ−Ｓｕｌｆｏタグ標識化検出抗体（抗ヒト（Ｆａｂ）２、最終的な希釈を、典型的に、１：２０００とする）を、ＭＳＤプレートへと添加し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆシェーカー上（７００ｒｐｍ）、ＲＴで３０分間にわたりインキュベートした。
ＭＳＤプレートを洗浄し、ウェル１つ当たり３０μＬずつのＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔを、界面活性剤と共に添加した後、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して、電気化学発光シグナルを検出した。
データは、カスタマイズ化当てはめモデルを適用する、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソフトウェアで査定した。Ｆａｂ分子のＫＤを決定するために、以下の当てはめモデル（Haenel et al., 2005に従い、Abraham et al., 1996に従い改変した）：
［Ｆａｂ］ｔ：適用された総Ｆａｂ濃度
ｘ：適用された総可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂｍａｘ：抗原を伴わないＦａｂの最大シグナル
ＫＤ：アフィニティー
を使用した。
ＩｇＧ分子のＫＤを決定するために、以下の当てはめモデル（Piehler et al., 1997に従い改変した）：
［ＩｇＧ］：適用された総ＩｇＧ濃度
ｘ：適用された総可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂｍａｘ：抗原を伴わないＩｇＧの最大シグナル
ＫＤ：アフィニティー
を使用した。
実験設定：
ＦａｂのＫＤ決定は基本的に、以下の通りに実施した。ＭＳＤプレートを、４℃、１０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ８中、１〜３ｕｇ／ｍＬのｈＢＭＰ６、ウェル１つ当たり１０ｕＬずつで、一晩にわたり、コーティングした。その後、プレートを、５％のＢＳＡを含有するＰＢＳで、１時間にわたりブロッキングした。ｈＢＭＰ６抗原を、遊離Ｆａｂ断片の滴定のために使用した。抗原原液を、１０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ８．０中１：４０で、４７５ｎＭまであらかじめ希釈してから、滴定のために、アッセイ緩衝液で、意図される出発濃度へと調整した。
ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔによる反応速度の測定
反応速度パラメータの決定によるアフィニティー評価は、バイオレイヤー干渉技術を介して実施した。
精製Ｆａｂ試料は、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄバイオセンサーを使用して測定した。プレートを、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に入れ、恒温チャンバー内で、２５℃へと平衡化させた。センサーを、１５ｕｇ／ｍＬのビオチニル化ｈＢＭＰ６抗原を含有するウェルに、６００秒間にわたり入れることにより、試行を開始した。次いで、センサーを、０、２００、４００、８００、１６００ｎＭの精製Ｆａｂ試料を含有するウェルに入れた。０ｎＭのＦａｂ濃度は、バックグラウンドを決定するために使用した。Ｆａｂの会合および解離は、各々、時間に伴う、層の厚さ（ナノメートル、ｎｍ単位）の変化を、８００秒間ずつにわたり、全てコンピュータの制御下で測定することにより記録した。データは、Ｏｃｔｅｔ Ｕｓｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０を使用して、自動的に処理した。
Ｂｉａｃｏｒｅによる反応速度の測定
測定は、精製Ｆａｂ試料および精製ＩｇＧ試料、ならびにヒトＢＭＰ６抗原およびヒトＢＭＰ７抗原を使用して実施した。
ＥＬＩＳＡによるエピトープビニング
競合ＥＬＩＳＡによるエピトープビニングを実施して、抗体を、同一なエピトープまたは著明に重複するエピトープの群、すなわち、互いの結合を阻害することが可能な抗体へと分類した。
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ中に６６ｎＭの抗ＢＭＰ６ ＩｇＧ ２０ｕＬでコーティングした。プレートを、４℃で一晩にわたりインキュベートした。ＴＢＳＴで２回にわたる洗浄後、プレートを、ＲＴ、ウェル１つ当たり１００ｕＬずつのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液で、２．５時間にわたりブロッキングし、次いで、ＴＢＳＴで２回にわたり洗浄した。
プレートをブロッキングする間、ＰＢＳＴ中に６６ｎＭの、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製ｈＢＭＰ６を、エッペンドルフチューブ内のＰＢＳＴ中３００ｎＭ（ミックス中の最終濃度について言及する）の精製抗ＢＭＰ６ Ｆａｂ（Ｆｌａｇ−Ｈｉｓでタグ付けした）と、あらかじめ混合した。ＲＴで２時間にわたるインキュベーションの後、２０ｕＬの、あらかじめ混合されたｈＢＭＰ６／Ｆａｂを、プレートレイアウトに従い、ブロッキングされた抗ＢＭＰ６ ＩｇＧコーティングウェルへと添加し、ＲＴで、最長２０分間にわたりインキュベートした。
プレートを、ＴＢＳＴで４回にわたり洗浄し、ＰＢＳＴ中で１０００分の１に希釈された、抗Ｈｉｓ６−ＰＯＤ（配列番号９６として開示される「Ｈｉｓ６」）抗体コンジュゲートを、プレートへと添加した。ＲＴで１時間にわたるインキュベーションの後、プレートを、ＴＢＳＴで５回にわたり洗浄した。化学発光ＥＬＩＳＡ基質溶液を、各ウェルへと添加し、Ｔｅｃａｎプレートリーダーを使用して、インキュベーション時間を伴わずに発光を読み取った。
レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ効力
抗体クローンを、精製Ｆａｂ断片および／または精製ＩｇＧ試料として、レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）で調べた。
略述すると、ＨＥＰ３Ｂ肝臓がん細胞株に、ホタルルシフェラーゼを駆動するプロモーター内にＢＭＰ応答性エレメントであるＢＲＥを含有する、ｐＧＬ４−ＢＲＥ２−Ｌｕｃ２レンチウイルスベクターを、安定的にトランスフェクトした。Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製のＢＭＰタンパク質を使用して、シグナル伝達を誘導した。処置の２４時間後に、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏアッセイを行った。
オフターゲット活性の査定
Ｐｒｏｇｅｎ ＵＮＩｃｈｉｐ（登録商標）ＡＶ−ＶＡＲ ＥＰは、大腸菌（E. coli）内で、Ｎ末端のＨｉｓタグ融合タンパク質として発現する、３８４の精製細胞外タンパク質または精製分泌性タンパク質を含有する。
５ｕｇ／ｍＬの抗ｈＢＭＰ６抗体を伴うインキュベーション後、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９コンジュゲートＦ（ａｂ’）２−ヤギ抗ｈＩｇＧＦ（ａｂ’）２断片特異的抗体を使用することにより、結合した抗体を検出する。
内部対照ｈＩｇＧのシグナルを、１００％とし；オフターゲット活性を、ｈＩｇＧに対して標準化し；シグナルが、４％以上である場合に、ヒットを、陽性と考える（カットオフは、バックグラウンドにおいて測定されたｍ＋３に対応する）。
マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性
精製抗体である、抗体５、抗体６、および抗体７を、ＥＳＡ抵抗性貧血マウスモデルにおいて調べた。
結果
抗ＢＭＰ６抗体の特徴付け
操作されたＩｇＧについての特異性評価
２８の抗ｈＢＭＰ６操作ＩｇＧ（生殖細胞系列化され、ＰＴＭ除去された）を、マイクロスケールで作製し、特異性ＥＬＩＳＡにおいて、０．２ｕＭの濃度で調べた。
非操作成熟クローンと比較して、他のＢＭＰタンパク質に対する限定的な交差反応性、およびｈＢＭＰ６に対する強いアフィニティーを保持する操作された変異体を、さらなる特徴付けのために選択した。
・全てのＮＯＶ０４２９操作ＩｇＧ変異体は、ＢＳＡに対する非特異的結合の高度な増大を示した。
・ＮＯＶ０４４１操作ＩｇＧ変異体は、ｈＢＭＰ５に対する交差反応性の、それらの成熟親ＩｇＧと比較したわずかな増大を示した。
・ＮＯＶ０４４２操作ＩｇＧ変異体は、ｈＢＭＰ７およびｈＢＭＰ５に対する、それらの限定的な交差反応性を保持した。
レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）における活性
マイクロスケールで作製された、２８の抗ｈＢＭＰ６操作ＩｇＧ（生殖細胞系列化され、ＰＴＭ除去された）について、既に記載した通りに調べた。結果を、表３にまとめる。
・ＮＯＶ０４２９操作ＩｇＧ変異体は、ＢＭＰ６活性の３〜５倍の改善を示したが、引き換えに、他の全てのＢＭＰに対するアゴニスト活性を獲得した。
・ＮＯＶ０４４１操作ＩｇＧ変異体は、他の３つ全てのＢＭＰに対する、ある程度の交差反応性を獲得した。
・ＮＯＶ０４４２操作ＩｇＧ変異体は、ＢＭＰ活性の改善を示したが、また、２５ｕｇ／ｍｌの最高濃度で、ＢＭＰ７誘導系の、ある程度の阻害も示した。
Ｓ−ＤＡＳ ３による、開発可能性の評価
生殖細胞系列化およびＰＴＭ除去の後、１８の成熟クローンによる、２３の抗ｈＢＭＰ６操作変異体を、第３の開発可能性評価にかけた。
抗体は、高凝集レベルに起因して、高度な危険性を示す２つのクローン（ＮＯＶ０４２９のＨＣＤＲ２誘導体であるＮＯＶ０９４２；ＮＯＶ０４４１のＬＣＤＲ３誘導体であるＮＯＶ０９４４）を除き、好適な危険性開発可能性プロファイルを有することが見出された。
他の２つのクローンは、それらの低生産性力価のために、中程度の危険性プロファイルを伴うと表示した（ＮＯＶ０４４２親抗体のＨＣＤＲ２誘導体であるＮＯＶ０９５７およびＮＯＶ０９６０）。
オフターゲット活性の査定
３つの有力候補物質である、ＮＯＶ０９５１、ＮＯＶ０９５４、およびＮＯＶ０９５８を、精製ｈＩｇＧ１として、上記で記載した、３８４の精製細胞外タンパク質または精製分泌性タンパク質でコーティングされたＰｒｏｔａｇｅｎ ＵＮＩｃｈｉｐ上のオフターゲット結合について調べた。これらは全て、問題ではないと考えられる、低度のオフターゲット活性（≦１０のヒット）を示した。
有力抗体およびバックアップ抗体の選択
ＲＧＡにおける、タンパク質結合データ、活性データ、および特異性データのほか、開発可能性の評価にも基づき、操作された候補物質である、ＮＯＶ０９５１、ＮＯＶ０９５４、ＮＯＶ０９５８を、有力抗体として選択することを決定した。加えて、これらは全て、ｈＢＭＰ６に対する、抗体６７６と比較して優れた特異性ウィンドウを示した。操作された候補物質である、ＮＯＶ０９６１、ＮＯＶ０９４３、ＮＯＶ０９４５は、バックアップ抗体として考えた。表６は、最終候補物質の系統樹について概括する。
結論および考察
この研究計画の目標は、ＢＭＰ６シグナル伝達を阻害し、したがって、慢性疾患性貧血の処置に適する抗体を明らかにすることであった。
したがって、３つの異なるタンパク質ベースのパニング戦略を適用した。一次ＥＬＩＳＡヒットは主に、固相パニングプールから見出されたが、ＲＧＡにおける活性試験の後、１２の抗体が、ｈＢＭＰ６シグナル伝達を阻害することが示された。パニングサブコード２０２３．５に由来する、３つの抗体クローン（ＮＯＶ０４２９、ＮＯＶ０４４１、およびＮＯＶ０４４２）は、ＢＭＰ６特異的活性および良好な開発可能性特性を示し、したがって、アフィニティー成熟のために選択された。
ＬＣＤＲ３またはＨＣＤＲ２をランダム化させて、各抗体クローンについて、２つずつのライブラリーを作り出した。３つの異なる成熟パニング戦略を適用した。ＳＥＴスクリーニング、特異性ＥＬＩＳＡ、およびシークェンシングの後、１８の成熟抗体クローンが、ＲＧＡにおけるＢＭＰ６シグナル伝達を特異的に阻害することが見出され、操作のために選択された。
ＮＯＶ０４４２のファミリーに由来する成熟クローンを、ＬＣＤＲ２内の、潜在的な脱アミド化部位の除去、フレームワーク修復、および生殖細胞系列化にかけた。これは、それらのそれぞれの非突然変異体の成熟親抗体と同様の結合特性を有することが示された抗体である、ＮＯＶ０９５１、ＮＯＶ０９５４、ＮＯＶ０９５８、およびＮＯＶ０９６１を結果としてもたらした。
ＮＯＶ０４４１のファミリーに由来する成熟クローンを、生殖細胞系列化にかけたが、これは、それらのそれぞれの非突然変異体の成熟親抗体と比較して、ＢＭＰ５に対する交差反応性を増大させることが示された抗体である、ＮＯＶ０９４３、ＮＯＶ０９４５、およびＮＯＶ０９４６を結果としてもたらした。
他のＢＭＰタンパク質に対する、限定的な交差反応性、およびそれらの好適な開発可能性プロファイルを伴う、ＢＭＰ６シグナル伝達を阻害するそれらの能力に基づき、ＮＯＶ０９５１、ＮＯＶ０９５４、およびＮＯＶ０９５８を、高量で作製し、ＥＰＯ抵抗性（鉄欠乏性）貧血のための治療薬としてのそれらの有用性についてさらに評価するように手配した。ＥＳＡ抵抗性貧血マウスモデルを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるそれらの有効性を決定した。
３つの有力抗体である、ＮＯＶ０９５１、ＮＯＶ０９５４、およびＮＯＶ０９５８を、最終的な開発可能性評価にかけた。３つの有力抗体の、ｉｎ ｖｉｖｏにおける適合性は、ラットにおけるそれらのＰＫプロファイルを決定することにより評価した。
表７は、企図の開始時において規定された抗体への要求を満たした、最終有力候補物質の特性についてまとめる。
抗ＢＭＰ６抗体の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性およびｉｎ ｖｉｖｏ活性、ならびにＰＫ／ＰＤ
材料
被験化合物は、５０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に約８ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体５、抗体６、および抗体７（表８）であり、動物投与の前に、ＰＢＳ中で希釈した。雄Ｃ５６ＢＬ／６マウスまたは雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを使用した（表９）。
ＢＭＰレポーター遺伝子アッセイのために、ホタルルシフェラーゼを駆動するプロモーター［Korchynskyi et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 4882-91］内にＢＭＰ応答性エレメントであるＢＲＥを含有するレンチウイルスベクターは、ｐＧＬ４−ＢＲＥ２−Ｌｕｃ２に由来した。レンチウイルスベクターを使用して、ＨＥＰ３Ｂ肝臓がん細胞株に、安定的にトランスフェクトした。細胞株を、１０％のウシ胎仔血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、および５ｕｇ／ｍｌのブラストサイジンを伴うＥＭＥＭ中で維持した。組換えヒトＢＭＰタンパク質は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
６０ｍｌのボトル中の、ウシ流産菌（Brucella abortus）リング検査抗原（株１１１９−３）は、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｍｅｓ、Ｉｏｗａから購入した。ブルセラ症リング検査抗原は、フェノール化緩衝液中の、殺滅され、染色されたウシ流産菌（B. abortus）株１１１９−３細胞の懸濁液を含有する。６０ｍＬずつのボトルの濃度は、１ｍｌ当たりの粒子約１０９個である。５×１０９個の原液を、以下の方式で、洗浄および調製する。まず、６０ｍｌのボトルを、冷蔵庫から取り出し、完全に混合する。次いで、５００ｍｌのＢＡを、５００ｍＬの遠心分離機用ボトルへと移す。次いで、超遠心分離機を使用して、これらを、１０，０００ｒｐｍで１５分間にわたり遠心分離する。上清を取り出し、１００ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させる結果として、１ｍｌ当たりの粒子５×１０９個の原液をもたらし、これを、アリコート分割し、−８０℃で凍結させた。
動物の維持条件
馴致期間中および研究期間中、動物を、Ｍｉｃｒｏ Ｉｓｏｌａｔｏｒ非金網底ケージ内で、集団的に飼育した。動物は、室温を２１〜２３℃とし、湿度を３０〜７０％とする、以下の通りの標準的な明周期：１２時間にわたる暗期、１２時間にわたる明期（明期オン：午前６：３０、明期オフ：午後６：３０）下に保った。馴致期間中および研究期間中、動物には、齧歯動物用飼料および水へ自由に（ａｄ ｌｉｂ）アクセスさせた。
実験条件
ＢＭＰレポーター遺伝子アッセイにおける抗体活性の決定
典型的なアッセイでは、０．６×１０４個のＢＲＥ−Ｌｕｃ２ＨＥＰ３Ｂ細胞を、３８４ウェルプレート内の、２５ｕｌの基礎培養培地中に播種したが、血清は２％まで低減した。翌日、ＰＢＳ中で希釈された抗体を添加するのに続き、ＢＭＰ６を、１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。血清を伴わないＥＭＥＭ培地により、容量を５０ｕｌとし、最終血清濃度を１％とした。カウンターアッセイとして、ＢＭＰ２／４／７による活性化を、並行して行った。ＢｒｉｇｈＧｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、製造元の指示書に従い、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、抗体添加後２４時間にわたり実施した。データは、各抗体について、対照抗体による完全なレポーター活性化と比較した阻害パーセントとして計算した。
ラットにおける単回投与による、抗体の薬物動態研究
ラットＰＫトリアージ研究は、規定された統計学的確実性で、古典的なＰＫパラメータを決定するのではなく、被験抗体について、血清半減期の推定値をもたらすことを意図するものである。３匹の動物に、抗体の単回ＩＶ注射を施した。
マウス用量反応ＰＫ／ＰＤ研究のために、動物を、等しい数の、２つの個別のコホートへと分けた。各コホートは、ビヒクル処置マウスおよび化合物処置マウスの両方を含む。１つのコホートを、抗体注射後２、４日目に解析にかけたのに対し、第２のコホートは、６、８日目に解析した。コホート分離の理由は、血清鉄パラメータに対する影響を最小限に保つように、逐次的採血に対する必要を低減することである。動物群を、表１０に示す。
マウスにおける炎症性貧血の確立および治療的処置
注射のためのＢＡ粒子５×１０８個は、以下の方式（マウス１０匹の例）で調製する。マウス１匹当たり２００μｌを注射するので、出発濃度は、１ｍｌ当たりの粒子２．５×１０９個であることが必要である。ＰＢＳを使用して、原液を２倍に希釈する。例えば、マウス１０匹×０．２００μｌ＝２ｍｌ＋２０％の過剰量＝１ｍｌ当たりの粒子２．５×１０９個による２．２ｍＬは、１．１ｍｌのＢＡ原液＋１．１ｍＬのＰＢＳを必要とした。ＥＳＡ処置の１〜８日前におけるＢＡ投与は、６〜７日間後におけるＨＧＢ応答の鈍化を結果としてもたらすことが示された。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＢＡ（マウス１匹当たりの粒子３×１０８個）を注射し、５時間後に、血清ＩＬ６レベルを、ＥＬＩＳＡ（ＫＭＣ００６１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定して、炎症応答を決定した。ＩＬ６濃度が、全てのＢＡ処理動物についての平均値の９５％信頼区間より小さい動物を、研究から除外した結果として、一部の群では、マウスが５〜６匹より少なくなった。この除外過程を実行して、ＥＳＡ応答を鈍化させるのに十分な炎症を示さなかった動物を組み入れることによりもたらされる偽陽性結果の可能性を低下させた。除外過程後、６日目に、マウスに、表示の抗体をＩＶ注射し、ＥＰＯ（１００ｇ／ｋｇの皮下ダルベポエチンアルファ、Ａｍｇｅｎ）を、ＢＡ処理に対して７日目に、１００ｍｇ／ｋｇで投与した。ＥＳＡおよび抗体療法に対する応答を、６日間後に測定した。
薬物動態、薬力学、および有効性評価項目についての解析
マウスおよびラットによるＰＫ／ＰＤ研究のために、抗体注射後の表示の時点において、血清試料を回収した。ビオチニル化抗ヒトＩｇＧを、一次捕捉抗体とする、自動式ハイスループットイムノアッセイシステム（Ｇｙｒｏｓ）を介して、循環抗体濃度を決定するのに、血清のアリコートを使用した。各試料の第２の血清アリコートは、定量的比色鉄アッセイ（Ｑｕｎｔｉｃｈｒｏｍ、ＤＩＦＥ−２５０、Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のために使用した。第３のアリコートを、既に記載された（Li et al. 2009. J. Pharm. Tox. Meth. 59: 171-80）改変手順に従う、ラットまたはマウスヘプシジン２５ペプチドのＬＣ−ＭＳによる定量化のために処理した。
ＢＡ誘導性貧血／抗体処置研究のために、ＥＤＴＡコーティングＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブによる最終採血は、終了時に、心臓穿刺を介して得た。全血液を、ＸＴ−２０００ｉＶ血液解析基上の全血球算定解析のために使用した。有効性評価項目は、ＨＧＢ、ＨＣＴ、ＲＥＴＡ、およびＲＥＴ−ＨＥを含む。
統計学的解析
一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続き、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定を実行して、血液学パラメータの群間差について解析する（ｐ＜０．０５を有意と考える）。データは、平均値±ＳＥＭとして報告する。
結果
細胞内ＢＭＰ依存的転写アッセイにおける、ＢＭＰ６アンタゴニスト抗体の生物学的活性
３つのＢＭＰ６アンタゴニスト抗体５、抗体６、および抗体７全ては、ヒト肝臓がん細胞株であるＨｅｐ３Ｂ内の組換えヒトＢＭＰ６に誘導されるＢＭＰレポーター（ＢＲＥ−ｌｕｃ）活性の生体活性を完全に阻害し（０．３ｎＭのｒｈＢＭＰ６に対するＩＣ５０＝０．４ｎＭ）、したがって、Ａｇ：ｍＡｂ＝１：１以上のモル比で活性である。抗体は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ７を含む、類縁のＢＭＰファミリータンパク質を、５００倍以上のウィンドウで上回る、良好な選択性を裏付けた。図１を参照されたい。
ラットにおける、ＢＭＰ６アンタゴニスト抗体の、薬物動態プロファイルおよび薬力学プロファイル
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける単回投与トリアージ薬物動態研究を、ＢＭＰ６抗体５、抗体６、および抗体７について、頸静脈カテーテルを介する、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇのＩＶ注射により実施した。３つの抗体の、血清中の総抗体濃度−時間関係（特に、ｔ１／２、ＭＲＴ）を、標準的なプロファイルと比較することにより、典型的なヒトＩｇＧと符合する特徴が示唆される（図２および表１１を参照されたい）。標的により媒介される薬物貯留の証拠は見られない。この用量で、全てのＢＭＰ６抗体は、血清ヘプシジンを、注射後１日目までに、検出レベルを下回るように抑制した。ヘプシジン発現の強い抑制の持続は、１６日目までやはり明らかであったことから、活性の長い持続期間が示唆される。これに対応して、循環鉄濃度の一過性のピーク上昇が、抗体注射後２日目に観察され、レベルは、１６日目まで高レベルを維持した。
血清抗体濃度は、単回の抗体注射後、時間経過にわたり測定した。試料は、投与（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）の１時間、６時間、１、２、４、８、１６、２８日後に回収した。
同様に、抗体７（遊離の抗体７およびＢＭＰ６に結合した抗体７の両方）の総血清濃度も、抗体７（ラットでは、１０、３、１、０．３、０．１、および０．０３ｍｇ／ｋｇの用量；カニクイザルでは、３ｍｇ／ｋｇの用量）の単回のＩＶ注射後、表示の時点のラットおよびカニクイザルにおいて、ラットにおけるＬＬＯＱを４６ｎｇ／ｍＬ（点線）とし、サルにおけるＬＬＯＱを０．２ｕｇ／ｍＬ（点線）とする、ＥＬＩＳＡにより測定した。結果を、図９（ラット）および図１２（サル）に示す。
マウスおよびカニクイザルのＢＭＰ６抗体処置後における、血清鉄パラメータの用量依存的応答
ＢＭＰ６抗体処置に対する鉄代謝の用量依存的応答をさらに規定するために、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに、表示の通り、０．０２〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲で用量を増大させる抗体６を注射した。抗体６は、３つの抗体が、同様のフレームワーク、齧歯動物のＰＫプロファイル、およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける活性を共有するので、それらを代表するものとして選択した。０．５または０．１ｍｇ／ｋｇの単回投与は、血清ヘプシジンを著明に抑制し、したがって、処置の２日後に、血清鉄濃度を増大させた。しかし、わずか０．５ｍｇ／ｋｇでも、注射後最長８日間にわたり、鉄代謝に対する強い持続的効果が観察された。図３を参照されたい。これらの結果は、強力なＢＭＰ６アンタゴニスト抗体を使用して、用量依存的で飽和可能な標的中和を、たやすく達成しうることを示唆する。
図３を参照されたい。ＢＭＰ６抗体の、鉄代謝についての血清バイオマーカーに対する用量依存的効果、上：表示の用量の、抗体６の単回ＩＶ注射後における、時間経過にわたる血清ｈＩｇＧ濃度である。下：左パネルが、単回の抗体６または対照ヒトＩｇＧ注射の後における、血清ヘプシジン濃度についての定量的解析であるのに対し、右パネルは、血清鉄濃度である。
同様の実験を、抗体７で実施した。循環血清ヘプシジンの、抗体７による、用量および時間依存的抑制を、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて調べた。血清試料は、抗体７の単回投与を、０．０３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量のＩＶ注射により投与した、０．２５、１、２、６時間、ならびに１、２、４、７、および１４日後に回収した。血清ヘプシジンレベルは、ＬＬＯＱ＝９ｎｇ／ｍＬとするＬＣ／ＭＳにより測定した。同じ動物において、血清鉄レベルもまた測定した。結果を、図１１に報告する。
これらの結果は、本発明の抗ＢＭＰ６抗体が、血清鉄の用量依存的増大を引き起こすことが可能であることを指し示す。効果は、頑健であり、抗体投与後、少なくとも２週間にわたり持続した。
抗ＢＭＰ６抗体に応答する、血清鉄パラメータに対する効果もまた、カニクイザルにおいて調べた。雄カニクイザルに、用量を３ｍｇ／ｋｇとする、抗体７の単回静脈内注射を施した。注射の表示の日数後において、血清試料を回収し、総血清鉄（Ｆｅ）濃度および総血清ヘプシジン濃度について解析した。結果を、図１３に示す。３匹の個々の動物に由来するデータを提示する（投与前のベースラインレベルに対してプロットする）。平均値を、「×」線により指し示す。血清鉄の増大および血清ヘプシジンの抑制は、抗体投与の２４時間後に観察され、効果（投与前レベルと比べた）は、２８日間にわたる研究の終了時まで維持された。これらの結果は、本発明のＢＭＰ６抗体が、非ヒト霊長動物におけるヘプシジンの発現を強力に低減し、循環鉄濃度を誘導することを指し示す。
マウスの炎症駆動型ＥＳＡ抵抗性貧血における赤血球パラメータに対する、ＢＭＰ６抗体の効果
炎症性貧血のマウスモデルにおける抗ＢＭＰ６抗体の治療有用性を査定する実験を実施した。図４を参照されたい。ウシ流産菌（Brucella abortus）抗原（ＢＡ）で処理されたマウスは、６日後に貧血を発症した。貧血性動物を、１日間隔てて開始した組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）を加えた、抗ＢＭＰ６抗体で処置し、抗体療法の、貧血の進行に対する効果を、ＢＡに対して１３日目にモニタリングした。ＨＧＢ値およびＨＣＴ値は、処置の開始〜１３日目の間で低下し、これは、ＥＰＯ処置単独に対して抵抗性であった。ＢＭＰ６抗体とＥＰＯとによる組合せ処置は、ＥＰＯ応答を有効に元に戻し、ＨＧＢレベルおよびＨＣＴレベルを有意に上昇させた。この効果は、ＲＥＴＡの持続的増大のほか、網状赤血球のヘモグロビン含量の回復によっても反映される、エリスロポエチン活性の共時的刺激と関連したことから、赤血球生成コンパートメント内の機能的な鉄欠損に起因する、ヘム合成の是正が示唆される。
図４を参照されたい。ＥＳＡ抵抗性炎症性貧血マウスモデルにおける、ＢＭＰ６抗体の治療的処置、上：ＢＡ誘導型ＥＳＡ抵抗性炎症性貧血モデルについて実験のスキームである。下：ＢＡ処理の１３日後における、赤血球生成パラメータである。ＨＧＢ：ヘモグロビン；ＨＣＴ：ヘマトクリット；ＲＥＴＡ：網状赤血球カウント；ＲＥＴ−ＨＥ：網状赤血球ヘモグロビン同等物である。ＢＡ＋ＥＰＯ＋ｈＩｇＧ１に対し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。
ヒトにおけるＢＭＰ６抗体について調べるための臨床計画
臨床試験計画：ヒトＢＭＰ６に結合する抗体またはその抗原結合性断片を使用する治療についての評価。
末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を伴う患者は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を、産生するとしても、わずかしか産生せず、ＥＰＯに誘導されるＨｇｂの合成を可能とするのに、外因性ＥＰＯの定期的な投与および鉄の静脈内（ＩＶ）注入を一般に必要とする。慢性血液透析（ＨＤ）患者のうちの、最大で３分の１は、主に、鉄の細胞内隔離のために、ＥＰＯに十分に応答しない。ヘプシジンは、主に腎臓によりクリアランスされるが、透析による除去は不十分である。したがって、慢性ＨＤ患者は、ヘプシジンレベルを著明に上昇させる傾向があり、これは、赤血球生成のための鉄の移動を妨げる。体内の鉄貯蔵が、臨界レベル（高血清フェリチンレベルにより指し示される）に達したら、ＩＶ鉄治療は、もはや有効でもなく、推奨もされない。現行のガイドラインは、ＩＶ鉄を、フェリチンレベルの高い貧血性透析患者に施すことに反対しており、したがって、これらの患者は、なお高度なＥＰＯ用量を施される場合があり、関連する、潜在的な、ＥＰＯ低応答性貧血の危険性を伴う（Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group 2012）。ＥＰＯ低応答性貧血は、血液透析患者（Kilpatrick et al 2008、Lopez-Gomez et al 2008、Fukuma et al 2012）および腹膜透析患者（Suttorp et al 2013）における、貧血および高ＥＰＯ用量の両方と関連する全死亡原因の危険性の著明な増大を付与する。本開示の、ヒトＢＭＰ６に結合する単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ＥＰＯおよびＩＶ鉄の投与の必要を同時に低減しながら、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）レベルを改善することにより、鉄欠乏性貧血を伴う慢性腎疾患患者に利益をもたらしうる。ＥＰＯ抵抗性指数（ＥＰＯ用量の、Ｈｇｂレベルに対する比）の低下は、死亡危険性の低下と相関する。
まとめると、本開示の、ヒトＢＭＰ６に結合する単離抗体またはそれらの抗原結合性断片を使用する治療の目標は、隔離された鉄を移動させ、次いで、これにより、ＥＰＯ投与および鉄投与の必要を低減し、Ｈｇｂレベルを改善することであり、これらの全ては、患者の転帰を改善することが予測される。これは、ヒトＢＭＰ６に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を使用する治療についての、ファースト・イン・ヒューマン（ＦＩＨ）の単回投与研究である。本研究は、慢性血液透析患者集団における、安全性、忍容性、薬物動態、薬力学、および有効性について評価する。本研究の目的は、ヒトＢＭＰ６に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を使用する治療が、慢性腎疾患と関連する貧血における、さらなる臨床開発を正当化するのかどうかを査定することである。
治験計画
研究デザイン
これは、慢性血液透析患者集団における、安全性、忍容性、ＰＫ、ＰＤ、および有効性について評価するための、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片についてのＦＩＨ（ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ）、２パート、単回投与の、非確認研究である。パート１は、ＦＩＨ（ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ）、単回投与、オープンラベルの、用量設定研究である。パート２は、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片の２つの用量レベルについて比較する、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、単回投与研究である。
安全性評価は、身体検査、ＥＣＧ、バイタルサイン、標準的な臨床的検査室査定（血液学指数、血液化学指数、血清鉄指数）、有害事象および重篤な有害事象のモニタリングを含むであろう。
パート１
パート１の目途は、（ａ）単回投与の安全性、ＰＫ、ＰＤ、および忍容性を査定すること、ならびに（ｂ）パート１において調べられ、投与の２９日後における、Ｈｇｂの増大（ベースライン≒０．５ｇ／ｄＬからの変化の中央値）を結果としてもたらす最低用量として規定される、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片の最小ＰＡＤ（薬理学的活性量）を決定することである。
パート１の期間中に、スクリーニング来院を行い、ここで、研究に参入する患者の適格性を決定する（図６）。適格な患者は、研究施設に受け入れ、ベースライン来院時に、適格性基準について再査定する。ベースラインにおける、全ての安全性査定の結果は、投与前に入手可能でなければならず、再検討されなければならない。
図６は、パート１のための研究デザインについての概観を提示する。患者は、ルーチンの透析来院の直後の１日目に、研究施設を訪れるように求められる。次いで、患者は、ヒトＢＭＰ６に結合する抗体またはその抗原結合性断片（正確な用量は、コホートに依存する）の注入を受ける。可能な場合、投与は、２透析間日（例えば、金曜日または土曜日）の前の透析日に行うことが好ましいものとし、その日の透析セッションの後で行う。しかし、可能でない場合、投与は、２透析間日に先行しない透析日に行うことができる。投与後、パート１における最初の２例の患者は、安全性評価およびＰＫ／ＰＤ評価のために、少なくとも４８時間にわたり在院する。患者は、４および６日目に、ＰＫ／ＰＤ評価のために研究施設に帰院し、次いで、合計２９日間にわたるＰＫ評価、および合計１２週間にわたる安全性評価のためにも、毎週研究施設に帰院し、およそ８５日目に研究終了時の来院を行う。透析後ＰＫ評価以外の全ての検査室検査を含む研究来院は、患者の規定の透析来院の前に行うものとする。
パート１は、薬理学的に活性でないと予測される用量で開始する。用量は、パート１の、各後続のコホートについて、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片の単回投与後における、各コホートの、Ｈｇｂの変化の中央値、および「統計学的考察」の節で論じられ、図７で示される、トランスフェリン飽和度（ＴＳＡＴ）レベルに基づき調整する。この決定木の目途は、鉄移動（投与の１週間後に、患者６例のコホート内の、少なくとも４例の患者において観察される、５０％超のトランスフェリン飽和度（ＴＳＡＴ）レベルにより指し示される）を誘導し、Ｈｇｂを増大させる最小投与可能用量を同定することである。鉄は移動するが、Ｈｇｂが、投与の２９日後に、少なくとも０．５ｇ／ｄＬ増大しない場合は、臨床データを解析して、潜在的な交絡因子（例えば、研究以外の過剰な瀉血に起因する失血）について評価する。該当する治験責任医師および治験依頼者の代表者は、各コホートの有害事象について再検討し、（ａ）慢性腎不全と関連する、公知の医学的問題、および（ｂ）非臨床毒性所見の文脈で、これらの事象について評価する。後続のコホートは、治験責任医師および治験依頼者が、先に進めることが安全であると指し示すまで投与しない。
図７は、パート１における、用量の調整のためのアルゴリズムを提示する。Ｈｇｂ測定を含む血液検査は、透析前に行う。開始用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇとする。パート１では、患者を、患者最大で６例ずつの、最大で６つのオープンラベルの投与コホートのうちの１つへと割り付ける。上記で規定された、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片の最小ＰＡＤを、パート２のために選択される低用量アームとする。各後続のコホートの用量は、図７に示す通り、高用量に調整することもでき、低用量に調整することもできる。最低投与可能用量（０．００１ｍｇ／ｋｇ）が、Ｈｇｂの増大の中央値≧０．５ｇ／ｄＬを結果としてもたらす場合、これを、最小ＰＡＤ、およびパート２のために選択される低用量とし、パート１で査定された２番目の高用量を、パート２のための高用量アームとする。パート１で査定された最高用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）が、最小ＰＡＤである場合、パート２は、２つのアーム：プラセボおよび最小ＰＡＤだけで進める。パート１で、さらなる投与コホートが必要とされる場合、これらのコホートを、本明細書で記載される通りに追加する。
パート１の各コホートは、６例の患者を含むであろう。パート１の第１のコホート内の、最初の２例の患者には、少なくとも７日間隔てて投与する。パート１の後続のコホートの患者への投与タイミングは、それぞれの施設のスケジュールおよびサポートリソースに応じて実施可能なタイミングとする。全てのパート１の患者は、投与後１２週間にわたり追跡される。
パート２
パート２の目途は、（ａ）安全性、ＰＫ、ＰＤ、および忍容性を査定すること、ならびに（ｂ）プラセボと対比した、ヒトＢＭＰ６に結合する抗体の単回投与に応答する、Ｈｇｂの変化に基づき、有効性を決定することである。パート２は、最大で３つのアーム：最大で２つのＡｂ投与アームおよびプラセボアーム（図８）を含むであろう。２つのＡｂ投与アームは、パート１で生成されたデータに由来する。パート２は、３つのアームへと、１：１：１で無作為化された約６０例の患者を含むであろう。パート１で、最小ＰＡＤがまた、査定された最高用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）でもある場合、パート２は、２つのアーム：最小ＰＡＤおよびプラセボだけを有する。この場合は、４０例の患者を、１：１の無作為化比で、２つのアームへと無作為化する。パート２の標本サイズは、パート１における、Ｈｇｂの、ベースラインからの変化のばらつきに基づき、調整することができる。
図８は、パート２のための研究デザインを提示する。パート２の期間中に、スクリーニング来院を行い、ここで、研究に参入する患者の適格性を決定する。適格な患者は、ベースライン来院時に、適格性基準に従い再査定される。ベースラインにおける、全ての安全性査定の結果は、投与前に入手可能でなければならず、再検討されなければならない。
患者は、ルーチンの透析来院の直後の１日目に、研究施設を訪れるように求められる。次いで、患者は、無作為化された割り付けにより決定される通り、Ａｂまたはプラセボの注入を施される。可能な場合、投与は、２透析間日（例えば、金曜日または土曜日）の前の透析日に行うことが好ましいものとし、その日の透析セッションの後で行う。しかし、可能でない場合、投与は、２透析間日に先行しない透析日に行うことができる。患者は、４および６日目に研究施設に帰院し、次いで、フォローアップ評価のために毎週帰院する。フォローアップ来院時に、患者は、ルーチンの安全性評価を受け、また、ＰＫデータも、８５日間にわたり収集する。研究来院は、患者の透析スケジュールに適合させるために、患者の規定の透析来院の後で行うことができる。パート２に登録された全ての患者は、Ａｂ（またはプラセボ）の投与後１２週間にわたり追跡される。
ＥＰＯ用量の管理（両方のパート）
両方のパート期間中の、個別のＥＰＯ用量の調整は、各透析施設の標準治療プロトコールに従い管理する。施設プロトコールを、施設評価の一部として再検討し、標準治療ガイドライン（KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012）の遵守について確認する。研究期間中の任意の時点において、１３ｇ／ｄＬ以上のＨｇｂレベルを達成する患者は、目標レベルを上回るようにＨｇｂ値を管理するための施設独自のガイドラインに加えて、治験責任医師の指示による治療的瀉血により管理することができる。
静脈内鉄の管理（両方のパート）
負荷用量のＩＶ鉄（毎週１００ｍｇ）を施される患者は、研究から除外する。毎週の維持ＩＶ鉄（毎週＜１００ｍｇ）を施される患者は、本研究に組入れることができる。毎週の維持ＩＶ鉄用量は、Ａｂ投与の１週目の開始時にも保持する。鉄指数は、Ａｂ投与後１週目にモニタリングし、レスキュー鉄治療および維持ＩＶ鉄管理は、管理的血液透析ユニットのプロトコールに従う、標準治療ガイドラインに従う。施設プロトコールを、施設評価の一部として再検討し、標準治療ガイドライン（KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012）の遵守について確認する。
研究デザインについての根拠
２パート研究デザインについての根拠
同じ患者集団内の２つのパートの根拠は、潜在的に治療未満用量へと曝露される患者およびコホートの数を最小化することを目途として、安全かつ効率的に、最小ＰＡＤを同定することである。パート２は、最小ＰＡＤ、および最小ＰＡＤ（パート１で決定された）を上回る１つの用量レベルの、プラセボ群と比較した有効性について評価する。
パート１は、単回投与の安全性、忍容性、ＰＫ／ＰＤのほか、オープンラベル研究におけるＡｂの最小ＰＡＤを査定するようにデザインする。最小ＰＡＤは、Ａｂ投与の２９日後における、各投与コホートのＨｇｂの変化の中央値に基づき決定する。ＰＡＤ決定基準の根拠は、ＥＰＯに対する臨床的に有意味な応答が、ＥＰＯ用量の変化後、最長で４週間を要求しうることである。Ａｂが、標的集団内の鉄を移動させるならば、これは、患者の現行のＥＰＯ用量が、より頑健な赤血球生成効果を及ぼすことを可能としうる。ＰＡＤ決定基準に列挙された、２９日間にわたるＨｇｂの範囲は、ＥＰＯ用量（２９日間にわたり、約０．５ｇ／ｄＬ）に応答した、Ｈｇｂの、臨床的に有意かつ安全な増大速度に基づく。最大効果ではなく、最小ＰＡＤを探索することの根拠は、過剰に頑健Ｈｇｂ応答が、現行の標準治療ガイドライン（Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group 2012）における目標Ｈｇｂ範囲により反映される通り、この患者集団における安全性に対する危険性であることである。パート１における安全性評価および忍容性評価の目標は、（ａ）安全性シグナルを同定すること、および（ｂ）用量調整の決定を通知し、パート２（最小ＰＡＤ＋１レベル高い用量）のために選択された用量が、プラセボと比べた安全性および有効性の両方のさらなる査定に適することを確認することである。パート１が、安全性についての、バイアスのかからない評価をもたらすのに、検出力が十分でないのに対し、パート２における、プラセボ群および大きな標本サイズは、最小ＰＡＤおよび１レベル高い用量における、バイアスのかからない安全性評価を可能とするであろう。安全性、忍容性、およびＰＫ／ＰＤに加えて、パート２は、二重盲検研究における、プラセボと対比した有効性について評価するようにもデザインする。有効性評価は、主に、Ｈｇｂに基づき、ＥＰＯ抵抗性指数（ＥＲＩ＝毎週の体重により調整されたＥＰＯ用量をＨｇｂで除した数）を、鍵となる副次的評価項目として伴う。ＥＲＩは、所与のＨｇｂ値を達成するのに必要とされるＥＰＯの量についての定量的尺度をもたらし、したがって、Ｈｇｂ単独に加えて、臨床的に重要な情報をもたらす。
透析患者におけるＦＩＨについての根拠
このＦＩＨ（ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ）（ＦＩＨ）研究は、健常ボランティア（ＨＶ）ではなく、慢性血液透析（ＨＤ）患者において行う。ＨＶにおける、抗ヒトＢＭＰ６ Ａｂに対する安全性、忍容性、およびＰＫ／ＰＤ応答についての査定は、いくつかの理由で、慢性ＨＤ患者へと敷衍することができない：
ＨＶと異なり、貧血、高血清フェリチン、および低ＴＳＡＴを伴う慢性ＨＤ患者は、慢性的に蓄積された細胞内鉄貯蔵を有する。したがって、慢性ＨＤ患者では、安全性、忍容性、および低用量のＡｂに応答した、鉄移動と関連する薬理学的効果が、最も適切に査定される。正常な腎機能を伴うＨＶでは、ヘプシジン（ＢＭＰ６は、この鍵となる調節因子である）は、腎臓により濾過され、尿中に効率的に排出され、低循環レベルをもたらす。これに対し、透析では、ヘプシジンの濾過は、それほど効率的ではなく、一過性であることから、慢性ＨＤ患者では、高循環レベルがもたらされる（Zaritsky et al 2010）。さらに、正常な腎臓は、内因性ＥＰＯレベルを動的に調整し、Ａｂに応答したＨｇｂの変化は、明らかとならない可能性がある。したがって、ＢＭＰ６経路によるヘプシジンのモジュレーション、ならびにＡｂの、Ｈｇｂに対する効果と関連する、安全性および忍容性は、慢性ＨＤ患者において、最も適切に査定される。
標的患者集団についての根拠
本研究は、ＥＰＯ低応答性、鉄欠乏性貧血の状況下において、抗ヒトＢＭＰ６ Ａｂを査定するようにデザインする。確立された臨床ガイドライン（KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012）は、ＥＰＯ低応答性を、ＥＰＯ用量の２つの増大、安定用量を最大５０％上回る増大と、安定Ｈｇｂ濃度を維持する増大とに対する必要として規定している。提起される適格性基準は、貧血を伴う、安定的な慢性ＨＤ患者、ならびに鉄欠乏の臨床的指標：フェリチンの増大および低ＴＳＡＴ（ＴＳＡＴ＝血清鉄結合能／総鉄結合能；ＴＳＡＴは、血清鉄と、極めて緊密に相関する）について選択するようにデザインする。さらに、ＥＰＯおよびＩＶ鉄用量の調整は、Ｈｇｂ、ＴＳＡＴ、およびフェリチンについての、厳格な標準治療目標に準拠する。鉄および血液学パラメータの変化は、標準治療に従い管理されるため、このデザインは、所望のＨｇｂ目標を超過する危険性を低減する。さらに、ベースラインの１週間前以内に、負荷用量のＩＶ鉄を施される患者は、除外される。維持ＩＶ鉄を施されている患者は、組入れることができる（他の全ての適格性基準が満たされる場合）。これらの患者を組み入れる根拠は、米国における現行の標準治療が、ＨｇｂおよびＴＳＡＴを、狭い限界内に維持することを指示しており、したがって、低ＴＳＡＴ適格性基準を満たすことを目的とする、維持鉄療法の完全な中止は、ＴＳＡＴが２５％を下回る場合、患者を危険性に曝すことから、標準治療に従う、ＩＶ鉄負荷用量のコースが必然化されることである。しかし、維持ＩＶ鉄について適格な患者は、それらの毎週ＩＶ鉄用量を、Ａｂを投与する週の開始時に保持し、モニタリングされる鉄指数に基づき、施設の標準治療プロトコールにより決定される維持ＩＶ鉄療法だけを再開する。
処置の用量／レジメン、持続期間についての根拠
開始用量についての根拠
最大推奨開始用量（ＭＲＳＤ）は、ラットおよびカニクイザルにおいて行われた、１３週間（１４回の投与）にわたるＧＬＰ毒性研究に由来する無有害作用レベル（ＮＯＡＥＬ）に基づき計算した。動物は、０．１、１、１０、および１００ｍｇ／ｋｇの、毎週のＩＶボーラス投与を施された。ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片の最終回投与の後、１および１００ｍｇ／ｋｇの投与群（だけ）を、その後、ラットにおいて１６週間にわたり、またはカニクイザルにおいて２４週間にわたり追跡した。これらの研究に由来するＮＯＡＥＬ（０．１ｍｇ／ｋｇ）のヒト同等用量（ＨＥＤ）をまず計算し（分子量＞１００ｋＤａである薬物に適切であるとみなされる手法）、その後、貯蔵された鉄の量および赤血球生成に対する要求量など、非臨床種と患者との差違を説明する安全性係数１０をかけたることによりＭＲＳＤを推定した。非臨床種についてのＰＫパラメータは、ＩＮＤ申請のための毒性研究において収集された毒性反応速度（ＴＫ）データから推定した。次いで、患者における対応するＰＫパラメータを、アロメトリックスケーリングを使用して推定し、これらのパラメータを使用して、ヒトＢＭＰ６に結合する遊離の単離抗体またはその抗原結合性断片の濃度を、所与の用量について、患者における時間の関数として予測した。毒性研究に由来するＴＫデータを、患者における、モデルベースのＡｂ ＰＫと比較することにより、ＮＯＡＥＬ／ＨＥＤの１０分の１の用量は、Ａｂ濃度に基づく（最低で）１０倍のマージンをもたらすと予測されることが指し示された。
ＩＶ鉄療法を投与されたＨＤ患者は、健常動物より高度な、鉄の組織貯蔵を有するため、動物研究において、Ａｂに応答して観察された血清鉄の最高レベルは、Ａｂに対する予測ヒト鉄応答を過少推定しうる。しかし、健常の非貧血性動物と異なり、ＨＤ患者は、放出血清鉄を、赤血球生成のために活用すると予測され、したがって、動物モデルは、鉄上昇の持続期間を過大推定しうる。１３週間研究で観察される肝臓病態が、４週間研究で観察されなかったことから、毒性は、鉄の急性放出に対する応答ではなく、血清鉄への累積的曝露によることが示唆される。
非臨床種と患者との、貯蔵鉄の、予期される差違を説明するために、ＭＲＳＤはまた、血清鉄濃度についての、モデルベースの解析に基づいても予測した。毒性所見を結果としてもたらす、血清鉄への累積的曝露を、鉄曲線下面積（Ｆｅ ＡＵＣ）として表した。この手法では、ＮＯＡＥＬ用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）について計算されるＦｅ ＡＵＣは、十分に安全であると考えられた。次いで、患者において提起されるＭＲＳＤのときのＦｅ ＡＵＣを予測し、ＮＯＡＥＬのときの非臨床種におけるＦｅ ＡＵＣと比較した。患者において、ＭＲＳＤのときに、モデルにより予測される血清鉄曝露は、非臨床種における、ＮＯＡＥＬのときの血清鉄曝露の１０分の１未満であるため、ＮＯＡＥＬ／ＨＥＤを、安全性係数である１０減少させることは、ＭＲＳＤの推定に十分であるとみなされた。したがって、提起されるＭＲＳＤは、０．０１ｍｇ／ｋｇである。
用量調整についての根拠
本研究では、最大被験用量（ｘｍａｘ）を、２つのＩＮＤ申請のための毒性研究の各々におけるＮＯＡＥＬ：０．１ｍｇ／ｋｇに対応するＨＥＤとする。最小投与可能被験用量（ｘｍｉｎ）は、適合性研究に基づく、技術的に投与可能な最低用量：０．００１ｍｇ／ｋｇである。ＭＲＳＤ（ｘ０）は、安全性基準、ＴＳＡＴ基準、およびＨｇｂ基準に従い査定する（図７）。ｘ０が、投与前と比べて、Ｈｇｂの変化の中央値＜０．５ｇ／ｄＬを結果としてもたらす場合、ｘ０とｘｍａｘとの間の、自然対数スケール上の直線的な外挿（Ｓ字型の用量反応関係を予期する）により、ｘ＋の選択（図７）が導かれるであろう。この用量漸増のための暫定的な用量は、上記に提示されている。これらの暫定的な用量は、各コホートの間の非公式の中間解析におけるデータの再検討に基づき調整することができる。この手法は、最小ＰＡＤを同定するか、またはｘｍａｘに達するまで継続する。ｘｍａｘが、Ｈｇｂの変化の中央値＜０．５ｇ／ｄＬを結果としてもたらす場合、この用量の安全性について査定し、プロトコールを修正して、安全性データ、ＰＫデータ、およびＰＤデータに基づき、ｘｍａｘを超える用量の、さらなるコホートを追加するのかどうかの決定を下す。パート１における被験最高用量が、Ｈｇｂの増大の中央値＜０．５ｇ／ｄＬを結果としてもたらし、５０％を上回ってＴＳＡＴを増大させず、この用量が、ｘｍａｘを下回る場合、プロトコールを修正して、さらなるコホートを追加することができる。
そうではなくて、ｘ０が、投与前と比べて、Ｈｇｂの変化の中央値≧０．５ｇ／ｄＬを結果としてもたらす場合、次のコホートのための用量を、ｘｍｉｎとなるように調整する。ｘｍｉｎもまた、Ｈｇｂの変化の中央値≧０．５ｇ／ｄＬを結果としてもたらす場合、ｘｍｉｎを、最小ＰＡＤとみなし、パート２では、ｘｍｉｎおよびｘ０について査定する。ｘｍｉｎが、Ｈｇｂの変化の中央値＜０．５ｇ／ｄＬＴＳＡＴ≦５０％を結果としてもたらす場合（図７）、用量を、最小ＰＡＤを同定するまで、または６つの用量（コホート）について査定するまで、自然対数スケール上の区間（ｘｍｉｎ、ｘ０）内の直線的外挿により増大させる。区間（ｘｍｉｎ、ｘ０）内の暫定的な用量は、上記に提示されている。これらの暫定的な用量は、各コホートの間の非公式の中間解析におけるデータの再検討に基づき調整することができる。最小ＰＡＤは、投与前と比べて、Ｈｇｂの変化の中央値≧０．５ｇ／ｄＬを結果としてもたらす、被験最低用量として規定する。
Ａｂは、非臨床毒性研究における有害所見と関連する血清鉄曝露未満の血清鉄曝露（Ｆｅ ＡＵＣ）を確保するように、ＩＶ注入による単回投与として投与する。Ａｂ溶液は、透析の、ＰＫまたは投与直後の鉄バイオアベイラビリティーに対する潜在的な影響を最小化するように、１日目の血液透析セッションの直後に注入する。透析後における、さらに約３０分間にわたる投与注入（投与日に限る）は、患者に対して、いかなる著明な危険性も、不快感ももたらさないことが予測される。
対照薬の選択のための根拠
パート２では、プラセボを、対照薬として利用して、臨床転帰についてのバイアスのかからない査定を可能とする。
中間解析／デザイン適応の目的およびタイミング
パート１では、６例ずつの患者による各コホートが、投与後４週目の評価を終えた後で、非公式の中間解析を行って、次のコホートのための用量調整の決定を下す。該当する治験責任医師および治験依頼者の代表者を含む、用量調整チームの全てのメンバーが、安全性マーカーおよびＰＤマーカーを再検討する。新たなコホートは、図７に記載される通り、安全性および忍容性が確認され、ＰＤ条件が満たされた場合に限り始動する。パート１では、最大で５回にわたる非公式の中間解析を行う。公式の中間解析は、パート１の最終コホートの全ての患者が、被験用量の臨床効果を査定する、投与後４週目の評価を終えた後で計画し、さらなる非臨床研究の潜在的な契機となり、体温、血圧、脈拍、ＥＣＧ査定、血液化学、血液鉄指数、ＥＰＯ抵抗性指数を、後続の臨床的研究に通知することが可能であり、パート１で行われた最終コホートの２９日目までを通して収集された有害事象を含める。
最小ＰＡＤおよび最小ＰＡＤより１レベル高い用量を、パート２のために選択する。最低可能被験用量が、Ｈｇｂの増大≧０．５ｇ／ｄＬを誘導する場合、２つの最低被験用量を、パート２のために選択する。
危険性および有益性
本研究に参加する患者の潜在的な有益性は、処置時およびその後のある程度の期間にわたる、ＥＰＯおよびＩＶ鉄の必要の低減、ならびにＨｇｂレベルの改善を含みうる。
本試験における患者に対する危険性は、適格性基準への準拠、およびＡｂ投与後最初の４８時間にわたる、全ての患者の緊密な臨床的モニタリング（およびパート１における最初の２例の患者の在院）により最小化する。
鉄移動と関連する潜在的な危険性は、（ａ）組織、ならびに脾臓、肝臓、心臓、膵臓、および脳下垂体などの臓器への鉄の再分布と、（ｂ）特に、血管内カテーテルを常駐させている患者における、細菌への易感染性のわずかな増大とを含む。適格性基準のうちのいくつかは、合併症の危険性を低減する。肝機能検査のレベルの上昇は、鉄再分布との関連で見ることができる。肝機能は、血液学的パラメータおよび鉄パラメータと並行してモニタリングする。標準治療のＨｇｂ目標の超過は、多血症を結果としてもたらしうる。Ｈｇｂの管理、ＥＰＯ療法、および鉄療法を企図することができる。
ＩＶ鉄療法を投与されたＨＤ患者は、健常動物より組織鉄貯蔵が高度である可能性があり、したがって、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片で処置された患者において観察される血清鉄の最高レベルは、動物研究において見られる血清鉄の最高レベルを超えうる。しかし、健常動物と異なり、ＨＤ患者は、放出血清鉄を、赤血球生成のために活用すると予測され、したがって、動物モデルは、鉄上昇の持続期間を過大推定しうる。モデルにより予測される、ＭＲＳＤのときの、Ａｂに対する曝露量（例えば、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ）は、非臨床研究において、ＮＯＡＥＬのときに観察される曝露の１０分の１であることが予期される。この曝露は、前臨床研究で観察された、肝臓トランスアミナーゼの上昇および肝臓内の単一細胞の壊死と関連する血清鉄曝露（ＡＵＣ）レベルを結果としてもたらさないことが予測される。Ａｂ用量の、ＮＯＡＥＬへの漸増は、記載された安全性査定に従い行う。慢性の鉄過負荷を伴う患者のほか、非経口鉄を施される患者についての臨床経過は、Ａｂにより誘導される細胞内鉄の急性増大から生じうる効果を、必ずしも予測しない可能性が高い。したがって、Ａｂに誘導される急性鉄毒性の潜在的な危険性は、おそらく低い。急性鉄毒性は、心臓、肝臓、および／または膵臓に影響を及ぼしうる。急性鉄毒性の臨床症状は、心伝導障害、肝臓トランスアミナーゼの上昇、および耐糖能異常／高血糖症を含みうる。重度の急性鉄毒性はまた、代謝性アシドーシス、電解質異常、および神経症状も含みうる。急性鉄毒性が生じる場合、患者は、血液透析と組み合わせた、デフェロキサミンなどの鉄キレート化療法で応急処置することができる。研究の一部として、最大で１３４ｍＬ（パート１）および１７２ｍＬ（パート２）の血液を、各患者から、１１５日間にわたり回収するように計画する。任意の安全性所見のモニタリングのためには、さらなる試料をこれに加える。これは、この集団に対する危険性とは考えられない。
現在のところ、抗ヒトＢＭＰ６抗体に関する生殖系毒性研究は、実施されていない。カニクイザルにおける１３週間毒性研究では、卵巣および精巣ならびに付随の生殖系臓器についての、注意深い標準的組織病理学検査により、雄または雌の生殖系臓器に対する潜在的作用が評価されている。処置関連作用は、観察されなかった。ＢＭＰ６ノックアウトマウスは、胸骨骨化の遅延および鉄過負荷を示した（Meynard et al 2009）。
著明な胎児および母体の罹患率および死亡率が、慢性血液透析と関連している。慢性血液透析を受ける女性（出生数２６７）を、腎移植を施された女性（出生数２６４）、血液透析を受ける女性と比較する、レトロスペクティブの一コホート研究では、胎盤早期剥離率、輸血率、胎内発育不全児率、胎児死率、および母体死率の上昇が裏付けられた（Saliem et al 2015）。したがって、出産の潜在的可能性を有する女性は、ヒトＢＭＰ６に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片の投与時において、かつ、最終回投与後１２５日間にわたり、妊娠を防止するのに高度に有効な避妊法を使用すべきである。
集団
研究集団は、少なくとも毎週２回の慢性血液透析治療を要求し、機能的鉄欠損性貧血の臨床的証拠を有し、フェリチンレベルおよびトランスフェリン飽和度レベルにより決定される通り、見かけ上十分な鉄貯蔵量の存在下で、貧血と規定される、末期腎疾患を伴う患者から構成されるであろう。パート１は、当初、６つのコホート内に、最大で３６例の患者（コホート１つ当たりの患者６例）について査定する計画を含む。６つのコホートの後で、ＴＳＡＴおよびＨｇｂに対する効果が見られず、安全性懸念（該当する治験責任医師および治験依頼者の代表者により決定される）も見られない場合、さらなる患者６例ずつのコホート最大で２つを追加することができる（パート１におけるのべ患者４８例）。パート２は、最大で３つのアーム（さらなる査定のために、パート１から選択された２つの用量レベル、およびプラセボ群）からなり、アーム１つ当たりの患者最大で約２０例を伴った（パート２におけるのべ患者６０例）。したがって、合計約９６例の患者（最大で１０８例）の登録を計画し、このうちの約６０例を、パート２において無作為化する。約６０例の患者（パート１における１２例、パート２における４８例）が、研究を完了すると予測される。治験責任医師は、研究について検討下にある全ての患者が、以下の適格性基準を満たすことを確認しなければならない。研究集団が、全ての適格な患者を代表するために、治験責任医師は、さらなる基準を適用しないものとする。
患者の選択は、スクリーニング時および最初のベースラインにおいて、全ての適格性基準を通して確認することにより確立するものとする。適格性基準についての関連する記録（例えば、チェックリスト）は、情報源の文書化により、研究施設で保存しなければならない。いかなる参入基準からの逸脱も、患者を、研究への登録から除外する。
組入れ基準（両方のパート）
本研究への組入れに適格な患者は、以下の基準：
１．説明同意文書は、任意の評価を実施する前に得なければならないこと。同意を書き表すことができない場合、理想的には、独立の信任を受けた立会人による、公的な文書化および立合いを受けなければならない。
２．スクリーニング時の年齢≧１８歳であること。
３．スクリーニングの前少なくとも２カ月間にわたり、血液透析依存的であること。
４．末期腎疾患では、毎週少なくとも２回にわたり、十分な血液透析を受けること。十分とは、スクリーニング前の、最近の毎月の評価における、Ｋｔ／Ｖ≧１．２として規定される。
５．透析施設の貧血管理プロトコールに従い、慢性エリスロポエチン（ＥＰＯ）療法を受けること。ＥＰＯ用量は、ベースライン前の１４日間において、５０％以上増大させない。ＥＰＯ療法は、短期作用性製剤（ダルベポエチンは不可）に限らなくてはならず、ＩＶ（ＳＣは不可）投与しなくてはならない。
６．Ｈｇｂ≧８．５、かつ、＜１１．５ｇ／ｄＬを含むＨｇｂ≧８．５であり、ベースラインにおける、先行する１４日間と対比した増大が、≧０．５ｇ／ｄＬではないこと。
７．ベースライン（スクリーニングを含みうる）前少なくとも２８日間にわたるフェリチンが、２００〜２０００ｎｇ／ｍＬ（端点を含む）であること。
８．ベースライン前の９０日間の１つの時点における最小のときのＴＳＡＴ≦３０％、およびベースラインにおけるＴＳＡＴ≦３０％であること。
の全てを満たさなければならない。
除外基準（両方のパート）
以下の基準のうちのいずれかを満たす患者は、本研究への組入れに適格でない。研究集団が、全ての適格な患者を代表することを確保するために、治験責任医師は、さらなる除外を適用することができない。
１．登録から５半減期以内の他の被験薬の使用、または予測される薬力学効果が、ベースラインへと戻るまでの、いずれか長い方の期間内にある。
２．治験薬または治療用抗体に対する過敏性の既往歴がある。
３．ヘモクロマトーシスの診断が既知である。
４．骨髄悪性腫瘍、リンパ悪性腫瘍、または骨髄異形成症候群が既知である。
５．スクリーニングの前２カ月以内における、透析、ＡＶ瘻、血栓症の既往歴、またはスクリーニングの前６カ月以内における、ＡＶ瘻、血栓症の、２回以上の挿間がみられる。
６．重度の併発肝疾患／肝機能不全（チャイルド−ピュースコア≧６）を伴う、または肝移植前である。
７．心不全（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｌａｓｓ ＩＩＩまたはＩＶ）を伴う。
８．スクリーニングの過去２カ月以内において、介入を要求する消化管出血がみられる。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した患者は、他の全ての肝機能適格性基準が満たされる場合は、組入れうる。
９．ベースラインの前４週間以内における、ＡＬＴ、ＡＳＴ、またはビリルビン≧１．５×ＵＬＮである。
１０．スクリーニング時におけるインタクトＰＴＨ≧７５０ｐｇ／ｍＬとして規定される、コントロール不良の腎性骨ジストロフィーを伴う。
１１．スクリーニングの前２週間の任意の時点における、血管内カテーテル（中心静脈ラインまたは血液透析カテーテル）の常駐または抗生剤治療を要求する、活動性の感染など、重篤な感染症の危険性の増大の素因となる条件がみられる。
１２．ベースラインの前４週間以内において、輸血が実施されている。
１３．ベースラインの前１週間以内において、負荷用量（１週間当たり１００ｍｇ）のＩＶ鉄を受けている。
１４．投与前の１２カ月間以内における、薬物乱用もしくはアルコール乱用の既往歴が見られる、またはスクリーニング時に行われる検査室アッセイにより指し示される通り、このような乱用の証拠が見られる。
１５．Ｂ型肝炎表面抗原検査の結果が陽性である。
１６．ＨＩＶ検査（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）の結果が陽性であることを含む、免疫不全症の既往歴がある。
１７．高度に有効な避妊を、ヒトＢＭＰ６に結合する抗体または抗原結合性断片の投与後、最短で１２５日間にわたり使用する場合、出産の潜在的可能性を有する女性を、本研究に登録することができる。高度に有効な避妊とは、以下：ａ．全面的な禁欲（これが、患者の好ましく、通例の生活形態と符合する場合。定期的禁欲（例えば、カレンダー法、排卵法、排卵徴候体温法、排卵後法）および膣外射精は、許容可能な避妊法ではない）；ｂ．男性／女性の避妊手術；ｃ．経口式、注射式、もしくは植込み式のホルモン避妊法の使用、または子宮内デバイス（ＩＵＤ）もしくは子宮内システム（ＩＵＳ）もしくは同等な有効性（失敗率＜１％）を有する、ホルモン避妊の他の形態、例えば、ホルモン膣リングもしくは経皮ホルモン避妊のうちの１つと規定される。
処置
被験処置
本研究における被験治療は、ヒトＢＭＰ６に結合する抗体または抗原結合性断片、例えば、抗ＢＭＰ６ ＩｇＧ１、インタクトヒト抗体である。抗体は、溶液で提供する。原液の濃度は、投与される用量に従い、施設内で希釈する。注入時間は、約３０分間と、コホートにわたり比較的一定に維持する。パート１は、オープンラベルの単回投与であり、パート２は、二重盲検、単回投与で、マッチさせたプラセボ（ビヒクル対照）と比較する。抗ヒトＢＭＰ６ Ａｂの活性物質およびプラセボは、バイアル内の液体として供給する。活性物質中の賦形剤とプラセボ中の賦形剤とは、同一である。
処置アーム
パート１では、患者を、６例ずつの患者からなる、最大６つの投与コホートのうちの１つへと割り付ける。パート１は、オープンラベルの処置である。開始用量、最高用量、および用量調整についての根拠は、上記に記載した。パート１のための暫定用量を、表１２（ＭＲＳＤのときのＨｇｂ＜０．５ｇ／ｄＬ）および表１３（ＭＲＳＤのときのＨｇｂ≧０．５ｇ／ｄＬ）に示す。
この表は、パート１の用量調整の、指針だけのための例として意図されている。中間用量レベルも、高用量レベルも使用することができ、一部の用量レベルは、各コホート間の非公式の中間解析時のデータ査定に基づき、省略することができる。実際の用量レベルは、Ｎｏｖａｒｔｉｓにより、書面で確認され、新たなコホートにおける患者の処置の前に、全ての参加研究施設へと提示される。
この表は、パート１の用量調整の、指針だけのための例として意図されている。中間用量レベルも、高用量レベルも使用することができ、一部の用量レベルは、各コホート間の非公式の中間解析時のデータ査定に基づき、省略することができる。
治験処置は、
・Ａ：プラセボの単回投与
・Ｂ：パート１で決定した最小ＰＡＤにおける、抗ヒトＢＭＰ６ Ａｂの単回投与
・Ｃ：パート１で決定した最小ＰＡＤを１レベル上回る用量レベルにおける、抗ヒトＢＭＰ６ Ａｂの単回投与
として規定される。
併用処置
研究開始前および研究期間中、参入基準で規定された時間枠内で投与または服用された全ての処方医薬、市販薬、および重要な非薬物療法（理学治療および輸血を含む）は、ＣＲＦの「併用医薬／重要な非薬物療法」節に記録しなければならない。医薬項目は、商標名、単回投与および単一単位、投与回数および投与経路、治療の開始日および中止日および治療の理由に対して具体的であるものとする。
有効性／薬力学
有効性評価については、下記で詳述する。有効性評価のための試料は、多様な時点で回収する。血液学検査値について評価する。Ｈｇｂ指数およびＦｅ指数は、研究のパート１における、用量調整査定の一部としての、各コホート間の、非公式の中間解析において再検討する。初期に設定した試料の回収回数が、鉄とＰＫとの間の関係を理解するために最適未満であるとみなされる場合、試料の回収回数を、パート１の後続のコホートにおいて改変することができる。
鉄指数パネル
抗ヒトＢＭＰ６ Ａｂは、Ｆｅを、体内貯蔵部から移動させる結果として、血清Ｆｅ、トランスフェリン飽和度（ＴＳＡＴ）、結合しなかったＦｅ結合能（ＵＩＢＣ）、総Ｆｅ結合能（ＴＩＢＣ）、フェリチン、および網状赤血球ヘモグロビン含量（ＣＨｒ）を含む血清Ｆｅパラメータの変化をもたらすことが予測される。これらは、検証されたアッセイを使用して、血清中で測定する。
安全性
安全性評価については、下記に詳述する。
身体検査
完全な身体検査は、全般的な外見、皮膚、頸部（甲状腺を含む）、眼、耳、鼻、喉、肺、心臓、腹部、背部、リンパ節、四肢末端についての検査、血管検査、および神経学的検査を含むであろう。医療既往歴および／または徴候に基づき、適応である場合、直腸、外性器、乳房、および／または骨盤の検査を実施することができる。
治験薬の開始前に存在する著明な所見は、患者のｅＣＲＦ上の、関連する医療既往歴／現在の医学的状態スクリーンに組み入れなければならない。治験薬の開始後に見られる著明な所見であって、「有害事象」の規定を満たす所見は、患者のｅＣＲＦの有害事象スクリーンに記録しなければならない。
バイタルサイン
・体温
・血圧（ＢＰ）
・脈拍
身長および体重
・身長
・体重
・体格指数（ＢＭＩ）は、（体重（ｋｇ）／［身長（ｍ）］２）と計算する
検査室査定
検査室検査の結果の、臨床的関連性がある逸脱は、有害事象を規定する基準について査定し、基準を満たす場合は、有害事象として報告する。査定の反復は、結果が正常化するまで、または変化がもはや臨床的関連性がなくなるまで必須である。
血液学
ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球カウント、分画による白血球カウント、および血小板数を測定する。鉄指数をモニタリングする。
臨床化学
ナトリウム、カリウム、クレアチニン、尿素、塩化物、アルブミン、カルシウム、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、ＬＤＨ、ＧＧＴ、ＡＳＴ、およびＡＬＴをモニタリングする。総ビリルビン濃度が、正常値上限の１．５倍を上回って上昇する場合は、直接反応型ビリルビンと、間接反応型ビリルビンとを差別化するべきである。
心電図（ＥＣＧ）
ＰＲ区間、ＱＲＳ持続期間、心臓数、ＲＲ、ＱＴ、ＱＴｃ。臨床決定のためには、フレデリカＱＴ補正式（ＱＴｃＦ）を使用するものとする。
妊娠および受胎能力の評価
報告された生殖／更年期状態に関わらず、全ての女性患者についての妊娠検査が要求される。
本研究のために、血清妊娠検査を実施する。陽性の場合、患者は、試験を打ち切らなければならない。
スクリーニングおよびベースラインにおいて実施する場合、本試験の結果は、患者に投与する前に受け渡さなければならない。
薬物動態
ＰＫ試料を回収する。ＰＫデータは、研究のパート１における、用量調整査定の一部としての、各コホート間の、非公式の中間解析において再検討する。初期に設定した試料の回収回数が、ＰＫプロファイルを特徴付けるために不十分または不適切であるとみなされる場合、試料の回収回数を、パート１の後続のコホートにおいて改変することができる。採血回数および回収される総血液容量は、プロトコールにおいて言明されている採血回数および回収される総血液容量を超えないものとする。
ＰＫ試料を回収し、全ての患者において、全ての用量レベルで査定する。
遊離抗ヒトＢＭＰ６ Ａｂの濃度は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定する。予期される定量下限（ＬＬＯＱ）は、１０ｐｇ／ｍＬである。
非処置（プラセボ）試料については、解析しない。
遊離抗ヒトＢＭＰ６ Ａｂ濃度は、μｇ／ｍＬ単位で表す。ＬＬＯＱを下回る全ての濃度または逸失データは、濃度データ一覧において、そのようなものとして表示する。ＬＬＯＱを下回る濃度は、濃度データについての概要統計でのみ、ゼロとして処理する。これらは、ＰＫパラメータの計算では、考慮に入れない。
遊離抗ヒトＢＭＰ６ Ａｂの決定の後の残りのＰＫ試料は、探索的評価または他のバイオアナリシスの目的（例えば、異なる施設間の照合、安定性評価）のために使用することができる。
Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．２以上）によるノンコンパートメント方法を使用して、以下の薬物動態パラメータ：Ｃｍａｘ、ｔｍａｘ、ＡＵＣ（０−ｔ）、ＡＵＣ（０−ｔｌａｓｔ）、Ｃｍａｘ／Ｄ、およびＡＵＣ／Ｄを、血清濃度−時間データに基づき決定する（決定可能な場合）。ＡＵＣの計算のためには、線形台形法を使用する。ヒトＢＭＰ６に結合する抗体または抗原結合性断片（ｔ１／２）の終末半減期もまた、データに基づき推定可能な場合は、推定する。
他の評価
免疫原性
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗ヒトＢＭＰ６抗体を検出する。免疫原性解析の後の残りのＩＧ試料は、探索的評価または他のバイオアナリシスの目的（例えば、異なる施設間の照合）のために使用することができる。
探索的評価
バイオマーカーとは、正常な生物学的過程、病理学的過程、または治療的介入に対する薬理学的応答について、客観的に測定および査定された指標である（Biomarkers Definitions Working Group 2001）。
ＢＭＰ６ヘプシジン経路は、以下の通りである。肝細胞内のＢＭＰ６シグナル伝達は、ヘプシジンの発現の誘導、腸細胞による鉄吸収の阻害、およびマクロファージによる鉄移出に要求される。ヘプシジン降下療法としてのＢＭＰ６中和抗体は、ＥＰＯの要求を軽減し、かつ、目標Ｈｇｂレベルに達する患者の数を増大させることにより、鉄欠乏性貧血を伴う患者に利益をもたらすはずである。
上記で記載した生物学に基づくと、探索的バイオマーカー評価は、ヘプシジン（ＬＣ−ＭＳアッセイを使用して測定する）を含むがこれらに限定されない。
さらなる探索的評価により、骨吸収マーカーの潜在的な役割について探査しうるほか、作用機構に寄与する因子としての炎症にも取り組むことができる。
探索の目的は、以下の通り：
・ヘプシジンレベルと、ＥＲＩおよび鉄指数など、いくつかの鍵となる尺度との関係について評価すること；
・主要評価項目および副次的評価項目と探索的バイオマーカーとの力動関係を、縦断的に研究すること；
・薬理遺伝学について評価すること；
・免疫原性について評価すること
である。試料は、多様な時点で回収する。
試料の回収、番号付け、処理、および出荷についてのさらなる詳細は、中央検査室マニュアルに提示する。
ＤＮＡ
探索的ＤＮＡ調査研究を、（１）機能的鉄欠損性貧血を伴う、エリスロポエチンで処置された慢性血液透析患者に関連する場合もあり、（２）抗ヒトＢＭＰ６ Ａｂによる処置に対する応答を予測する場合もあり、（３）副作用に対する遺伝的素因を予測する場合もある遺伝因子を同定することを目的とする、本研究の一部として計画する。
加えて、ジェノタイピング技術の最近の進展により、ゲノムワイドの手法も可能となっている。ゲノムワイドの手法はまた、上記で記載した通り、これらの研究についての限定的な範囲内で企図することもできる。
可溶性バイオマーカー
ヘプシジンを、血漿中で、潜在的なＰＤ／バイオマーカーとして定量化する。
アッセイについての詳細な記載は、バイオアナリシスデータの報告書に組み入れる。
他のバイオマーカー
仮説によらないプラットフォームを使用して、疾患の異質性、作用方式、および／または層別化マーカーの潜在的な同定について理解することができるであろう。免疫原性（ＩＧ）試料は、多様な時点で回収する。抗ヒトＢＭＰ６ Ａｂの免疫原性は、抗ヒトＢＭＰ６抗体を認識する抗体を測定することにより評価する。
参考文献
Fukuma S, Yamaguchi T, Hashimoto S et al (2012) Erythropoiesis-stimulating agent responsiveness and mortality in hemodialysis patients: results from a cohort study from the dialysis registry in Japan. Am J Kidney Dis; 59(1): p. 108-16.
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Saliem S, Patenaude V, Abenhaim HA (2015) Pregnancy outcomes among renal transplant recipients and patients with end-stage renal disease on dialysis. J Perinat Med (Epub ahead of print) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25719292.
Suttorp MM, Hoekstra T, Rotmans JI et al (2013) Erythropoiesis-stimulating agent resistance and mortality in hemodialysis and peritoneal dialysis patients. BMC Nephrol; 14(1):200.
Zaritsky J, Young B, Gales B, et al (2010) Reduction of serum hepcidin by hemodialysis in pediatric and adult patients. Clin J Am Soc Nephrol; 5(6):1010-14.
別段に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者により通例理解される意味と同じ意味を有する。
別段に指し示されない限り、具体的な詳細について記載されていない、全ての方法、ステップ、技法、および操作を実施することができ、当業者に明らかな通り、それ自体、公知の方式で実施されている。例えば、ここでもまた、本明細書で言及される、標準的なハンドブック、および一般的な背景技術、ならびにその中で引用されている、さらなる参考文献が参照される。別段に指し示されない限り、本明細書で引用される参考文献の各々は、参照によりその全体において組み込まれる。
本発明に対する特許請求の範囲は、非限定的なものであり、下記に提示される。
本明細書では、特定の態様および特許請求の範囲について、詳細に開示してきたが、これは、例示だけを目的とする例としてなされたものであり、付属の特許請求の範囲、または任意の、対応する、将来の適用についての、特許請求の範囲の対象物の範囲に関して、限定することを意図するものではない。特に、本発明者らは、特許請求の範囲により規定される、本開示の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、本開示に対して、多様な代替、改変、および変更を施しうることを想定する。核酸の出発材料、対象のクローン、またはライブラリーの種類の選択は、本明細書で記載される態様について通じた当業者には、ルーチンの事柄であると考えられる。他の態様、利点、および変更も、以下の特許請求の範囲内にあると考えられる。当業者は、ルーチンの実験だけを使用して、本明細書で記載される、本発明の具体的な態様についての、多くの同等物を認識し、これらを確認することが可能であろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包摂されることが意図される。後日になされる、対応する出願における、特許請求の範囲の再起草は、多様な諸国の特許法による制限に起因する可能性があり、特許請求の範囲の対象物の放棄として解釈すべきではない。

以下の態様を包含し得る。
［１］ ヒトＢＭＰ６に結合し、
（ａ）それぞれ、配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｂ）それぞれ、配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｃ）それぞれ、配列番号２９、３０、および３１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３９、４０、および４１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｄ）それぞれ、配列番号３２、３３、および３４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号４２、４３、および４４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｅ）それぞれ、配列番号４９、５０、および５１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５９、６０、および６１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｆ）それぞれ、配列番号５２、５３、および５４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号６２、６３、および６４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｇ）それぞれ、配列番号９、１０、および１１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１９、２０、および２１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；または
（ｈ）それぞれ、配列番号１２、１３、および１４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２］ （ａ）配列番号７５のＶＨ配列
（ｂ）配列番号３５のＶＨ配列
（ｃ）配列番号５５のＶＨ配列、または
（ｄ）配列番号１５のＶＨ配列
を含む、上記［１］に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［３］ （ｅ）配列番号８５のＶＬ配列
（ｆ）配列番号４５のＶＬ配列
（ｇ）配列番号６５のＶＬ配列、または
（ｈ）配列番号２５のＶＬ配列
を含む、上記［１］に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［４］ （ｉ）配列番号７５のＶＨ配列；および配列番号８５のＶＬ配列
（ｊ）配列番号３５のＶＨ配列；および配列番号４５のＶＬ配列
（ｋ）配列番号５５のＶＨ配列；および配列番号６５のＶＬ配列、または
（ｌ）配列番号１５のＶＨ配列；および配列番号２５のＶＬ配列
を含む、上記［１］に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［５］ （ａ）配列番号７７の重鎖配列；
（ｂ）配列番号３７の重鎖配列；
（ｃ）配列番号５７の重鎖配列；または
（ｄ）配列番号１７の重鎖配列
を含む、上記［１］に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［６］ （ｅ）配列番号８７の軽鎖配列；
（ｆ）配列番号４７の軽鎖配列；
（ｇ）配列番号６７の軽鎖配列；または
（ｈ）配列番号２７の軽鎖配列
を含む、上記［１］に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［７］ （ｉ）配列番号７７の重鎖配列；および配列番号８７の軽鎖配列；
（ｊ）配列番号３７の重鎖配列；および配列番号４７の軽鎖配列；
（ｋ）配列番号５７の重鎖配列；および配列番号６７の軽鎖配列；または
（ｌ）配列番号１７の重鎖配列；および配列番号２７の軽鎖配列
を含む、上記［１］に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［８］ １ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＭＰ６に結合する、上記［１］から［７］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［９］ ０．１ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＭＰ６に結合する、上記［１］から［８］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［１０］ ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ７に対するアフィニティーの少なくとも約１００倍のアフィニティーを有する、上記［１］から［９］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［１１］ ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ５、またはヒトＢＭＰ７に対するアフィニティーの少なくとも約１００倍のアフィニティーを有する、上記［１］から［１０］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［１２］ ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ５、またはヒトＢＭＰ７に対するアフィニティーの少なくとも約５００倍のアフィニティーを有する、上記［１］から［１１］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［１３］ ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＢＭＰ２またはヒトＢＭＰ７に対する、検出可能な結合を有さない、上記［１］から［１２］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［１４］ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、肝細胞株内または初代ヒト肝細胞内の、ＢＭＰ６に誘導されるヘプシジン発現を低減する、上記［１］から［１３］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［１５］ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、肝細胞株内または初代ヒト肝細胞内の、ＢＭＰ６に誘導されるヘプシジン発現の、少なくとも約５０％の低減を呈する、上記［１］から［１４］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［１６］ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ヒトＢＭＰ６の活性を低減する、上記［１］から［１５］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［１７］ ＨＥＰ３Ｂ−ＢＲＥ−Ｌｕｃレポーター遺伝子アッセイにおいて測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ヒトＢＭＰ６の活性を低減する、上記［１］から［１６］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［１８］ ＩｇＭおよびＩｇＧから選択される足場を含む、上記［１］から［１７］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［１９］ ＩｇＭおよびＩｇＧであり、前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される、上記［１］から［１８］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２０］ モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、およびｓｃＦｖからなる群から選択される、上記［１］から［１９］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２１］ 免疫コンジュゲートの成分である、上記［１］から［２０］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２２］ Ｆｃ領域の突然変異を介して、エフェクター機能が改変された、上記［１］から［２１］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２３］ 上記［１］から［２２］のいずれかに記載の抗体またはその単離抗原結合性断片を交差遮断する、抗体またはその抗原結合性断片。
［２４］ 配列ＱＴＬＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰ（配列番号９２）からなるヒトＢＭＰ６エピトープに結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２５］ 配列ＱＴＬＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰ（配列番号９２）からなるヒトＢＭＰ６エピトープに対して、（ａ）配列ＱＴＬＶＨＦＩＮＰＥＴＶＰＫＰ（配列番号９３）からなるヒトＢＭＰ７エピトープ、または（ｂ）配列ＱＴＬＶＨＬＭＦＰＤＨＶＰＫＰ（配列番号９４）からなるヒトＢＭＰ５エピトープに対するアフィニティーの、少なくとも約１００倍のアフィニティーを有する、上記［２４］に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２６］ 配列ＱＴＬＶＨＬＭＮＰＥＹＶＰＫＰ（配列番号９２）からなるヒトＢＭＰ６エピトープに対して、（ａ）配列ＱＴＬＶＨＦＩＮＰＥＴＶＰＫＰ（配列番号９３）からなるヒトＢＭＰ７エピトープ、または（ｂ）配列ＱＴＬＶＨＬＭＦＰＤＨＶＰＫＰ（配列番号９４）からなるヒトＢＭＰ５エピトープに対するアフィニティーの、少なくとも約５００倍のアフィニティーを有する、上記［２４］に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２７］ （ａ）それぞれ、配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、または
（ｂ）それぞれ、配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む、上記［２４］から［２６］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２８］ 配列番号７５のＶＨ配列；および配列番号８５のＶＬ配列を含む、上記［２７］に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２９］ 上記［２４］から［２８］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を交差遮断する、抗体またはその抗原結合性断片。
［３０］ 上記［１］から［２９］のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物。
［３１］ 薬学的に許容される担体を含む、上記［３０］に記載の組成物。
［３２］ さらなる治療剤を含む、上記［３０］から［３１］のいずれかに記載の組成物。
［３３］ 前記さらなる治療剤が、ＢＭＰ６の活性を低減する、上記［３２］に記載の組成物。
［３４］ 前記さらなる治療剤が、ｓｉＲＮＡ、抗体もしくはその抗原結合性断片、または低分子である、上記［３３］に記載の組成物。
［３５］ 前記治療剤が、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）または鉄である、上記［３２］から［３３］のいずれかに記載の組成物。
［３６］ 前記治療剤が、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）である、上記［３５］に記載の組成物。
［３７］ 上記［１］から［２９］のいずれかに記載の、ヒトＢＭＰ６に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片をコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド。
［３８］ 上記［１］から［２９］のいずれかに記載の、ヒトＢＭＰ６に結合する抗体またはその抗原結合性断片のＶＨ配列またはＶＬ配列をコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド。
［３９］ ヒトＢＭＰ６に対する抗体またはその抗原結合性断片のＶＨ配列またはＶＬ配列をコードする配列を含み、前記抗体またはその抗原結合性断片が、
（ａ）それぞれ、配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｂ）それぞれ、配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｃ）それぞれ、配列番号２９、３０、および３１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号３９、４０、および４１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｄ）それぞれ、配列番号３２、３３、および３４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号４２、４３、および４４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｅ）それぞれ、配列番号４９、５０、および５１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号５９、６０、および６１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｆ）それぞれ、配列番号５２、５３、および５４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号６２、６３、および６４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；
（ｇ）それぞれ、配列番号９、１０、および１１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号１９、２０、および２１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；または
（ｈ）それぞれ、配列番号１２、１３、および１４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
を含む、単離ポリヌクレオチド。
［４０］ ＢＭＰ６に対する抗体またはその抗原結合性断片の重鎖または軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号７８の重鎖配列；
（ｂ）配列番号７６のＶＨ配列；
（ｃ）配列番号８８の軽鎖配列；
（ｄ）配列番号８６のＶＬ配列；
（ｅ）配列番号３８の重鎖配列；
（ｆ）配列番号３６のＶＨ配列；
（ｇ）配列番号４８の軽鎖配列；
（ｈ）配列番号４６のＶＬ配列；
（ｉ）配列番号５８の重鎖配列；
（ｊ）配列番号５６のＶＨ配列；
（ｋ）配列番号６８の軽鎖配列；
（ｌ）配列番号６６のＶＬ配列；
（ｍ）配列番号１８の重鎖配列；
（ｎ）配列番号１６のＶＨ配列；
（ｏ）配列番号２８の軽鎖配列；または
（ｐ）配列番号２６のＶＬ配列
のうちのいずれかの配列を含む単離ポリヌクレオチド。
［４１］ 上記［３７］から［４０］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［４２］ 上記［４１］に記載のベクター、または上記［３７］から［４０］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
［４３］ チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、上記［４２］に記載の宿主細胞。
［４４］ 細胞内のＢＭＰ６の活性を低減する方法であって、前記細胞を、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または上記［３０］から３６］のいずれかに記載の組成物と接触させるステップを含む方法。
［４５］ それを必要とする患者における、ＢＭＰ６を阻害する方法であって、前記患者に、治療有効量の、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または上記［３０］から［３６］のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含む方法。
［４６］ 前記患者が、貧血を有する、上記［４４］から［４５］のいずれかに記載の方法。
［４７］ 前記貧血が、慢性疾患性貧血（ＡＣＤ）、慢性腎疾患（ＣＫＤ）性貧血、がん性貧血、炎症性貧血、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）抵抗性貧血、または鉄欠乏性貧血である、上記［４６］に記載の方法。
［４８］ 前記患者が、慢性血液透析患者である、上記［４４］から［４７］のいずれかに記載の方法。
［４９］ 前記患者が、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）を、投与されたことがあるか、または投与されている、上記［４４］から［４８］のいずれかに記載の方法。
［５０］ 前記ＥＳＡが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である、上記［４９］に記載の方法。
［５１］ 血清鉄レベル、トランスフェリン飽和度（ＴＡＳＴ）、網状赤血球ヘモグロビン含量（ＣＨｒ）、網状赤血球カウント、赤血球カウント、ヘモグロビン、またはヘマトクリットを上昇させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または上記［３０］から［３６］のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含む方法。
［５２］ それを必要とする患者における、ヘプシジンの活性またはレベルを低減する方法であって、前記患者に、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または上記［３０］から［３６］のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含む方法。
［５３］ ヘプシジンの前記活性またはレベルを、少なくとも５０％低減する、上記［５２］に記載の方法。
［５４］ それを必要とする患者における、貧血を処置する方法であって、前記患者に、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または上記［３０］から［３６］のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含む方法。
［５５］ 患者におけるヘモグロビンレベルを上昇させるか、または維持する方法であって、前記患者に、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または上記［３０］から［３６］のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含む方法。
［５６］ 上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または上記［３０］から［３６］のいずれかに記載の組成物による処置の非存在下におけるＥＰＯ要求用量および／または鉄要求用量と比べて、患者の鉄要求用量を低減するか、患者のＥＰＯ要求用量を低減するか、または患者の鉄要求用量および患者のＥＰＯ要求用量の両方を低減するステップをさらに含む、上記［５５］に記載の方法。
［５７］ 前記患者が、貧血を有する、上記［５５］から［５６］のいずれかに記載の方法。
［５８］ 前記貧血が、慢性疾患と関連する貧血である、上記［５４］または［５７］に記載の方法。
［５９］ 前記慢性疾患が、慢性腎疾患、がん、または炎症である、上記［５８］に記載の方法。
［６０］ 前記患者が、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）で処置されているか、または処置されたことがある、上記［５４］または［５８］から［５９］のいずれかに記載の方法。
［６１］ 前記ＥＳＡが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である、上記［６０］に記載の方法。
［６２］ 前記貧血が、ＥＰＯ低応答性貧血である、上記［５４］または［５７］から［６１］のいずれかに記載の方法。
［６３］ 前記貧血が、鉄欠乏性貧血である、上記［５４］または［５７］から［６２］のいずれかに記載の方法。
［６４］ 前記患者が、慢性血液透析患者である、上記［５４］から［６３］のいずれかに記載の方法。
［６５］ 前記抗体またはその抗原結合性断片を、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与する、上記［４４］から［６４］のいずれかに記載の方法。
［６６］ 前記抗体またはその抗原結合性断片を、０．００６３〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与する、上記［６５］に記載の方法。
［６７］ 前記抗体またはその抗原結合性断片を、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００１６ｍｇ／ｋｇ、０．００２５ｍｇ／ｋｇ、０．００４０ｍｇ／ｋｇ、０．００６３ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１６ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４０ｍｇ／ｋｇ、０．０６３ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、上記［４４］から［６５］のいずれかに記載の方法。
［６８］ 前記抗体またはその抗原結合性断片を、静脈内投与または皮下投与する、上記［４４］から［６７］のいずれかに記載の方法。
［６９］ 前記抗体またはその抗原結合性断片を、静脈内投与する、上記［６８］に記載の方法。
［７０］ 前記投与が、約３０〜約６０分間にわたる注入による投与である、上記［６８］から［６９］のいずれかに記載の方法。
［７１］ 表１に列挙されるＣＤＲを含む、ＢＭＰ６に対する抗体またはその抗原結合性断片。
［７２］ 表１に列挙される、ＢＭＰ６に対する抗体またはその抗原結合性断片。
［７３］ 表１に列挙される、ＢＭＰ６に対する抗体またはその抗原結合性断片の、ＣＤＲを含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
［７４］ 上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、上記［３０］から［３６］のいずれかに記載の組成物、上記［３７］から［４０］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、上記［４１］に記載のベクター、または上記［４２］から［４３］のいずれかに記載の宿主細胞の、医薬の製造における使用。
［７５］ 医薬としての使用のための、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または上記［３０］から［３６］のいずれかに記載の組成物。
［７６］ 治療における使用のための、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または上記［３０］から［３６］のいずれかに記載の組成物。
［７７］ 患者におけるヘモグロビンレベルの上昇または維持における使用のための、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または上記［３０］から［３６］のいずれかに記載の組成物。
［７８］ 貧血を伴う患者の処置における使用のための、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または上記［３０］から［３６］のいずれかに記載の組成物。
［７９］ 前記貧血が、慢性疾患性貧血である、上記［７８］に記載の使用のための抗体または組成物。
［８０］ 前記慢性疾患が、慢性腎疾患、がん、または炎症である、上記［７９］に記載の使用のための抗体または組成物。
［８１］ 前記患者が、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）で処置されているか、または処置されたことがある、上記［７５］から［８０］のいずれかに記載の使用のための抗体または組成物。
［８２］ 前記ＥＳＡが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である、上記［８１］に記載の使用のための抗体または組成物。

Claims (64)

  1. ヒトＢＭＰ６に結合し、
    （ａ）それぞれ、配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；または
    （ｂ）それぞれ、配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
    を含む単離抗体またはその抗原結合性断片。
  2. 配列番号７５のＶＨ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  3. 配列番号８５のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  4. 配列番号７５のＶＨ配列；および配列番号８５のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  5. 配列番号７７の重鎖配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  6. 配列番号８７の軽鎖配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  7. 配列番号７７の重鎖配列；および配列番号８７の軽鎖配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  8. １ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＭＰ６に結合する、請求項１から７のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  9. ０．１ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＭＰ６に結合する、請求項１から８のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  10. ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ７に対するアフィニティーの少なくとも約１００倍のアフィニティーを有する、請求項１から９のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  11. ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ５、またはヒトＢＭＰ７に対するアフィニティーの少なくとも約１００倍のアフィニティーを有する、請求項１から１０のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  12. ヒトＢＭＰ６に対して、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ５、またはヒトＢＭＰ７に対するアフィニティーの少なくとも約５００倍のアフィニティーを有する、請求項１から１１のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  13. ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＢＭＰ２またはヒトＢＭＰ７に対する、検出可能な結合を有さない、請求項１から１２のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  14. ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、肝細胞株内または初代ヒト肝細胞内の、ＢＭＰ６に誘導されるヘプシジン発現を低減する、請求項１から１３のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  15. ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、肝細胞株内または初代ヒト肝細胞内の、ＢＭＰ６に誘導されるヘプシジン発現の、少なくとも約５０％の低減を呈する、請求項１から１４のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  16. ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ヒトＢＭＰ６の活性を低減する、請求項１から１５のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  17. ＨＥＰ３Ｂ−ＢＲＥ−Ｌｕｃレポーター遺伝子アッセイにおいて測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ヒトＢＭＰ６の活性を低減する、請求項１から１６のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  18. ＩｇＭおよびＩｇＧから選択される足場を含む、請求項１から１７のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  19. ＩｇＭまたはＩｇＧであり、前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される、請求項１から１８のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  20. モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、およびｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１から１９のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  21. 免疫コンジュゲートの成分である、請求項１から２０のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  22. Ｆｃ領域の突然変異を介して、エフェクター機能が改変された、請求項１から２１のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
  23. 請求項１から２２のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物。
  24. 薬学的に許容される担体を含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. さらなる治療剤を含む、請求項２３または２４に記載の組成物。
  26. 前記さらなる治療剤が、ＢＭＰ６の活性を低減する、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記さらなる治療剤が、ｓｉＲＮＡ、抗体もしくはその抗原結合性断片、または低分子である、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記さらなる治療剤が、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）または鉄である、請求項２５または２６に記載の組成物。
  29. 前記さらなる治療剤が、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）である、請求項２８に記載の組成物。
  30. 請求項１から２２のいずれかに記載の、ヒトＢＭＰ６に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片をコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド。
  31. 請求項１から２２のいずれかに記載の、ヒトＢＭＰ６に結合する抗体またはその抗原結合性断片のＶＨ配列およびＶＬ配列をコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド。
  32. ヒトＢＭＰ６に対する抗体またはその抗原結合性断片のＶＨ配列およびＶＬ配列をコードする配列を含み、前記抗体またはその抗原結合性断片が、
    （ａ）それぞれ、配列番号６９、７０、および７１の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号７９、８０、および８１の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列；または
    （ｂ）それぞれ、配列番号７２、７３、および７４の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列
    を含む、単離ポリヌクレオチド。
  33. ヒトＢＭＰ６に結合する抗体またはその抗原結合性断片の重鎖および軽鎖またはＶＨおよびＶＬをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、
    （ａ）重鎖をコードする配列が配列番号７８のヌクレオチド配列を含み；
    （ｂ）ＶＨをコードする配列が配列番号７６のヌクレオチド配列を含み；
    （ｃ）軽鎖をコードする配列が配列番号８８のヌクレオチド配列を含み；または
    （ｄ）ＶＬをコードする配列が配列番号８６のヌクレオチド配列を含む
    単離ポリヌクレオチド。
  34. 請求項３０から３３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  35. 請求項３４に記載のベクター、または請求項３０から３３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  36. チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞。
  37. 細胞内のＢＭＰ６の活性を低減する方法で使用するための、請求項２３から２９のいずれかに記載の組成物。
  38. それを必要とする患者における、ＢＭＰ６を阻害する方法で使用するための、請求項２３から２９のいずれかに記載の組成物。
  39. 前記患者が、貧血を有する、請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記貧血が、慢性疾患性貧血（ＡＣＤ）、慢性腎疾患（ＣＫＤ）性貧血、がん性貧血、炎症性貧血、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）抵抗性貧血、鉄欠乏性貧血、または機能的鉄欠損性貧血である、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記患者が、慢性血液透析患者である、請求項３８から４０のいずれかに記載の組成物。
  42. 前記患者が、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）を、投与されたことがあるか、または投与されている、請求項３８から４１のいずれかに記載の組成物。
  43. 前記ＥＳＡが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である、請求項４２に記載の組成物。
  44. 血清鉄レベル、トランスフェリン飽和度（ＴＡＳＴ）、網状赤血球ヘモグロビン含量（ＣＨｒ）、網状赤血球カウント、赤血球カウント、ヘモグロビン、またはヘマトクリットを上昇させる方法で使用するための、請求項２３から２９のいずれかに記載の組成物。
  45. それを必要とする患者における、ヘプシジンの活性またはレベルを低減する方法で使用するための、請求項２３から２９のいずれかに記載の組成物。
  46. ヘプシジンの前記活性またはレベルを、少なくとも５０％低減する、請求項４５に記載の組成物。
  47. それを必要とする患者における、貧血を処置する方法で使用するための、請求項２３から２９のいずれかに記載の組成物。
  48. 患者におけるヘモグロビンレベルを上昇させるか、または維持する方法で使用するための、請求項２３から２９のいずれかに記載の組成物。
  49. 前記組成物による処置の非存在下におけるＥＰＯ要求用量および／または鉄要求用量と比べて、患者の鉄要求用量を低減するか、患者のＥＰＯ要求用量を低減するか、または患者の鉄要求用量および患者のＥＰＯ要求用量の両方を低減するようにさらに用いられる、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記患者が、貧血を有する、請求項４８または４９に記載の組成物。
  51. 前記貧血が、慢性疾患と関連する貧血である、請求項４７または５０に記載の組成物。
  52. 前記慢性疾患が、慢性腎疾患、がん、または炎症である、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記患者が、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）で処置されているか、または処置されたことがある、請求項４７、５１および５２のいずれかに記載の組成物。
  54. 前記ＥＳＡが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である、請求項５３に記載の組成物。
  55. 前記貧血が、ＥＰＯ低応答性貧血である、請求項４７および５０から５４のいずれかに記載の組成物。
  56. 前記貧血が、鉄欠乏性貧血、または機能的鉄欠損性貧血である、請求項４７および５０から５５のいずれかに記載の組成物。
  57. 前記患者が、慢性血液透析患者である、請求項４７から５６のいずれかに記載の組成物。
  58. 前記抗体またはその抗原結合性断片を、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与するように用いられる、請求項３７から５７のいずれかに記載の組成物。
  59. 前記抗体またはその抗原結合性断片を、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１６ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４０ｍｇ／ｋｇ、０．０６３ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇの用量で投与するように用いられる、請求項３７から５８のいずれかに記載の組成物。
  60. 前記抗体またはその抗原結合性断片を、静脈内投与または皮下投与するように用いられる、請求項３７から５９のいずれかに記載の組成物。
  61. 前記抗体またはその抗原結合性断片を、静脈内投与するように用いられる、請求項６０に記載の組成物。
  62. 前記投与が、約３０〜約６０分間にわたる注入による投与である、請求項６０または６１に記載の組成物。
  63. 医薬としての使用のための、請求項２３から２９のいずれかに記載の組成物。
  64. 治療における使用のための、請求項２３から２９のいずれかに記載の組成物。
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