PT1071700E

PT1071700E - Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos

Info

Publication number: PT1071700E
Application number: PT99918731T
Authority: PT
Inventors: James E Bailey; Pablo Umana; Joel Jean-Mairet
Original assignee: Glycart Biotechnology Ag
Priority date: 1998-04-20
Filing date: 1999-04-20
Publication date: 2010-04-23
Also published as: JP4334141B2; EP2261229A2; DK2180007T4; US20090304690A1; US20110142825A1; US8623644B2; EP2180007A3; US9718885B2; US20050074843A1; AU3657899A; EP1071700B1; US8629248B2; JP2018038431A; ATE458007T1; JP2009100748A; JP2015051017A; JP2017108747A; JP2012210209A; EP1071700A1; US20050079605A1

Description

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DESCRIÇÃO "MODIFICAÇÃO POR GLICOSILAÇÃO DE ANTICORPOS PARA MELHORAR A CITOTOXICIDADE CELULAR DEPENDENTE DE ANTICORPOS"

I. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção insere-se no domínio da modificação por glicosilação de proteínas. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito à modificação por glicosilação para gerar proteínas com melhores propriedades terapêuticas, incluindo anticorpos com maior citotoxicidade celular dependente de anticorpos.

II. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As glicoproteínas intervêm indirectamente em muitas funções essenciais dos seres humanos, de outros organismos eucarióticos e de alguns procariotas, incluindo a catálise, a sinalização, a comunicação célula a célula, o reconhecimento molecular e a associação. Elas constituem a maioria das proteínas não citosólicas em organismos eucarióticos. Lis e Sharon, 1993, Eur. J Biochem. 218: 1-27. Muitas glicoproteínas foram já utilizadas para fins terapêuticos e, durante as duas últimas décadas, as versões recombinantes de glicoproteínas segregadas que ocorrem naturalmente constituíram um produto importante da indústria biotecnológica. Como exemplos refere-se a eritropoietina (EPO), os anticorpos monoclonais terapêuticos (os mAb terapêuticos), o activador do plasminogénio tecidual (tPA), o interferão β (INF-β) , o 2 factor estimulador de colónias de granulócitos-macrofagos (GM-CSF) e a gonadotrofina coriónica humana (hCH). Cumming et al., 1991, Glycobiology 1: 115-130. O componente oligossacaridico pode afectar, significativamente, propriedades relevantes para a eficácia de uma glicoproteina terapêutica, incluindo a estabilidade física, a resistência ao ataque pelas proteases, as interacções com o sistema imunitário, a farmacocinética e a actividade biológica específica. Tais propriedades podem depender não só da presença ou da ausência de oligossacarídeos, mas também das estruturas específicas. É possível fazer algumas generalizações entre a estrutura oligossacarídica e a função da glicoproteina. Por exemplo, determinadas estruturas oligossacarídicas intervêm indirectamente na depuração rápida de glicoproteínas, retirando-as da corrente sanguínea, mediante interacções com proteínas de ligação a hidratos de carbono específicos, ao passo que outras podem ficar ligadas a anticorpos e desencadear reacções imunitárias indesejadas. Jenkins et al., 1996, Nature Biotechn. 14: 975-981.

As células de mamíferos são as células hospedeiras preferíveis para a produção de glicoproteínas terapêuticas, devido à sua capacidade para glicosilarem proteínas na forma mais compatível para aplicação humana. Cumming, 1991, supra-, Jenkins et al., 1996, supra. As bactérias só muito raramente glicosilam as proteínas e, tal como acontece com outros tipos de células hospedeiras vulgares, por exemplo, as células de leveduras, de fungos filamentoso, de insectos e de plantas, geram padrões de glicosilação associados a uma rápida depuração a partir da corrente sanguínea, reacções imunitárias indesejáveis e, em alguns casos específicos, uma actividade biológica reduzida. Entre as 3 células de mamíferos têm sido as células de ovário do criceto chinês (CHO) as mais vulgarmente utilizadas durante as duas últimas décadas. Para além de proporcionarem padrões de glicosilação adequados, estas células permitem uma geração consistente de linhagens de células clonais, altamente produtivas e geneticamente estáveis. Podem ser criadas em cultura com elevadas densidades em biorreactores simples, utilizando meios isentos de soro, e permitem o desenvolvimento de bioprocessos seguros e reproduzíveis. Outras células de animais, vulgarmente utilizadas, são as células do rim do criceto bebé (BHK) e as células de mieloma de murganho NSO e SP2/0. Mais recentemente também tem vindo a ser experimentada a produção a partir de animais transgénicos. Jenkins et al., 1996, supra. A glicosilação de proteínas terapêuticas recombinantes, produzidas em células de animais, pode ser manipulada por sobreexpressão de genes da glicosil-transferase em células hospedeiras. Bailey, 1991, Science 252: 1668-1675. No entanto, em trabalhos anteriores realizados neste domínio recorreu-se apenas à expressão constitutiva dos genes da glicosil-transferase modificadora das glicoproteínas, tendo sido prestada pouca atenção à intensidade da expressão. 0 documento WO 97/30087 descreve uma preparação de anticorpos em que um local de glicosilação N do domínio Fc do anticorpo é substituído por um oligossacarídeo biantenal, em que pelo menos 2 0% da preparação é constituída por moléculas de anticorpos que possuem um oligossacarídeo que contém pelo menos um resíduo de galactose. 4

III. DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto proporcionar processos para gerar proteínas com um padrão de glicosilação alterado, daí resultando melhores aplicações terapêuticas. A presente invenção proporciona um processo in vitro ou ex vivo para a produção de um anticorpo recombinante que possui uma maior citotoxicidade celular mediada por Fc, o qual compreende os passos seguintes: (i) arranjar uma célula hospedeira de mamífero que seja capaz de expressar um anticorpo recombinante que possua uma região Fc de IgG contendo oligossacarídeos ligados a N, e modificar geneticamente a célula hospedeira para regular uma maior expressão de uma enzima, pelo menos, seleccionada do conjunto constituído por β (1,4)-N-acetil-glucosaminil-transferase III, β(1,4)-N-acetil-glucosaminil-transferase V e manosidase II, alterando assim o padrão de glicosilação do anticorpo; (ii) criar em cultura a célula hospedeira resultante de (i), em condições que permitam a produção do referido anticorpo recombinante; e (iii) isolar o referido anticorpo recombinante; em que esse anticorpo recombinante possui uma maior proporção de resíduos de GlcNAc na região Fc comparativamente com a proporção de resíduos de fucose e possui uma maior citotoxicidade celular mediada por Fc comparativamente com o correspondente anticorpo produzido pela mesma célula hospedeira que não tenha sido geneticamente modificada como no passo (i). 5 A invenção baseia-se, em parte, na conclusão a que chegaram os inventores de que há um intervalo óptimo de expressão da glicosil-transferase modificadora de glicoproteinas para maximizar o complexo de oligossacarídeos ligados a N, portadores de GlcNAc bissectado.

Mais concretamente, a presente invenção tem por objecto proporcionar um processo para produzir glicoformas alteradas de proteínas com melhores aplicações terapêuticas, por exemplo, um anticorpo que possua uma maior citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), numa célula hospedeira.

IV. DESCRIÇÃO ABREVIADA DOS DESENHOS A FIGURA 1 representa, esquematicamente, estruturas oligossacarídicas típicas associadas a Fc. A FIGURA 2 mostra uma análise de "western blot" respeitante à expressão de GnT III, regulada pela tetraciclina, em dois clones de CHO diferentes, produtores de tTA. Foram transfectadas células de CH0t2 (pistas A e B) e de CH0tl7 (pistas C e D) , com o vector de expressão pUDH10-3GnTIIlm, tendo sido criadas em cultura durante 36 horas na ausência (pistas A e C) ou na presença de tetraciclina, com uma concentração de 400 ng/mL (pistas B e D) . Depois, efectuou-se a preparação dos lisados celulares para a análise de "western blot", fazendo a hibridação com um anticorpo (9E10) que reconhece, especificamente, o identificador c-myc acrescentado a GnT III no seu terminal carboxi. A FIGURA 3 mostra a determinação do intervalo de concentrações de tetraciclina em que é possível controlar a 6 expressão de GnT III marcada com o identificador myc. As células de CH0tl7 foram transfectadas com o vector de expressão pUDH10-3GnTIIIm e depois foram criadas em cultura durante 48 horas na presença das concentrações indicadas de tetraciclina. Efectuou-se a comparação dos níveis e GnT III nos lisados celulares resultantes destas culturas, recorrendo à análise de "western blot". A GnT III foi detectada por meio do identificador c-myc, utilizando o anticorpo 9E10.

As FIGURAS 4A e 4B mostram a despistagem de clones de CHO para pesquisa da expressão estável das glicosil-transferases GnT V, regulada pela tetraciclina (FIGURA 4A), ou GnT III marcada com o identificador myc (FIGURA 4B), por análise "western blot". As células de CH0tl7 foram co-transfectadas com um vector para expressão da resistência à puromicina (pPUR) e com pUHD10-3GnTV (FIGURA 4A) ou pUHDlO-3GnTIIIm (FIGURA 4B), tendo sido seleccionados clones estáveis de CHO para resistência à puromicina (7,5 pg/mL), na presença de tetraciclina (2 pg/mL). Foram utilizados oito clones (1-8) para cada glicosil-transferase, os quais foram criados em cultura durante 48 horas na ausência ou na presença (+) de tetraciclina (2 pg/mL), e analisados por "western blot", utilizando quer um anticorpo anti-GnT V (FIGURA 4A) quer um anticorpo (9E10) anti-myc (FIGURA 4B).

As FIGURAS 5A e 5B mostram a verificação de actividade das glicosil-transferases heterólogas GnT V (FIGURA 5A) e GnT III (FIGURA 5B) in vivo, por análise de absorção da lectina. As glicoproteínas celulares, provenientes de diversos clones estáveis (numerados conforme indicado na FIGURA 4), criados em cultura na ausência ou na presença (+) de tetraciclina (2 pg/mL), foram separadas por SDS-PAGE, 7 transferidas para uma membrana e hibridadas com a lectina L-PHA (FIGURA 5A) e com a lectina E-PHA (FIGURA 5B) . Estas lectinas ligam-se aos produtos oligossacaridicos das reacções, catalisadas por GnT V e GnT III, com maior afinidade do que aos correspondentes substratos dos oligossacarideos destas reacções. Paralelamente, utilizou-se um marcador de pesos moleculares (MPM). Uma comparação entre as absorções das lectinas nas FIGURAS 5A e 5B indica um domínio de substratos, entre as glicoproteínas endógenas das células de CHO, mais amplo para as GnT III (FIGURA 5B) do que para a GnT V (FIGURA 5A).

As FIGURAS 6A a 6D mostram a inibição do crescimento celular em consequência da sobreexpressão da glicosil- transferase. Preparou- se um inoculo com células de CHO-tet- GnTIIIm até 5-10% da confluência, tendo sido criadas em cultura na ausência (FIGURAS 6A e 6B) ou na presença (FIGURAS 6C e 6D) de tetraciclina. As culturas foram fotografadas decorridas 45 horas (FIGURAS 6A e 6C) e 85 horas (FIGURAS 6B e 6D) após a preparação do inoculo. A FIGURA 7C ilustra sequências de iniciadores oligonucleotídicos utilizados nos protocolos de PCR para a construção do gene de cadeia pesada de chCE7. Os iniciadores directos e inversos são identificados respectivamente pelos sufixos "dir" e "inv". Estão indicadas as sobreposições entre os diferentes iniciadores, necessárias para a execução dos passos das PCR secundárias, utilizando como matriz o produto de um passo de PCR primária. Também estão indicados os locais de restrição introduzidos, as sequências recombinantes com o ADN genómico quimérico de CE7 e a sequência líder sintética introduzida. A FIGURA 8 ilustra as sequências dos iniciadores oligonucleotidicos utilizados nas PCR para a construção do gene de cadeia leve de chCE7. Os iniciadores directos e inversos estão identificados, respectivamente, pelos sufixos "dir" e "inv". Estão indicadas as sobreposições entre os diferentes iniciadores, necessárias para a execução dos passos das PCR secundárias, utilizando como matriz o produto de um passo de PCR primária. Também estão indicados os locais de restrição introduzidos, as sequências recombinantes com o ADN genómico quimérico de CE7 e a sequência lider sintética introduzida. A FIGURA 9 ilustra os espectros, obtidos por MALDI/TOF-MS de misturas oligossacaridicas neutras, resultantes de amostras de chCE7 produzidas quer com células SP2/0 de mieloma de murganho (FIGURA 9A, oligossacarídeos provenientes de 50 pg de CE7-SP2/0), quer com culturas de células de CHO-tetGnTIII-chCE7, que diferem pela concentração da tetraciclina acrescentada aos meios e que expressam, consequentemente, o gene de GnT III com níveis diferentes. Por ordem decrescente da concentração da tetraciclina, isto é, níveis crescentes de expressão do gene de GnT III, as amostras em causa são: CE7-2000t (FIGURA 9B, oligossacarídeos provenientes de 37,5 pg de anticorpos), CE7-60t (FIGURA 9C, oligossacarídeos provenientes de 37,5 pg de anticorpos), CE7-30t (FIGURA 9D, oligossacarídeos provenientes de 25 pg de anticorpos) e CE7-15t (FIGURA 9E, oligossacarídeos provenientes de 10 pg de anticorpos). A FIGURA 10 ilustra as vias de biossíntese de oligossacarídeos ligados a N, que proporcionam um complexo de oligossacarídeos bissectados, mediante uma reacção catalisada 9 por GnT III. 0 símbolo M significa manose; Gn significa N-acetil-glucosamina (GlcNAc); G significa galactose; Gnb significa GlcNAc bissectora; f significa fucose. A nomenclatura dos oligossacarídeos consiste em enumerar os resíduos M, Gn e G acoplados ao oligossacarídeo central e indicar a presença de uma GlcNAc bissectora por inclusão de uma Gnb. 0 centro oligossacarídico é, ele próprio, constituído por dois resíduos Gn e pode incluir ou não uma fucose. As classes principais de oligossacarídeos estão indicadas dentro de rectângulos a traço interrompido. A abreviatura Man I significa manosidase do Golgi; GnT significa GlcNAc-transferase; e GalT significa galactosiltransferase. A massa associada ao ião do oligossacarídeo associado ao sódio, observado na análise de MALDI/TOF-MS, está indicada ao lado de cada oligossacarídeo. Para os oligossacarídeos que potencialmente possam ter núcleo fucosilado, estão indicadas as massas associadas a ambas as formas, a fucosilada (+f) e a não fucosilada (-f). A FIGURA 11 ilustra a via de biossíntese de oligossacarídeos ligados a N, que proporciona um complexo bissectado, e oligossacarídeos híbridos bissectados mediante reacções catalisadas por GnT III. 0 símbolo M significa manose; Gn significa N-acetilglucosamina (GlcNAc); G significa galactose; Gnb significa GlcNAc bissectora; f significa fucose. A nomenclatura dos oligossacarídeos consiste em enumerar os resíduos M, Gn e G acoplados ao oligossacarídeo comum e indicar a presença de uma GlcNAc bissectora por inclusão de uma Gnb. 0 centro oligossacarídico é, ele próprio, constituído por dois resíduos Gn e pode incluir ou não uma fucose. As classes principais de oligossacarídeos estão indicadas dentro de 10 rectângulos a traço interrompido. A abreviatura Man I significa manosidase do Golgi; TnT significa GlcNAc-transferase; e GalT significa galactosil-transferase. A massa associada ao ião do oligossacarideo associado ao sódio, observado na análise de MALDI/TOF-MS, está indicada ao lado de cada oligossacarideo. Para os oligossacarideos que potencialmente possam ter núcleo fucosilado, estão indicadas as assas associadas a ambas as formas, a fucosilada (+f) e a não fucosilada (-f). A FIGURA 12 ilustra a actividade de ADCC para diferentes amostras de chCE7. Mediu-se a lise de células do neuroblastoma IMR-32, pelos linfócitos humanos (razão objecto:efector = 1:19; 16 horas de incubação a 37°C), com intervenção de diferentes concentrações de amostras de chCE7, através da retenção de um corante fluorescente. Calcula-se o valor percentual da citotoxicidade relativamente a um agente de contraprova de lise total (por meio de um detergente) , após a subtracção do sinal na ausência do anticorpo. A FIGURA 13 ilustra a expressão de GnT III para diferentes culturas de células de CHO-tet-GnTIII que se desenvolveram com concentrações diferentes de tetraciclina, utilizadas para a produção de amostras distintas de anticorpos C2B8. Os lisados celulares de cada cultura, uma desenvolvida com tetraciclina na concentração de 2000 ng/mL (pista C) e outra com uma concentração de tetraciclina de 25 ng/mL (pista D), foram objecto de resolução pelo protocolo de SDS-PAGE, transferidas por absorção para uma membrana e hibridadas com uma sonda de 9E10 (ver supra) e com peroxidase de Armoracia rusticana contra o murganho, 11 enquanto anticorpos primários e secundários, respectivamente. A pista A ilustra uma contraprova negativa.

As FIGURAS 14A e 14b mostram a especificidade do antigénio que se liga ao anticorpo monoclonal C2B8 anti-CD20, recorrendo a um ensaio de imunofluorescência indirecta com células em suspensão. Foram utilizadas células positivas a CD20 (células SB; número ATCC CCL 120 de depósito na ATCC) e células negativas a CD20 (células HSB; número ATCC CCL 120.1 de depósito na ATCC), FIGURAS 14A e 14B respectivamente. As células de cada tipo ficaram a incubar com o anticorpo C2B8, produzido com uma concentração de tetraciclina igual a 25 ng/mL, enquanto anticorpo primário. As contraprovas negativas incluíram HB-SSB, em vez do anticorpo primário. Como anticorpo secundário utilizou-se, para todas as amostras, um anticorpo policlonal conjugado com FITC específico de Fc anti-IgG humana. A FIGURA 15 ilustra a actividade de ADCC para diferentes amostras de anticorpos C2B8 para diferentes concentrações dos anticorpos (0,04-5 pg/mL). A amostra C2B8-nt representa a actividade de ADCC do anticorpo C2B8 produzido numa linhagem celular sem expressão de GnT III. As amostras C2B8-2000t, C2B8-50t, C2B8-25t revelam a actividade de ADCC de três amostras de anticorpos produzidas com concentrações decrescentes de tetraciclina (isto é, aumento da expressão de GnT III).

V. DEFINIÇÕES

Os termos aqui utilizado são os vulgarmente consagrados na especialidade, salvo quando definidos de outra forma, conforme se indica a seguir. 12

Tal como aqui utilizado, o termo anticorpo abrange moléculas de anticorpos inteiros, fragmentos de anticorpos ou proteinas de fusão que incluam uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina.

Tal como aqui utilizado, o termo glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas designa uma enzima que efectua a modificação do padrão de glicosilação de uma glicoproteina. Como exemplos de glicosil-transferases modificadoras de glicoproteínas refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as glicosil-transferases tais como GnT III, GnT V, GalT e Man II.

Tal como aqui utilizado, o termo manipulação da glicosilação pretende abranger qualquer tipo de modificação do padrão de glicosilação de um polipeptido que ocorra naturalmente ou de um seu fragmento. A manipulação da glicosilação compreende a manipulação metabólica do mecanismo de glicosilação de uma célula, incluindo as manipulações genéticas das vias de síntese dos oligossacarídeos, para se obter uma glicosilação alterada das glicoproteínas expressas em células. Mais ainda, a manipulação da glicosilação abrange os efeitos de mutações e do ambiente celular sobre a glicosilação. mas sem que isso constitua

Tal como aqui utilizado, o termo célula hospedeira abrange todos os tipos de sistemas celulares que possam ser manipulados para gerar glicoformas modificadas de proteínas, de fragmentos de proteínas ou de péptidos relevantes, incluindo anticorpos e fragmentos de anticorpos. Tipicamente, as células hospedeiras são manipuladas para expressarem níveis optimizados de uma glicosil-transferase, pelo menos, modificadora de uma glicoproteina, incluindo, 13 qualquer limitação, as GnT III, GnT V, GalT e Man II e/ou pelo menos uma glicosidase. As células hospedeiras compreendem as células criadas em cultura, por exemplo, células de mamíferos criadas em cultura, tais como as células de CHO, as células de BHK, as células de NSO e as células de SP2/0, ou células de hibridomas, células de leveduras e células de insectos, isto para designar apenas algumas, mas também células de um animal transgénico ou de tecidos criados em cultura.

Tal como aqui utilizado, o termo citotoxicidade celular mediada por Fc serve para designar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), e a citotoxicidade celular orientada para as células que tenham sido manipuladas para expressarem sobre a sua superfície celular uma região Fc ou uma região equivalente de uma imunoglobulina G e ainda a citotoxicidade celular mediada por uma proteína de fusão solúvel constituída por um domínio de uma proteína destinatária fundido com o terminal N de uma região Fc ou de uma região equivalente de uma imunoglobulina G. VI. DESCRIÇÃO MINUCIOSA DA INVENÇÃO A. Conceito Geral A presente invenção tem por objectivo proporcionar glicoformas de proteínas, em particular anticorpos, incluindo as moléculas de anticorpos inteiros, de fragmentos de anticorpos ou de proteínas de fusão que contenham uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina, para a produção de novas variantes de um 14 proteína terapêutica. A invenção baseia-se, em parte, no facto de os inventores terem concluído que é possível manipular a rede de reacções de glicosilação de uma célula para maximizar a proporção de determinadas glicoformas no conjunto da população e que determinadas glicoformas possuem melhores características terapêuticas. A invenção baseia-se também, em parte, no facto de terem sido encontradas vias para identificar glicoformas de proteínas que possuem um melhor valor terapêutico e no facto de se saber como as gerar de maneira reproduzível. A invenção também se baseia, em parte, no facto de se ter concluído que há um intervalo preferencial de expressão da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas na célula geradora de anticorpos, para aumentar os oligossacarídeos complexos ligados a N, portadores de GlcNAc bissectoras.

Assim sendo, a presente invenção tem por objecto, genericamente, proporcionar processos para a manipulação da glicosilação de proteínas para alterar e melhorar as suas propriedades terapêuticas. Mais concretamente, a presente invenção descreve processos para produzir, numa célula hospedeira, um anticorpo que possui um padrão de glicosilação alterado, daí resultando uma maior citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Para a prática dos referidos processos, a presente invenção proporciona células hospedeiras que albergam um ácido nucleico que codifica um anticorpo e pelo menos um ácido nucleico que codifica uma glicosil-transferase modificadora de uma glicoproteína. Mais ainda, a presente invenção proporciona processos e protocolos para a cultura de tais células hospedeiras em condições que permitam a expressão do anticorpo desejado que possui um padrão de glicosilação 15 alterado, daí resultando uma maior citotoxicidade celular dependente de anticorpos. Além disso, a invenção descreve também processos para isolar o anticorpo assim gerado, com maior citotoxicidade celular dependente de anticorpos.

Em variantes da invenção mais concretas, utilizou-se como modelo de glicoproteínas terapêuticas dois anticorpos monoclonais, designadamente o anticorpo chCE7 anti-neuroblastoma e o anticorpo C2B8 anti-CD20, tendo as glicoformas relevantes sido as que são portadoras de uma classe especial de hidratos de carbono, designadamente o complexo de oligossacarideos biantenais ligados a N, modificados com N-acetilglucosamina bissectora (GlcNAc). No sistema modular proporcionado pela invenção, são utilizadas como células hospedeiras as células de CHO, embora muitos outros sistemas celulares possam ser utilizados como sistemas celulares hospedeiros. A glicosil-transferase que adiciona uma GlcNAc bissectora a diversos tipos de oligossacarideos ligados a N, GlcNAc-transferase III (GnT III), não é produzida normalmente pelas células de CHO. Stanley e Campell, 1984, J. Biol. Chem. 261: 13370-13378.

Para se investigar experimentalmente os efeitos da sobreexpressão de GnT III, preparou-se uma linhagem de células de CHO com sobreexpressão, regulada pela tetraciclina, de ADNc de GnT III de um rato. Utilizando este sistema experimental, os inventores concluíram que a sobreexpressão de GnT III, com níveis elevados, conduz à inibição do crescimento e que é tóxica para as células. Uma outra linhagem de células de CHO, com sobreexpressão, regulada pela tetraciclina, de GnT V, que é uma glicosil-transferase distinta, revelou o mesmo efeito inibidor, indicando que isto pode ser uma propriedade geral da sobreexpressão das glicosil-transferases modificadoras de 16 glicoproteínas. 0 efeito da expressão enzimática sobre o crescimento das células determina um limite superior para o nível de sobreexpressão das glicosil-transferases modificadoras de glicoproteínas e, consequentemente, pode limitar também a intensidade com que locais de glicosilação dificilmente acessíveis podem ser modificados por manipulação das vias e padrões de glicosilação, utilizando vectores de expressão não regulados.

Descreve-se a produção de um conjunto de amostras de mAb de chCE7 e de C2B8, que diferem nas distribuições das suas glicoformas, mediante o controlo da expressão de GnT III no intervalo entre níveis elementares e níveis tóxicos. A medição da actividade de ADCC das amostras dos mAb de chCE7 revelou um intervalo óptimo de expressão de GnT III para uma actividade biológica máxima de chCE7 in vitro. A actividade está correlacionada com o nível de oligossacarídeos complexos bissectados associados a Fc. A expressão de GnT III no intervalo prático, isto é, onde não se observou nenhuma toxicidade e nenhuma inibição significativa do crescimento, conduziu a um aumento das estruturas complexas bissectadas destinatárias, para este conjunto de amostras de chCE7. Os valores máximos dos padrões dos oligossacarídeos na análise por MALDI/TOF-espectrometria de massa, respeitante às amostras de chCE7 produzidas para níveis elevados de GnT III, indicam que há uma proporção significativa de potenciais substratos de GnT III que é desviada para subprodutos, oligossacarídicos híbridos bissectados. Deste modo, poderia ser valiosa a minimização destes subprodutos, mediante uma manipulação suplementar da via de transformação. 17 B. Identificação e geração de ácidos nucleicos que codificam uma proteína para a qual é desejável uma modificação do padrão de glicosilação A presente invenção proporciona sistemas de células hospedeiras, adequados para gerar glicoformas alteradas de todas as proteínas, de fragmentos de proteínas ou de péptidos relevantes, para os quais seja desejável uma alteração desse tipo no padrão de glicosilação. Os ácidos nucleicos que codificam tais proteínas, fragmentos de proteínas ou péptidos relevantes podem ser obtidos por processos genericamente conhecidos na especialidade. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser isolado a partir de um banco de ADNc ou de um banco genómico. Para um estudo das estratégias de clonagem que é possível utilizar recomenda-se, por exemplo, a obra de Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.; e a de Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).

De acordo com uma variante alternativa da invenção, a sequência codificadora da proteína, do fragmento proteínico ou do péptido relevante pode ser sintetizada total ou parcialmente, utilizando processos químicos perfeitamente conhecidos na especialidade. Ver, por exemplo, Caruthers et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7:215 -233; Crea e Horn, 1980, Nuc. Acids Res . USA 9: 2331; Matteucci e Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21: 719; Chow e Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9: 2807-2817. Em alternativa, poderia ser produzida a própria proteína, utilizando processos químicos para sintetizar a sua sequência de aminoácidos, total ou parcialmente. Por exemplo, é possível sintetizar 18 péptidos recorrendo a técnicas em fase sólida, clivá-los para os separar da resina e purificá-los por cromatografia em liquido de alto rendimento, preparatória. Ver, por exemplo, Creighton, 1983, Protein Structures And Molecular Principies, W.H. Freeman and Co., N.Y. pp. 50-60. A composição de outros péptidos sintéticos pode ser confirmada por análise ou por sequenciação dos aminoácidos ( por exemplo, recorrendo ao processo de degradação de Edman; ver Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman and Co., N.Y., pp. 34-49) .

De acordo com variantes preferenciais, a invenção proporciona processos para gerar e utilizar sistemas de células hospedeiras para a produção de glicoformas de anticorpos ou de fragmentos de anticorpos ou de proteínas de fusão que incluam fragmentos de anticorpos com maior citotoxicidade celular dependente de anticorpos. A identificação de epítopos destinatários e a geração de anticorpos que possuem um potencial valor terapêutico, para os quais é desejável a modificação do padrão de glicosilação, e o isolamento das suas correspondentes sequências de ácidos nucleicos codificadoras, também estão abrangidas no âmbito da invenção. É possível utilizar diversos procedimentos conhecidos na especialidade para a produção de anticorpos para epítopos destinatários relevantes. Tais anticorpos compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos, de cadeia singular, fragmentos Fab e fragmentos produzidos por um banco de expressão de Fab. Tais anticorpos podem ser úteis, por exemplo, como agentes de diagnóstico ou terapêuticos. Como 19 agentes terapêuticos são especialmente preferíveis os anticorpos neutralizadores, isto é, aquelas que competem pela ligação com um ligando, um substrato ou uma molécula adaptadora.

Para a produção de anticorpos são imunizados diversos animais hospedeiros não humanos, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, coelhos, murganhos, ratos, etc., por injecção com a proteína relevante. É possível utilizar diversos adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, dependendo isso da espécie hospedeira, incluindo-se entre eles, mas sem nenhuma limitação, os adjuvantes de Freund (completo e incompleto), os geles minerais, tais como o hidróxido de alumínio, substâncias tensioactivas, tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, hemocianina de moluscos gastrópodes, dinitrofenol e os adjuvantes humanos potencialmente úteis, tais como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Os anticorpos monoclonais para o alvo relevante podem ser preparados recorrendo a qualquer técnica que permita produzir moléculas de anticorpos, continuamente, por meio de linhagens celulares em cultura. Entre tais técnicas refere-se, mas sem nenhuma limitação, a técnica do hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein, 1975, Nature 256: 495-497, a técnica do hibridoma das células B humanas (Kosbor et al., 1983, Immunoloy Today 4: 72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80: 2026-2030) e a técnica do hibridoma de EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Além disso, é possível utilizar as técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. 20

Acad. Sei. U.S.A. 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984. Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:453-454), juntando os genes de uma molécula de um anticorpo de murganho, com uma especificidade antigénica adequada, com genes de uma molécula de um anticorpo humano com uma actividade biológica adequada. Em alternativa, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia singular (patente de invenção norte-americana n° 4 946 778) podem ser adaptadas para a produção de anticorpos de cadeia singular que possuam uma especificidade desejada.

Os fragmentos de anticorpos, que contêm locais de ligação específica da proteína visada relevante, podem ser gerados por meio de técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos compreendem, mas sem nenhuma limitação, os fragmentos de F(ab')2 que podem ser produzidos por digestão da molécula do anticorpo com pepsina e os fragmentos de Fab que podem ser gerados reduzindo as pontes dissulfureto dos fragmentos de F(ab')2- Em alternativa, é possível construir bancos de expressão de Fab (Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281) para permitir uma identificação rápida e fácil dos fragmentos de Fab monoclonais com a especificidade desejada para a proteína visada relevante.

Logo que tenha sido identificado um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, para o qual seja desejável uma modificação no padrão de glicosilação, identifica-se e isola-se a sequência de ácidos nucleicos codificadora, utilizando técnicas perfeitamente conhecidas na especialidade. Ver supra. C. Geração de linhagens celulares para a produção de proteínas com um padrão de glicosilação alterado 21 A presente invenção proporciona sistemas de expressão de células hospedeiras para gerar proteínas que possuem padrões de glicosilação modificados. Em particular, a presente invenção proporciona sistemas e células hospedeiras para gerar glicoformas de proteínas que possuem um melhor valor terapêutico. Assim sendo, a invenção proporciona sistemas de expressão de células hospedeiras, seleccionados ou manipulados para aumentar a expressão de uma glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas. Concretamente, tais sistemas de expressão de células hospedeiras podem ser manipulados para conterem uma molécula de um ácido nucleico recombinante que codifique uma glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas, funcionalmente ligada a um sistema promotor constitutivo ou regulado. Em alternativa, entre os sistemas de expressão de células hospedeiras, podem ser utilizados os que produzam naturalmente, sejam induzidos a produzir e/ou sejam seleccionados para produzir uma glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas.

De acordo com uma variante concreta, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira que tenha sido manipulada para expressar pelo menos um ácido nucleico que codifique uma glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas. De acordo com um aspecto, a célula hospedeira é transformada ou transfectada com uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos um gene que codifica uma glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas. De acordo com um aspecto alternativo, a célula hospedeira é manipulada e/ou seleccionada de tal maneira que seja activada uma glicosil-transferase endógena modificadora de glicoproteínas. Por exemplo, a célula hospedeira pode ser seleccionada para ser portadora de uma mutação que desencadeie a expressão de uma 22 glicosil-transferase endógena modificadora de glicoproteinas. Este aspecto é exemplificado numa variante concreta, em que a célula hospedeira é uma célula mutante leclO de CHO. Em alternativa, a célula hospedeira pode ser manipulada de tal modo que seja activada uma glicosil-transferase endógena modificadora de glicoproteinas. Ainda de acordo com uma outra alternativa, a célula hospedeira é manipulada de tal modo que seja activada uma glicosil-transferase endógena modificadora de glicoproteinas, por inserção de um elemento promotor regulado dentro do cromossoma dessa célula hospedeira. De acordo com uma outra alternativa, a célula hospedeira é manipulada de tal modo que seja activada uma glicosil-transferase endógena modificadora de glicoproteinas, por inserção de um elemento promotor constitutivo, um transposão ou um elemento retroviral no cromossoma dessa célula hospedeira.

De um modo geral, é possível utilizar todos os tipos de linhagens de células criadas em cultura como material secundário para manipular as linhagens de células hospedeiras da presente invenção. De acordo com uma variante preferencial, são utilizadas células de CHO, células de BHK, células de NSO, células de SP2/0 ou uma linhagem de células de hibridoma, como linhagem de células secundárias para gerar as células hospedeiras manipuladas da invenção. A invenção também tenciona abranger as células hospedeiras manipuladas que expressam todos os tipos de glicosil-transferases modificadoras de glicoproteinas, conforme aqui definido. No entanto, em variantes preferenciais, pelo menos uma glicosil-transferase modificadora de glicoproteinas, expressa pelas células hospedeiras de invenção, é a GnT III, 23 em alternativa, a β (1,4)-N-acetil-glucosaminil-transferase V (GnT V). No entanto, todos os outros tipos de glicosil-transferases modificadoras de glicoproteínas também podem ser expressos no sistema hospedeiro, tipicamente como complemento da GnT III ou GnT V, incluindo β(1,4)-galactosil-transferase (GalT) e manosidase II (Man II) . De acordo com uma variante da invenção, a GnT III é co-expressa com GalT. De acordo com uma outra variante da invenção, a GnT III é co-expressa com Man III. De acordo com mais uma variante da invenção, a GnT III é co-expressa com GalT e Man III. Todavia, todas as permutações entre glicosil-transferases modificadoras de glicoproteínas estão abrangidas no âmbito da invenção. Mais ainda, pode ser desejável a expressão de uma glicosidase no sistema de células hospedeiras.

Um ou vários ácidos nucleicos codificadores de uma glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas podem ser expressos sob o controlo de um promotor constitutivo ou, em alternativa, de um sistema de expressão regulado. Os sistemas de expressão regulados convenientes compreendem, mas sem nenhuma limitação, um sistema de expressão regulado pela tetraciclina, um sistema de expressão induzível pela ecdisona, um sistema de expressão comutado por lac, um sistema de expressão induzível por glicocorticóides, um sistema promotor induzível pela temperatura e um sistema de expressão induzível pelo metal de uma metalotioneína. Se no sistema de células hospedeiras estiverem compreendidos diversos ácidos nucleicos diferentes, codificadores de glicosil-transferases modificadoras de glicoproteínas, alguns deles podem ser expressos sob o controlo de um promotor constitutivo, ao passo que outros são expressos sob o controlo de um promotor regulado. Os níveis óptimos de 24 expressão irão ser diferentes para cada proteína relevante e irão ser determinados utilizando protocolos experimentais consagrados. Os níveis de expressão são determinados por processos geralmente conhecidos na especialidade, incluindo a análise de "western blot", utilizando um anticorpo específico da glicosil-transferase, a análise de absorção 'Northern', utilizando uma sonda de ácido nucleíco específica da glicosil-transferase, ou medindo a actividade enzimática. Em alternativa, é possível utilizar uma lectina que se ligue aos produtos biossintéticos da glicosil-transferase, por exemplo, a lectina E4-PHA. De acordo com uma outra alternativa, o ácido nucleico pode estar funcionalmente ligado a um gene repórter; os níveis de expressão da glicosil-transferase modificadora das glicoproteínas são determinados medindo um sinal correlacionado com o nível de expressão do gene repórter. 0 gene repórter pode ser transcrito conjuntamente com o (s) ácido (s) nucleico (s) que codifica(m) a referida glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas, sob a forma de uma molécula de ARNm singular; as respectivas sequências codificadoras podem ser ligadas quer por um local interno de entrada ribossómico (IRES), quer por um intensificador de tradução independente da protecção (CITE). 0 gene repórter pode ser traduzido conjuntamente com um ácido nucleico, pelo menos, que codifique a referida glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas, de tal modo que se forme uma cadeia singular de polipeptidos. 0 ácido nucleico codificador da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas pode estar funcionalmente ligado ao gene repórter sob o controlo de um promotor singular, de tal modo que o ácido nucleico que codifica a glicosil-transferase 25 modificadora de glicoproteínas e o gene repórter sejam transcritos numa molécula de ARN que é, alternativamente, dividida em duas moléculas separadas de ARN mensageiro (ARNm); uma das moléculas de ARNm resultantes é traduzida na referida proteína repórter e a outra é traduzida na referida glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas.

Se forem expressos diversos ácidos nucleicos diferentes, codificadores de uma glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas, então podem ficar dispostos de tal maneira que sejam transcritos sob a forma de uma ou várias moléculas de ARNm. Se forem transcritos como uma única molécula de ARNm, as suas respectivas sequências codificadoras podem ser ligadas quer por um local interno de entrada ribossómico (IRES), quer por um intensificador de tradução independente da protecção (CITE). Podem ser transcritos a partir de um único promotor numa molécula de ARN que seja, alternativamente, dividida em várias moléculas separadas de ARN mensageiro (ARNm), que são depois traduzidas nas suas respectivas glicosil-transferases codificadas modificadoras de glicoproteínas.

De acordo com outras variantes, a presente invenção proporciona sistemas de expressão de células hospedeiras para gerar proteínas terapêuticas, por exemplo, anticorpos, que possuem uma maior citotoxicidade celular dependente de anticorpos, e células que apresentam à superfície a região Fc de IgG, para favorecer a citotoxicidade mediada por Fc. De um modo geral, os sistemas de expressão de células hospedeiras têm sido manipulados e/ou seleccionados para expressarem ácidos nucleicos que codificam a proteína para a qual é desejável a produção de glicoformas alteradas, conjuntamente com um ácido nucleico, pelo menos, que codifica uma glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas. De acordo com uma 26 variante, o sistema de células hospedeiras é transfectado pelo menos com um gene que codifica uma glicosil-transferase modificadora de glicoproteinas. De uma forma tipica, as células transfectadas são seleccionadas para identificar e isolar clones que expressam estavelmente a glicosil-transferase modificadora de glicoproteinas. De acordo com uma outra variante, as células hospedeiras são seleccionadas para expressão de glicosil-transferase endógena. Por exemplo, é possível seleccionar células portadoras de mutações que desencadeiem a expressão de glicosil-transferases modificadoras de glicoproteinas que não teriam, de outra forma, efeito aparente. Por exemplo, sabe-se que as células de CHO são portadoras de um gene de GnT III sem efeito aparente que está activo em alguns mutantes, por exemplo, no mutante LeclO. Além disso, é possível utilizar processos conhecidos na especialidade para activar genes de glicosil-transferases modificadoras de glicoproteinas sem efeito aparente, incluindo a inserção de um promotor regulado ou constitutivo, a utilização de transposões, elementos retrovirais, etc.. Também é possível recorrer à utilização de tecnologias de inactivação de genes ou à utilização de métodos ribozimáticos para definir os níveis de expressão das glicosil-transferases e/ou glicosidases nas células hospedeiras, pelo que isto também está abrangido no âmbito da invenção. É possível utilizar todos os tipos de linhagens de células criadas em cultura como material secundário para manipular as linhagens de células hospedeiras da presente invenção. De acordo com uma variante preferencial são utilizadas células de CHO, células de BHK, células de NSO e células de SP2/0. De uma forma típica, tais linhagens de 27 células são manipuladas para compreenderem também, pelo menos, um ácido nucleico transfectado que codifique uma molécula de um anticorpo inteiro, um fragmento de anticorpo ou uma proteína de fusão que contenha uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina. De acordo com uma variante alternativa, utiliza-se uma linhagem de células de hibridoma que expressa um anticorpo particular relevante, enquanto linhagem celular secundária para gerar as células hospedeiras manipuladas da invenção.

De uma forma típica, há pelo menos um ácido nucleico no sistema de células hospedeira que codifica GnT III ou, em alternativa, GnT V. No entanto, todos os outros tipos de glicosil-transferases modificadoras de glicoproteínas podem ser expressos no sistema hospedeiro, tipicamente como suplemento de GnT III ou GnT V, incluindo GalT e Man II. De acordo com uma variante da invenção, a GnT III é co-expressa com GalT. De acordo com uma outra variante da invenção, a GnT III é co-expressa com Man II. De acordo com mais uma outra variante da invenção, a GnT III é co-expressa com GalT e Man II. Todavia, todas as outras permutações de glicosil-transferases modificadoras de glicoproteínas estão abrangidas no âmbito da invenção. Mais ainda, pode ser desejável a expressão de uma glicosidase no sistema de células hospedeiras.

Um ou vários ácidos nucleicos codificadores de glicosil-transferases modificadoras de glicoproteínas podem ser expressos sob o controlo de um promotor constitutivo ou, em alternativa, de um sistema de expressão regulado. Os sistemas de expressão regulados convenientes compreendem, mas sem nenhuma limitação, um sistema de expressão regulado pela tetraciclina, um sistema de expressão induzível por ecdisona, 28 um sistema de expressão comutado por lac, um sistema de expressão induzivel por glicocorticóides, um sistema promotor induzivel pela temperatura e um sistema de expressão induzivel pelo metal de uma metalotioneina. Se no sistema de células hospedeiras estiverem compreendidos diversos ácidos nucleicos diferentes codificadores de glicosil-transferases modificadoras de glicoproteínas, alguns deles podem ser expressos sob o controlo de um promotor constitutivo, ao passo que outros são expressos sob o controlo de um promotor regulado. Os níveis óptimos de expressão irão ser diferentes para cada proteína relevante e irão ser determinados utilizando protocolos experimentais consagrados. Os níveis de expressão são determinados por processos geralmente conhecidos na especialidade, incluindo a análise de "western blot", utilizando um anticorpo específico da glicosil-transferase, a análise de absorção 'Northern' utilizando uma sonda de ácido nucleíco específica da glicosil-transferase, ou medindo a actividade enzimática. Em alternativa, é possível utilizar uma lectina que se ligue aos produtos biossintéticos da glicosil-transferase, por exemplo, a lectina E4-PHA. De acordo com uma outra alternativa, o ácido nucleíco pode estar funcionalmente ligado a um gene repórter; os níveis de expressão da glicosil-transferase modificadora das glicoproteínas são determinados medindo um sinal correlacionado com o nível de expressão do gene repórter. 0 gene repórter pode ser transcrito conjuntamente com o(s) ácido (s) nucleíco (s) que codifica(m) a referida glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas, sob a forma de uma molécula de ARNm singular; as respectivas sequências codificadoras podem ser ligadas quer por um local interno de entrada ribossómico (IRES), quer por um intensificador de 29 tradução independente da protecção (CITE). 0 gene repórter pode ser traduzido conjuntamente com um ácido nucleico, pelo menos, que codifique a referida glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas, de tal modo que se forme uma cadeia singular de polipeptidos. 0 ácido nucleico codificador da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas pode estar funcionalmente ligado ao gene repórter sob o controlo de um promotor singular, de tal modo que o ácido nucleico que codifica a glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas e o gene repórter sejam transcritos numa molécula de ARN que é, alternativamente, dividida em duas moléculas separadas de ARN mensageiro (ARNm); uma das moléculas de ARNm resultantes é traduzida na referida proteína repórter e a outra é traduzida na referida glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas.

Se forem expressos diversos ácidos nucleicos diferentes, codificadores de uma glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas, então podem ficar dispostos de tal maneira que sejam transcritos sob a forma de uma ou várias moléculas de ARNm. Se forem transcritos como uma única molécula de ARNm, as suas respectivas sequências codificadoras podem ser ligadas quer por um local interno de entrada ribossómico (IRES), quer por um intensificador de tradução independente da protecção (CITE). Podem ser transcritos a partir de um único promotor numa molécula de ARN que seja, alternativamente, dividida em várias moléculas separadas de ARN mensageiro (ARNm), que são depois traduzidas nas suas respectivas glicosil-transferases codificadas modificadoras de glicoproteínas. 1. Sistemas de Expressão 30 É possível utilizar processos perfeitamente conhecidos pelos especialistas na matéria para construir vectores de expressão que contenham a sequência codificadora da proteína relevante e as sequências codificadoras das glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas e sinais de controlo transcricionais/traducionais adequados. Estes processos compreendem as técnicas de ADN recombinante in vitro, as técnicas sintéticas e a recombinação genética/recombinação in vivo. Ver, por exemplo, as técnicas descritas por Maniatis et ai., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. e por Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.. É possível utilizar diversos sistemas de hospedeiros-vectores de expressão para expressar a sequência codificadora da proteína relevante e a sequência codificadora da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas. De preferência, são utilizadas células de mamíferos como sistemas de células hospedeiras transfectadas com vectores de expressão de ADN plasmídico recombinante ou de ADN cosmídico, contendo a sequência codificadora da proteína relevante e a sequência codificadora da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas. Mais preferencialmente, são utilizadas, como sistemas de células hospedeiras, células de CHO, células de BHK, células de NSO ou células de SP2/0 ou, em alternativa, células de hibridomas. Em variantes alternativas, é possível prever a utilização de outros sistemas de células hospedeiras eucarióticas, incluindo células de leveduras transformadas 31 com vectores de expressão de leveduras recombinantes que contenham a sequência codificadora da proteína relevante e a sequência codificadora da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas; sistemas de células de insectos infectadas com vectores de expressão de vírus recombinantes ( por exemplo, baculovírus) contendo a sequência codificadora da proteína relevante e a sequência codificadora da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas; sistemas de células de plantas infectadas com vectores de expressão de vírus recombinantes ( por exemplo, o vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; o vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vectores de expressão plasmídicos recombinantes ( por exemplo, o plasmídeo Ti) contendo a sequência codificadora da proteína relevante e a sequência codificadora da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas; ou sistemas de células de animais, infectadas com vectores de expressão de vírus recombinantes ( por exemplo, adenovírus, vírus de vacínia), incluindo as linhagens de células manipuladas para conterem várias cópias de ADN que codifica a proteína relevante e que codifica a sequência da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas, quer estavelmente amplificada (CHO/dhfr), quer amplificada instavelmente em cromossomas que duplicam por minuto ( por exemplo, linhagens de células de murinos).

Para os processos da presente invenção, a expressão estável é, geralmente, preferível para a expressão transitória, uma vez que permite obter, tipicamente, resultados mais reproduzíveis e também mais propícios para produção em grande escala. Em vez de se utilizar vectores de expressão que contenham origens de replicação virais, as células hospedeiras podem ser transformadas com os 32 correspondentes ácidos nucleicos codificadores, controlados por elementos adequados de controlo de expressão ( por exemplo, promotores, intensificadores, sequências, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, etc.) e por um marcador seleccionável. Após a introdução de ADN exógeno, as células manipuladas podem ficar a desenvolver-se durante 1-2 dias num meio enriquecido, sendo depois transferidas para um meio selectivo. 0 marcador seleccionável no plasmídeo recombinante confere resistência à selecção e permite seleccionar células em cujos cromossomas estejam estavelmente integrados os plasmídeos, desenvolvendo-se então para formarem focos que por sua vez podem ser clonados e multiplicados em linhagens celulares. É possível utilizar diversos sistemas de selecção, incluindo, mas sem nenhuma limitação, os genes da cinase da timidina do vírus do herpes simplex (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), da hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (Szybalska & Szybalski, 1962. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48: 2026), e da adenina-fosforribosil-transferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817), que podem ser utilizados respectivamente em células tk~, hgprt~ ou aprt”. Também se pode recorrer à resistência aos antimetabolitos como base de selecção para o gene de dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad Sei. USA 77: 3567; 0'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad Sei. USA 78: 1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad Sei. USA 78: 2072); neo, que confere resistência ao aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1) e higro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al. , 1984, Gene 30: 147). Recentemente foram descritos 33 outros genes seleccionáveis, designadamente trpB, que permite que as células utilizem indol em vez de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad Sei. USA 85: 8047); o sistema da glutamina-sintase; e ODC (ornitina-descarboxilase), que confere resistência ao inibidor da ornitina-descarboxilase, designado por 2-(difluorometil)-DL-ornitina (DFMO) (McConlogue, 1987, em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.). 2. Identificação de transfectantes ou transformantes que expressam a proteína que possui um padrão de glicosilação modificado

As células hospedeiras que contêm a sequência codificadora e que expressam os produtos génicos biologicamente activos podem ser identificadas recorrendo, pelo menos, a quatro metodologias gerais: (a) hibridação ADN-ADN ou ADN-ARN, (b) a presença ou a ausência de funções génicas "marcadoras", (c) avaliação do nivel de transcrição, quando medido pela expressão dos respectivos transcritos de ARNm na célula hospedeira, e (d) detecção do produto génico, quando medido por imunoensaios ou pela sua actividade biológica.

De acordo com a primeira metodologia, a presença da sequência codificadora da proteína relevante e da sequência codificadora das glicosil-transferases modificadoras de glicoproteínas, inseridas no vector de expressão, pode ser detectada por hibridação ADN-ADN ou ADN-ARN, utilizando sondas constituídas por sequências nucleotídicas que são 34 homólogas das respectivas sequências codificadoras ou de partes suas ou de seus derivados.

De acordo com a segunda metodologia, o sistema hospedeiro/vector de expressão recombinante pode ser identificado e seleccionado com base na presença ou na ausência de determinadas funções génicas "marcadoras" ( por exemplo, actividade de timidina-cinase, resistência aos antibióticos, resistência ao metotrexato, fenótipo de transformação, formação de corpos de oclusão em baculovirus, etc.). Por exemplo, se a sequência codificadora da proteína relevante e a sequência codificadora da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas forem inseridas dentro de uma sequência do gene marcador do vector, então os recombinantes que contêm as respectivas sequências codificadoras podem ser identificados pela ausência da função do gene marcador. Em alternativa, é possível colocar um gene marcador em tandem com sequências codificadoras, sob o controlo de um promotor diferente ou do mesmo promotor utilizado para controlar a expressão das sequências codificadoras. A expressão do marcador, em resposta à indução ou selecção, indica a expressão da sequência codificadora da proteína relevante e da sequência codificadora da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas.

De acordo com a terceira metodologia, é possível avaliar, por meio de ensaios de hibridação, a actividade transcricional para a região codificadora da proteína relevante e para a sequência codificadora da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas. Por exemplo, é possível isolar ARN e analisá-lo pela metodologia de absorção 'Northern', utilizando uma sonda homóloga das 35 sequências codificadoras das proteínas relevantes e da sequência codificadora da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas ou de partes suas específicas. Em alternativa, é possível extrair os ácidos nucleicos totais da célula hospedeira e analisá-los por hibridação com tais sondas.

De acordo com a quarta metodologia, é possível avaliar imunologicamente a expressão dos produtos proteínicos da proteína relevante e da sequência codificadora da glicosil-transferase modificadora de glicoproteínas, por exemplo, pela metodologia de "western blot", imunoensaios, tais como a radioimunoprecipitação, imunoensaios associados a enzimas e não só. Contudo, o teste definitivo sobre o êxito do sistema de expressão implica a detecção dos produtos génicos biologicamente activos. D. Geração e utilização de proteínas e de fragmentos de proteínas que possuam padrões de glicosilação modificados 1. Geração e utilização de anticorpos que possuam maior citotoxicidade celular dependente de anticorpos

Em variantes preferenciais, a presente invenção proporciona glicoformas de anticorpos e de fragmentos de anticorpos que possuem uma maior citotoxicidade celular dependente de anticorpos.

Experiências clínicas efectuadas com anticorpos monoclonais (mAb) não conjugados, para o tratamento de alguns tipos de cancros, permitiram obter, recentemente, resultados encorajadores. Dillman, 1997, Câncer Biother. & Radiopharm. 12: 223-225; Deo et al., 1997, Immunology Today 18:127. Foi 36 já aprovada uma IgGl quimérica, não conjugada, para o linfoma folicular ou de pequena gravidade de tipo não Hodgkin das células B (Dillman, 1997, supra), ao passo que um outro mAb não conjugado, uma IgGl humanizada destinada a tumores sólidos da mama, proporcionou também resultados promissores em ensaios clínicos de fase III. Deo et al., 1997, supra. Os antigénios destes dois mAb são fortemente expressos nas suas respectivas células tumorais e os anticorpos são mediadores de uma poderosa destruição tumoral pelas células efectoras in vitro e in vivo. Pelo contrário, há muitos outros mAb não conjugados, que possuem especificidades tumorais bem definidas, que não conseguem desencadear funções efectoras com uma potência suficiente para serem clinicamente úteis. Frost et al., 1997, Câncer 80: 317-333; Surfus et al., 1996, J. Immunother. 19: 184-191. Para alguns destes mAb mais fracos, está a ser experimentada, presentemente, uma terapia complementar com citoquinas. A adição de citoquinas pode estimular a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), aumentando a actividade e o número de linfócitos na circulação. Frost et al., 1997, supra; Surfus et al., 1996, supra. A ADCC, que é um ataque lítico às células visadas pelos anticorpos, é desencadeada pela ligação dos receptores linfocíticos à região constante (Fc) dos anticorpos. Deo et al., 1997, supra.

Uma metodologia diferente, mas complementar, para aumentar a actividade de ADCC das IgGl não conjugadas, poderia ser a manipulação genética da região Fc do anticorpo para aumentar a sua afinidade para os receptores linfocíticos (FcyR) . Estudos de manipulação genética de proteínas demonstraram que os FC/R interactuam com a região de charneira inferior do domínio CH2 da IgG. Lund et al., 1996, J. Immunol. 37 157: 4963-4969. No entanto, a ligação do FcyR também exige a presença de oligossacarideos ligados, de forma covalente, à Asn 297 conservada na região de CH2. Lund et al., 1996, supra; Wright e Morrison, 1997, Tibtech 15:26-31, sugerindo que tanto o oligossacarideo como o polipeptido contribuem ambos directamente para o local de interacção e que o oligossacarideo é necessário para manter uma conformação activa do polipeptido de CH2. Assim sendo, é possivel tirar partido da modificação da estrutura oligossacaridica, como forma de aumentar a afinidade da interacção.

Uma molécula de IgG é portadora de dois oligossacarideos ligados a N na sua região Fc, um em cada cadeia pesada. Tal como sucede com todas as glicoproteínas, um anticorpo é produzido como uma população de glicoformas que partilham a mesma estrutura polipeptídica, mas que possuem diferentes oligossacarideos acoplados aos locais de glicosilação. Os oligossacarideos normalmente existentes na região Fc da IgG sérica são de tipo biantenal complexo (Wormald et al. , 1997, Biochemistry 36: 130-1380), com um nivel diminuto de ácido siálico terminal e de N-acetil-glucosamida bissectora (GlcNAc), e um grau variável de galactosilação terminal e fucosilação central (FIGURA 1) . Alguns estudos sugerem que a estrutura mínima de hidratos de carbono necessária para a ligação do FcyR está situada no interior da região central do oligossacarideo. Lund et al., 1996, supra. A remoção das galactoses terminais tem como resultado, aproximadamente, uma redução de duas vezes na actividade de ADCC, indicando a função destes resíduos na ligação do receptor FcyR. Lund et al., 1996, supra.

As linhagens de células obtidas a partir de murganhos ou de cricetos, utilizadas na indústria e nos meios 38 académicos para a produção de mAb terapêuticos não conjugados, normalmente fixam os necessários determinantes oligossacarideos aos locais Fc. Porém, às IgG expressas nestas linhagens celulares falta-lhes a GlcNAc bissectora existente em pequenas quantidades nas IgG do soro. Lifely et al., 1995, Glycobiology 318: 813-822. Pelo contrário, verificou-se recentemente que há uma IgGl humanizada, produzida pelo mieloma do rato (CAMPATH-1H) que transporta uma GlcNAc bissectora em algumas das suas glicoformas. Lifely et al., 1995, supra. 0 anticorpo derivado da célula do rato atingiu in vitro uma actividade de ADCC semelhante à dos anticorpos CAMPATH-1H produzidos em linhagens de células convencionais, mas com concentrações de anticorpos significativamente inferiores. 0 antigénio CAMPATH encontra-se normalmente presente em niveis elevados nas células de linfomas e o seu mAb quimérico possui uma actividade elevada de ADCC na ausência de uma GlcNAc bissectora. Lifely et al., 1995, supra. Embora no estudo de Lifely et al., 1995, supra, a actividade máxima de ADCC in vitro não seja aumentada alterando o padrão da glicosilação, o facto de este nível de actividade ser obtido com concentrações de anticorpos relativamente diminutas, para o anticorpo portador dos oligossacarideos bissectados, sugere a existência de uma função importante para os oligossacarideos bissectados. Foi desenvolvida uma metodologia para aumentar a actividade de ADCC das IgGl com fracos níveis de actividade básica, mediante a produção de glicoformas destes anticorpos, portadoras de oligossacarideos bissectados na região Fc.

Na via de glicosilação ligada a N, é acrescentada uma GlcNAc bissectora pela enzima β(1,4)-N-acetil-glucosaminil- 39 transferase III (GnT III) . Schachter, 1986, Biochem. Cell Biol. 64:163-181. Lifely et al., 1995, supra, obtiveram diferentes padrões de glicosilação do mesmo anticorpo, produzindo o anticorpo em diferentes linhagens de células com diferentes mecanismos de glicosilação, mas que não foram geneticamente manipulados, incluindo uma linhagem de células de mieloma do rato que expressam GnT III com um nível constante endógeno. Pelo contrário, utilizámos uma única linhagem de células de CHO, produtora de anticorpos, que foi previamente manipulada para expressar, de uma maneira regulada externamente, níveis diferentes de um gene de GnT III clonado. Esta metodologia permitiu-nos estabelecer, pela primeira vez, uma correlação rigorosa entre a expressão de GnT III e a actividade de ADCC no anticorpo modificado.

Conforme aqui demonstrado, ver o exemplo 4 infra, o anticorpo C2B8 modificado, de acordo com o processo descrito, apresentou uma actividade de ADCC cerca de dezasseis vezes superior à do anticorpo C2B8 convencional não modificado, produzido em condições idênticas de cultura celular e de purificação. Dito de uma forma abreviada, uma amostra de anticorpos C2B8 expressos em células de CHo-tTA-C2B8, em que não há expressão de GnT III, revelou uma actividade de citotoxicidade de cerca de 31% (para uma concentração de anticorpos de 1 pg/mL), sendo a medição feita em termos de citólise, in vitro, de células SB (CD20+) por acção dos linfócitos humanos. Pelo contrário, o anticorpo C2B8, obtido a partir de uma cultura de células de CHO que expressam GnT III com um nível básico fortemente reprimido, revelou um aumento de 33% na actividade de ADCC para uma concentração de anticorpos igual a 1 pg/mL, comparativamente com a contraprova utilizada para o mesmo valor de concentração de 40 anticorpos. Mais ainda, aumentando a expressão de GnT III, obteve-se um grande aumento, quase igual a 80%, na actividade máxima de ADCC (para uma concentração de anticorpos igual a lpg/mL), comparativamente com a contraprova utilizada para o mesmo valor de concentração de anticorpos. Ver o Exemplo 4 infra.

Outros anticorpos da invenção, que possuem uma maior citotoxicidade celular dependente de anticorpos, são, mas sem nenhuma limitação, o anticorpo monoclonal anti-neuroblastoma humano (chCE7), produzido pelos processos da invenção, um anticorpo monoclonal quimérico anti-carcinoma das células renais humanas (ch-G250), produzido pelos processo da invenção, um anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado, produzido pelos processos da invenção, um anticorpo monoclonal quimérico anti-carcinoma da mama, do pulmão e do cólon humanos (ING-1), produzido pelos processos da invenção, um anticorpo monoclonal humanizado anti-antigénio 17-1A humano (3622W94), produzido pelos processos da invenção, um anticorpo tumoral humanizado anti-colorrectal humano (A33), produzido pelos processos da invenção, um anticorpo anti-melanoma humano (R24) dirigido contra o gangliósido GD3, produzido pelos processos da invenção e ainda um anticorpo monoclonal quimérico anti-carcinoma das células escamosas humanas (SF-25), produzido pelos processos da invenção. Além disso, a invenção tem por objecto proporcionar fragmentos de anticorpos e proteínas de fusão que compreendem uma região que é equivalente à região Fc das imunoglobulinas. Ver infra. 2. Geração e utilização de proteínas de fusão que compreendem uma região equivalente a uma região Fc de uma imunoglobulina que favorece a citotoxicidade mediada por Fc 41

Conforme se disse antes, a presente invenção diz respeito a um processo para aumentar a actividade de ADCC de anticorpos terapêuticos. Isto é conseguido mediante a manipulação genética do padrão de glicosilação da região Fc de tais anticorpos, em particular maximizando a proporção de moléculas de anticorpos, que transportam oligossacarideos complexos bissectados ligados a N, para os locais de glicosilação conservados nas suas regiões Fc. Esta estratégia pode ser aplicada para aumentar a citotoxicidade celular, mediada por Fc, contra células indesejáveis mediadas por quaisquer moléculas portadoras de uma região que seja um equivalente da região Fc de uma imunoglobulina, não só pelos anticorpos terapêuticos, uma vez que as modificações introduzidas pela manipulação da glicosilação afectam apenas a região Fc e consequentemente as suas interacções com os receptores de Fc sobre a superfície das células efectoras implicadas no mecanismo de ADCC. As moléculas que contêm Fc, às quais podem ser aplicados os processos agora descritos, compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, (a) proteínas de fusão solúveis produzidas a partir de um domínio proteínico de endereçamento fundido com o terminal N de uma região Fc (Chamov e Ashkenazi, 1996, TIBTECH 14:52) e (b) proteínas de fusão ancoradas na membrana plasmática, produzidas a partir de um domínio transmembranar de tipo II que está localizado na membrana plasmática fundida com o terminal N de uma região Fc (Stabila, P.F., 1998, Nature Biotech. 16: 1357) .

No caso das proteínas de fusão solúveis (a), o domínio de endereçamento orienta a ligação da proteína de ligação 42 para as células indesejáveis, tais como células cancerosas, isto é, de uma maneira análoga à dos anticorpos terapêuticos. Deste modo, a aplicação do processo agora descrito, para aumentar a actividade citotóxica celular mediada por Fc, por acção destas moléculas, poderia ser idêntica ao processo aplicado aos anticorpos terapêuticos.

No caso das proteínas de fusão (b) ancoradas à membrana, as células indesejáveis no corpo têm de expressar o gene que codifica a proteína de fusão. Isto tem de ser feito quer pelas metodologias de terapia génica, isto é, transfectando as células in vivo com um vector plasmídico ou virai que oriente a expressão do gene, que codifica a proteína de fusão, para as células indesejáveis, ou implantando no corpo células geneticamente manipuladas que expressem a proteína de fusão na sua superfície. Estas células, agora referidas, poderiam ser implantadas normalmente no corpo, dentro de uma cápsula polimérica (terapia de células encapsuladas) onde não podem ser destruídas por um mecanismo de citotoxicidade celular mediada por Fc. No entanto, se o dispositivo capsular avariar e as células que dele saem passarem a ser indesejáveis, então podem ser eliminadas pela citotoxicidade celular mediada por Fc. Stabila et al., 1998, Nature

Biotech. 16: 1357. Neste caso, o processo agora descrito poderia ser aplicado quer incorporando no vector de terapia génica uma cassete de expressão de um gene suplementar que determine níveis de expressão adequados ou óptimos de GnT III, quer manipulando as células que irão ser implantadas de modo a expressarem níveis adequados ou óptimos de GnT III. Em ambos os casos, o objectivo do processo descrito é o de aumentar ou maximizar a proporção de regiões Fc expostas à 43 superfície, portadoras de oligossacarídeos complexos bissectados.

Os exemplos subsequentes explicam a invenção de uma forma mais minuciosa. As preparações e exemplos seguintes são apresentados para proporcionar, aos especialistas na matéria, uma melhor compreensão e para os habilitar na prática da presente invenção

VII. EXEMPLOS A. Exemplo 1: sobreexpressão de glicosil-transferases, regulada pela tetraciclina, em células do ovário do criceto chinês

Para se estabelecer uma linhagem celular em que a expressão de GnT III pudesse ser controlada externamente, utilizou-se um sistema de expressão regulado pela tetraciclina. Gossen, M. e Bujard, H., 1992, Proc. Nat. Acad Sei. USA, 89:5547-5551. A quantidade de GnT III nestas células pode ser controlada simplesmente por manipulação da concentração da tetraciclina no meio de cultura. Utilizando este sistema, concluiu-se que a sobreexpressão de GnT III com níveis elevados permitiu a inibição do crescimento e foi tóxica para as células. Uma outra linhagem de células de CHO, em que a tetraciclina regula a sobreexpressão de GnT V, que é uma glicosil-transferase distinta modificadora de glicoproteínas, revelou o mesmo efeito inibidor, indicando que isto pode ser uma propriedade geral da sobreexpressão das glicosil-transferases modificadoras de glicoproteínas. Este fenómeno nunca antes havia sido descrito, provavelmente devido ao facto de as investigações 44 terem utilizado, geralmente, promotores constitutivos para as experiências afins. 0 efeito do crescimento determina um limite superior para o nivel de sobreexpressão das glicosil-transferases modificadoras de glicoproteinas e pode, por isso, limitar também a intensidade máxima de modificação de locais de glicosilação dificilmente acessíveis. 1. Materiais e métodos

Criação de células de CHO com expressão de glicosil-transf erases regulada pela tetraciclina. Num primeiro passo, gerou-se, antes de mais, uma linhagem intermédia de células de CHO, (CHO-tTA) que expressa constitutivamente um transactivador controlado pela tetraciclina (tTA) com um nível conveniente para o sistema de regulação. Utilizando o reagente lipofectamina (Gibco, Eggenfelden, Alemanha), efectuou-se a co-transfecção de células CHO (DUKX) com pUHDl5-l, que é um vector para a expressão constitutiva do gene de tTA (Gossen e Bujard, 1992, Proc. Nat. Acad Sei. USA, 89: 5547-5551), e com pSV2Neor que é um vector para a expressão constitutiva de um gene de resistência à neomicina (Clontech, Paio Alto, CA) . Foram seleccionados clones estáveis, resistentes ao fármaco, que foram depois analisados para se investigar os níveis adequados de expressão de tTA através de transfecções transitórias com um vector de expressão de β-galactosidase regulado pela tetraciclina, designado por pUHG16-3. Acrescentou-se ADN que codifica o epítopo c-myc na extremidade 3' do ADNc de GnT III do rato (Nishikawa et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:18199-18204) por amplificação por PCR. Nilsson et ai., 45 1993, J. Cell Biol. 120:5-13. O produto foi sequenciado e subclonado em pUHDlO-3, que é um vector para a expressão regulada pela tetraciclina (Gossen e Bujard, supra) para gerar o vector pUHDlO-3-GnT Illm. O ADNc de GnT V humana (Saito et al., 1995, Eur. J Biochem. 233:18-26) foi subclonado directamente no pUHD10-3 para gerar o vector plasmídico pUHDl0-3-GnT V. As células de CHO-tTA foram co-transfectadas, utilizando um processo de transfecção com fosfato de cálcio (Jordan e Wurm, 1996, Nucleic Acids Res. 24:596-601), com pPur, que é um vector para a expressão constitutiva da resistência à puromicina (Clontech, Paio Alto, CA) , e ainda com o vector pUHDlO-3-GnT Illm ou o vector pUHDl0-3-GnT V. Os clones resistentes à puromicina foram seleccionados na presença de tetraciclina, isolados e depois analisados para se pesquisar a expressão de GnT II ou GnT V, regulada pela tetraciclina, por meio da análise de "western blot". Ver infra. "western blot" e de lectina. Para a análise de "western blot" de GnT III ou GnT V, efectuou-se a separação dos lisados celulares pelo protocolo SDS-PAGE, com electroabsorção sobre membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MA). Detectou-se a GnT III utilizando o anticorpo monoclonal 9E10 anti-c-myc (Nilsson et al., 1993, J. Cell

Biol. 120:5-13) e detectou-se a GnT V utilizando um anticorpo policlonal de coelho anti-GnT V (Chen et al., 1995, Glycoconjugate J. 12:813-823). Como anticorpo secundário utilizou-se peroxidase de Armoracia rusticana anti-IgG de murganho ou anti-IgG de coelho (Amersham, Arlington, IL). Detectou-se o anticorpo secundário ligado, utilizando um estojo de quimioluminescência de alta qualidade (estojo ECL, Amersham, Arlington, IL). 46

Para a análise de absorção de lectina, com as glicoproteínas modificadas nas reacções catalisadas pela GnT III ou pela GnT V, utilizou-se respect ivamente E-PHA biotinilada (Oxford Glycosciences, Oxford, Reino Unido) ou L-PHA-digoxigenina (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha). Merkle e Cummings, 1987, Methods Enzymol. 138:232-259. 2. Resultados e discussão

Criação de linhagens de células de CHO com sobreexpressão de glicosil-transferases regulada pela tetraciclina. A estratégia utilizada para a criação de linhagens de células em que há sobreexpressão de glicosil-transferases consistiu em gerar, em primeiro lugar, uma linhagem de células intermédias de CHO que expressam constitutivamente o transactivador (tTA) controlado pela tetraciclina, com um nível conveniente para que o sistema funcione. Yin et al., 1996. Anal. Biochem. 235:195-201.

Este nível teve de ser suficientemente elevado para activar níveis intensos de transcrição, na ausência de tetraciclina, a partir do promotor minimal a montante dos genes da glicosil-transferase. As células de CHO foram co-transfectadas com um vector para a expressão constitutiva de tTA, comandada pelo promotor/intensificador de citamegalovírus humano (hCMV), e com um vector para expressão de um gene de resistência à neomicina (NeoR) . Utilizou-se um excesso do vector de expressão tTA e fez-se o isolamento dos clones resistentes à neomicina.

Em células de mamíferos, o ADN co-transfectado integra-se adjacentemente em locais aleatórios dentro dos 47 cromossomas e a expressão depende, em grande medida, do local de integração e também do número de cópias das cassetes de expressão intactas. É gerada uma população mista de clones com diferentes niveis de expressão dos genes transfectados. Yin et al., 1996, supra. A selecção pela resistência à neomicina selecciona simplesmente a integração de uma cassete de expressão de NeoR intacta, ao passo gue a utilização de um excesso do vector de expressão de tTA aumenta a probabilidade de serem encontrados clones com boa expressão de tTA. A população mista de clones tem de ser pesquisada recorrendo a um ensaio funcional para expressão de tTA. Gossen e Bujard, 1992, supra; Yin et ai., 1996, supra. Isto foi feito por transfecção de cada clone com um segundo vector que alberga um gene repórter, lacZ, sob o controlo do promotor tet e pesquisando a actividade de β-galactosidase em termos da expressão transitória (isto é, um a três dias após a transfecção) regulada pela tetraciclina (regulada por tet). Para os trabalhos subsequentes foram seleccionados os clones de CH0tl7 que manifestaram o mais elevado nível de actividade de β-galactosidase, regulada por tet, entre vinte clones pesquisados.

Foram efectuados ensaios com células de CH0tl7 para se pesquisar a expressão de GnT III regulada por tet, transfectando as células com o vector pUHD10-3-GnT Illm e comparando os níveis relativos de GnT III após a incubação das células na presença e na ausência de tetraciclina, durante 36 horas. Os níveis de GnT III foram comparados por meio de análises de "western blot", utilizando o anticorpo monoclonal (9E10) que reconhece o identificador de epítopos peptídicos c-myc no terminal carboxi de GnT III. 0 48 identificador havia sido introduzido através de uma modificação do gene da glicosil-transferase, recorrendo à amplificação por PCR. Diversos estudos demonstraram que a adição de identificadores de epitopos peptidicos aos terminais carboxi das glicosil-transferases, um grupo de enzimas que partilha a mesma topologia, não provoca a disrupção da localização ou da actividade. Nilsson et al., 1993, supra·, Rabouille et al., 1995, J. Cell Science 108: 1617-1627. A FIGURA 2 mostra que no clone CHOtl7 GnT III a acumulação é significativamente maior na ausência do que na presença de tetraciclina. Paralelamente, foi testado (FIGURA 2) um outro clone, CH0t2, que determina uma activação menor de transcrição no ensaio de actividade de β-galactosidase. Os niveis de expressão de GnT III e de β-galactosidase seguem o mesmo padrão, de regulação pela tetraciclina, para estes dois clones. Concluiu-se que o intervalo de concentrações da tetraciclina, em que a expressão de GnT III pode ser quantitativamente controlada, está compreendido entre 0 e 100 ng/mL (FIGURA 3). Este resultado está em concordância com trabalhos anteriores em que foram utilizadas diferentes linhagens celulares e diferentes genes ( (Yin et al., 1996, supra).

Para gerar uma linhagem celular estável, com expressão de GnT III regulada por tet, as células de CHOtl7 foram co-transfectadas com o vector pUHD10-3-GnT Illm e com o vector pPUR, para expressão de um gene de resistência à puromicina. Em paralelo, as células de CHOtl7 foram co-transfectadas com os vectores pUHD10-3-GnT V e pPUR para gerar uma linhagem celular análoga para esta outra glicosil-transferase. Utilizou-se um processo altamente eficiente de transfecção com fosfato de cálcio e 49 linearizou-se o ADN em locais de restrição únicos, fora das cassetes de expressão eucarióticas, para diminuir a probabilidade da sua destruição após a integração. Utilizando um hospedeiro em que se havia demonstrado previamente que os niveis de tTA expresso eram adequados, aumenta a probabilidade de se encontrar clones com elevada expressão das glicosil-transferases na ausência de tetraciclina.

Foram seleccionados integrantes adequados pela resistência à puromicina, mantendo-se a tetraciclina no meio durante a selecção de clones para se manter em niveis básicos a expressão das glicosil-transferases. Para cada glicosil-transferase foram criados em cultura dezasseis clones resistentes à puromicina na presença e na ausência de tetraciclina, tendo sido analisados oito de cada pela metodologia de "western blot" (FIGURA 4). A maior parte dos clones revelou uma boa regulação da expressão de glicosil-transferase. Um dos clones, em que há expressão de GnT II, revelou um nível básico relativamente elevado na presença de tetraciclina (FIGURA 4B, clone 3), o que sugere a integração da cassete de expressão próximo de um intensificador endógeno de células de CHO, ao passo que dois clones resistentes à puromicina revelaram a inexistência de expressão de GnT III na ausência de tetraciclina (FIGURA 4B, clones 6 e 8). Entre os clones que revelaram uma boa regulação da expressão foram observados diferentes níveis máximos de glicosil-transferases. Isto pode ser devido a variações no local de integração ou no número de cópias integradas. Verificou-se a actividade das glicosil-transferases pela ligação das lectinas de E-PHA e de L-PHA às glicoproteínas celulares endógenas derivadas 50 dos diversos clones desenvolvidos na presença e na ausência de tetraciclina (FIGURA 5) . As lectinas são proteínas que se ligam a estruturas oligossacarídicas específicas. A lectina de E-PHA liga-se aos oligossacarídeos bissectados, os produtos das reacções catalisadas por GnT III, e a de L-PHA liga-se aos oligossacarídeos triantenais e tetrantenais produzidos pelas reacções catalisadas por GnT V (Merkle e Cummings, 1987, Methods Enzymol. 138:232-259). Para cada glicosil-transferase seleccionou-se, para estudos subsequentes, um clone com expressão elevada na ausência (mas com expressão indetectável na presença) de tetraciclina (clone 6, FIGURA 4A, CHO-tet-GnT V, e clone 4, FIGURE 4B, CHO-tet-GnT Illm). B. Exemplo 2: inibição do crescimento celular efectuada pela sobreexpressão de glicosil-transferases

Durante a pesquisa de clones que expressam GnT III e GnT V, na ausência de tetraciclina (ver o exemplo 1, supra), aproximadamente metade de cada conjunto de clones revelou uma forte inibição do crescimento. A intensidade da inibição do crescimento variou entre os clones e a comparação com os níveis de expressão estimados a partir das análises de "western blot" (FIGURA 4) sugeriu a existência de uma correlação entre o grau de inibição do crescimento e a sobreexpressão de glicosil-transferases. Esta correlação foi perfeitamente confirmada produzindo culturas dos clones finais, CHO-tet-GnT Illm e CHOtet-GnT V, para diferentes concentrações de tetraciclina. Foi evidente uma forte inibição do crescimento após dois dias de cultura com níveis diminutos de tetraciclina (FIGURA 6). 51

As células com o crescimento inibido apresentaram uma pequena morfologia arredondada em vez da forma típica distendida das células aderentes de CHO. Decorridos alguns dias foi evidente uma morte celular significativa, a partir da morfologia das células com o crescimento inibido. A inibição de crescimento, devida à sobreexpressão de gl icosil-transferases, nunca havia sido anteriormente descrita na literatura, provavelmente devido à utilização vulgarizada de promotores constitutivos. Os clones que proporcionam a expressão constitutiva de uma glicosil-transferase com níveis inibidores do crescimento poderiam ter sido perdidos durante o procedimento de selecção. Isto foi evitado aqui mantendo a tetraciclina no meio, isto é, mantendo níveis de expressão básicos, durante toda a selecção. Antes da selecção, previu-se que seria menor a frequência de clones capazes de expressarem glicosil-transferases até aos níveis inibidores do crescimento, utilizando os tradicionais vectores de mamíferos baseados no promotor/intensificador constitutivo hCMV. Isto deve-se ao facto de o vector pUHD10-3, para qualquer gene considerado, em linhagens de células de CHO seleccionadas para níveis constitutivos elevados de tTA, proporcionar níveis de expressão significativamente mais elevados do que os vectores baseados no promotor/intensificador hCMV constitutivo, conforme observado por outros autores. Yin et al., 1996, supra. A inibição do crescimento celular poderia ser devida a um efeito directo da sobreexpressão das glicosil-transferases residentes no Golgi, ancoradas à membrana, independentemente da sua actividade catalítica in vivo, por exemplo, através de um dobramento incorrecto do 52 retículo endoplásmico (ER), originando a saturação em elementos que ajudam o dobramento das proteínas no ER. Isto poderia afectar, possivelmente, o dobramento e a secreção de outras proteínas celulares essenciais. Em alternativa, a inibição do crescimento poderia estar relacionada com uma maior actividade in vivo da glicosil-transferase determinante de uma modificação do padrão de glicosilação, de uma maneira destruidora da função, de um conjunto de glicoproteínas endógenas necessárias para o crescimento em condições de cultura convencionais in vitro.

Independentemente do mecanismo subjacente, o efeito de inibição do crescimento tem duas consequências para a manipulação da glicosilação de células de animais. Em primeiro lugar, implica que a co-transfecção de vectores de expressão constitutivos de glicosil-transferase, conjuntamente com vectores para o produto glicoproteínico destinatário, é uma estratégia medíocre. Também devem ser evitadas outras maneiras de associar a expressão destas duas classes de proteínas, por exemplo, através da utilização de promotores constitutivos múltiplos com uma potência semelhante, ou através da utilização de vectores de expressão constitutivos multicistrónicos. Nestes casos, os clones com elevadíssima expressão constitutiva da glicoproteína destinatária, um pré-requisito para um bioprocesso económico, também deveriam ter elevada expressão da glicosil-transferase e poderiam ser eliminados durante o processo de selecção. A expressão induzível associada também poderia ser problemática para os bioprocessos industriais, uma vez que a viabilidade das células com o crescimento inibido poderia ser comprometida pela sobreexpressão das glicosil-transferases. 53 A segunda consequência é o facto de impor um limite superior à sobreexpressão de glicosil-transferases nas metodologias de manipulação da glicosilação. Dito de forma explicita, as conversões de inúmeras reacções celulares catalisadas pelas glicosil-transferases, aos níveis endógenos das glicosil-transferases, são muito intensas para diversos locais de glicosilação. No entanto, também há locais de glicosilação onde os oligossacarídeos estão relativamente inacessíveis ou estão estabilizados em conformações desfavoráveis para glicosil-transferases específicas. Por exemplo, observou-se que a adição de GlcNAc bissectora está mais limitada para os oligossacarídeos fixados à região Fc do que para aqueles que estão localizados nas regiões variáveis de anticorpos de IgG humana. Savvidou et al., 1984, Biochemistry 23:3736-3740. A manipulação da glicosilação destes locais restringidos poderia ser afectada por tais limites impostos à expressão de glicosil-transferases. Embora isso possa apontar para uma distribuição "não natural" das glicoformas, poderia ter interesse para aplicações terapêuticas especiais das glicoproteínas. C. Exemplo 3: manipulação da glicosilação de um anticorpo anti-neuroblastoma humano, em células de ovário do criceto chinês

Com a finalidade de se validar o conceito de manipulação de um anticorpo terapêutico, mediante a modificação do seu padrão de glicosilação, escolheu-se uma IgGl quimérica anti-neuroblastoma humano (chCE7) que possui uma actividade insignificante de ADCC quando produzida 54 pelas células recombinantes de mieloma de murganho SP2/0. A chCE7 reconhece uma glicoproteína membranar de 190 kD associada ao tumor e reage fortemente com todos os tumores neuroblastomas testados até ao momento presente. Possui uma afinidade elevada para o seu antigénio (Kd igual a 1010M_1) e é vulgarmente utilizada, devido à sua elevada especificidade tumoral, como ferramenta de diagnóstico em patologia clínica. Amstutz et al., 1993. Int. J. Câncer _53_: 147-152. Em estudos recentes, o chCE7 marcado com radioisótopos tem permitido uma boa localização de tumores em pacientes humanos. Diirr, 1993, Eur. J. Nucl. Med. 2_0:858. O padrão de glicosilação do chCE7, gue é um anticorpo monoclonal (mAb) terapêutico anti-neuroblastoma, foi manipulado em células de CHO com expressão de GnT III regulada pela tetraciclina. Produziu-se um conjunto de amostras de mAb que diferem entre si pela distribuição das glicoformas, regulando a expressão de GnT III num intervalo compreendido entre níveis básicos e níveis tóxicos, tendo os seus perfis de glicosilação sido analisados pelo protocolo MALDI/TOF-MS respeitante a oligossacarídeos neutros. A medição da actividade de ADCC destas amostras revelou um intervalo óptimo de expressão de GnT III para uma actividade biológica máxima de chCE7 in vitro, estando esta actividade correlacionada com o nível de oligossacarídeos complexos bissectados associados a Fc. 1. Materiais e Métodos

Construção de vectores de expressão de chCE7. Foram utilizados os vectores plasmídicos 10CE7VH e 98CE7VL, respectivamente para a expressão da cadeia pesada (IgGl) e 55 da cadeia leve (K) do anticorpo chCE7 quimérico anti-neuroblastoma humano, o qual contém ADN genómico quimérico que compreende o promotor/intensificador de imunoglobulina de murganho, as regiões variáveis do anticorpo de murganho e as regiões constantes do anticorpo humano (Amstutz et al. , 1993, Int. J. Câncer 53:147-152), enquanto materiais de partida para a construção dos vectores de expressão finais pchCE7H e pchCE7L. Os genes quiméricos de chCE7 das cadeias pesada e leve foram novamente montados e subclonados no vector pcDNA3.1(+). Durante a nova montagem procedeu-se à remoção de todos os intrãos e fez-se a substituição da sequência líder por sequências sintéticas, Reff et al. , 1994, Blood 83: 435-445, tendo sido introduzidos locais de restrição exclusivos das sequências da região variável e da região constante. Os intrãos da região constante pesada foram removidos mediante junção por sobreposição-extensão-PCR. Clackson et al., 1991, General Applications of PCR to Gene Cloning and Manipulation, p. 187-214, in: McPherson et al. (ed.), PCR a Practical Approach, Oxford University Press, Oxford.

Produção de chCE7 em células de CHO que expressam níveis diferentes de GnT III. Efectuou-se a co-transfecção de células de CHO-tet-GnT Illm (ver, supra) com os vectores pchCE7H, pchCE7L, e pZeoSV2 (para resistência à zeocina, Invitrogen, Groningen, Holanda), utilizando um processo de transfecção com fosfato de cálcio. Os clones resistentes à zeocina foram transferidos para uma placa de cultura de células com 96 cavidades e foram objecto de análise para se pesquisar a expressão de anticorpos quiméricos, recorrendo ao protocolo de ensaio ELISA específico para a região constante da IgG humana. Lifely et al., 1995, supra. Foram 56 utilizadas quatro amostras de anticorpos chCE7, provenientes de culturas paralelas de um clone seleccionado (CH0-tet-GnTIIIm-chCE7), que se desenvolveram em meio de cultura celular FMX-8 enriquecido com 10% de FCS; cada cultura continha uma concentração diferente de tetraciclina, pelo que a expressão de GnT III ocorreu com valores diferentes. As células de CHO-tet-GnTIIIm-chCE7 foram multiplicadas e previamente adaptadas a uma concentração diferente de tetraciclina durante 7 dias. As concentrações de tetraciclina, foram 2000, 60, 30 e 15 ng/mL.

Purificação de amostras de anticorpos chCE7. Purificou-se o anticorpo a partir do meio de cultura, recorrendo à cromatografia de afinidade com a proteína A, numa coluna 'HiTrap' com 1 mL de proteína A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia), tendo a eluição sido feita em gradiente linear de pH, variando desde o tampão A constituído por fosfato de sódio 20 mM, citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 500 mM, 0,01% de Tween 20, ureia 1 M a pH 7,5 (tampão A), até ao tampão B (que é o tampão A sem o fosfato de sódio a pH 2,5). Nas amostras de chCE7 purificadas por afinidade substituiu-se o tampão por PBS numa coluna de permuta de catiões de 1 mL 'Resources' (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). Considerou-se que a pureza final era superior a 95% pelo protocolo de SDS-PAGE e por coloração com o corante azul de Coomasie. Estimou-se a concentração de cada amostra pela absorvência a 280 nm.

Ligação de anticorpos às células do neuroblastoma. Estimou-se a afinidade de ligação às células de neuroblastoma humano por deslocação do chCE7 marcado com 125I, pelas amostras produzidas por CHO. Amstutz et al.r 1993, supra. 57

Análise dos oligossacarídeos pelo protocolo MALDI/TOF— MS. As amostras de CE7-2000t, -60t, -30t e -15t foram tratadas com sialidase de A. urefaciens (Oxford Glycosciences, Oxford, Reino Unido), em conformidade com as instruções do fabricante, para remoção de todos os residuos monossacaridicos do ácido siálico. Os produtos de digestão com a sialidase foram então tratados com N-glicosidase F peptidica (PNGaseF, Oxford Glycosciences, Oxford, Reino Unido), em conformidade com as instruções do fabricante, para libertar os oligossacarideos ligados a N. As proteínas, os detergentes e os sais foram removidos fazendo passar os produtos de digestão através de microcolunas contendo, de cima para baixo, 20 mL de matriz de fase inversa 'SepPak C18' (Waters, Milford, MA), 20 mL de matriz de permuta de catiões 'Dowex AG 50WX8' (BioRad, Hercules, CA) e 20 mL de matriz de permuta de aniões 'AG 4X4' (BioRad, Hercules, CA). As microcolunas foram preparadas acondicionando as matrizes num bico 'Gel Loader' (Eppendorf, Basileia, Suíça) repleto de etanol, seguindo-se uma fase de equilíbrio com água. Kuster et al., 1997, Anal. Biochem. 250:82-101. Juntou-se o líquido de passagem com o produto de lavagem obtido com 300 mL de água, filtrou-se a mistura e evaporou-se até à secura à temperatura ambiente e depois recolocou-se o produto obtido em suspensão em 2 mL de água desionizada. Aplicou-se 1 pL desta suspensão a uma placa de amostras para o protocolo MALDI-MS (Perseptive Biosystems, Farmingham, MA) e misturou-se com 1 mL de uma solução de ácido desidrobenzóico em acetonitrilo na concentração de 10 mg(mL (DHB, Aldrich, Milwakee, Wisconsin). Efectuou-se a secagem das amostras ao ar e dissolveu-se os cristais resultantes em 0,2 mL de etanol e 58 a seguir esperou-se que recristalizassem por secagem ao ar. Harvey, 1993, Rapid Mass. Spectrom. 7:614-619. As amostras de oligossacarídeos foram então analisadas pelo protocolo do período de duração da análise por ionização/dessorção da matriz auxiliadas por laser (protocolo MALDI/TOF-MS), utilizando um espectrómetro 'Elite Voyager 400' (Perseptive Biosystems, Farmingham, MA), equipado com uma fonte de iões para o protocolo MALDI com extracção retardada de iões, a trabalhar em modo positivo e em modo reflector, com uma tensão eléctrica de aceleração igual a 20 kV. Foi feita uma ponderação de cento e vinte e oiro varrimentos. Foram atribuídas estruturas oligossacarídicas complexas biantenais a cinco picos associados a HexNAc. Nunca foram encontrados oligossacarídeos ligados a N, triantenais e não bissectados, que são a alternativa aos cinco isómeros que contêm HexNAc, na região Fc das IgG, e as suas sínteses são catalisadas pelas glicosil-transferases distintas de GnT III.

Ensaio de actividade de ADCC. Mediu-se a lise de células do neuroblastoma humano IMR-32 (objecto) por acção dos linfócitos humanos (efector), para uma proporção entre objecto:efector igual a 1:19, durante 16 horas de incubação a 37°C na presença de concentrações diferentes de amostras de chCE7, pela retenção de um corante fluorescente. Kolber et al., 1988, J. Immunol. Methods 108: 255-264. As células de IMR-32 foram marcadas com o corante fluorescente identificador calceína AM durante 20 minutos (concentração final igual a 3,3 μΜ) . As células marcadas (80 000 células / cavidade) ficaram a incubar durante 1 hora com concentrações diferentes de anticorpo CE7. Depois foram acrescentadas células mononucleares (1 500 000 células / cavidade), sem monócitos, e manteve-se a mistura de células a incubar durante 16 horas a 59 37 °C numa atmosfera contendo 5% de CO2. Deitou-se fora o sobrenadante e efectuou-se a lavagem das células uma vez com HBSS e efectuou-se a citólise em Triton X-100 (0,1%). Mediu-se a retenção do corante fluorescente nas células de IMR-32, utilizando um fluorómetro (Perkin Elmer, Luminscence Spectrometer LS 50B), (Foster City, CA) e calculou-se a citólise específica relativamente a uma contraprova de lise total, resultante da exposição das células destinatárias (objecto) a um detergente, em vez da exposição ao anticorpo. Ao sinal existente na ausência do anticorpo foi atribuído o valor de 0% de citotoxicidade. Analisou-se em triplicado a concentração de cada anticorpo e repetiu-se a experiência três vezes, separadamente. 2. Resultados e discussão

Produção de chCE7 em células de CHO que expressam níveis diferentes de GnT III. Foram construídos vectores de expressão das cadeias pesada e leve de chCE7, incorporando as sequências do promotor de citomegalovírus humano (hCMV), da terminação da hormona do crescimento de bovinos e de poliadenilação, e eliminando os intrãos das cadeias pesada e leve. Esta concepção do vector baseou-se em documentos respeitantes à expressão reproduzível com nível intenso de genes de IgG recombinante em células de CHO. Reff et al., 1994, supra; Trill et al. , 1995, Current Opinion Biotechnol. _6:553-560. Além disso, introduziu-se em cada cadeia um único dos locais de restrição, na junção entre as regiões variável e constante. Estes locais conservam a grelha de leitura e não alteram a sequência de aminoácidos. Têm de permitir uma troca simples das regiões variáveis do 60 murganho, para a produção de outros anticorpos quiméricos de murganho-seres humanos. Reff et ai., 1994, supra. A sequenciação de ADN confirmou que os genes desejados estavam correctamente montados, tendo a produção do anticorpo quimérico em células de CHO transfectadas sido verificada pelo protocolo de ensaio ELISA para a região Fc humana.

Foram criadas células de CHO-tet-GnTIIIm-chCE7 com expressão de GnT III estável e regulada pela tetraciclina e com expressão estável e constitutiva de chCE7, tendo sido depois aumentadas em número para a produção de um conjunto de amostras de chCE7. Durante o período em que se aumentou o seu número, foram produzidas quatro culturas paralelas obtidas a partir do mesmo clone de CHO, cada uma delas com uma concentração diferente de tetraciclina, diferindo por isso apenas em termos de nível de expressão do gene de GnT III. Este procedimento elimina todos os efeitos clonais originados por outras variáveis que afectem a biossíntese de glicoformas ligadas a N, permitindo definir uma correlação rigorosa entre a expressão do gene de GnT III e a actividade biológica do anticorpo glicosilado. A concentração da tetraciclina variou entre 2000 ng/mL, isto é, o nível básico de expressão de GnT III, e 15 ng/mL, valor para o qual se observou uma inibição significativa do crescimento e toxicidade devida à sobreexpressão de glicosil-transferase (ver, supra). Na realidade, apenas foi possível recuperar, a partir desta última cultura, uma pequena quantidade de anticorpos. Com o segundo nível mais elevado de expressão de GnT III, utilizando a tetraciclina com uma concentração de 30 ng/mL, observou-se apenas uma inibição moderada do crescimento. A quantidade de anticorpo 61 purificado, obtida a partir desta cultura, foi aproximadamente 70% do valor obtido com os outros dois niveis menores de sobreexpressão do gene de GnT III.

As quatro amostras de anticorpos, CE7-2000t, -60t, -30t e -15t, em que os números indicam as concentrações de tetraciclina que lhes estão associadas, foram purificadas por cromatografia de afinidade sobre Proteína A e com permuta do tampão para PBS, utilizando uma coluna de permuta de catiões. A pureza foi superior a 95%, conforme se concluiu pelo protocolo de ensaio SDS-PAGE com o corante azul de Coomassie. Os ensaios de ligação às células do neuroblastoma humano revelaram uma afinidade elevada para as células e não foram observadas nenhumas diferenças significativas na ligação do antigénio, entre as diferentes amostras (as constantes de dissociação em equilíbrio que foram estimadas estavam compreendidas entre 2,0 e 2,7 x 10“10 M) . Era isto que se previa, uma vez que não há nenhuns locais potenciais de glicosilação ligada a N nas regiões variáveis de CE7.

Distribuições dos oligossacarídeos e níveis de oligossacarídeos complexos bissectados de diferentes amostras de chCE7. Os perfis oligossacarídicos foram obtidos por espectrometria de massa por ionização/dessorção da matriz, auxiliadas por laser, num instrumento de medida do período de duração da análise (MALDI/TOF-MS) . As misturas de oligossacarídeos neutros ligados a N, provenientes de cada uma das quatro amostras de anticorpos produzidos por CHO, e dos provenientes de uma amostra de chCE7 derivada do mieloma de murganho SP2/0 (CE7-SP2/0) foram analisadas utilizando como matriz o ácido 2,5-desidrobenzóico (2,5-DHB) (FIGURA 9). Nestas condições, os 62 oligossacarídeos neutros aparecem essencialmente sob a forma de iões singulares [M + Na+] , acompanhados por vezes por iões mais pequenos [M + K+] , dependendo isso do teor em potássio existente na matriz. Bergweff et ai., 1995, Glycoconjugate J. 12:318-330.

Este tipo de análise permite obter simultaneamente as proporções relativas de oligossacarídeos neutros com massas diferentes, estando isso reflectido na altura dos picos relativos, e a composição monossacaridica isobárica de cada pico. Kuster et al., 1997, supra; Naven e Harvey, 1996, Rapid Commun. Mass Spectrom. 10:1361-1366. Aos diferentes picos são atribuídas estruturas, por tentativas, com base na composição monossacaridica, no conhecimento da via biossintética e também em dados estruturais anteriores para oligossacarídeos obtidos a partir da mesma glicoproteína produzida pelo mesmo hospedeiro, uma vez que a estrutura proteínica e o tipo de célula podem ter uma forte influência sobre a distribuição dos oligossacarídeos. Field et ai., 1996, Anal. Biochem. 239:92-98. No caso dos oligossacarídeos associados a Fc, apenas os oligossacarídeos complexos biantenais foram detectados nas IgG presentes no soro humano

ou produzidas por culturas de células de mamíferos em condições normais. Wormald et ai., 1997, Biochemistry 36:1370-1380; Wright e Morrison, 1997, Tibtech 15:26-31. A via de síntese que conduz a estes compostos está ilustrada na FIGURA 10, onde estão incluídas as massas do ião [M + Na+] correspondente a cada oligossacarídeo. Também foram detectados oligossacarídeos com elevado teor em manose, nos anticorpos produzidos nas fases estacionária e final das culturas de células nos lotes. Yu Ip et al., 1994, Arch. Biochem. Biophys. 308:387-399. 63

Os dois picos principais na amostra de CE7-SP2/0 (FIGURA 9A) correspondem às massas de oligossacarideos fucosilados com quatro N-acetil-hexosaminas (HexNAc) contendo três (m/z 1486) ou quatro (m/z 1648) hexoses. Ver a FIGURA 10, mas ter em consideração o facto de a notação abreviada para os oligossacarideos nesta figura ignorar os dois GlcNAc centrais. Esta composição é consistente com estruturas oligossacaridicas complexas biantenais fucosiladas no centro, que não contêm nenhum resíduo de galactose ou que contêm apenas um, respectivamente, típicas dos oligossacarideos associados a Fc e, conforme anteriormente observado em análises por NMR, típicas de oligossacarideos associados a Fc e derivados de uma IgGl quimérica expressa em células de SP2/0. Bergweff et al., 1995, supra. A transferência de uma GlcNAc bissectora, catalisada por GnT III, para estes compostos biantenais, que são os aceitadores preferenciais de GnT III, poderia proporcionar oligossacarideos com cinco HexNAc (m/z 1689 e 1851, respectivamente não galactosilados e monogalactosilados, FIGURA 10), que estão nitidamente ausentes na amostra de CE7-SP2/0. Os últimos picos referidos aparecem quando o chCE7 é expresso em células de CHO-tet-GnTIIIm. Nos anticorpos expressos em CHO, os quatro picos que contêm HexNAc também estão essencialmente fucosilados, embora seja evidente uma pequena quantidade de estruturas não fucosiladas, a partir do pico correspondente ao valor m/z 1339 (ver a FIGURA 10). O nível de galactosilação também não é muito diferente entre o material derivado de CHO e o derivado de SP2/0. Ao nível básico de expressão de GnT III (amostra de CE7-2000t, FIGURA 9B) , as moléculas com cinco 64

HexNAc encontram-se presentes numa proporção inferior às que possuem quatro HexNAc. Um nivel mais elevado de expressão de GnT III (amostra de CE7-60t, FIGURA 9C) conduz a uma inversão das proporções a favor dos oligossacarideos com cinco HexNAc. Com base nesta tendência, é possível atribuir estruturas oligossacarídicas complexas biantenais e bissectadas aos compostos que tenham cinco HexNAc nestas amostras. Os oligossacarideos triantenais ligados a N, que são os isómeros alternativos que contêm cinco HexNAc, nunca antes haviam sido observados na região Fc das IgG e as suas sínteses são catalisadas por GlcNAc-transferases distintas da GnT III.

Um outro aumento na expressão de GnT III (amostra de CE7-30t, FIGURA 9D) não conduziu a nenhuma modificação significativa nos níveis de oligossacarideos complexos bissectados. Aparece um outro pico (m/z 1543) que contém cinco HexNAc para um nível baixo, mas relativamente constante, nas amostras de CHO-GnTIII e a sua massa corresponde à massa de um oligossacarídeo complexo, bissectado e não fucosilado (FIGURA 10) . Os picos mais pequenos para os valores m/z 1705 e 1867, correspondem também a cinco oligossacarideos complexos biantenais que contêm cinco HexNAc. Podem ser atribuídos quer a uma adução de potássio, com os picos a valores de m/z 1689 e 1851 (a diferença de massa é igual a 16 Da relativamente à adução de sódio) (Kuster et al., 1997, supra) quer a oligossacarideos complexos, bissectados e bigalactosilados, sem fucose (FIGURA 10) . Conjuntamente, a quantidade de oligossacarideos complexos bissectados corresponde aproximadamente a 25% do valor total existente na amostra 65 de CE7-2000t e vai aproximadamente até 45-50% nas amostras de CE7-60t e CE7-30t.

Informação suplementar proveniente dos perfis oligossacarídicos de amostras de chCE7. Embora os níveis de oligossacarídeos complexos bissectados não fossem superiores na amostra de CE730t, uma maior expressão de GnT III continuou realmente a reduzir, embora com pequena intensidade, as proporções entre os substratos de oligossacarídeos complexos biantenais. Isto foi acompanhado por aumentos moderados em dois picos diferentes que contêm quatro HexNAc (m/z 1664 e 1810) . Estes dois últimos picos podem corresponder quer a oligossacarídeos complexos biantenais galactosilados quer a compostos híbridos bissectados (FIGURA 11). Também é possível uma combinação das duas classes de estruturas. O aumento relativo neste pico é consistente com a acumulação de subprodutos híbridos bissectados, da sobreexpressão de GnT III. Na realidade, a amostra produzida ao nível mais elevado de sobreexpressão de GnT III, a CE7-15t, revelou um grande aumento no pico para o valor m/z 1664, uma redução no pico para o valor m/z 1810 e uma redução concomitante de oligossacarídeos bissectados complexos, para um nível aproximadamente igual a 25%. Ver os picos com os valores m/z 1689 e 1851 na FIGURA 9E e as correspondentes estruturas na FIGURA 11. Uma maior acumulação de subprodutos híbridos bissectados não fucosilados (m/z 1664), em vez dos fucosilados (m/z 1810), estaria em conformidade com o facto de os oligossacarídeos que são modificados em primeiro lugar pela GnT III deixarem de poder ser substratos biossintéticos para a OCl, 6-fucosil- 66 transferase central. Schachter, 1986, Biochem. Cell Biol. 64:163-181. 0 pico correspondente ao valor m/z 1257 está presente a um nível de 10-15% do total nas amostras derivadas de CHO e com um nível menor na amostra CE7-SP2/0 (FIGURA 9) . Corresponde a cinco hexoses mais duas HexNAc. A única estrutura conhecida de oligossacarídeos ligados a N com esta composição é um composto de tipo alto teor em manose, gue contém cinco resíduos manose. Um outro oligossacarídeo de alto teor em manose, um composto com seis resíduos manose (m/z 1420), também se encontra presente com níveis muito inferiores. Conforme se disse anteriormente, tais oligossacarídeos foram detectados na região Fc das IgG expressas na última fase das culturas de células em lotes. Yu Ip et al., 1994, supra.

Citotoxicidade celular dependente de anticorpos em amostras de chCE7. A amostra de ChCE7 revela alguma actividade de ADCC, medida pela lise in vitro de células do neuroblastoma pelos linfócitos humanos, guando expressa em células de CHO-tet-GnTIIIm com o nível mínimo de sobreexpressão de GnT III (FIGURA 12, amostra CE7-2000t). O aumento do nível de GnT III produziu um grande aumento de actividade de ADCC (FIGURA 12, amostra CE7-60t). Um aumento da sobreexpressão de GnT III não foi acompanhado por nenhuma aumento suplementar de actividade (FIGURA <N i—1 amostra CE7-30t) e o nível mais elevado de expressão conduziu, realmente, a uma ADCC reduzida (FIGURA 12, amostra CE7-15t). Para além de manifestar as mais elevadas actividades de ADCC, ambas as amostras de CE7-60t e CE7-30t apresentaram níveis significativos de citotoxicidade para concentrações de anticorpos muito peguenas. Estes 67 resultados demonstram que há um intervalo óptimo de sobreexpressão de GnT III em células de CHO para a actividade de ADCC e a comparação com os perfis oligossacaridicos mostra que a actividade está correlacionada com o nivel de oligossacarideos complexos bissectados, associados a Fc.

Dada a importância dos oligossacarideos complexos bissectados para a actividade de ADCC, considera-se que seria útil manipular a via de sintese para aumentar ainda mais a proporção destes compostos. A sobreexpressão de GnT III para níveis que se aproximem dos que são utilizados com a amostra de CE7-30t está contida no intervalo prático, sob o ponto de vista biotecnológico, em que não se observa nenhuma toxicidade nem nenhuma inibição de crescimento significativas. A este nível de expressão, os oligossacarideos complexos biantenais não bissectados e não galactosilados, isto é, os substratos de GnT III potenciais preferidos, são reduzidos para menos de 10% do total. Ver pico m/z 1486, FIGURA 9D. No entanto, apenas 50% são convertidos em estruturas complexas biantenais bissectadas desejadas. A parte restante, ou é transformada em subprodutos oligossacaridicos híbridos bissectados ou é consumida pela enzima competidora βΐ,4-galactosil-transferase, GalT (FIGURA 11) ·

A resolução dos picos oligossacaridicos complexos galactosilados híbridos, bissectados e não bissectados, por análises estruturais complementares, poderia determinar quanto é consumido por cada via indesejada potencial. O aumento dos picos m/ z 1664 e 1810, a níveis elevados de sobreexpressão de GnT III, sugere que há pelo menos uma fracção destes picos que corresponde a oligossacarideos híbridos bissectados (FIGURA 11). Em teoria, é possível 68 reduzir um fluxo orientado para os compostos híbridos bissectados, por co-sobreexpressão de enzimas precocemente na via de síntese, tais como a manosidase II conjuntamente GnT III. Por outro lado, a competição entre GnT III e GalT pelos substratos oligossacarídicos complexos bissectados poderia ser potencialmente enviesada, com propensão para as reacções catalisadas por GnT III, mediante um aumento da concentração de UDP-GlcNAc intra-Golgi, embora realizando a sobreexpressão de GnT III. A GnT III transfere uma GlcNAc do co-substrato UDP-GlcNAc para diferentes oligossacarídeos. Se a concentração do co-substrato de UDP-GlcNAc intra-Golgi fosse subsaturante para GnT III, então o seu aumento, quer por manipulação da composição do meio de cultura quer por manipulação genética do transporte de nucleótidos do açúcar para dentro do Golgi, poderia favorecer a GnT III numa competição, pelos oligossacarídeos, com a GalT.

Fica por determinar se o aumento da actividade de ADCC resulta do aumento simultâneo de oligossacarídeos complexos bissectados, galactosilados e não galactosilados, ou se resulta apenas do aumento de uma destas formas. Ver os picos para os valores m/z 1689 e 1851 na FIGURA 9. Concluiu-se que os oligossacarídeos biantenais complexos bissectados e galactosilados são as estruturas óptimas para uma maior actividade de ADCC, pelo que uma maximização da fracção destes compostos na região Fc necessitaria da sobreexpressão simultânea de GnT III e de GalT. Dado 0 cenário competitivo anteriormente descrito, os níveis de expressão dos dois genes teriam de ser cuidadosamente regulados. Além disso, seria vantajoso tentar redistribuir a GalT sobreexpressa, tanto quanto possível, orientando-a para TGN em vez da cisterna trans-Golgi. Esta última 69 estratégia pode ser executada trocando as sequências de GalT, que codificam a região transmembranar, pelas de a2,6-sialil-transferase (Chege e Pfeffer, 1990, J. Cell. Biol. 111:893-899). D. Exemplo 4: manipulação da glicosilação do anticorpo monoclonal C2B8 anti-CD20 O anticorpo C2B8 é um anticorpo quimérico anti-CD20 dos seres humanos, Reff, M.E. et al.r 1994, supra. Recebeu a aprovação da FDA em 1997 e está presentemente a ser utilizado com o nome comercial 'RituxanTM', para o tratamento de linfomas de tipo não Hodgkin nos estados Unidos da América do Norte. É obtido a partir de uma cultura de células de CHO e por tal motivo não deve ser portador de oligossacarídeos bissectados. Ver supra. Com o intuito de se produzir uma versão aperfeiçoada deste anticorpo, aplicou-se o processo anteriormente demonstrado para o anticorpo chCE7 anti-neuroblastoma. Ver supra. O anticorpo C2B8, modificado de acordo com o processo descrito, tinha uma actividade de ADCC superior à do anticorpo C2B8 normal não modificado, em condições idênticas de cultura das células e da sua purificação. 1. Materiais e métodos

Sintese das regiões das cadeias leve variável e pesada variável do anticorpo monoclonal quimérico (C2B8) anti-CD20. Os genes de VH e de VL do anticorpo C2B8 foram montados sinteticamente, utilizando um conjunto de oligonucleótidos (iniciadores) de cadeia singular em sobreposição, num processo de um só passo, utilizando a 70 metodologia de PCR, Kobayashi et al., 1997, Biotechniques 23: 500-503. Os dados respeitantes à sequência que codifica as regiões variáveis das cadeias leve e pesada da imunoglobulina do murganho (respectivamente VL e VH) do anticorpo anti-CD20 fora obtidas a partir de um pedido de patente de invenção internacional já publicado (publicação internacional com o número WO 94/11026) . Os fragmentos de ADN montados foram subclonados no pBluescriptIIKS ( + ) e sequenciados mediante a pratica de um ciclo de sequenciação de ADN, para se verificar que não tinham sido introduzidas nenhumas mutações.

Construção de vectores para expressão do anticorpo monoclonal quimérico (C2B8) anti-CD20. As regiões codificadoras de VH e VL do anticorpo monoclonal C2B8 foram subclonadas respectivamente em pchCE7H e pchCE7L. Na subclonagem, as sequências codificadoras das cadeias pesada e leve variáveis do anti-neuroblastoma CE7 (ver supra) foram substituídas pelas regiões de cadeias pesada variável e leve variável do C2B8, montadas por via sintética.

Geração de células de CHO-tet-GnTIIIm que expressam o anticorpo C2B8. O processo para gerar uma linhagem de células de CHO-tet-GntIIIm que expressam o anticorpo C2B8 foi exactamente o mesmo utilizado para CHO-tet-GnTIIIm-CE7. Ver supra. O clone escolhido para trabalhos suplementares foi designado por CHO-tet-GnTIIIm-C2B8.

Geração de CHO-tTA que expressa o anticorpo C2B8. A linhagem celular CHO-tTA é a precursora da linhagem celular CHO-tet-GnTIIIm. Ver supra. O processo para gerar a linhagem celular CHO-tTA que expressa o anticorpo C2B8 sem expressão de GnT III foi exactamente o mesmo utilizado para CHO-tet-GnTIIIm-C2B8 e CHO-tet-GnTIIIm-chCE7. Ver supra. O 71 clone escolhido para trabalhos suplementares recebeu a designação de CHOtTA-C2B8.

Produção de amostras de anticorpos C2B8. Foram obtidas duas amostras de anticorpos C2B8 em culturas paralelas de CHO-tet-GnTIIIm-C2B8; cada cultura continha concentrações diferentes de tetraciclina e por isso era previsível a expressão de níveis diferentes de GnT III. As concentrações de tetraciclina foram 2000, 50 e 25 ng/mL. As amostras de anticorpos C2B8 obtidas a partir destas culturas foram designadas respectivamente por C2B8-2000t, C2B8-50t e C2B8-25t. Em paralelo, preparou-se uma amostra de um anticorpo (C2B8-nt) a partir de uma cultura de CHO-tTA-C2B8, sabendo-se que esta linhagem celular não expressa GnT III. As células de CHO-tTA-C2B8 foram criadas em cultura sem tetraciclina.

Análise da expressão de GnT III. Para as análises de GnT III por "western blot", efectuou-se a resolução dos lisados celulares de cada uma das culturas de produção, pelo protocolo de SDS-PAGE, tendo a transferência por electroabsorção sido feita para membranas de difluoreto de polivinilideno. Utilizou-se o anticorpo monoclonal 9E10 anti-c-myc e a peroxidase de Armoracia rusticana anti IgG de murganho (Amersham, Arlington, IL), respectivamente como anticorpos primários e secundários. Detectou-se o anticorpo ligado, utilizando um estojo de quimioluminescência intensificada (Amersham, Arlington, IL).

Purificação de amostras de anticorpos C2B8. As amostras de anticorpos foram purificadas utilizando o mesmo processo utilizado para as amostras de anticorpos chCE7. Ver supra. Mediu-se a concentração utilizando um estojo à 72 base de fluorescência da 'Molecular Probes' (Leiden, The Holanda).

Verificação da ligação do antigénio específico de C2B8. Verificou-se a especificidade de ligação do antigénio do anticorpo monoclonal C2B8 anti-CD20, recorrendo a um ensaio de imunofluorescência indirecta, com células em suspensão. Para o estudo foram utilizadas células positivas ao CD20 (células SB; depósito na ATCC com o n° ATCC CCL 120) e células negativas ao CD20 (células HSB; depósito na ATCC com o n° ATCC CCL 120.1). As células de cada tipo ficaram a incubar com o anticorpo C2B8 produzido com uma concentração de tetraciclina igual a 25 ng/mL, enquanto anticorpo primário. As contraprovas negativas continham HBSSB, em vez do anticorpo primário. Utilizou-se um anticorpo policlonal conjugado com FITC, anti-IgG humana, especifico para a Fc, para todas as amostras, enquanto anticorpo secundário (SIGMA, St. Louis, MO). As células foram examinadas utilizando um microscópio de fluorescência 'Leica' (Bensheim, Alemanha).

Ensaio de actividade de ADCC. Efectuou-se a lise de células SB (CD20 + células destinatárias; depósito na ATCC com o n° ATCC CCL 120), por acção das células mononucleares (células efectoras) do sangue periférico humano, desprovidas de monócitos, na presença de concentrações diferentes de amostras de C2B8, executando basicamente o mesmo procedimento descrito por Brunner et al., 1968, Immunology 14:181-189. A razão entre células efectoras e células destinatárias foi de 100:1. 2. Resultados e discussão 73 A GnT III é expressas com níveis diferentes em diferentes linhagens celulares e culturas. Efectuou-se a lise de células de culturas paralelas de CHO-tet-GnTIIIm-C2B8, em que cada cultura continha concentrações diferentes de tetraciclina (2000, 50 e 25 ng/mL) , sendo por isso previsível que ocorresse a expressão de GnT III com níveis diferentes, tendo a resolução dos lisados celulares sido efectuada pelo protocolo de SDS-PAGE, com detecção pela metodologia de "western blot". Os lisados da cultura produzida com uma concentração de tetraciclina igual a 25 ng/mL revelaram uma banda intensa para o valor do peso molecular correspondente a GnT III, ao passo que as culturas produzidas com as concentrações de 50 e 2000 ng/mL manifestaram muito menos expressão de GnT III, conforme se observa na FIGURA 13.

Verificação da ligação do antigénio específico de C2B8. As amostras de C2B8 produzidas a partir de culturas paralelas de células que expressam níveis diferentes de GnT III foram purificadas a partir dos sobrenadantes das culturas, por cromatografia de afinidade e substituição do tampão por PBS numa coluna de permuta de catiões. Estimou-se que a pureza era superior a 95%, pelo protocolo de SDS-PAGE com coloração com o corante azul de Coomassie, em condições redutoras. Estas amostras de anticorpos foram obtidas a partir da expressão dos genes de anticorpos cujas regiões variáveis foram sintetizadas por meio de um método de montagem por PCR. A sequenciação dos fragmentos sintéticos de ADNc revelou que não havia diferenças nenhumas em relação às sequências da região variável do C2B8 original, já anteriormente publicadas num pedido de patente de invenção internacional (número de publicação 74 internacional WO 94/11026). A ligação especifica das amostras às CD20 humanas, que constituem os antigénios destinatários dos C2B8, foi demonstrada por imunofluorescência indirecta, utilizando uma linhagem de células linfoblastóides humanas SB que expressam as CD20 sobre a sua superfície, e uma linhagem de células linfoblastóides HSB às quais lhes falta este antigénio. As amostras de anticorpos C2B8-25t deram origem a uma coloração positiva das células SB (FIGURA 14A), o mesmo não acontecendo com as células HSB em condições experimentais idênticas (ver a FIGURA 14B). Fez-se uma experiência suplementar com contraprova negativa constituída por células SB incubadas com tampão PSB, em vez do anticorpo C2B8-25t. Não foi observada nenhuma coloração.

Actividade ADCC de amostras C2B8 in vitro. A amostra de anticorpos C2B8-nt expressos em células de CHO-tTAC2B8, em que não há realmente expressão de GnT III (ver supra) , demonstrou 31% de actividade citotóxica (para uma concentração de anticorpos igual a 1 pg/mL), medida pela lise de células SB (CD20+) in vitro, efectuada pelos linfócitos humanos (FIGURA 15, amostra C2B8-nt). O anticorpo C2B8-2000t, obtido a partir de uma cultura de CHO-tet-GnTIII, produzida com presença de tetraciclina numa concentração de 2000 ng/mL (isto é, ao nível básico de expressão da GnT III clonada) , revelou, para uma concentração de anticorpos igual a 1 pg/mL, um aumento de 33% na actividade de ADCC, comparativamente com a amostra de C2B8-nt, para a mesma concentração de anticorpos. A redução da concentração da tetraciclina para 25 ng/mL (amostra C2B8-25t), o que faz aumentar significativamente a expressão de GnT III, produziu um grande aumento de quase 75 80% na actividade máxima de ADCC (para uma concentração de anticorpos igual a 1 pg/mL), comparativamente com a amostra de anticorpos C2B8-nt, para a mesma concentração de anticorpos (FIGURA 15, amostra C2B8-25t).

Para além de manifestar a mais levada actividade de ADCC, os anticorpos C2B8-25t revelaram níveis significativos de citotoxicidade para concentrações de anticorpos muito pequenas. A amostra de C2B8-25t, para uma concentração de 0,06 pg/mL, revelou uma actividade de ADCC semelhante à actividade máxima de ADCC verificada com C2B8-nt com uma concentração de 1 pg/mL. Este resultado demonstrou que a amostra C2B8-25t, para uma concentração de anticorpos 16 vezes menor, alcançou a mesma actividade de ADCC conseguida pelo C2B8-nt. Este resultado indica que o anticorpo quimérico C2B8 anti-CD20, produzido numa linhagem de células que expressam activamente GnT III, foi significativamente mais activo do que o mesmo anticorpo produzido numa linhagem de células que não expressam GnT III.

Uma vantagem deste anticorpo, utilizando os processo da invenção, reside no facto de (1) ser necessário injectar doses menores de anticorpos para se conseguir o mesmo efeito terapêutico, daí resultando um impacto benéfico em termos de economia na produção de anticorpos, ou (2) o facto de a utilização da mesma dose de anticorpos permitir obter um melhor efeito terapêutico.

E. Exemplo 5: criação de linhagens de células de CHO com expressão constitutiva de genes de glicosil-transferases com níveis óptimos que conduzem à actividade máxima de ADCC

Em algumas aplicações do processo para aumentar a ADCC, pode ser desejável recorrer à expressão de GnT III 76 constitutiva em vez de regulada, por si só ou conjuntamente com outras glicosil-transferases e/ou glicosidases clonadas. No entanto, os inventores demonstraram que a actividade de ADCC do anticorpo modificado depende do nível de expressão de GnT III. Ver supra. Assim sendo, é importante seleccionar um clone com expressão constitutiva de GnT II por si só ou conjuntamente com outros genes de glicosil-transferases e/ou glicosidases, a níveis óptimos ou próximos de valores óptimos. Em primeiro lugar, os níveis óptimos de expressão de GnT III, por si só ou conjuntamente com outras glicosil-transferases, tais como β(1,4)-galactosil-transferase (GalT), são determinados utilizando linhagens de células com expressão regulada das glicosil-transferases. São então pesquisados os clones estáveis com expressão constitutiva de GnT III e de quaisquer outras glicosil-transferases clonadas, para procurar níveis de expressão próximos do valor óptimo. 1. Determinação de niveis de expressão quase óptimos Construção de um vector para a GnT II regulada

Expressão ligada à expressão de GFP. Cada gene de glicosil-transferase está ligado, através de uma sequência de IRES a um gene repórter que codifica uma proteína retida na célula, por exemplo, a proteína fluorescente verde (GFP) ou uma proteína da membrana do plasma marcada com um péptido que pode ser reconhecido por anticorpos disponíveis. No caso de se testar mais do que uma glicosil-transferase, associa-se um marcador diferente a cada glicosil-transferase, por exemplo, a GnT III pode ficar associada a GFP e a GalT pode ficar associada à proteína 77 fluorescente azul (BFP). Em primeiro lugar monta-se, executando passos convencionais de subclonagem e/ou PCR, uma cassete de expressão eucariótica constituída pelo ADNc de GnT III a montante de um elemento de IRES a montante do ADNc de GFP. Esta cassete é depois subclonada no vector de expressão pUHD10-3 regulado pela tetraciclina (ver supra), a jusante do promotor tet e a montante das sequências de terminação e de poliadenilação, de que resulta o vector pUHDl0-3-GnTIII-GFP.

Criação de células de CHO com expressão de GnT III regulada, ligada à expressão de GFP e ao anticorpo chCE7 constitutivo. As células de CHO-tTA (ver supra), que expressam o transactivador que reage à tetraciclina, são co-transfectadas com o vector pUHD10-3-GnTIII-GFP e com o vector pPur para expressão de um gene de resistência à puromicina. Ver supra. Os clones resistentes à puromicina são seleccionados na presença de tetraciclina. Os clones individuais são criados em cultura para serem duplicados na presença (2 pg/mL) ou na ausência de tetraciclina. São seleccionados seis clones que revelam inibição de crescimento na ausência de tetraciclina, devido à sobreexpressão da glicosil-transferase (ver supra), sendo analisados por meio de um seleccionador celular activado pela fluorescência (FACS), para detecção do sinal associado à GFP. Para trabalhos subsequentes escolheu-se um clone que origina o mais elevado índice de indução, definido como sendo a razão entre a fluorescência na ausência de tetraciclina e a fluorescência na presença de tetraciclina, tendo recebido a designação de CHO-tet-GnTIII-GFP. Os clones CHO-tet-GnTIII-GFP são transfectados com vectores de expressão para o anticorpo chCE7, sendo seleccionado um 78 clone com elevada expressão constitutiva deste anticorpo, designado por CHO-tet-GnTIII-GFP-chCE7. Ver supra.

Produção de amostras de chCE7, medição da actividade de ADCC e determinação dos níveis óptimos de expressão de GnT III. Foram desenvolvidas culturas paralelas de CHO-tet-GnTIII-GFP-chCE7 com concentrações diferentes de tetraciclina, expressando consequentemente GnT III conjuntamente com GFP a níveis diferentes. As amostras de anticorpos chCE7 foram purificadas, a partir dos sobrenadantes das culturas, por cromatografia de afinidade. Em simultâneo, as células de cada cultura foram analisadas por FACS para se determinar o nível médio de fluorescência associada à GFP, que está correlacionada com o nível de expressão de GnT III de cada cultura. Determina-se a actividade de ADCC in vitro para cada amostra de anticorpos chCE7 (ver supra) e traça-se um gráfico da actividade de ADCC in vitro de cada amostra, em função da fluorescência média das células utilizadas para a produzir. 2. Criação de uma linhagem de células de CHO com expressão de GnT III constitutiva a níveis próximos do valor óptimo

Efectua-se a subclonagem da cassete de GnT III-IRES-GFP (ver supra) num vector de expressão constitutiva. As células de CHO são estavelmente co-transfectadas com este vector e com um vector que confere resistência à puromicina. Efectua-se a selecção das células resistentes à puromicina. Esta população de células, estavelmente transfectadas, é depois classificada por FACS, sendo seleccionados os clones que expressam os níveis do gene de GFP repórter, no intervalo ou próximo do intervalo em que se encontra a actividade de ADCC óptima ou próxima do valor 79 óptimo. Ver supra. 0 passo final de transfecção pode ser realizado quer sobre células de CHO, que já expressam estavelmente um anticorpo terapêutico, quer sobre células de CHO vazias, por exemplo, células DUKX ou DG44-dhfr-CHO. Neste último caso, os clones obtidos em conformidade com o procedimento descrito anteriormente irão ser transfectados com vectores de expressão de anticorpos terapêuticos com o intuito de se gerar as linhagens de células finais produtoras de anticorpos F. Exemplo 6: expressão de uma quimera de Fc de IgG humana sobre a superfície celular com glicosilação optimizada A terapia com células encapsuladas está presentemente a ser experimentada em diversas doenças. Constrói-se um implante de células encapsuladas para ser colocado cirurgicamente dentro do corpo para lhe administrar uma substancia terapêutica desejada, directamente onde for necessária. No entanto, se o dispositivo encapsulado tiver uma falha mecânica depois de ter sido implantado, as células podem escapar e tornar-se indesejáveis. Uma maneira de destruir no corpo as células indesejáveis que escaparam é através de um mecanismo citotóxico celular mediado por Fc. Para o efeito, as células que irão ser encapsuladas podem ser manipuladas para expressarem uma proteína de fusão ancorada à membrana do plasma, feita de um domínio transmembranar de tipo II, que se localiza na membrana do plasma, fundida com o terminal N de uma região Fc. Stabila, P.F., 1998, supra. As células contidas dentro da cápsula são protegidas por essa cápsula contra a citotoxicidade celular mediada por Fc, ao passo que as células que 80 escaparam ficam acessíveis para destruição pelos linfócitos que reconhecem as regiões Fc apresentadas à superfície, isto é, através de um mecanismo de citotoxicidade celular mediada por Fc. Este exemplo ilustra o modo como a actividade de citotoxicidade celular mediada por Fc é reforçada por manipulação da glicosilação das regiões Fc apresentadas.

1. Criação de células que expressam a quimera de Fc sobre a sua superfície e que expressam GnT III

Em primeiro lugar, as células que irão ser implantadas para uma terapia particular, por exemplo, células do rim do criceto bebé (BHK) , que produzem já a quimera Fc apresentada na superfície e uma proteína terapêutica segregada, são transfectadas com um vector para a expressão constitutiva de GnT III ligado através de um elemento de IRES à expressão de GFP. Ver supra. Os transfectantes estáveis são seleccionados por meio de um marcador incorporado no vector, por exemplo, por meio de um marcador de resistência ao fármaco, sendo seleccionadas para sobreviverem na presença do fármaco. 2. Pesquisa de células que expressam níveis diferentes de GnT III e medição

Os transfectantes estáveis são analisados por selecção celular activada pela fluorescência (FACS) e selecciona-se um conjunto de clones com níveis diferentes de

fluorescência média para estudos posteriores. Cada clone seleccionado é criado em cultura e reanalisado por FACS 81 para se garantir a estabilidade de GFP e, consequentemente, a expressão da GnT III associada. 3. Verificação de niveis diferentes de oligossacarideos complexos bissectados nas regiões Fc apresentadas

As regiões de Fc de três clones com niveis diferentes de fluorescência associada à GFP e os provenientes das células BHK originais não transfectadas com o vector GnTIII-IRES-GFP, são solubilizadas a partir da membrana por meio de um detergente e são depois purificadas por cromatografia de afinidade. Seguidamente, faz-se a remoção dos oligossacarideos que são purificados e analisados pelo protocolo de MALDI-TOF/MS. Ver supra. Os perfis de MALDI-TOF/MS resultantes mostram que as regiões Fc dos clones fluorescentes modificados são portadores de proporções diferentes de oligossacarideos complexos bissectados. 0 perfil do protocolo MALDI, obtido com células não modificadas, não apresenta nenhum pico associado aos oligossacarideos bissectados. 0 clone que é portador dos níveis mais elevados de oligossacarideos complexos bissectados nas regiões Fc apresentadas é seleccionado para trabalhos subsequentes. 4. Ensaio de actividade de citotoxicidade celular mediada por Fc in vitro São então executados simultaneamente dois ensaio de actividade de citotoxicidade celular mediada por Fc. Num dos ensaios, as células destinatárias provêm do clone seleccionado anteriormente. No ensaio realizado 82 paralelamente, as células destinatárias são as células originais que irão ser encapsuladas e que não foram modificadas para expressarem GnT III. 0 ensaio é realizado utilizando o procedimento descrito anteriormente (ver supra), mas na ausência de qualquer anticorpo suplementar, uma vez que as células destinatárias apresentam já regiões Fc. Esta experiência demonstra que a actividade de citotoxicidade celular mediada por Fc, contra as células que expressam GnT III, é maior do que a verificada contra células que não expressam esta glicosil-transferase. 83

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

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Lisboa, 16/04/2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo in vitro ou ex vivo para a produção de um anticorpo recombinante que possui maior citotoxicidade celular mediada por Fc, o qual compreende os passos seguintes: (i) arranjar uma célula hospedeira de mamífero que seja capaz de expressar um anticorpo recombinante que compreenda uma região Fc de IgG contendo oligossacarídeos ligados a N, e modificar geneticamente a célula hospedeira para regular uma maior expressão de uma enzima, pelo menos, seleccionada do conjunto constituído por:: β (1,4) -N-acetil-glucosaminil-transferase III, β (1,4)-N-acetil-glucosaminil-transferase V e manosidase II, alterando assim o padrão de glicosilação do anticorpo; (ii) criar em cultura a célula hospedeira resultante do passo (i) em condições que permitam a produção do referido anticorpo recombinante; e (iii) isolar o referido anticorpo recombinante; em que o referido anticorpo recombinante possui uma proporção maior de resíduos de GlcNAc na região Fc, comparativamente com a proporção de resíduos de fucose e possui uma maior citotoxicidade celular mediada por Fc, comparativamente com o correspondente anticorpo produzido pela mesma célula hospedeira que não tenha sido geneticamente modificada como no passo (i).

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida modificação genética aumenta a expressão da referida, pelo menos uma, enzima. 2

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a, pelo menos uma, enzima referida é β(1,4)-N-acetil-glucosaminil-transferase III.

4. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a, pelo menos uma, enzima referida é a manosidase II.

5. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a, pelo menos uma, enzima referida é β (1,4)-N-acetil-glucosaminil-transferase III e manosidase II.

6. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que é aumentada a expressão da referida β(1,4)-N-acetil-glucosaminil-transferase III.

7. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que é aumentada a expressão da referida manosidase II.

8. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que é aumentada a expressão quer da referida β(1,4)-N-acetil-glucosaminil-transferase III quer da referida manosidase II.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida modificação genética consiste em introduzir na referida célula hospedeira pelo menos um polinucleótido que codifica uma enzima seleccionada do conjunto constituído por β (1,4)-N-acetil-glucosaminil-transferase III, β(1,4)-Ν-acetil-glucosaminil-transferase V e manosidase II.

10. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida célula hospedeira criada em cultura é seleccionada do conjunto constituído por uma célula de CHO modificada por glicosilação, uma célula de BHK modificada por glicosilação, uma célula de NSO modificada por glicosilação e uma célula de SP2/0 modificada por glicosilação. 3

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, em que a referida célula hospedeira é uma célula de CHO modificada por glicosilação.

12. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo recombinante possui uma proporção maior de oligossacarideos não fucosilados na região Fc em consequência da referida modificação, comparativamente com o correspondente anticorpo produzido pela mesma célula hospedeira que não tenha sido modificada.

13. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo recombinante é um anticorpo quimérico.

14. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo recombinante é um anticorpo humanizado.

15. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo recombinante é um fragmento de anticorpo que contém uma região Fc.

16. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo recombinante é uma proteína de fusão que contém uma região Fc de uma imunoglobulina.

17. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo é um anticorpo terapêutico.

18. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo se liga selectivamente a um antigénio expresso por uma célula cancerosa.

19. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal.

20. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que o referido anticorpo é seleccionado do conjunto constituído por uma anticorpo anti-CD20, um anticorpo anti-neuroblastoma humano, um anticorpo anti-carcinoma das células renais humanas, um anticorpo anti-HER2, um 4 anticorpo anti-carcinoma do cólon, do pulmão e da mama humanos, um anticorpo anti-antigénio 17-1A humano, um anticorpo humanizado anti-tumor colorrectal humano, um anticorpo anti-melanoma humano e um anticorpo anti-carcinoma das células escamosas humanas.

21. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a maior parte dos oligossacarídeos ligados a N na referida região Fc do referido anticorpo produzido pela célula hospedeira modificada são bissectados e não fucosilados.

22. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a, pelo menos uma, enzima referida é a GnT III do rato.

23. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a, pelo menos uma, enzima referida é a GnT V humana.

24. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida modificação genética consiste em manipular geneticamente a referida célula hospedeira para que essa célula hospedeira tenha um nivel alterado de expressão de pelo menos uma enzima referida.

25. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida região Fc de IgG contendo oligossacarídeos ligados a N compreende uma região Fc inteira de IgG

26. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo recombinante compreendendo uma região Fc de IgG que contém oligossacarídeos ligados a N compreende um fragmento de IgG com uma região Fc.

27. Processo de acordo com a reivindicação 26, em que o referido fragmento de IgG compreende um domínio CH2.

28. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida célula hospedeira é geneticamente modificada para expressar o referido anticorpo recombinante compreendendo uma região Fc de IgG que contém oligossacarídeos ligados N 5 depois de a referida célula hospedeira geneticamente modificada para regular o expressão de pelo menos uma referida enzima. ter aumento sido da Lisboa 16/04/2010