TW202035447A - 新穎雙特異性促效性4-1bb抗原結合分子 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於新穎雙特異性抗原結合分子，其包含(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中該等Fab片段(a)及(b)彼此融合，且本發明係關於產生此等分子之方法及使用此等分子之方法。

Description

新穎雙特異性促效性4-1BB抗原結合分子
本發明係關於新穎雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中Fab片段(a)及(b)彼此融合。本發明進一步係關於產生此等分子之方法及使用此等分子之方法。
4-1BB (CD137)為TNF受體超家族之成員，已最先鑑別為由T細胞活化誘導表現之分子(Kwon Y.H.及Weissman S.M. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1963-1967)。後續研究證明4-1BB於T淋巴細胞及B淋巴細胞(Snell L.M.等人。(2011) Immunol. Rev. 244, 197-217或Zhang X.等人(2010), J. Immunol. 184, 787-795)、NK細胞(Lin W.等人。(2008), Blood 112, 699-707)、NKT細胞(Kim D.H.等人。(2008), J. Immunol. 180, 2062-2068)、單核球(Kienzle G.及von Kempis J. (2000), Int. Immunol. 12, 73-82或Schwarz H.等人(1995), Blood 85, 1043-1052)、嗜中性白細胞(Heinisch I.V.等人(2000), Eur. J. Immunol. 30, 3441-3446)、肥大細胞(Nishimoto H.等人。(2005), Blood 106, 4241-4248)及樹突狀細胞以及非造血來源之細胞，諸如內皮細胞及平滑肌細胞(Broll K.等人。(2001), Am. J. Clin. Pathol. 115, 543-549或Olofsson P.S.等人。(2008), Circulation 117, 1292-1301)中之表現。4-1BB於不同細胞類型中之表現大部分可由多種刺激信號誘導及驅動，諸如T細胞受體(TCR)或B細胞受體觸發，以及經共刺激分子或促炎性細胞介素受體誘導之信號傳導(Diehl L.等人。(2002), J. Immunol. 168, 3755-3762；von Kempis J.等人。(1997), Osteoarthritis Cartilage 5, 394-406；Zhang X.等人。(2010), J. Immunol. 184, 787-795)。
已知CD137信號傳導刺激IFNγ分泌及NK細胞增殖(Buechele C.等人。(2012), Eur. J. Immunol. 42, 737-748；Lin W.等人。(2008), Blood 112, 699-707；Melero I.等人。(1998), Cell Immunol. 190, 167-172)以及促進DC活化，如由其存活率提高及分泌細胞介素及上調共刺激分子之能力指示(Choi B. K.等人。(2009), J. Immunol. 182, 4107-4115；Futagawa T.等人。(2002), Int. Immunol. 14, 275-286；Wilcox R. A.等人。(2002), J. Immunol. 168, 4262-4267)。然而，CD137最佳表徵為共刺激分子，其調節T細胞之CD4+ 及CD8+ 子集中TCR誘導之活化。與TCR觸發組合，促效4-1BB特異性抗體提高T細胞之增殖、刺激淋巴激素分泌及降低T淋巴細胞對活化誘導之細胞死亡的靈敏度(SnellL.M.等人。(2011) Immunol. Rev. 244, 197-217)。符合4-1BB抗體對T細胞之此等活體外共刺激作用，其向腫瘤攜帶小鼠投與導致許多實驗腫瘤模型中的有效抗腫瘤作用(MeleroI.等人。(1997), Nat. Med. 3, 682-685；NarazakiH.等人。(2010), Blood115, 1941-1948)。活體內消耗實驗證明CD8+ T細胞在4-1BB特異性抗體之抗腫瘤作用中起最關鍵作用。然而，視包括抗4-1BB之腫瘤模型或組合療法而定，已報導其他類型之細胞(諸如DC、NK細胞或CD4+ T細胞)之貢獻(Murillo O.等人。(2009), Eur. J. Immunol. 39, 2424-2436；Stagg J.等人。(2011), Proc. Natl. Acad. Sci. USA108, 7142-7147)。
4-1BB促效抗體之活體內免疫調節特性看起來需要抗體分子上存在野生型Fc部分，由此暗示Fc受體結合為該等試劑之藥理學活性所需的重要事件，如已經針對對TNFR超家族之其他細胞凋亡誘導或免疫調節成員具有特異性之促效抗體所述(Li F.及Ravetch J.V. (2011), Science 333, 1030-1034；Teng M.W.等人。(2009), J. Immunol. 183, 1911-1920)。然而，全身性投與具有功能活性Fc域之4-1BB特異性促效抗體亦誘導與肝毒性相關之CD8+ T細胞之擴展(Dubrot J.等人。(2010), Cancer Immunol. Immunother. 59, 1223-1233)，此在小鼠體內在功能性Fc受體不存在下減弱或顯著改善。
烏瑞魯單抗(Urelumab) (BMS-666513，純系10C7)係結合至4-1BB胞外域之完全人類促效非配位體阻斷單株IgG4抗體。其作為20H4.9-IgG4揭示於美國專利第7,288,638號中。在人類臨床試驗(ClinicalTrials.gov、NCT00309023及NCT00612664)中，每三週一次投與烏瑞魯單抗持續12週誘導患有黑色素瘤、卵巢癌或腎細胞癌之患者的疾病穩定。然而，試驗已終止，因為抗體引起4級肝炎，導致出現兩起肝毒性相關死亡(Simeone E.及Ascierto P.A. (2012), J. Immunotoxicology 9, 241-247)。臨床安全資料之後續詳細分析證明重度轉胺酶升高(transaminitis)之出現主要由給定烏瑞魯單抗之劑量觸發。亦觀測到2+級嗜中性白血球減少症、白血球減少症及血小板減少症。臨床安全資料之後續詳細分析證明重度轉胺酶升高(transaminitis)之出現主要由給定烏瑞魯單抗之劑量觸發。在2012年，烏瑞魯單抗再進入臨床研發，然而在每三週給定＜ 1 mg/kg之劑量條件下使用。當前推薦劑量係每三週給定0.1 mg/kg (N. Segal 等人 (2016), Results From an Integrated Safety Analysis of Urelumab, an Agonist Anti-CD137 Monoclonal Antibody, Clin. Cancer Res., 2016年12月1日線上公開)。鑒於劑量限制性毒性，因此需要改良的對4-1BB具有特異性的抗原結合分子，其應僅作用於腫瘤特異性部位以便避免不可控制的副作用。本發明之雙特異性抗原結合分子將能夠較佳結合至腫瘤特異性或腫瘤相關抗原(靶細胞抗原)之Fab片段與兩個能夠促效結合至4-1BB之Fab片段組合。呈其特異性形式之本發明之雙特異性抗原結合分子可能夠不僅有效地，且極具選擇性地在所要部位觸發4-1BB，由此減少諸如烏瑞魯單抗之習知單特異性抗體已觀測到的非所要副作用。
本發明係關於新穎雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中Fab片段(a)及(b)彼此融合，且本發明係關於產生此等分子之方法及其使用方法。此等雙特異性抗原結合分子係有利的，因為其歸因於其對靶細胞抗原之結合能力將較佳在表現靶細胞抗原之部位活化4-1BB，且減少在體內其他部位之活化，由此避免僅對4-1BB具有特異性之抗體的副作用。其特徵進一步在於其特異性結構特點，諸如兩個分別能夠特異性結合至4-1BB及靶細胞抗原之Fab片段的鄰近度、與4-1BB之二價結合及與靶細胞抗原之單價結合，這使此等雙特異性抗原結合分子非常有效。
在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及 (d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在Fab重鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)之Fab重鏈之N端，該第一Fab片段(a)之Fab重鏈繼而在其C端融合至該第一Fc域子單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域子單元之N端， 且其中在能夠特異性結合至靶細胞抗原之該第二Fab片段中，(i) Fab輕鏈Fab重鏈之可變區VL及VH相互置換，或(ii) Fab輕鏈及Fab重鏈之恆定區CL及CH1相互置換。
在一特定態樣中，提供如本文所述之雙特異性抗原結合分子，其中雙特異性抗原結合分子提供與4-1BB之二價結合及與靶細胞抗原之單價結合。
在另一態樣中，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域為IgG Fc域，特定言之IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。在一個態樣中，在Fc域之第一子單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在第一子單元之CH3域內產生可定位於第二子單元之CH3域內之凹穴中的隆凸，且在Fc域之第二子單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在第二子單元之CH3域內產生第一子單元之CH3域內之隆凸可定位於其中的凹穴。因此，提供雙特異性抗原結合分子，其中根據杵-臼方法，該Fc域之該第一子單元包含杵且該Fc域之該第二子單元包含臼。在一特定態樣中，Fc域之第一子單元包含胺基酸取代S354C及T366W (根據Kabat EU索引編號)且Fc域之第二子單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
在另一態樣中，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中Fc域包含一或多個降低對Fc受體之結合及/或效應子功能之胺基酸取代。在一個態樣中，該一或多個胺基酸取代位於一或多個選自L234、L235及P329 (Kabat EU索引編號)之群的位置。在一個態樣中，Fc域包含一或多個降低該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應子功能的胺基酸取代，特定言之胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。特定言之，Fc受體為Fcγ受體，且/或效應子功能為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
在一個態樣中，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至4-1BB (a)及(c)之第一Fab片段及第三Fab片段一致。在一特定態樣中，本發明提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含：重鏈可變區(VH 4-1BB)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL 4-1BB)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之CDR-L3。
在一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段，其各自包含：重鏈可變區(VH 4-1BB)，其包含與SEQ ID NO:7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL 4-1BB)，其包含與SEQ ID NO:8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。更特定言之，能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之重鏈可變區(VH 4-1BB)及含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL 4-1BB)。
在一個態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中第二Fab片段(b)在Fab重鏈之C端融合至第一Fab片段(a)之Fab重鏈之N端，該第一Fab片段(a)之Fab重鏈繼而在其C端融合至第一Fc域子單元之N端，且第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至第二Fc域子單元之N端，其中在能夠特異性結合至靶細胞抗原之第三Fab片段中，(i)可變域VL及VH相互置換，或(ii)恆定域CL及CH1相互置換，且其中在能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K) ((根據Kabat EU索引編號)取代，且位置123處之胺基酸經精胺酸(R)或離胺酸(K) (根據Kabat EU索引編號)取代，且其中在能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E) (根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E) (根據Kabat EU索引編號)取代。
在一特定態樣中，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中在能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段中，Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區VL及VH相互置換。
在另一態樣中，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、CD33及PD-L1。在一個態樣中，靶細胞抗原選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20及CD33。在一特定態樣中，靶細胞抗原選自纖維母細胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)及CD19。更特定言之，靶細胞抗原選自FAP及CEA。在另一態樣中，靶細胞抗原為PD-L1。
在一個態樣中，能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段為能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)之Fab片段。因此，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中第二Fab片段能夠特異性結合至FAP，且包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之CDR-L3。
在另一態樣中，能夠特異性結合至FAP之Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:21之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:22之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
特定言之，能夠特異性結合至FAP之Fab片段包含含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或含SEQ ID NO:23之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。更特定言之，能夠特異性結合至FAP之Fab片段包含含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
此外，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或含SEQ ID NO:23之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。
在另一態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段為能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段。
因此，提供雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之第二Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列之CDR-L3，或 (c)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之CDR-L3，或 (d)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列之CDR-L3，或 (e)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列之CDR-L3，或 (f)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:129或SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:131之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:132之胺基酸序列之CDR-L3。
在一個態樣中，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中第二Fab片段能夠特異性結合至CEA，且包含 (a)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列之CDR-L3，或 (c)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之CDR-L3，或 (d)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列之CDR-L3。
在另一態樣中，能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (c)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (d)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列， (d)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (e)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:121之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:122之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (f)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:133之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:143之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (g)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:137之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:143之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
更特定言之，能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段包含含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或含SEQ ID NO:39之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:40之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)。此外，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段包含含SEQ ID NO:121之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:122之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)。
在一個態樣中，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中第二Fab片段能夠特異性結合至CEA且包含含SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)。
特定言之，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含含SEQ ID NO:133之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或含SEQ ID NO:137之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或含SEQ ID NO:134之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或含SEQ ID NO:138之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或含SEQ ID NO:137之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或含SEQ ID NO:135之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或含SEQ ID NO:133之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)。
此外，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，且 (ii)能夠特異性結合至CEA之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或含SEQ ID NO:39之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:40之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。
亦提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中(i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，及(ii)能夠特異性結合至CEA之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:121之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:122之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。
在另一態樣中，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，且 (ii)能夠特異性結合至CEA之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:133之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或含SEQ ID NO:137之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或含SEQ ID NO:134之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或含SEQ ID NO:138之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或含SEQ ID NO:137之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或含SEQ ID NO:135之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區VL，或含SEQ ID NO:135之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。
在一特定態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中(i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且(ii)能夠特異性結合至CEA之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之輕鏈可變區。更特定言之，能夠特異性結合至CEA之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:121之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:122之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。
在另一特定態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中(i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且(ii)能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含含SEQ ID NO:39之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:40之胺基酸序列之輕鏈可變區。在另一特定態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中(i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且(ii)能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段為能夠特異性結合至CD19之Fab片段。
特定言之，提供雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD19之Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之CDR-L3。
特定言之，能夠特異性結合至CD19之Fab片段包含：重鏈可變區(VH CD19)，其包含與SEQ ID NO:63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含與SEQ ID NO:64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。更特定言之，能夠特異性結合至CD19之Fab片段包含含SEQ ID NO:63之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD19)及含SEQ ID NO:64之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD19)。
在一特定態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至CD19之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:63之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:64之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。
在又另一態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段為能夠特異性結合至PD-L1之Fab片段。
特定言之，提供雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至PD-L1之Fab片段包含重鏈可變區(VH PD-L1)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL PD-L1)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:149之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:150之胺基酸序列之CDR-L3。
特定言之，能夠特異性結合至PD-L1之Fab片段包含：重鏈可變區(VH PD-L1)，其包含與SEQ ID NO:152之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL PD-L1)，其包含與SEQ ID NO:153之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。更特定言之，能夠特異性結合至PD-L1之Fab片段包含含SEQ ID NO:152之胺基酸序列之重鏈可變區(VH PD-L1)及含SEQ ID NO:153之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL PD-L1)。
在一特定態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至PD-L1之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:152之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:153之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。
根據本發明之另一態樣，提供編碼如前文所述之雙特異性抗原結合分子的經分離聚核苷酸。本發明進一步提供載體，特定言之表現載體，其包含本發明之經分離聚核苷酸；及宿主細胞，其包含本發明之經分離聚核苷酸或載體。在一些態樣中，宿主細胞為真核細胞，特定言之哺乳動物細胞。
在另一態樣中，提供用於產生如前文所述之雙特異性抗原結合分子之方法，其包含以下步驟：(i)在適於表現抗原結合分子之條件下培養本發明之宿主細胞，及(ii)回收抗原結合分子。本發明亦涵蓋藉由本發明之方法產生之雙特異性抗原結合分子。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含如前文所述之雙特異性抗原結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在一個態樣中，醫藥組合物用於治療癌症。
本發明亦涵蓋如前文所述之雙特異性抗原結合分子，或包含雙特異性抗原結合分子之醫藥組合物，其用作藥物。
在一個態樣中，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子或本發明之醫藥組合物，其用於 (i)刺激T細胞反應， (ii)支持活化T細胞之存活， (iii)治療癌症， (iv)延遲癌症惡化，或 (v)延長罹患癌症之患者的存活期。
在一個態樣中，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子或本發明之醫藥組合物以用於治療癌症。在另一態樣中，本發明提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子以用於治療癌症，其中雙特異性抗原結合分子與用於癌症免疫療法之化學治療劑、輻射療法及/或其他藥劑組合投與。
在另一態樣中，本發明提供一種抑制個體中腫瘤細胞生長之方法，其包含向個體投與有效量之如前文所述之雙特異性抗原結合分子或本發明之醫藥組合物來抑制腫瘤細胞生長。
亦提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子之用途，其用於製造用以治療有需要之個體之疾病之藥物，特定言之用於製造用以治療癌症或傳染病之藥物，以及治療個體之疾病之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之呈醫藥學上可接受形式的包含本發明之雙特異性抗原結合分子的組合物。在一具體態樣中，疾病為癌症。在上述態樣中之任一者中，個體為哺乳動物，特定言之人類。
定義
除非以其他方式定義，否則本文所用之技術及科學術語具有與本發明所屬領域中通常所使用相同之含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下定義且只要適合，以單數形式使用之術語亦將包括複數形式且反之亦然。
如本文所用，術語「抗原結合分子 」以其最廣泛意義係指特異性結合抗原決定子的分子。抗原結合分子之實例為抗體、抗體片段及骨架抗原結合蛋白。
如本文所用，術語「能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合域 」或「能夠特異性結合至靶細胞抗原之部分」係指特異性結合至抗原決定子之多肽分子。在一個態樣中，抗原結合域能夠經由其靶細胞抗原活化信號傳導。在一特定態樣中，抗原結合域能夠將其所連接之實體(例如，4-1BB促效劑)引導至靶點，例如引導至攜帶抗原決定子之特異性類型之腫瘤細胞或腫瘤基質。能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合域包括如本文進一步定義之抗體及其片段。另外，能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合域包括如本文進一步定義之骨架抗原結合蛋白，例如，基於經設計之重複蛋白質或經設計之重複域之結合域(參見例如，WO 2002/020565)。
關於抗體或其片段，術語「能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合域」係指包含特異性結合至部分或所有抗原及與部分或所有抗原互補的區域的分子的一部分。可例如藉由一或多種抗體可變域(亦稱作抗體可變區)提供能夠特異性結合抗原之抗原結合域。特定言之，能夠特異性結合抗原之抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。
在一特定態樣中，「能夠特異性結合至靶細胞抗原之抗原結合域」為Fab片段或交叉Fab片段。
術語「抗體 」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所要抗原結合活性即可。
如本文所用之術語「單株抗體 」係指由實質上均質抗體之群體獲得之抗體，亦即包含該群體之個別抗體為一致的及/或結合相同抗原決定基，除了可能的變異抗體，例如，含有天然存在之突變或在產生單株抗體製備期間出現，該等變異通常以少量存在。相比於通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。
如本文所用之術語「單特異性 」抗體表示具有一或多個結合位點之抗體，該一或多個結合位點中之各者結合至相同抗原之相同抗原決定基。術語「雙特異性 」意謂，抗原結合分子能夠特異性結合至至少兩個不同的抗原決定子。通常，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，其各者對不同抗原決定子具有特異性。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原決定子，特定言之兩個不同細胞上所表現的兩個抗原決定子。
如本申請案中所用之術語「價 」表示存在對抗原結合分子中一個不同抗原決定子具有特異性的指定數目之結合位點，其對一個不同抗原決定子具有特異性。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」分別表示抗原結合分子中存在對某一抗原決定子具有特異性的兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。在本發明之特定態樣中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子對於某一抗原決定子可為單價，意謂其具有僅一個針對該抗原決定子之結合位點，或其對於某一抗原決定子可為二價或四價，意謂其針對該抗原決定子分別具有兩個結合位點或四個結合位點。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用，其係指具有與原生抗體結構實質上類似之結構的抗體。「天然抗體 」係指具有不同結構的天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，原生IgG類抗體係約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體醣蛋白，其包含二硫鍵鍵結之兩個輕鏈及兩個重鏈。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域，之後為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域，繼之為輕鏈恆定域(CL)，亦稱為輕鏈恆定區。抗體之重鏈可歸為五種類型之一，該五種類型稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中一些可進一步分成亞型，例如γ1 (IgG1)、γ2 (IgG2)、γ3 (IgG3)、γ4 (IgG4)、α1 (IgA1)及α2 (IgA2)。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，稱為卡帕(κ)及拉姆達(λ)。
「抗體片段 」係指不同於完整抗體，包含完整抗體之一部分，結合完整抗體所結合之抗原的分子。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 ；雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、交叉Fab片段；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及單域抗體。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat Med 9, 129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述，參看例如Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁 (1994)；亦參看WO93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性，參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9, 129-134 (2003)；及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat Med 9, 129-134 (2003)中。單域抗體為包含抗體重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參看例如美國專利第6,248,516 B1號)。抗體片段可藉由各種技術製得，該等技術包括但不限於蛋白分解消化完整抗體以及藉由如本文所述之重組宿主細胞(例如，大腸桿菌(E. coli)或噬菌體)產生。
完整抗體之番木瓜蛋白酶消化產生兩個一致的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自含有重鏈及輕鏈可變域以及輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。如本文所用，因此，術語「Fab 片段 」或「Fab 分子 」係指包含輕鏈片段之抗體片段，該片段包含VL域及輕鏈之恆定域(CL)及VH域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於，在包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸之重鏈CH1域的羧基端處添加幾個殘基。Fab'-SH為其中恆定域之半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基之Fab'片段。胃蛋白酶處理產生F(ab')2 片段，其具有兩個抗原結合位點(兩個Fab片段)及Fc區之一部分。根據本發明，術語「Fab片段」亦包括如下文所定義之「交叉Fab片段」或「互換型Fab片段」。
術語「交叉 Fab 片段 」或「交叉Fab分子」或「xFab片段」或「互換型Fab片段」係指Fab片段，其中重鏈及輕鏈之可變區或恆定區交換。交叉Fab分子之兩種不同鏈組合物是可能的且包含於本發明之雙特異性抗體中：一方面，Fab重鏈及輕鏈之可變區經交換，亦即互換型Fab分子包含由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)構成之肽鏈以及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)構成之肽鏈。此互換型Fab分子亦稱為交叉Fab(VLVH)。另一方面，當Fab重鏈及輕鏈之恆定區交換時，互換型Fab分子包含由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)構成之肽鏈以及由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)構成之肽鏈。此互換型Fab分子亦稱為交叉Fab (CLCH1)。
「單鏈Fab片段」或「scFab 」係由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該抗體域及該連接子按N端至C端方向之次序具有以下中之一者：a) VH-CH1-連接子-VL-CL，b) VL-CL-連接子-VH-CH1，c) VH-CL-連接子-VL-CH1或d) VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子係至少30個胺基酸、較佳32與50個胺基酸之間的多肽。該等單鏈Fab片段經由CL域與CH1域之間的天然二硫鍵穩定化。另外，此等單鏈Fab分子可經由插入半胱胺酸殘基(例如，根據Kabat編號，可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100)藉由產生鏈間二硫鍵而進一步穩定化。
「互換型單鏈Fab片段」或「x-scFab 」為由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該等抗體域及該連接子按N端至C端方向之次序具有以下中之一者：a) VH-CL-連接子-VL-CH1及b) VL-CH1-連接子-VH-CL；其中VH及VL一起形成與抗原特異性結合的抗原結合位點，且其中該連接子為至少30個胺基酸之多肽。另外，此等x-scFab分子可經由插入半胱胺酸殘基(例如，根據Kabat編號，可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100)藉由產生鏈間二硫鍵而進一步穩定化。
「單鏈可變片段 (scFv )」係與具有十至約25個胺基酸之短連接肽連接的抗體之重鏈(VH )及輕鏈(VL )可變區之融合蛋白。連接子通常富含甘胺酸以具有可撓性，以及絲胺酸或蘇胺酸以具有可溶性，且可使VH 之N端與VL 之C端連接，或反之亦然。儘管移除恆定區且引入連接子，但此蛋白質保留原始抗體之特異性。scFv抗體例如描述於Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)中。另外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有VH域(亦即能夠與VL域一起組裝成功能性抗原結合位點)或VL域(亦即能夠與VH域一起組裝成功能性抗原結合位點)之特徵，且由此提供全長抗體之抗原結合特性。
「骨架抗原結合蛋白 」為此項技術中已知，例如纖維結合蛋白及經設計之錨蛋白重複蛋白質(DARPins)已用作抗原結合域之替代性骨架，參見例如Gebauer及Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)及Stumpp等人，Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。在本發明之一個態樣中，骨架抗原結合蛋白係選自由以下組成之群：CTLA-4 (艾維伯迪(Evibody))；脂質運載蛋白(抗運載蛋白)；蛋白質A衍生之分子，諸如蛋白質A之Z域(親和抗體)；A域(高親和性多聚體/最大抗體)；血清運鐵蛋白(反式體)；經設計之錨蛋白重複蛋白質(DARPin)；抗體輕鏈或重鏈之可變域(單域抗體，sdAb)；抗體重鏈之可變域(奈米抗體，aVH)；VNAR 片段；纖維結合蛋白(阿耐克汀(AdNectin))；C型凝集素結構域(四連接素)；新型抗原受體β-內醯胺酶之可變域(VNAR 片段)；人類γ-晶狀體球蛋白或泛素(阿菲林(Affilin)分子)；人類蛋白酶抑制劑之kunitz型結構域，微體，諸如來自打劫素(knottin)家族之蛋白質、肽適體及纖維結合蛋白(阿耐克汀)。CTLA-4 (細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4)為表現於大部分CD4+ T細胞上之CD28家族受體。其胞外域具有可變域類Ig摺疊。對應於抗體之CDR之環可經異源序列取代以賦予不同結合特性。經工程改造以具有不同結合特異性之CTLA-4分子亦稱為艾維伯迪(Evibody) (例如US7166697B1)。艾維伯迪與抗體(例如結構域抗體)之經分離之可變區的尺寸大致相同。關於其他細節，參見Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)。脂質運載蛋白為胞外蛋白質之家族，其傳遞小型疏水性分子，諸如類固醇、後色膽素、類視黃素及脂質。其具有剛性β-片狀第二結構，其在圓錐結構之開放端具有許多環，其可經工程改造以與不同靶抗原結合。抗運載蛋白之大小在160-180個胺基酸之間，且衍生自脂質運載蛋白。關於其他細節，參見Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、US7250297B1及US20070224633。親和抗體為來源於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之蛋白質A的骨架，其可經工程改造以結合至抗原。結構域由具有約58個胺基酸之三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機化產生文庫。關於其他細節，參看Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462及EP 1641818A1。高親合性多聚體為來源於A域骨架家族之多域蛋白質。約35個胺基酸之原生結構域採用經定義之二硫鍵鍵結之結構。藉由改組由A域之家族呈現之天然變化來產生多樣性。關於其他細節，參見Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)及Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (2007年6月)。運鐵蛋白為單體血清傳遞醣蛋白。運鐵蛋白可藉由在允許的表面環中插入肽序列而經工程改造，以結合不同靶抗原。經工程改造之運鐵蛋白骨架之實例包括反式體。關於其他細節，參見J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)。經設計之錨蛋白重複蛋白質(DARPins)來源於錨蛋白，其為介導整合膜蛋白質與細胞骨架之連接的蛋白質之家族。單一錨蛋白重複為由兩個α螺旋及β回旋(beta-turn)組成之33個殘基基元。其可藉由隨機化各重複之第一個α螺旋及β回旋中之殘基而經工程改造為結合不同靶抗原。可藉由增加模組數目來增加其結合界面(親和力成熟方法)。關於其他細節，參見J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)及J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)以及US20040132028A1。單域抗體為由單一單體可變抗體域組成之抗體片段。第一個單域來源於來自駱駝之抗體重鏈之可變域(奈米抗體或VH H片段)。此外，術語單域抗體包括自主人類重鏈可變域(aVH)或來源於鯊魚之VNAR 片段。纖維結合蛋白為可經工程改造以結合至抗原之骨架。阿耐克汀由III型人類纖維結合蛋白(FN3)之15個重複單元之第10個結構域的天然胺基酸序列之主鏈組成。β-夾層結構之一端處的三個環可經工程改造以使阿耐克汀能夠特異性識別相關治療目標。關於其他細節，參見Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)、US20080139791、WO2005056764及US6818418B1。肽適體為組合性識別分子，其由恆定骨架蛋白質(通常為硫氧還蛋白(TrxA))組成，該恆定骨架蛋白質含有在活性位點處插入之限制性可變肽環。關於其他細節，參見Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)。微體來源於天然存在之長度為25-50個胺基酸之微型蛋白質，其含有3-4個半胱胺酸橋，微型蛋白質之實例包括KalataBI及芋螺毒素(conotoxin)及打結素。微型蛋白質具有環，其可經工程改造以包括至多25個胺基酸而不影響微型蛋白質之整體摺疊。關於經工程改造之打結素結構域之其他細節，參見WO2008098796。
至於參考分子，「結合至相同抗原決定基之抗原結合分子 」係指一種抗原結合分子，其在競爭檢定中阻斷參考分子與其抗原之結合達50%或更多，且相反，參考分子在競爭檢定中阻斷抗原結合分子與其抗原之結合達50%或更多。
術語「抗原結合域 」或「抗原結合位點 」係指包含特異性結合至部分或所有抗原且與部分或所有抗原互補之區域的抗原結合分子的部分。當抗原較大時，抗原結合分子可僅結合至抗原之特定部分，該部分稱為抗原決定基。抗原結合域可由例如一或多個可變域(亦稱為可變區)提供。較佳地，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。
如本文所用，術語「抗原決定子 」與「抗原」及「抗原決定基」同義且係指多肽大分子上與抗原結合部分結合、形成抗原結合部分-抗原複合物的位點(例如連續胺基酸區段或由非連續胺基酸之不同區域組成的構形組態)。適用的抗原決定子可發現於例如腫瘤細胞表面上、經病毒感染細胞之表面上、其他病變細胞表面上、免疫細胞表面上、游離於血清中及/或胞外基質(ECM)中。除非另外指示，否則在本文中適用作抗原之蛋白質可以為來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)的任何原生形式之蛋白質。在一特定實施例中，抗原為人類蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」的未經處理之蛋白質，以及由細胞中之處理所產生的任何形式之蛋白質。該術語亦涵蓋天然存在之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。
「特異性結合 」意謂結合對於抗原而言具選擇性且可與非所需或非特異性相互作用區分。抗原結合分子結合至特定抗原之能力可經由酶聯結免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉之其他技術，例如表面電漿子共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析) (Liljeblad等人，Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合檢定(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))量測。在一個實施例中，如例如由SPR量測，抗原結合分子與不相關蛋白質之結合程度比抗原結合分子與抗原之結合低約10%。在某些實施例中，結合至抗原之分子之解離常數(Kd)為≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如，10-8 M或更低，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。
「親和力 」或「結合親和力」係指分子(例如，抗體)與其結合搭配物(例如，抗原)之單一結合位點之間之非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間的1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y的親和力通常可由解離常數(Kd)表示，該解離常數係解離速率常數與締合速率常數(分別係koff及kon)之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。親和力可藉由本領域中已知之常用方法，包括本文所述之方法來量測。一種用於量測親和力之特定方法係表面電漿子共振(SPR)。
「親和力成熟 」抗體係指相較於在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多個變化之親本抗體，具有該等變化之抗體，該等變化使抗體對抗原之親和力得到改善。
如本文所用之「靶細胞抗原 」係指靶細胞(例如腫瘤中之細胞，諸如癌細胞或腫瘤基質細胞)表面上所呈遞的抗原決定子。在某些實施例中，靶細胞抗原為腫瘤特異性或腫瘤相關抗原(TAA)。在一個實施例中，TAA為腫瘤細胞表面上之抗原。在一個實施例中，TAA在腫瘤基質細胞上。在另一態樣中，靶細胞抗原為T細胞或B細胞上之腫瘤相關抗原。在一個實施例中，靶細胞抗原選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、CD19、CD20、CD33及PD-L1。在一特定態樣中，靶細胞抗原為纖維母細胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)或CD19。更特定言之，靶細胞抗原為纖維母細胞活化蛋白(FAP)或CEA。在另一態樣中，靶細胞抗原為PD-L1。
除非另外指示，否則術語「纖維母細胞活化蛋白 (FAP) 」，亦稱為脯胺醯基內肽酶FAP或Seprase (EC 3.4.21)，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生FAP。該術語涵蓋「全長」的未經處理之FAP以及由細胞中之處理產生的任何形式之FAP。該術語亦涵蓋天然存在之FAP變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個實施例中，本發明之抗原結合分子能夠特異性結合至人類、小鼠及/或食蟹獼猴FAP。人類FAP之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號Q12884 (149版，SEQ ID NO:86)或NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2中。人類FAP之胞外域(ECD)自胺基酸位置26延伸至胺基酸位置760。His標記之人類FAP ECD之胺基酸序列展示於SEQ ID NO 87中。小鼠FAP之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P97321 (126版，SEQ ID NO:88)或NCBI RefSeq NP_032012.1中。小鼠FAP之胞外域(ECD)自胺基酸位置26延伸至胺基酸位置761。SEQ ID NO:89展示His標記之小鼠FAP ECD之胺基酸序列。SEQ ID NO: 90展示His標記之食蟹獼猴FAP ECD之胺基酸序列。本發明之抗FAP結合分子較佳結合至FAP之胞外域。
除非另外指示，否則術語「癌胚抗原 (CEA) 」，亦稱為癌胚抗原相關細胞黏附分子5 (CEACAM5)，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CEA。人類CEA之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P06731 (151版，SEQ ID NO:91)中。長期將CEA鑑別為腫瘤相關抗原(Gold及Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965；Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002)。最初歸類為僅表現於胎兒組織中之蛋白質，現今在若干正常成年人組織中鑑別出CEA。此等組織之來源主要為上皮，包括胃腸道、呼吸道及尿道之細胞，及結腸、子宮頸、汗腺及前列腺之細胞(Nap等人，Tumour Biol., 9(2-3):145-53, 1988；Nap等人，Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992)。上皮來源之腫瘤以及其癌轉移含有CEA作為腫瘤相關抗原。儘管存在CEA本身並不指示轉型為癌細胞，但指示CEA之分佈。在正常組織中，CEA通常表現於細胞之頂端表面上(Hammarström S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999))，使其不可接近血流中之抗體。與正常組織相反，CEA傾向於在癌細胞之整個表面上表現(Hammarström S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999))。此表現模式之變化使得CEA可實現癌細胞中之抗體結合。另外，CEA表現在癌細胞中增加。此外，增加之CEA表現促進增加之細胞間黏附，其可引起癌轉移(Marshall J., Semin Oncol., 30(增刊8):30-6, 2003)。多種腫瘤實體中之CEA表現之發生率通常極高。根據公開之資料，組織樣品中進行之自身分析證實其高發生率，在結直腸癌(CRC)中為約95%，在胰臟癌中為90%，在胃癌中為80%，在非小細胞肺癌(NSCLC，其中其與HER3共表現)中為60%且在乳癌中為40%；在小細胞肺癌及神經膠母細胞瘤中發現低表現。
CEA易於自細胞表面裂解且自腫瘤直接或經由淋巴管進入血流。由於此特性，已使用血清CEA之含量作為用於診斷癌症及篩檢癌症(特定言之結直腸癌)復發之臨床標記物(Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992；Chau I.等人，J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004；Flamini等人，Clin Cancer Res；12(23):6985-6988, 2006)。
除非另外指示，否則術語「黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣 (MCSP) 」，亦稱為硫酸軟骨素蛋白聚醣4 (CSPG4)，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生MCSP。人類MCSP之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號Q6UVK1 (103版，SEQ ID NO:92)中。除非另外指示，否則術語「表皮生長因子受體 (EGFR) 」，亦稱為原癌基因c-ErbB-1或受體酪胺酸-蛋白激酶erbB-1，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生EGFR。人類EGFR之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P00533 (211版，SEQ ID NO:93)中。除非另外指示，否則術語「CD19 」係指B淋巴細胞抗原CD19，亦稱為B淋巴細胞表面抗原B4或T細胞表面抗原Leu-12，且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD19。人類CD19之胺基酸序列展示於Uniprot寄存編號P15391 (160版，SEQ ID NO:94)中。除非另外指示，否則「CD20 」係指B淋巴細胞抗原CD20，亦稱為跨膜4-結構域子族A成員1 (MS4A1)、B淋巴細胞表面抗原B1或白細胞表面抗原Leu-16，且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD20。人類CD20之胺基酸序列展示於Uniprot寄存編號P11836 (149版，SEQ ID NO:95)中。除非另外指示，否則「CD33 」係指骨髓細胞表面抗原CD33，亦稱為SIGLEC3或gp67，且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD33。人類CD33之胺基酸序列展示於Uniprot寄存編號P20138 (157版，SEQ ID NO:96)中。
術語「PD-L1 」(亦稱為CD274或B7-H1)係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生PD-L1，尤其係指「人類PD-L1」。完整人類PD-L1之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號Q9NZQ7 (SEQ ID NO:106)中。術語「抗 PD-L1 抗體 」或「結合至人類PD-L1之抗體」或「特異性結合至人類PD-L1之抗體」或「拮抗性抗PD-L1」係指以1.0×10-8 mol/l或更低之KD值，在一個態樣中，以1.0×10-9 mol/l或更低之KD值之結合親和力特異性結合至人類PD-L1抗原之抗體。結合親和力係用標準結合檢定，諸如表面電漿子共振技術(BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)測定。
術語「可變區 」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗原結合分子與抗原之結合的結構域。原生抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)可變域通常具有類似的結構，其中各結構域包含四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參見例如Kindt等人，Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁 (2007)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。
如本文所用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中之序列高變且決定抗原結合特異性之區(例如「互補決定區」(「CDR」))中之每一者。
一般而言，抗體包含六個CDR：VH中的三個(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)及VL中的三個(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中之例示性CDR包括： (a)出現在胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處之高變環(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))； (b)出現在胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)處之CDR (Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；及 (c)出現在胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)處之抗原觸點(MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))。
除非另外指示，否則CDR係根據Kabat等人，同前文獻測定。熟習此項技術者將理解，CDR名稱亦可根據Chothia, 同前文獻，McCallum, 同前文獻，或任何其他科學上可接受的命名法系統確定。Kabat等人定義適用於任何抗體之可變區序列之編號系統。一般技術者可將此「Kabat編號」系統明確地分配給任何可變區序列，而不依賴於超過序列本身的任何實驗資料。如本文所用，「Kabat編號」或「Kabat EU索引」係指由Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)闡述之編號系統。除非另外指定，否則提及抗體可變區中之特定胺基酸殘基位置的編號係依據Kabat EU索引編號系統。
「構架 」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基之外的可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，在VH (或VL)中，HVR及FR序列通常依以下序列呈現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「嵌合 」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，同時重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別 」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在五種主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。
「人類化 」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個及通常兩個可變域之實質上全部，其中全部或實質上全部HVR (例如CDR)對應於非人類抗體之彼等，且全部或實質上全部FR對應於人類抗體之彼等。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。例如非人類抗體之抗體的「人類化形式 」係指已經歷人類化之抗體。本發明所涵蓋之「人類化抗體」之其他形式為其中恆定區已自原始抗體另外修飾或改變以產生根據本發明之特性，尤其為C1q結合及/或Fc受體(FcR)的抗體。
「人類 」抗體係胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
術語「Fc域」或「Fc 區 」在本文中用於定義抗體重鏈中含有恆定區之至少一部分的C端區。該術語包括原生序列Fc區及變異型Fc區。IgG Fc區包含IgG CH2及IgG CH3域。人類IgG Fc區之「CH2域」通常自約位置231處之胺基酸殘基延伸至約位置340處之胺基酸殘基。在一個實施例中，碳水化合物鏈連接至CH2域。本文中，CH2域可為原生序列CH2域或變異型CH2域。「CH3域」包含在Fc區中將殘基C端沿展至CH2域(亦即，自IgG之約位置341處之胺基酸殘基至約位置447處之胺基酸殘基)。本文中之CH3區可為原生序列CH3域或變異型CH3域(例如，在其一個鏈中具有引入之「隆凸」(「杵」)之CH3域及在其其他鏈中相應引入之「凹穴」(「臼」；參見美國專利第5,821,333號，其以引用之方式明確地併入本文中)。該等變異型CH3域可用於促進如本文中所述之兩個非一致抗體重鏈之雜二聚化。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226、或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，宿主細胞所產生之抗體可能在重鏈C端經歷一或多個(特定言之，一個或兩個)胺基酸之轉譯後裂解。因此，宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈之特定核酸分子產生的抗體可包括全長重鏈，或其可包括全長重鏈之裂解變異體。在重鏈之最末兩個C端胺基酸為甘胺酸(G446)及離胺酸(K447，根據Kabat EU索引編號)的情況下，情況可為如此。因此，Fc區之C端離胺酸(K447)或C端甘胺酸(G446)及離胺酸(K447)可能存在或可能不存在。若不另外指示，則包括Fc區的重鏈之胺基酸序列在本文中表示為無C端甘胺酸-離胺酸二肽。在一個態樣中，包括如本文指定之Fc區、包含於根據本發明之抗體中的重鏈包含另一C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在一個態樣中，包括如本文指定之Fc區、包含於根據本發明之抗體中的重鏈包含另一C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。除非本文中另外指定，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。
「杵 - 臼 」技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，該方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入相應凹穴(「臼」)，使得隆凸可定位於凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構建隆凸。大小與隆凸相同或類似之補償性凹穴係在第二多肽之界面中藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈來形成。隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸，例如藉由定點突變誘發或藉由肽合成來產生。在一具體實施例中，杵修飾包含Fc域之兩個子單元中之一者中的胺基酸取代T366W，且臼修飾包含Fc域之兩個子單元中之另一者中的胺基酸取代T366S、L368A及Y407V。在另一具體實施例中，包含杵修飾之Fc域之子單元另外包含胺基酸取代S354C，且包含臼修飾之Fc域之子單元另外包含胺基酸取代Y349C。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得Fc區之兩個子單元之間形成二硫橋鍵，由此進一步穩定二聚體(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
「與免疫球蛋白之Fc區等效之區」意欲包括免疫球蛋白之Fc區之天然存在之對偶基因變異體以及具有變化之變異體，該等變化產生取代、添加或刪除，但實質上不降低免疫球蛋白介導效應子功能(諸如抗體依賴性細胞毒性)之能力。舉例而言，一或多個胺基酸可自免疫球蛋白之Fc區之N端或C端刪除而實質上不損失生物功能。該等變異體可根據此項技術中已知的通用法則選擇以對活性具有最小影響(參見例如Bowie, J. U.等人，Science 247:1306-10 (1990))。
術語「效應 子 功能 」係指可歸因於抗體之Fc區的彼等生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞噬菌作用(ADCP)、細胞介素分泌、抗原呈遞細胞之免疫複合物介導之抗原攝取、細胞表面受體(例如，B細胞受體)之下調及B細胞活化。
可藉由抗體Fc區與Fc受體(FcR) (其為造血細胞上之特殊化細胞表面受體)之相互作用介導Fc受體結合依賴性效應子功能。Fc受體屬於免疫球蛋白超家族，且已展示介導藉由免疫複合物之噬菌作用移除經抗體塗佈之病原體，及經由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)裂解用相應抗體塗佈之紅血球及各種其他細胞標靶(例如，腫瘤細胞) (參見例如，Van de Winkel, J.G.及Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524)。FcR由其對免疫球蛋白同型之特異性定義：針對IgG抗體之Fc受體稱為FcγR。例如Ravetch, J.V.及Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492；Capel, P.J.等人，Immunomethods 4 (1994) 25-34；de Haas, M.等人., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341；及Gessner, J.E.等人，Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248描述Fc受體結合。
IgG抗體之Fc區(FcγR)的受體交聯觸發多種效應子功能，包括噬菌作用、抗體依賴性細胞毒性及炎性介質釋放，以及免疫複合物清除及抗體產量之調節。在人類中，已表徵三種類別之FcγR，其為：
- FcγRI (CD64)以高親和力結合單體IgG且在巨噬細胞、單核球、嗜中性白細胞及嗜伊紅白血球上表現。在Fc區IgG內至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327及P329 (根據Kabat之EU索引編號)中之一者之修飾減少與FcγRI之結合。位置233-236處之IgG2殘基(經取代至IgG1及IgG4)將與FcγR之結合減少10³倍，且消除人單核球對抗體敏化紅血球之響應(Armour, K.L.等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。
- FcγRII (CD32)以中至低親和力結合複合的IgG且廣泛表現。此受體可分為兩種子類型：FcγRIIA及FcγRIIB。在許多涉及殺滅之細胞(例如，巨噬細胞、單核球、嗜中性球)上發現FcγRIIA，且其似乎能夠活化殺滅程序。FcγRIIB似乎在抑制程序中起一定作用，且在B細胞、巨噬細胞上及肥大細胞及嗜伊紅白血球上發現。在B細胞上，其作用似乎為遏制免疫球蛋白進一步產生及同型轉換為例如IgE類別。在巨噬細胞上，FcγRIIB用以抑制如經由FcγRIIA介導之噬菌作用。在嗜伊紅白血球及肥大細胞上，B形式可以經由IgE結合至其單獨的受體而有助於遏制此等細胞之活化。發現對於FcγRIIA結合減少，例如對於包含至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292及K414中之一者處具有突變之IgG Fc區的抗體(根據Kabat EU索引編號)。
- FcγRIII (CD16)以中至低親和力結合IgG，且以兩種類型存在。FcγRIIIA見於NK細胞、巨噬細胞、嗜伊紅白血球及一些單核球及T細胞上，且介導ADCC。FcγRIIIB高度表現於嗜中性白細胞上。發現與FcγRIIIA之結合見少，例如對於包含至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338及D376 (根據Kabat EU索引編號)中之一者處具有突變之IgG Fc區的抗體。
在Fc受體之人類IgG1上映射結合位點，上文所提及之突變位點及量測與FcγRI及FcγRIIA之結合之方法描述於Shields, R.L.,等人J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604中。
術語「ADCC 」或「抗體依賴性細胞毒性」為藉由Fc受體結合介導之功能，且係指在效應細胞存在下藉由如本文所報導之抗體溶解靶細胞。藉由量測其與Fcγ受體表現細胞之結合，諸如以重組方式表現FcγRI及/或FcγRIIA或NK細胞(基本上表現FcγRIIIA)之細胞，來研究引起介導ADCC之初始步驟的抗體能力。特定言之，量測NK細胞上與FcγR之結合。
「活化 Fc 受體 」為一種Fc受體，其與抗體之Fc區接合之後，引發信號傳導事件，此刺激攜帶受體之細胞執行效應子功能。活化Fc受體包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI (CD89)。特定活化Fc受體為人類FcγRIIIa (參見UniProt寄存編號P08637，141版)。
「腫瘤壞死因子受體超家族」或「TNF 受體超家族 」目前由27種受體組成。其為一群特徵為經富含半胱胺酸之胞外域(CRD)結合腫瘤壞死因子(TNF)之能力的細胞介素受體。此等偽重複由受體鏈內高度保守半胱胺酸殘基產生之鏈內二硫化物界定。除神經生長因子(NGF)以外，所有TNF與原型TNF-α同源。大部分TNF受體以其活性形式在漿膜中形成三聚複合物。因此，大部分TNF受體含有跨膜域(TMD)。若干此等受體亦含有胞內死亡結構域(DD)，其在配位體結合之後募集卡斯蛋白酶相互作用蛋白以起始卡斯蛋白酶活化之外源路徑。缺乏死亡結構域之其他TNF超家族受體結合TNF受體相關因子且活化可導致增殖或分化之胞內信號傳導路徑。此等受體亦可起始細胞凋亡，但其經間接機制進行。除了調節細胞凋亡之外，若干TNF超家族受體涉及調節免疫細胞功能(諸如B細胞內穩定及活化)、自然殺手細胞活化及T細胞共刺激。若干其他受體調節細胞類型特異性反應，諸如毛囊發育及蝕骨細胞發育。TNF受體超家族之成員包括以下：腫瘤壞死因子受體1 (1A) (TNFRSF1A、CD120a)、腫瘤壞死因子受體2 (1B) (TNFRSF1B、CD120b)、淋巴毒素β受體(LTBR、CD18)、OX40 (TNFRSF4、CD134)、CD40 (Bp50)、Fas受體(Apo-1、CD95、FAS)、誘餌受體3 (TR6、M68、TNFRSF6B)、CD27 (S152、Tp55)、CD30 (Ki-1、TNFRSF8)、4-1BB (CD137、TNFRSF9)、DR4 (TRAILR1、Apo-2、CD261、TNFRSF10A)、DR5 (TRAILR2、CD262、TNFRSF10B)、誘餌受體1 (TRAILR3、CD263、TNFRSF10C)、誘餌受體2 (TRAILR4、CD264、TNFRSF10D)、RANK (CD265、TNFRSF11A)、骨保護素(OCIF、TR1、TNFRSF11B)、TWEAK受體(Fn14、CD266、TNFRSF12A)、TACI (CD267、TNFRSF13B)、BAFF受體(CD268、TNFRSF13C)、疱疹病毒侵入介體(HVEM、TR2、CD270、TNFRSF14)、神經生長因子受體(p75NTR、CD271、NGFR)、B細胞成熟抗原(CD269、TNFRSF17)、糖皮質激素誘導之TNFR相關(GITR、AITR、CD357、TNFRSF18)、TROY (TNFRSF19)、DR6 (CD358、TNFRSF21)、DR3 (Apo-3、TRAMP、WS-1、TNFRSF25)以及外異蛋白A2受體(XEDAR、EDA2R)。
腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族之若干成員在初始T細胞活化之後用於維持T細胞反應。術語「共刺激 TNF 受體 家族成員 」或「共刺激TNF家族受體」係指能夠共刺激T細胞之增殖及細胞介素產生的TNF受體家族成員之子群。除非另外指示，否則該術語係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生TNF家族受體。在本發明之具體實施例中，共刺激TNF受體家族成員選自由以下組成之群：OX40 (CD134)、4-1BB (CD137)、CD27、HVEM (CD270)、CD30及GITR，其均可對T細胞具有共刺激作用。更特定言之，共刺激TNF受體家族成員為4-1BB。
除非另外指示，否則如本文所用之術語「4-1BB 」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生4-1BB。該術語涵蓋「全長」未經處理之4-1BB以及由細胞中之處理產生的任何形式之4-1BB。該術語亦涵蓋天然存在之4-1BB變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人類4-1BB之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:97 (Uniprot寄存編號Q07011)中，例示性鼠類4-1BB之胺基酸序列展示於SEQ ID NO: 98 (Uniprot寄存編號P20334)中且例示性獼猴4-1BB (來自恆河猴)之胺基酸序列展示於SEQ ID NO:99 (Uniprot寄存編號F6W5G6)中。
術語「抗 4-1BB 抗體 」、「抗4-1BB」、「4-1BB抗體」及「特異性結合至4-1BB之抗體」係指能夠以足夠親和力結合4-1BB以使得抗體在靶向4-1BB時適用作診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個實施例中，如例如藉由放射免疫檢定(RIA)或流動式細胞量測術(FACS)量測，抗4-1BB抗體與不相關的非4-1BB蛋白之結合程度比該抗體與4-1BB之結合低約10%。在某些實施例中，結合至4-1BB之抗體之解離常數(KD )為≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如，10-6 M或更低、例如10-68 M至10-13 M、例如10-8 M至10-10 M)。特定言之，抗4-1BB抗體係如揭示於美國專利第7,288,638中之純系20H4.9。
術語「肽連接子 」係指包含一或多個胺基酸(通常約2至20個胺基酸)的肽。肽連接子在此項技術中已知或描述於本文中。適合非免疫原性連接肽為例如(G4 S)n 、(SG4 )n 或G4 (SG4 )n 肽連接子，其中「n」通常為介於1與10之間、通常介於2與4之間，特定言之為2之數字，亦即肽選自由以下組成之群：GGGGS (SEQ ID NO: 100) GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:101)、SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:102)及GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:103)，但亦包括序列GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:104)、(G4S)3 (SEQ ID NO:105)、(G4S)4 (SEQ ID NO:106)、GSGSGSGS (SEQ ID NO:107)、GSGSGNGS (SEQ ID NO:108)、GGSGSGSG (SEQ ID NO:109)、GGSGSG (SEQ ID NO:110)、GGSG (SEQ ID NO:111)、GGSGNGSG (SEQ ID NO:112)、GGNGSGSG (SEQ ID NO:113)及GGNGSG (SEQ ID NO:114)。尤其關注之肽連接子係(G4S) (SEQ ID NO:100)、(G4 S)2 或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:101)、(G4S)3 (SEQ ID NO:105)及(G4S)4 (SEQ ID NO:106)，更特定言之(G4 S)2 或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:101)。
如本申請案中所用之術語「胺基酸 」表示包含以下之天然存在之羧基α-胺基酸之群：丙胺酸(三個字母碼：ala，一個字母碼：A)、精胺酸(arg，R)、天冬醯胺(asn，N)、天冬胺酸(asp，D)、半胱胺酸(cys，C)、麩醯胺酸(gln，Q)、麩胺酸(glu，E)、甘胺酸(gly，G)、組胺酸(his，H)、異白胺酸(ile，I)、白胺酸(leu，L)、離胺酸(lys，K)、甲硫胺酸(met，M)、苯丙胺酸(phe，F)、脯胺酸(pro，P)、絲胺酸(ser，S)、蘇胺酸(thr，T)、色胺酸(trp，W)、酪胺酸(tyr，Y)及纈胺酸(val，V)。
「融合 」或「連接 」意謂組分(例如，抗體及Fab片段之重鏈)藉由肽鍵直接或經由一或多個肽連接子連接。
關於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比 (%) 」定義為在比對序列及引入間隙後，視需要，為實現最大序列一致性百分比，且出於比對之目的不將任何保守取代視為序列一致性之一部分，候選序列中之胺基酸殘基之百分比，其與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的，可以此項技術中之技能內的各種方式實現比對，例如使用公開可用的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR)軟體或FASTA套裝程式。熟習此項技術者可測定適用於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內實現最大比對所需的任何演算法。或者，可使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生一致性百分比值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech, Inc.所著，且源碼已與華盛頓哥倫比亞特區美國版權局(U.S. Copyright Office, Washington D.C.), 20559中之使用者資料一起提交，其中其以美國版權登記號TXU510087註冊，且描述於WO 2001/007611中。
在某些實施例中，涵蓋本文提供之含有TNF配位三聚體之抗原結合分子的胺基酸序列變異體 。舉例而言，可能需要改善含有TNF配位三聚體之抗原結合分子之結合親和力及/或其他生物特性。含有TNF配位三聚體之抗原結合分子之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼核苷酸序列之分子或藉由肽合成來製備。該等修飾包括例如抗體胺基酸序列內的殘基刪除及/或插入及/或取代。可進行刪除、插入及取代之任何組合以獲得最終構建體，其限制條件為最終構建體具有所要特徵，例如抗原結合。用於取代型突變誘發之所關注位點包括HVR及構架(FR)。保守取代以標題「較佳取代」提供於表A中且在下文中參考胺基酸側鏈類別(1)至(6)進一步描述。可將胺基酸取代引入所關注分子中，且針對所要活性進行篩選之產物例如保留/改善抗原結合或減少免疫原性，或改善ADCC或CDC。 表A
初始殘基 例示性取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp, Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg； (5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將引起此等類別中之一者之成員換成另一個類別。
術語「胺基酸序列變異體 」實質上包括變異體，其中在親本抗原結合分子(例如，人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基中存在胺基酸取代。一般而言，所選擇之用於進一步研究之所得變異體與親本抗原結合分子相比將具有某些生物特性之修飾(例如改良) (例如提高之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗原結合分子之某些生物特性。例示性取代型變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體顯示之親和力成熟技術(諸如本文所述之技術)來便利地產生。簡言之，一或多個HVR殘基發生突變且變異型抗原結合分子顯示於噬菌體上且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩檢。在某些實施例中，一或多個HVR內可存在取代、插入或刪除，只要該等變化不實質上降低抗原結合分子結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守改變(例如如本文所提供之保守取代)。適用於鑑別突變誘發可靶向之抗體之殘基或區的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells (1989)Science , 244:1081-1085所描述。在此方法中，殘基或靶殘基之群(例如，帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)經鑑別出，且經中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以判定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在胺基酸位置引入進一步取代，證明對初始取代之功能敏感性。可替代地或另外，抗原-抗原結合分子之晶體結構複合以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。該等接觸殘基及相鄰殘基可作為取代候選者而經靶向或消除。可篩檢變異體以判定其是否含有所要特性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入的實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基的本發明之雙特異性抗原結合分子。分子之其他插入型變異體包括N端或C端與多肽之融合，這延長雙特異性抗原結合分子之血清半衰期。
在某些實施例中，改變本文所提供之雙特異性抗原結合分子以提高或降低抗體經糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列以使得形成或移除之一或多個糖基化位點來便利地獲得分子之糖基化變異體。當含有TNF配位三聚體之抗原結合分子包含Fc區時，可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含支鏈雙觸角寡醣，其通常藉由N鍵連接至Fc區之CH2域的Asn297上。參見例如Wright等人，TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可進行含有TNF家族配位三聚體之抗原結合分子中寡糖之修飾以形成具有某些改善之特性的變異體。在一個態樣中，提供本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體的變異體，其具有碳水化合物結構且不具有連接(直接或間接)至Fc區的海藻糖。該等海藻糖基化變異體可具有改善之ADCC功能，參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)或US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。在另一態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體的變異體具有對分寡醣，例如其中連接至Fc區的雙觸角寡醣經GlcNAc對分。該等變異體可具有降低之海藻糖基化及/或改善之ADCC功能，參見例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546 (Umana等人)。亦提供具有連接至Fc區的寡醣中之至少一個半乳糖殘基的變異體。該等抗體變異體可具有改善之CDC功能且描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。
在某些態樣中，可能需要形成本發明之雙特異性抗原結合分子之經半胱胺酸工程改造之變異體，例如「thioMAb」，其中分子之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定態樣中，經取代之殘基存在於分子之可達位點處。藉由經半胱胺酸取代彼等殘基，藉此將反應性硫醇基安置於抗體之可達位點處且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)綴合以形成免疫綴合物。在某些態樣中，以下殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。經半胱胺酸工程改造之抗原結合分子可如例如美國專利第7,521,541號中所述產生。
術語「核酸分子 」或「聚核苷酸 」包括含核苷酸聚合物之任何化合物及/或物質。各核苷酸包含鹼基，特定言之嘌呤或嘧啶鹼基(亦即，胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(亦即，脫氧核苷或核糖)及磷酸酯基。通常，核酸分子藉由鹼基序列描述，由此該等鹼基表示核酸分子之一級結構(線性結構)。鹼基序列通常自5'至3'表示。在本文中，術語核酸分子涵蓋脫氧核糖核酸(DNA)，包括例如互補DNA (cDNA)及基因組DNA；核糖核酸(RNA)，特定言之信使RNA (mRNA)；合成形式之DNA或RNA；及包含兩個或更多個此等分子之混合聚合物。核酸分子可以為線性或環形的。另外，術語核酸分子包括有義股及反義股兩者，以及單股及雙股形式。另外，本文描述之核酸分子可含有天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸之實例包括具有衍生化糖或磷酸酯主鏈鍵聯或化學修飾之殘基的經修飾核苷酸鹼基。核酸分子亦涵蓋DNA及RNA分子，其適用作活體外及/或活體內，例如在宿主或患者中直接表現本發明之抗體之載體。該等DNA (例如cDNA)或RNA (例如mRNA)載體可以為未修飾或經修飾的。舉例而言，mRNA可經化學修飾以增強RNA載體之穩定性及/或編碼分子之表現，以使得mRNA可注入個體中以在活體內產生抗體(參見例如Stadler等人，Nature Medicine 2017, 2017年6月12日線上公開, doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
「經分離」之聚核苷酸係指已與其天然環境之組分分離的核酸分子。經分離之核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置處。
「編碼雙特異性抗原結合分子之經分離聚核苷酸 」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多種核酸分子，包括單一載體或單獨載體中之該(等)核酸分子，存在於宿主細胞中之一或多個位置處之該(等)核酸分子。
術語「表現卡匣 」係指以重組或合成方式產生之聚核苷酸，其具有准許靶細胞中之特定核酸發生轉錄的一系列指定核酸元件。重組表現卡匣可併入質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現卡匣部分包括待轉錄之核酸序列及啟動子以及其他序列。在某些實施例中，本發明之表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「載體 」或「表現載體」與「表現構建體」同義且係指用於引入特定基因且引導該特定基因表現的DNA分子，該DNA分子與該特定基因在目靶細胞中可操作地連接。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入已將其引入之宿主細胞之基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許大量的穩定mRNA發生轉錄。一旦表現載體進入靶細胞內，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機制產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「宿主細胞 」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括一級轉型細胞及自其衍生之後代(不考慮繼代次數)。後代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，但可能含有突變。本文中包括針對原始轉型細胞篩選或選擇的具有相同功能或生物活性之突變後代。宿主細胞為可用於產生本發明之雙特異性抗原結合分子之任何類型的細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內所包含的細胞。
藥劑之「有效量 」係指在所投與之細胞或組織中產生生理變化所必需的量。
藥劑，例如醫藥組合物之「治療有效量 」係指在必要劑量及時間段下可有效地實現所要治療結果或預防結果的量。舉例而言，治療有效量之藥劑可消除、減少、延遲、最小化或預防疾病之副作用。
「個體 (individual )」或「個體(subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括但不限於家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體(individual/subject)為人類。
術語「醫藥組合物 」係指呈准許其中所含活性成分之生物活性有效之形式的製劑，且其不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之額外組分。
「醫藥學上可接受之賦形劑 」係指醫藥組合物中除活性成分以外之對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之賦形劑包括但不限於緩衝液、穩定劑或防腐劑。
術語「藥品說明書 」用以指通常包括於治療性產品之商業包裝中的說明書，其含有關於與使用該等治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告的資訊。
如本文所用，「治療 (treatment )」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床介入，且可出於預防目的或在臨床病理學之病程期間進行。所要治療作用包括但不限於預防疾病發生或復發，緩解症狀，減輕疾病之任何直接或間接病理性結果，預防癌轉移，減緩疾病惡化速率，改善或緩和疾病病況及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之分子用於延遲疾病發展或減慢疾病惡化。
如本文所用之術語「癌症 」係指增殖性疾病，諸如淋巴瘤、淋巴細胞性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭癌或頸癌、皮膚或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽道癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤文氏肉瘤(Ewings sarcoma)，包括任何上述癌症之難治性型式，或上述癌症中之一或多者的組合。 本發明之雙特異性抗原結合分子
本發明係關於具有尤其有利特性之新穎雙特異性抗體4-1BB，該等有利特性諸如可生產性、穩定性、結合親和力、生物活性、靶向效率及降低之毒性。其特徵進一步在於其特異性結構特點，諸如兩個分別能夠特異性結合至4-1BB及靶細胞抗原之Fab片段的鄰近度、與4-1BB之二價結合及與靶細胞抗原之單價結合，這使此等雙特異性抗原結合分子非常有效而不妨礙安全性。例示性雙特異性抗原結合分子
在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及 (d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在Fab重鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)之Fab重鏈之N端，該第一Fab片段(a)之Fab重鏈繼而在其C端融合至該第一Fc域子單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域子單元之N端，且其中在能夠特異性結合至靶細胞抗原之該第二Fab片段中，(i) Fab輕鏈Fab重鏈之可變區VL及VH相互置換，或(ii) Fab輕鏈及Fab重鏈之恆定區CL及CH1相互置換。
在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及 (d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在Fab重鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)之Fab重鏈之N端，該第一Fab片段(a)之Fab重鏈繼而在其C端融合至該第一Fc域子單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域子單元之N端，且其中在能夠特異性結合至靶細胞抗原之該第二Fab片段中，該Fab輕鏈及該Fab重鏈之可變區VL及VH相互置換。
特定言之，能夠特異性結合至4-1BB之Fab片段包含重鏈可變區(VH 4-1BB)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL 4-1BB)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之CDR-L3。
在一特定態樣中，提供如本文所述之雙特異性抗原結合分子，其中雙特異性抗原結合分子提供與4-1BB之二價結合及與靶細胞抗原之單價結合。更特定言之，雙特異性抗原結合分子提供與4-1BB之二價結合及與腫瘤相關抗原(TAA)之單價結合。
Fab片段可直接或藉由包含一或多個胺基酸，通常為約2-20個胺基酸之肽連接子與Fc域或彼此融合。肽連接子為此項技術中已知的且描述於本文中。適合的非免疫原性肽連接子包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽連接子。「n」一般為1至10、通常2至4之整數。適合於連接第一Fab片段及第二Fab片段之Fab重鏈的例示性肽連接子包含序列(D)-(G4 S)2 。另一種適合之該連接子包含序列(G4 S)4 。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)。特定言之，在Fab分子與Fc域子單元之N端融合的情況下，其可在額外肽連接子存在或不存在的情況下經由免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分融合。
在一個態樣中，提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至4-1BB (a)及(c)之第一Fab片段及第三Fab片段一致。在一特定態樣中，本發明提供如前文所述之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含：重鏈可變區(VH 4-1BB)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL 4-1BB)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之CDR-L3。
因此，在一個態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及 (d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在Fab重鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)之Fab重鏈之N端，該第一Fab片段(a)之Fab重鏈繼而在其C端融合至該第一Fc域子單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域子單元之N端，且其中在能夠特異性結合至靶細胞抗原之該第二Fab片段中，(i) Fab輕鏈Fab重鏈之可變區VL及VH相互置換，或(ii) Fab輕鏈及Fab重鏈之恆定區CL及CH1相互置換，且其中第一Fab片段及第三Fab片段各自包含：重鏈可變區(VH 4-1BB)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL 4-1BB)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之CDR-L3。
在一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段，其各自包含：重鏈可變區(VH 4-1BB)，其包含與SEQ ID NO:7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL 4-1BB)，其包含與SEQ ID NO:8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。更特定言之，能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之重鏈可變區(VH 4-1BB)及含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL 4-1BB)。
在一個態樣中，雙特異性抗原結合分子包含含SEQ ID NO:65之胺基酸序列之多肽(Fc臼重鏈)及含SEQ ID NO:67之胺基酸序列之兩個多肽(輕鏈)。
本發明之雙特異性抗原結合分子之特徵進一步在於包含能夠特異性結合至靶細胞抗原之一個Fab片段。雙特異性抗原結合分子因此相較於能夠特異性結合至4-1BB之習知抗體具有優勢，其在靶細胞(通常為癌細胞)處選擇性誘導共刺激T細胞反應。在一個態樣中，靶細胞抗原選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、CD33及PD-L1。在一個態樣中，靶細胞抗原選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20及CD33。特定言之，靶細胞抗原選自纖維母細胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)及CD19。在一個特定態樣中，靶細胞抗原選自纖維母細胞活化蛋白(FAP)及癌胚抗原(CEA)。更特定言之，靶細胞抗原為FAP。可替代地，靶細胞抗原為CEA。在另一特定態樣中，靶細胞抗原為CD19。在另一態樣中，靶細胞抗原為PD-L1。靶細胞抗原為 FAP 之雙特異性抗原結合分子
在一個特定態樣中，靶細胞抗原為纖維母細胞活化蛋白(FAP)。FAP結合部分已經描述於WO 2012/02006中，其以全文引用之方式包括在內。下文描述尤其受關注之FAP結合部分。
在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)之Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之CDR-L3。
特定言之，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP之Fab片段包含：重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR-L3。
在另一態樣中，能夠特異性結合至FAP之Fab片段包含：重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之CDR-L3。
特定言之，提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)之Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:21之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:22之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
特定言之，能夠特異性結合至FAP之Fab片段包含含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)，或含SEQ ID NO:23之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。更特定言之，能夠特異性結合至FAP之Fab片段包含含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之重鏈可變區(VH FAP)及含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL FAP)。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:23之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO: 66之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:68之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:66之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:68之多肽序列。靶細胞抗原為 CEA 之雙特異性抗原結合分子
在一特定態樣中，靶細胞抗原為癌胚抗原(CEA)。CEA結合部分已描述於例如WO 92/01059、WO 2007/071422、WO 2016/075278 A2或WO 2007/071426中，其以全文引用之方式包括在內。下文描述尤其受關注之CEA結合部分。
在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列之CDR-L3，或 (c)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之CDR-L3，或 (d)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列之CDR-L3，或 (e)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列之CDR-L3，或 (f)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:129或SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:131之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:132之胺基酸序列之CDR-L3。
特定言之，提供雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之CDR-L3。
特定言之，提供雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段包含：(a)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段包含：(a)包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA) (抗體A5B7)。
在一個態樣中，能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段包含：包含SEQ ID NO: 153之胺基酸序列之人類化重鏈可變區(VH CEA)，其係基於人類受體構架人類受體構架IGHV3-23-02；及包含SEQ ID NO: 165之胺基酸序列之人類化輕鏈可變區(VL CEA)，其係基於人類接受體構架IGKV3-11。
在一個特定態樣中，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列之CDR-L3。
在一個態樣中，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:121之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:122之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。特定言之，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含含SEQ ID NO:121之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:122之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA) (抗體A5H1EL1D)。在另一態樣中，與包含一致構架區但CDR區中包含突變之A5H1EL1D相比，Fab片段可包含對CEA具有較高親和力之抗體。因此，亦提供能夠特異性結合至CEA之Fab片段，其包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:121之胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:122之胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。
在另一態樣中，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列之CDR-L3。
在一個態樣中，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含含SEQ ID NO:39之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:40之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA) (抗體MFE23)。
特定言之，提供雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段包含人類化重鏈及輕鏈可變域。在一個態樣中，能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段包含含SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)。
在一個態樣中，能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段包含 (a)包含SEQ ID NO:133之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或 (b)包含SEQ ID NO:137之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或 (c)包含SEQ ID NO:134之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或 (d)包含SEQ ID NO:138之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或 (e)包含SEQ ID NO:137之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或 (f)包含SEQ ID NO:135之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)，或 (g)包含SEQ ID NO:133之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA)。
在另一態樣中，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之CDR-L3。
在一個態樣中，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。特定言之，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA) (抗體T84.66-LCHA)。
在另一態樣中，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列之CDR-L3。
在一個態樣中，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。特定言之，能夠特異性結合至CEA之Fab片段包含含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CEA)及含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CEA) (抗體CH1A1A 98/99/2F1)。
在一個態樣中，能夠特異性結合至CEA之抗原結合域包含含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之輕鏈可變區，或能夠特異性結合至FAP之抗原結合域包含含SEQ ID NO:39之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，能夠特異性結合至CEA之抗原結合域包含含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之輕鏈可變區，或能夠特異性結合至FAP之抗原結合域包含含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:39之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:40之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:121之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:122之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:133之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:137之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:134之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在又另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:138之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:137之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在另一態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:135之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在又另一態樣，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至FAP之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:133之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:76之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:77之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:76之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:77之多肽序列。
在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:78之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:79之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:78之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:79之多肽序列。
在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:80之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:81之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:80之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:81之多肽序列。
在又另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:82之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:83之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:82之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:83之多肽序列。
在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:173之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:174之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:173之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:174之多肽序列。
在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:179之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:180之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:179之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:180之多肽序列。
在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:181之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:182之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:181之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:182之多肽序列。
在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:183之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:184之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:183之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:184之多肽序列。
在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:185之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:186之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:185之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:186之多肽序列。
在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:187之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:188之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:187之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:188之多肽序列。
在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:189之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:190之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:189之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:190之多肽序列。
在另一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:191之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:192之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:191之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:192之多肽序列。靶細胞抗原為 CD19 之雙特異性抗原結合分子
在一特定態樣中，靶細胞抗原為CD19。CD19結合部分已描述於例如WO 2016/075278 A1中，其以全文引用之方式包括在內。下文描述尤其受關注之CD19結合部分。
在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD19之Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之CDR-L3。
特定言之，能夠特異性結合至CD19之Fab片段包含：重鏈可變區(VH CD19)，其包含與SEQ ID NO:63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含與SEQ ID NO:64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。更特定言之，能夠特異性結合至CD19之Fab片段包含含SEQ ID NO:63之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD19)及含SEQ ID NO:64之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD19)。
在一特定態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至CD19之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:63之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:64之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。
在一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:84之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:85之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:84之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:85之多肽序列。靶細胞抗原為 PD-L1 之雙特異性抗原結合分子
在一特定態樣中，靶細胞抗原為PD-L1。CD19結合部分已描述於例如WO 2010/077634中，其以全文引用之方式包括在內。下文描述尤其受關注之PD-L1結合部分。
在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至PD-L1之Fab片段包含 重鏈可變區(VH PD-L1)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL PD-L1)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:149之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:150之胺基酸序列之CDR-L3。
特定言之，能夠特異性結合至PD-L1之Fab片段包含：重鏈可變區(VH PD-L1)，其包含與SEQ ID NO:152之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL PD-L1)，其包含與SEQ ID NO:153之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。更特定言之，能夠特異性結合至PD-L1之Fab片段包含含SEQ ID NO:152之胺基酸序列之重鏈可變區(VH PD-L1)及含SEQ ID NO:153之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL PD-L1)。
在一特定態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其中 (i)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之輕鏈可變區，且 (ii)能夠特異性結合至CD19之第二Fab片段包含含SEQ ID NO:152之胺基酸序列之重鏈可變區VH及含SEQ ID NO:153之胺基酸序列之輕鏈可變區VL。
在一特定態樣中，雙特異性抗原結合分子包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:193之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的兩個多肽及與SEQ ID NO:194之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:193之多肽序列、SEQ ID NO:67之兩個多肽序列及SEQ ID NO:194之多肽序列。
亦揭示具有與4-1BB之單價結合之抗原結合分子(1+1形式)。因此，提供雙特異性抗原結合分子，其包含與SEQ ID NO: 65之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:195之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO:67之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽及與SEQ ID NO:194之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含SEQ ID NO:65之多肽序列、SEQ ID NO:195之多肽序列、SEQ ID NO:67之多肽序列及SEQ ID NO:194之多肽序列。降低 Fc 受體結合及 / 或效應子功能之 Fc 域 修飾
本發明之雙特異性抗原結合分子進一步包含由能夠穩定締合之第一及第二子單元構成之Fc域。
在某些態樣中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供之抗體的Fc區中，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，其在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如，取代)。
Fc域賦予本發明之雙特異性抗體有利的藥物動力學特性，包括長血清半衰期，其促進靶組織中之良好累積及有利的組織-血液分佈率。然而，其同時可引起本發明之雙特異性抗體不合需要地靶向表現Fc受體之細胞並非較佳的攜帶抗原之細胞。因此，在特定實施例中，本發明之雙特異性抗體之Fc域與原生IgG Fc域(尤其IgG1 Fc域或IgG4 Fc域)相比展現降低之對Fc受體的結合親和力及/或降低之效應子功能。更特定言之，Fc域為IgG1 Fc域。
在一個該態樣中，Fc域(或包含該Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子)與原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子)相比展現低於50%、較佳低於20%、更佳低於10%且最佳低於5%的對Fc受體之結合親和力，及/或與原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子)相比低於50%、較佳低於20%、更佳低於10%且最佳低於5%的效應子功能。在一個態樣中，Fc域(或包含該Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子)不會實質上結合至Fc受體及/或誘導效應子功能。在一特定態樣中，Fc受體為Fcγ受體。在一個態樣中，Fc受體為人類Fc受體。在一個態樣中，Fc受體為活化Fc受體。在一具體態樣中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之，人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具體言之，人類FcγRIIIa。在一個態樣中，Fc受體為抑制Fc受體。在一具體態樣中，Fc受體為抑制人類Fcγ受體，更具體言之人類FcγRIIB。在一個態樣中，效應子功能為CDC、ADCC、ADCP及細胞介素分泌中之一或多者。在一特定態樣中，效應子功能為ADCC。在一個態樣中，Fc域對新生兒Fc受體(FcRn)展現的結合親和力與原生IgG1 Fc域相比實質上類似。當Fc域(或包含該Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子)展現大於約70%，特定言之大於約80%，更特定言之大於約90%的原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子)對FcRn的結合親和力時，實現實質上類似的與FcRn之結合。
在一特定態樣中，與未經工程改造之Fc域相比，Fc域經工程改造，從而對Fc受體之結合親和力減小及/或效應子功能降低。在一個特定態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子之Fc域包含一或多個降低Fc域對Fc受體之結合親和力及/或效應子功能的胺基酸突變。通常，Fc域之兩個子單元中之各者中存在相同的一或多個胺基酸突變。在一個態樣中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體的結合親和力減小。在另一態樣中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體之結合親和力減小至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一個態樣中，包含經工程改造之Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子與包含未經工程改造之Fc域的本發明之雙特異性抗體相比展現小於20%、尤其小於10%、更尤其小於5%的對Fc受體之結合親和力。在一特定態樣中，Fc受體為Fcγ受體。在其他態樣中，Fc受體為人類Fc受體。在一個態樣中，Fc受體為抑制Fc受體。在一具體態樣中，Fc受體為抑制人類Fcγ受體，更具體言之人類FcγRIIB。在一些態樣中，Fc受體為活化Fc受體。在一具體態樣中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之，人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具體言之，人類FcγRIIIa。較佳地，與此等受體中之各者的結合減少。在一些態樣中，對互補組分之結合親和力，特定言之對C1q之結合親和力亦減小。在一個態樣中，對新生兒Fc受體(FcRn)的結合親和力未減小。與FcRn之實質上類似結合，亦即保留Fc域對該受體之結合親和力在Fc域(或包含該Fc域之本發明之雙特異性抗原結合分子)呈現大於約70%之非工程改造形式之Fc域(或包含該非工程改造形式之Fc域之本發明之雙特異性抗原結合分子)對FcRn之結合親和力時實現。Fc域或包含該Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子可以展現大於約80%且甚至大於約90%的該親和力。在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子之Fc域經工程改造以具有與非工程改造之Fc域相比降低之效應子功能。降低之效應子功能可包括但不限於以下中之一或多者：降低之補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、降低之抗體依賴性細胞噬菌作用(ADCP)、降低之細胞介素分泌、降低之抗原呈遞細胞之免疫複合物介導之抗原攝取、降低之與NK細胞之結合、降低之與巨噬細胞之結合、降低之與單核球之結合、降低之與多形核細胞之結合、降低之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、降低之樹突狀細胞成熟或降低之T細胞激活。
具有降低之效應子功能之抗體包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的抗體(美國專利第6,737,056號)。該Fc突變體包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者之取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」 Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。描述具有改善或減弱之與FcR之結合的某些抗體變異體。(例如，美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312及Shields, R.L.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。
在本發明之一個態樣中，Fc域包含在位置E233、L234、L235、N297、P331及P329處之胺基酸取代。在一些態樣中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A (「LALA」)。在一個該實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之人類IgG1 Fc域。在一個態樣中，Fc域包含在位置P329處之胺基酸取代。在一更具體態樣中，胺基酸取代為P329A或P329G，特定言之P329G。在一個實施例中，Fc域包含在位置P329處之胺基酸取代及選自由以下組成之群的另一胺基酸取代：E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在更特定實施例中，Fc域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」)。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全破壞人類IgG1 Fc域之Fcγ受體結合，如PCT專利申請案第WO 2012/130831 A1號中所述。該文獻亦描述製備該等突變Fc域之方法及測定其特性(諸如Fc受體結合或效應子功能)的方法。該抗體為具有突變L234A及L235A或具有突變L234A、L235A及P329G之IgG1 (根據Kabat等人之EU索引編號，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)。
在一個態樣中，Fc域為IgG4 Fc域。在一更具體實施例中，Fc域為包含在位置S228 (Kabat編號)處之胺基酸取代(特定言之，胺基酸取代S228P)的IgG4 Fc域。在一更具體實施例中，Fc域為IgG4 Fc域，其包含胺基酸取代L235E及S228P以及P329G。此胺基酸取代減少活體內IgG4抗體之Fab臂交換(參見Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010))。
半衰期延長且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn) (Guyer, R.L.等人，J. Immunol. 117 (1976) 587-593；及Kim, J.K.等人，J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)之結合改善的抗體描述於US 2005/0014934中。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該等取代改善Fc區與FcRn之結合。該等Fc變異體包括具有在一或多個Fc區殘基處之取代之變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan, A.R.及Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。
與Fc受體之結合可容易測定，例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)，且可諸如藉由重組表現來獲得Fc受體。適合的該結合檢定描述於本文中。或者，Fc域或包含Fc域之細胞活化雙特異性抗原結合分子對Fc受體的結合親和力可使用已知表現特定Fc受體的細胞株(諸如表現FcγIIIa受體的人類NK細胞)評估。可藉由此項技術中已知之方法量測Fc域、或包含Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子的效應子功能。適用於量測ADCC之檢定描述於本文中。用於評估所關注分子之ADCC活性的活體外檢定之其他實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人 Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)；及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)中。可替代地，可採用非放射性檢定方法(參見例如用於流動式細胞量測術之ACTI™非放射性細胞毒性檢定(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性檢定(Promega, Madison, WI))。適用於該等檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。可替代地或另外，可以在活體內，例如在動物模型中，諸如Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示之動物模型中評估所關注分子之ADCC活性。
以下部分描述本發明之雙特異性抗原結合分子的較佳態樣，其包含降低Fc受體結合及/或效應子功能之Fc域修飾。在一個態樣中，本發明係關於包含以下之雙特異性抗原結合分子：(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中Fc域包含降低抗體對Fc受體(特定言之對Fcγ受體)之結合親和力的一或多個胺基酸取代。在另一態樣中，本發明係關於包含以下之雙特異性抗原結合分子：(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中Fc域包含降低效應子功能之一或多個胺基酸取代。在另一態樣中，本發明係關於包含以下之雙特異性抗原結合分子：(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中與原生IgG1 Fc域相比，該Fc域展現與Fc受體、特定言之Fcγ受體之降低之結合親和力及/或降低之效應子功能，特定言之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。在另一態樣中，本發明係關於包含以下之雙特異性抗原結合分子：(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中Fc域包含降低與Fc受體之結合及/或效應子功能的一或多個胺基酸取代，特定言之其中該一或多個胺基酸取代在選自L234、L235及P329 (Kabat EU索引編號)之群的一或多個位置處。在另一態樣中，本發明係關於包含以下之雙特異性抗原結合分子：(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中Fc域之各子單元包含降低與活化Fc受體之結合及/或效應子功能的三個胺基酸取代，其中該等胺基酸取代為L234A、L235A及P329G (Kabat EU索引編號)。在特定態樣中，Fc域係具有胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)的人類IgG1子類別。促進雜二聚化之 Fc 域修飾
本發明之雙特異性抗原結合分子包含與Fc域之兩個子單元的一個或另一個融合的不同抗原結合位點，因此Fc域之兩個子單元可包含於兩個不一致多肽鏈中。此等多肽之重組共表現及後續二聚化產生兩種多肽之若干種可能的組合。為提高重組產生中本發明之雙特異性抗原結合分子的產量及純度，因此將適宜在本發明之雙特異性抗原結合分子之Fc域中引入促進所要多肽締合之修飾。
因此，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)至少一個能夠特異性結合至4-1BB之抗原結合域，(b)至少一個能夠特異性結至靶細胞抗原之抗原結合域，及(c)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元的Fc域，其中Fc域包含促進Fc域之第一及第二子單元締合的修飾。人類IgG Fc域中之兩個子單元之間最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點位於Fc域之CH3域中。因此，在一個態樣中，該修飾存在於Fc域之CH3域中。
在一特定態樣中，該修飾為所謂的「杵-臼」修飾，其包含Fc域之兩個子單元中之一者中的「杵」修飾及Fc域之兩個子單元中之另一者中的「臼」修飾。因此，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其中在該Fc域之第一子單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積的胺基酸殘基置換，從而在該第一子單元之CH3域內產生可定位於該第二子單元之CH3域內之凹穴中的隆凸，且在該Fc域之第二子單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積的胺基酸殘基置換，從而在該第二子單元之CH3域內產生該第一子單元之CH3域內之該隆凸可定位於其中的凹穴。因此，提供一種雙特異性抗原分子，其包含：(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中根據杵-臼方法，Fc域之第一子單元包含杵，且Fc域之第二子單元包含臼。特定言之，具有較大側鏈體積之該胺基酸殘基選自由以下組成之群：精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)，且具有較小側鏈體積之該胺基酸殘基選自由以下組成之群：丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。在一個態樣中，在Fc域之第一子單元中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二子單元中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)，且視情況，在Fc域之第二子單元中，位置366處之蘇胺酸殘基另外經絲胺酸殘基置換(T366S)，且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A) (所有均根據Kabat EU索引編號)。在一特定態樣中，Fc域之第一子單元包含胺基酸取代S354C及T366W (根據Kabat EU索引編號)且Fc域之第二子單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
杵-臼技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，該方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入相應凹穴(「臼」)，使得隆凸可定位於凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構建隆凸。大小與隆凸相同或類似之補償性凹穴係在第二多肽之界面中藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈來形成。
因此，在一個態樣中，在本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc域的第一子單元的CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在第一子單元之CH3域內產生可定位於第二子單元之CH3域內的凹穴中之隆凸，且在Fc域之第二子單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在第二子單元之CH3域內產生第一子單元之CH3域內之隆凸可定位於其中之凹穴。隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸，例如藉由定點突變誘發或藉由肽合成來產生。在一具體態樣中，在Fc域之第一子單元之CH3域中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二子單元之CH3域中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)。在一個態樣中，在Fc域之第二子單元中，位置366之蘇胺酸殘基另外經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)。
在又一態樣中，在Fc域之第一子單元中，位置354之絲胺酸殘基另外經半胱胺酸殘基置換(S354C)，且在Fc域之第二子單元中，位置349之酪胺酸殘基另外經半胱胺酸殘基置換(Y349C)。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得Fc域之兩個子單元之間形成二硫橋鍵，進一步穩定二聚體(Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15)。在一特定態樣中，Fc域之第一子單元包含胺基酸取代S354C及T366W (EU編號)，且Fc域之第二子單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
在一替代性態樣中，促進Fc域之第一及第二子單元之締合的修飾包含介導靜電轉向作用之修飾，例如如PCT公開案WO 2009/089004中所描述。一般而言，此方法涉及用帶電胺基酸殘基置換兩個Fc域子單元之界面處之一或多個胺基酸殘基，使得均二聚體形成在靜電上不利，但雜二聚化在靜電上係有利的。
如本文所報導之雙特異性抗體之重鏈的C端可為以胺基酸殘基PGK結束之完整C端。重鏈之C端可為縮短C端，其中已移除一個或兩個C端胺基酸殘基。在一個較佳態樣中，重鏈之C端為以PG結束之縮短C端。在如本文所報導之所有態樣之一個態樣中，如本文所指定之包含包括C端CH3域之重鏈的雙特異性抗體包含C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在如本文所報導之所有態樣中之一個實施例中，如本文所指定之包含包括C端CH3域之重鏈的雙特異性抗體包含C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。CH1/CL 域之修飾
為進一步改善正確配對，雙特異性抗原結合分子可含有不同帶電胺基酸取代(所謂的「帶電殘基」)。將此等修飾引入交叉或非交叉CH1及CL域中。在一特定態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其中在CL域中之至少一者中，位置123 (EU編號)處之胺基酸經精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)處之胺基酸經離胺酸(K)取代，且其中在CH1域中之至少一者中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸經麩胺酸(E)取代。更特定言之，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其中在結合至4-1BB之Fab域之CL域中，位置123 (EU編號)處之胺基酸已經精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)處之胺基酸已經離胺酸(K)取代，且其中在結合至4-1BB之Fab域之CH1域中，位置147 (EU編號)處及位置213 (EU編號)處之胺基酸已經麩胺酸(E)取代。
在一個態樣中，提供雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中第二Fab片段(b)在Fab重鏈之C端融合至第一Fab片段(a)之Fab重鏈之N端，該第一Fab片段(a)之Fab重鏈繼而在其C端融合至第一Fc域子單元之N端，且第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至第二Fc域子單元之N端，其中在能夠特異性結合至靶細胞抗原之第三Fab片段中，(i)可變域VL及VH相互置換，或(ii)恆定域CL及CH1相互置換，且其中在能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K) ((根據Kabat EU索引編號)取代，且位置123處之胺基酸經精胺酸(R)或離胺酸(K) (根據Kabat EU索引編號)取代，且其中在能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E) (根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E) (根據Kabat EU索引編號)取代。Fab 域之修飾
本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中在能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段中，(i) Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區VL及VH相互置換，或(ii) Fab輕鏈及Fab重鏈之恆定區CL及CH1相互置換。因此根據互換單抗(Crossmab)技術製備雙特異性抗體。
在一個結合臂中具有結構域置換/交換的多特異性抗體(互換單抗VH-VL或互換單抗CH-CL)詳細描述於WO2009/080252及Schaefer, W.等人，PNAS, 108 (2011) 11187-1191中。其明顯地減少由針對第一抗原之輕鏈與針對第二抗原之錯誤重鏈失配(與沒有該結構域交換之方法相比較)而造成的副產物。
在一個態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其中在能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段中，(i) Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區VL及VH相互置換，或(ii) Fab輕鏈及Fab重鏈之恆定區CL及CH1相互置換，其中在第二Fab片段中，恆定域CL及CH1相互置換，使得CH1域為輕鏈之一部分，且CL域為重鏈之一部分(CH-CL互換單抗)。在另一態樣中，在第二Fab片段中，可變域VL及VH相互置換，使得VH域為輕鏈之一部分，且VL域為重鏈之一部分(VH-VL互換單抗)。更特定言之，在能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段中，Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區VL及VH相互置換，使得VH域為輕鏈之一部分，且VL域為重鏈之一部分。 聚核苷酸
本發明進一步提供編碼如本文所述之雙特異性抗原結合分子的經分離之聚核苷酸或其片段。
編碼本發明之雙特異性抗原結合分子之經分離之聚核苷酸可表現為編碼整個抗原結合分子之單個聚核苷酸或共表現的多個(例如兩個或更多個)聚核苷酸。由共表現之聚核苷酸編碼之多肽可經由例如二硫鍵或其他手段締合，以形成功能性抗原結合分子。舉例而言，免疫球蛋白之輕鏈部分可由來自免疫球蛋白之重鏈部分的單獨聚核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽與輕鏈多肽締合以形成免疫球蛋白。
在一些態樣中，經分離之聚核苷酸編碼如本文所述之根據本發明之雙特異性分子中所包含的多肽。
在一個態樣中，本發明係針對編碼雙特異性抗原結合分子之經分離之聚核苷酸，該雙特異性抗原結合分子包含：(a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段，(b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段，(c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及(d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段各自包含：重鏈可變區(VH 4-1BB)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL 4-1BB)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之CDR-L3。
在某些實施例中，該聚核苷酸或核酸為DNA。在其他實施例中，本發明之聚核苷酸為RNA，例如呈信使RNA (mRNA)形式。本發明之RNA可為單股或雙股RNA。 重組方法
本發明之雙特異性抗原結合分子可例如藉由重組生成獲得。對於重組生成，提供一或多個編碼雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之聚核苷酸。一或多個編碼雙特異性抗原結合分子之聚核苷酸經分離且插入至一或多個載體中以用於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該聚核苷酸可使用習知程序容易地分離及測序。在本發明之一個態樣中，提供包含本發明之聚核苷酸中之一或多者的載體，較佳為表現載體。可使用熟習此項技術者熟知的方法構建含有雙特異性抗原結合分子(片段)之編碼序列以及適當轉錄/轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見例如Maniatis等人，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)中所述之技術。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括表現卡匣，將編碼雙特異性抗原結合分子或其多肽片段(亦即，編碼區)之聚核苷酸以與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作地締合之方式選殖至該表現卡匣中。如本文所用，「編碼區」為由轉譯成胺基酸之密碼子組成的核酸之一部分。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)未轉譯成胺基酸，但可將其視為編碼區(若存在)之一部分，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'非轉譯區及類似序列)不為編碼區之一部分。兩個或更多個編碼區可存在於單個聚核苷酸構建體中，例如，在單個載體上，或在單獨聚核苷酸構建體中，例如，在單獨(不同)載體上。此外，任何載體可含有單個編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如，本發明之載體可編碼一或多個多肽，其經由蛋白水解裂解以後轉譯或共轉譯方式分離成最終蛋白質。另外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼異源編碼區，其融合或未融合至編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段的聚核苷酸，或其變異體或衍生物。異源編碼區包括但不限於專用元件或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能域。可操作地締合為在基因產物(例如，多肽)之編碼區以使得將基因產物之表現置於調節序列之影響或控制下的方式與一或多個調節序列締合時。若誘導啟動子功能導致編碼所要基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間連接的性質不干擾表現調節序列引導基因產物表現的能力或不干擾DNA模板轉錄的能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其締合的啟動子)為「可操作地締合」。因此，若啟動子能夠實現核酸轉錄，則啟動子區與編碼多肽之核酸可操作地締合。啟動子可為僅引導預定細胞中之DNA實質性轉錄的細胞特異性啟動子。除啟動子以外的其他轉錄控制元件(例如增強子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可與引導細胞特異性轉錄之聚核苷酸可操作地締合。
適合之啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。多個轉錄控制區已為熟習此項技術者所知。此等區域包括但不限於在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如但不限於啟動子及增強子區段，其來自巨細胞病毒(例如即刻早期啟動子，連同內含子-A)、猴病毒40 (例如早期啟動子)及逆轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔â-血球蛋白)之區域，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。額外適合轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子以及誘導性啟動子(例如啟動子誘導性四環素(tetracyclin))。類似地，多種轉譯控制元件已為一般熟習此項技術者所知。此等元件包括但不限於核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，以及來源於病毒系統的元件(特定言之，內部核糖體入口位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特點，諸如複製起點，及/或染色體整合元件，諸如逆轉錄病毒長末端重複序列(LTR)，或腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌性肽或信號肽的額外編碼區締合，從而引導由本發明之聚核苷酸編碼的多肽之分泌。舉例而言，若需要分泌雙特異性抗原結合分子或其多肽片段，則編碼信號序列之DNA可置於編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段的核酸上游。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌之蛋白質具有信號肽或分泌性前導序列，一旦生長蛋白質鏈跨越粗糙內質網之輸出已起始，該信號肽或分泌性前導序列自成熟蛋白裂解。一般熟習此項技術者認識到，脊椎動物細胞分泌的多肽通常具有與多肽之N端融合的信號肽，該信號肽自所轉譯之多肽裂解以產生呈分泌或「成熟」形式的多肽。在某些實施例中，使用原生信號肽，例如，免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽，或該序列之功能衍生物，該功能衍生物保留引導與其可操作地締合之多肽分泌的能力。可替代地，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶之前導序列取代。
可用以促進後續純化(例如，組胺酸標籤)或有助於標記融合蛋白的編碼短蛋白質序列之DNA可包括在編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之聚核苷酸之內或末端。
在本發明之另一態樣中，提供包含一或多種本發明之聚核苷酸的宿主細胞。在某些態樣中，提供包含一或多種本發明之載體的宿主細胞。聚核苷酸及載體可單獨或組合地合併本文分別與聚核苷酸及載體相關描述之任一特點。在一個態樣中，宿主細胞包含含聚核苷酸之載體(例如，已經該載體轉型或轉染)，該聚核苷酸編碼本發明之雙特異性抗原結合分子(之一部分)。如本文所用，術語「宿主細胞」係指任何種類之可經工程改造以產生本發明之融合蛋白或其片段的細胞系統。適用於複製及支持抗原結合分子之表現的宿主細胞為此項技術中熟知。該等細胞可視需要經特定表現載體轉染或轉導，且可生長含有大量載體之細胞以用於接種大型醱酵槽，以獲得足量的抗原結合分子以用於臨床應用。適合之宿主細胞包括原核微生物，諸如大腸桿菌，或各種真核細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似細胞。舉例而言，可在細菌中生產多肽，尤其在不需要糖基化時。在表現之後，可自可溶性餾分之細菌細胞糊狀物分離出多肽且可將該多肽進一步純化。除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於編碼多肽之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而產生具有部分或完全人類糖基化型態之多肽的真菌及酵母菌株。參見Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)，及Li等人，Nat Biotech 24, 210-215 (2006)。
適用於表現(糖基化)多肽的宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物細胞及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述利用轉殖基因植物產生抗體的PLANTIBODIESTM 技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40轉型的猴腎CV1株(COS-7)；人類胚腎細胞株(293或293T細胞，如例如Graham等人，J Gen Virol 36, 59 (1977)中所述)；嬰兒倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cells) (TM4細胞，如例如Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(海拉細胞(HELA))；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell) (BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather等人，Annals N. Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)中所述)；MRC 5細胞及FS4細胞。其他適用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr-CHO細胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適用於蛋白質產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki及Wu, Methods in Molecular Biology, 第248卷(B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁(2003)。宿主細胞包括經培養細胞，例如哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞(僅舉數例)，且亦包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內所包含的細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在此等系統中表現外源基因之標準技術為此項技術中已知的。表現包含免疫球蛋白之重鏈或輕鏈之多肽的細胞可經工程改造以亦表現免疫球蛋白鏈中之另一者，使得所表現產物為具有重鏈及輕鏈的免疫球蛋白。
在一個態樣中，提供產生本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段的方法，其中該方法包含在適於表現本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段的條件下培養如本文所提供的包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段之聚核苷酸的宿主細胞，且自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收本發明之雙特異性抗原結合分子或其多肽片段。
如本文所述製備之本發明之雙特異性分子可藉由此項技術中已知的技術(諸如高效液相層析法、離子交換層析法、凝膠電泳、親和力層析法、尺寸排阻層析法及其類似技術)純化。用於純化特定蛋白質的實際條件部分地視諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素而定，且對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。對於親和力層析純化，可使用雙特異性抗原結合分子結合之抗體、配位體、受體或抗原。舉例而言，對於本發明之融合蛋白之親和力層析純化，可使用具有蛋白A或蛋白G之基質。可使用序列蛋白A或G親和力層析及尺寸排阻層析來分離基本上如實例中所描述之抗原結合分子。雙特異性抗原結合分子或其片段之純度可藉由多種熟知分析方法中之任一者測定，包括凝膠電泳、高壓液相層析法及其類似方法。舉例而言，如實例中所述表現之雙特異性抗原結合分子顯示為完整的且如還原及非還原SDS-PAGE所證明適當地裝配。檢定
本文所提供之雙特異性抗原結合分子可藉由此項技術中已知的各種檢定，針對其物理/化學特性及/或生物學活性加以鑑別、篩選或表徵。1. 親和力檢定
本文所提供之雙特異性抗原結合分子、抗體及抗體片段對4-1BB及靶細胞抗原之親和力可根據實例中所闡述之方法，藉由表面電漿子共振(SPR)，使用諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)之標準儀器來測定，且受體或靶蛋白諸如可藉由重組表現獲得。雙特異性抗原結合分子對靶細胞抗原之親和力亦可藉由表面電漿子共振(SPR)，使用諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)之標準儀器測定，且受體或靶蛋白諸如可藉由重組表現獲得。用於量測結合親和力之具體說明性及例示性實施例描述於實例1.2中。根據一個態樣，藉由表面電漿子共振使用BIACORE® T100機器(GE Healthcare)在25℃下量測KD 。2. 結合檢定及其他檢定
本文所提供之雙特異性抗原結合分子與表現相應受體之細胞的結合可例如藉由流動式細胞量測術(FACS)使用表現特定受體或靶抗原之細胞株評估。在一個態樣中，表現4-1BB之報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2用於結合檢定。在另一態樣中，表現靶細胞抗原(例如FAP或CEA)之癌細胞株用於證明抗原結合分子與靶細胞抗原之結合。
在另一態樣中，可使用競爭檢定來鑑別分別與結合至靶或4-1BB之特異性抗體或抗原結合分子競爭之抗原結合分子。在某些實施例中，此類競爭抗原結合分子結合至同一抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)，其與特異性抗靶抗體或特異性抗4-1BB抗體結合。用於對抗體所結合之抗原決定基進行映射的詳細例示性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols,」，於Methods in Molecular Biology 第66卷(Humana Press, Totowa, NJ)中。3. 活性檢定
在一個態樣中，提供用於鑑別結合至具有生物活性之特異性靶細胞抗原及4-1BB之雙特異性抗原結合分子的檢定。生物活性可包括例如經由表現靶細胞抗原之細胞上的4-1BB進行的促效性信號傳導。亦提供由該等檢定鑑別為在活體外具有該生物活性的雙特異性抗原結合分子。
在某些態樣中，測試本發明之雙特異性抗原結合分子的該生物活性。此外，用於偵測細胞溶解(例如藉由量測LDH釋放)、誘導之細胞凋亡動力學(例如藉由量測卡斯蛋白酶3/7活性)或細胞凋亡(例如使用TUNEL檢定)之檢定為此項技術中熟知的。另外，該等複合物之生物活性可藉由評估其對多種淋巴細胞子集(諸如NK細胞、NKT細胞或γδ T細胞)之存活、增殖及淋巴激素分泌之作用或評估其調節抗原呈遞細胞(諸如樹突狀細胞、單核球/巨噬細胞或B細胞)之表型及功能的能力來評估。 醫藥組合物、調配物及投與途徑
在另一態樣中，本發明提供包含一或多種本文所提供之雙特異性抗原結合分子之醫藥組合物，例如以用於以下治療方法中之任一者。在一個實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之雙特異性抗原結合分子中之任一者及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在另一實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之雙特異性抗原結合分子中之任一者及至少一種額外治療劑，例如如下文所述。
本發明之醫藥組合物包含治療有效量之一或多種雙特異性抗原結合分子，其溶解或分散於醫藥學上可接受之賦形劑中。片語「醫藥學上或藥理學上可接受」係指分子實體及組合物在所用劑量及濃度下對於接受者而言一般為無毒性的，亦即視需要向動物(諸如人類)投與時，不會產生不良的過敏反應或其他不良反應。含有至少一種根據本發明之雙特異性抗原結合分子及視情況選用之額外活性成分之醫藥組合物之製備將根據本發明為熟習此項技術者已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版Mack Printing Company, 1990所例示，其以引用之方式併入本文中。特定言之，組合物為凍乾調配物或水溶液。如本文中所用，「醫藥學上可接受之賦形劑」包括任何及所有溶劑、緩衝液、分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、鹽、穩定劑及其組合，如一般熟習此項技術者將已知。
非經腸組合物包括為藉由注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)投藥所設計的彼等組合物。注射時，本發明之雙特異性抗原結合分子可於水溶液中調配，較佳於生理上相容的緩衝液(諸如漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩衝液)中調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。可替代地，雙特異性抗原結合分子可呈用於在使用之前用適合之媒劑(例如無菌無熱原質水)復原的粉末形式。無菌可注射溶液藉由將所要量之本發明之抗原結合分子視需要與下文所列舉的多種其他成分一起併入適當溶劑中來製備。無菌性可容易地藉由例如用無菌過濾膜過濾來實現。一般而言，分散液係藉由將各種滅菌活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其由活性成分加任何額外所要成分的預先無菌過濾之液體介質得到該活性成分加任何額外所要成分之粉末。視需要，液體介質應適合地經緩衝，且在與足量鹽水或葡萄糖一起注射之前，首先使液體稀釋劑呈等張性。該組合物在製造及儲存條件下必須為穩定的，且必須避免諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。應瞭解，內毒素污染應最低限度地保持在安全水準，例如低於0.5 ng/mg蛋白質。醫藥學上可接受之賦形劑包括但不限於：緩衝液，諸如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯苄烷銨；苄索氯銨；酚，丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬複合物(例如，Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增大懸浮液之黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、聚葡萄糖或其類似化合物。視情況，懸浮液亦可含有適合之穩定劑或增大化合物可溶性以允許製備高度濃縮之溶液之藥劑。另外，活性化合物之懸浮液可視需要製備成油性注射懸浮液。適合之親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。
活性成分可包覆於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合法所製備之微膠囊，例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；包覆於膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版, Mack Printing Company, 1990)中。可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形製品形式，例如膜或微膠囊。在特定實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來達成。
本文中之例示性醫藥學上可接受之賦形劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)。某些例示性sHASEGP (包括rHuPH20)及使用方法描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種額外葡萄糖胺聚醣酶，諸如軟骨素酶組合。
例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利案第6,171,586號及WO 2006/044908中所述之調配物，後一調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
除了先前描述之組合物之外，抗原結合分子亦可調配為儲槽式製劑。該等長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內植入)或藉由肌肉內注射來投與。因此，例如，融合蛋白可用適合的聚合或疏水性材料(例如呈可接受之油中的乳液形式)或離子交換樹脂調配，或調配成微溶性衍生物，例如微溶性鹽。
包含本發明之雙特異性抗原結合分子的醫藥組合物可藉助於習知混合、溶解、乳化、囊封、包覆或凍乾法製造。醫藥組合物可使用有利於將蛋白質處理成可在醫藥學上使用之製劑的一或多種生理學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑，以習知方式調配。適當調配物視所選擇之投藥途徑而定。
雙特異性抗原結合分子可以調配成游離酸或鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽為實質上保持游離酸或鹼之生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如，由蛋白質組合物之游離胺基形成之鹽，或該等鹽由例如鹽酸或磷酸之無機酸或諸如乙酸、乙二酸、酒石酸或杏仁酸之有機酸形成。與游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。相較於相應的游離鹼形式，醫藥鹽傾向於更可溶於水性及其他質子性溶劑中。
本文中之組合物亦可含有超過一種為所治療之特定適應症所必需之活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之互補活性的活性成分。該等活性成分宜以有效達成預期目的之量的組合存在。
用於活體內投與之調配物一般為無菌的。無菌性可容易地藉由例如用無菌過濾膜過濾來實現。 治療方法及組合物
本文所提供之雙特異性抗原結合分子中之任一者可用於治療方法中。為了用於治療方法中，本發明之雙特異性抗原結合分子可以符合良好醫學實踐的方式調配、給藥及投與。在此情形中考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症病因、藥劑遞送位點、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知之其他因素。
在一個態樣中，提供本發明之雙特異性抗原結合分子，其用作藥物。
在其他態樣中，提供本發明之雙特異性抗原結合分子，其用於(i)刺激或增強T細胞反應，(ii)用於支持活化T細胞之存活，(iii)用於治療癌症，(iv)用於延遲癌症惡化，或(v)用於延長罹患癌症之患者之存活。在一特定態樣中，提供本發明之雙特異性抗原結合分子，其用於治療疾病，尤其用於治療癌症。
在某些態樣中，提供本發明之雙特異性抗原結合分子，其用於治療方法。在一個態樣中，本發明提供如本文所述之雙特異性抗原結合分子，其用於治療有需要之個體的疾病。在某些態樣中，本發明提供雙特異性抗原結合分子，其用於治療患有疾病之個體的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之雙特異性抗原結合分子。在某些態樣中，待治療之疾病為癌症。需要治療之個體、患者或「個體」通常係哺乳動物，更具體言之係人類。
在一個態樣中，提供一種方法，其用於(i)刺激或增強T細胞反應，(ii)支持活化T細胞之存活，(iii)治療癌症，(iv)延遲癌症惡化或(v)延長罹患癌症之患者之存活，其中該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明之雙特異性抗原結合分子。
在另一態樣中，本發明提供本發明之雙特異性抗原結合分子的用途，其用於製造或製備用以治療有需要之個體之疾病的藥物。在一個態樣中，藥物用於治療疾病之方法，該方法包含向患有疾病之個體投與治療有效量之藥物。在某些態樣中，待治療之疾病係增殖性病症，特定言之癌症。癌症之實例包括但不限於膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎癌。癌症之其他實例包括癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤及白血病。可使用本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體治療的其他細胞增殖病症包括但不限於定位於以下部位中之贅瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系統、肝臟、胰臟、腹膜、內分泌腺體(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼部、頭頸部、神經系統(中樞及周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸部區域及泌尿生殖系統。亦包括癌前病況或病灶及癌症轉移。在某些實施例中，癌症選自由以下組成之群：腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌。熟習此項技術者容易認識到在多數情況下，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體可能不提供治癒但可提供益處。在一些實施例中，具有一些益處之生理變化亦視為治療上有益的。因此，在一些態樣中，提供生理變化的本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體之量視為「有效量」或「治療有效量」。
為預防或治療疾病，適當劑量之本發明之雙特異性抗原結合分子(在單獨或與一種或多種其他額外治療劑組合使用時)將視待治療之疾病類型、投藥途徑、患者體重、特異性分子、疾病之嚴重程度及病因(無論是否針對預防或治療目的投與本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體)、先前或同時的治療性干預、患者之臨床病史及對融合蛋白之反應及主治醫師之判斷而定。負責投藥的從業者將在任何情況下判定組合物中活性成分之濃度及適用於個別個體的劑量。本文中涵蓋各種給藥時程，包括但不限於單次投藥或經各個時間點多次投藥、團式投藥及脈衝式輸注。
本發明之雙特異性抗原結合分子適合一次性或經一連串治療向患者投與。視疾病類型及嚴重程度而定，雙特異性抗原結合分子之約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)可為初始候選劑量以用於向患者投與，例如無論是否藉由一或多次獨立投與，或藉由連續輸注。視上文所提及之因素而定，一個典型的日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或或更多之範圍內。對於歷經數日或更長時間之重複投與，視病況而定，治療一般將持續直至發生疾病症狀之所要遏制為止。本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體的一個例示性劑量將在約0.005 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。在其他實例中，劑量亦可包含每次投藥約1 μg/kg體重、約5 μg/kg體重、約10 μg/kg體重、約50 μg/kg體重、約100 μg/kg體重、約200 μg/kg體重、約350 μg/kg體重、約500 μg/kg體重、約1 mg/kg體重、約5 mg/kg體重、約10 mg/kg體重、約50 mg/kg體重、約100 mg/kg體重、約200 mg/kg體重、約350 mg/kg體重、約500 mg/kg體重至約1000 mg/kg體重或更多及其中可衍生之任何範圍。在來自本文中列舉之數值之可衍生範圍之實例中，基於上文所述之數值，可投與約0.1 mg/kg體重至約20 mg/kg體重、約5 μg/kg體重至約1 mg/kg體重等之範圍。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)之一或多種劑量。該等劑量可間歇性地投與，例如，每週或每三週(例如，以使得患者接受約兩次至約二十次、或例如約六次劑量之融合蛋白)。在一特定態樣中，將每三週投與雙特異性抗原結合分子。可投與初始較高起始劑量，隨後可投與一或多種較低劑量。然而，其他劑量方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及檢定來監測。
本發明之雙特異性抗原結合分子一般將以有效實現預期目的之量使用。為了用於治療或預防疾病狀況，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體或其醫藥組合物以治療有效量投與或應用。治療有效量之判定完全在熟習此項技術者之能力範圍內，尤其根據本文所提供之詳細揭示內容。
全身性投藥時，可首先利用活體外檢定(諸如細胞培養檢定)估算治療有效劑量。可隨後在動物模型中調配劑量以達成循環濃度範圍，包括如在細胞培養物中所測定之IC50 。該資訊可用於更準確地判定適用於人類之劑量。
初始劑量亦可自活體內資料(例如動物模型)、使用此項技術中熟知的技術估算。一般熟習此項技術者可容易基於動物資料而使向人類投藥最佳化。
可以獨立地調整劑量及間隔以提供足以維持治療作用的本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體的血漿含量。常見的患者注射投藥劑量在約0.1至50毫克/公斤/天，通常約0.1至1毫克/公斤/天之範圍內。治療有效血漿含量可藉由每日投與多次劑量來達成。血漿含量可藉由例如HPLC量測。
在局部投與或選擇性攝入之情況下，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體的有效局部濃度可能與血漿濃度無關。熟習此項技術者將能夠最佳化治療有效局部劑量而無需不當實驗。
本文所述之本發明之雙特異性抗原結合分子的治療有效劑量一般將提供治療益處而實質上不引起毒性。可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥學程序測定融合蛋白質之毒性及治療功效。可使用細胞培養檢定及動物研究來測定LD50 (50%群體致死劑量)及ED50 (50%群體治療有效劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比為治療指數，其可表示為比率LD50 /ED50 。較佳為呈現較大治療指數之雙特異性抗原結合分子。在一個態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體呈現高治療指數。自細胞培養檢定及動物研究獲得之資料可用於調配適用於人類的劑量範圍。劑量較佳在循環濃度範圍內，其包括毒性極小或無毒性之ED50。劑量可視多種因素而在此範圍內變化，該等因素例如所用劑型、所用投藥途徑、個體之條件及其類似因素。確切調配物、投藥途徑及劑量可由個別醫師鑒於患者之條件進行選擇(參見例如Fingl等人，1975，於：The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第1章第1頁中，其以全文引用之方式併入本文中)。
用本發明之雙特異性抗體治療之患者的主治醫師將知曉如何及何時因毒性、器官功能異常及其類似物而終止、中斷或調整投藥。相反，主治醫師亦將知曉若臨床反應不充足(排除毒性)，則將治療調整至較高水準。管理所關注病症時所投與之劑量的量值將隨待治療之病況的嚴重程度、投藥途徑及其類似因素而變化。病況之嚴重程度可例如部分地藉由標準預後評估方法來加以評估。此外，劑量及可能的給藥頻率亦將根據個別患者之年齡、體重及反應而變。 其他藥劑及治療
本發明之雙特異性抗原結合分子在療法中可單獨或與一或多種其他藥劑組合投與。舉例而言，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體可與至少一種額外治療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋可投與以用於治療需要該治療之個體之症狀或疾病的任何藥劑。該額外治療劑可包含適於治療特定適應症的任何活性成分，較佳為具有互補活性、彼此間無不利影響的彼等活性成分。在某些實施例中，另一種治療劑係另一種抗癌劑或化學治療劑，例如微管瓦解劑、抗代謝產物、拓樸異構酶抑制劑、DNA嵌入劑、烷化劑、蒽環黴素、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞細胞凋亡活化劑或抗血管生成劑。在某些態樣中，另一種治療劑為免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏著抑制劑、細胞毒性或細胞生長抑制劑、細胞凋亡活化劑或提高細胞對細胞凋亡誘導劑之靈敏度的藥劑。
在一個態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子與化學治療劑、輻射療法及/或用於癌症免疫療法之其他藥劑組合投與。化學治療劑係如上文所定義之抗癌劑。可替代地，化學治療劑選自由以下組成之群：核苷酸類似物(例如阿紮胞苷(azacitidine)、卡培他濱(capecitabine)、脫氧氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲或甲胺喋呤)、基於鉑之藥劑(例如卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)或奧沙利鉑(oxaliplatin))、紫杉烷(taxane) (例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、阿布拉生(abraxane)或克癌易(taxotere))、烷基化劑(例如環磷醯胺、苯丁酸氮芥、達卡巴嗪(dacarbazine或替莫唑胺(temozolomide))、蒽環黴素(anthracycline) (例如小紅莓(doxorubicin)或艾達黴素(idarubicin))、拓樸異構酶I抑制劑(例如伊立替康(irinotecan)或拓朴替康(topotecan))、拓樸異構酶II抑制劑(例如依託泊苷(etoposide)或替尼泊苷(teniposide))、激酶抑制劑(例如埃羅替尼(erlotinib)、伊馬替尼(imatinib)、維羅非尼(vemurafenib)或維莫德吉(vismodegib))、類視黃素、組蛋白脫乙醯基酶抑制劑及長春花生物鹼。用於癌症免疫療法之其他藥劑包括例如阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑，諸如PD1抗體(例如，派立珠單抗(pembrolizumab)或納武單抗(nivolumab))或PD-L1抗體(例如，阿特珠單抗(atezolizumab))。本發明之雙特異性抗原結合分子亦可與輻射療法組合使用。
該等其他藥劑適合地以能有效用於預期目的之量組合存在。該等其他藥劑之有效量視所使用之融合蛋白之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體一般以相同劑量及如本文所述之投與途徑，或約1至99%本文所述之劑量，或經驗上/臨床上判定為適當的任何劑量及任何途徑使用。
上文提及之該等組合療法涵蓋組合投與(其中相同或分開的組合物中包括兩種或更多種治療劑)以及分開投與，在此情況下，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體的投與可在額外治療劑及/或佐劑投與之前、同時及/或之後進行。在一個態樣中，投與雙特異性抗原結合分子及投與另一種治療劑彼此相隔在約一個月內，或在約一週、兩週或三週內，或在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內發生。 製品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上文所述之病症之材料的製品。製品包含容器及處於容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。適合之容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器容納單獨或與能有效治療、預防及/或診斷病況之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之雙特異性抗原結合分子。
標籤或藥品說明書指示組合物用於治療所選病況。另外，製品可包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中該組合物包含本發明之雙特異性抗原結合分子；及(b)其中含有組合物的第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病況之藥品說明書。
可替代地或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所要之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 表B (序列)：
SEQ ID NO: 名稱 序列
1 4-1BB (20H4.9) CDR-H1 GYYWS
2 4-1BB (20H4.9) CDR-H2 EINHGGYVTYNPSLES
3 4-1BB (20H4.9) CDR-H3 DYGPGNYDWYFDL
4 4-1BB (20H4.9) CDR-L1 RASQSVSSYLA
5 4-1BB (20H4.9) CDR-L2 DASNRAT
6 4-1BB (20H4.9) CDR-L3 QQRSNWPPALT
7 4-1BB (20H4.9) VH QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSS
8 4-1BB (20H4.9) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIK
9 FAP(4B9)  CDR-H1 SYAMS
10 FAP(4B9)  CDR-H2 AIIGSGASTYYADSVKG
11 FAP(4B9)  CDR-H3 GWFGGFNY
12 FAP(4B9)  CDR-L1 RASQSVTSSYLA
13 FAP(4B9)  CDR-L2 VGSRRAT
14 FAP(4B9)  CDR-L3 QQGIMLPPT
15 FAP (28H1) CDR-H1 SHAMS
16 FAP (28H1) CDR-H2 AIWASGEQYYADSVKG
17 FAP (28H1) CDR-H3 GWLGNFDY
18 FAP (28H1) CDR-L1 RASQSVSRSYLA
19 FAP (28H1) CDR-L2 GASTRAT
20 FAP (28H1) CDR-L3 QQGQVIPPT
21 FAP(4B9) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS
22 FAP(4B9) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK
23 FAP(28H1) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS
24 FAP(28H1) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK
25 CEA (A5B7)- CDR-H1 DYYMN
26 CEA (A5B7)- CDR-H2 FIGNKANGYTTEYSASVKG
27 CEA (A5B7)- CDR-H3 DRGLRFYFDY
28 CEA (A5B7)- CDR-L1 RASSSVTYIH
29 CEA (A5B7)- CDR-L2 ATSNLAS
30 CEA (A5B7)- CDR-L3 QHWSSKPPT
31 CEA (A5B7) VH (親本) EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS
32 CEA (A5B7) VL (親本) QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGGGTKLEIK
33 CEA (MFE23)- CDR-H1 DSYMH
34 CEA (MFE23)- CDR-H2 WIDPENGDTEYAPKFQG
35 CEA (MFE23)- CDR-H3 GTPTGPYYFDY
36 CEA (MFE23)- CDR-L1 SASSSVSYMH
37 CEA (MFE23)- CDR-L2 STSNLAS
38 CEA (MFE23)- CDR-L3 QQRSSYPLT
39 CEA (MFE23) VH QVKLQQSGAELVRSGTSVKLSCTASGFNIKDSYMHWLRQGPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTTVTVSS
40 CEA (MFE23) VL ENVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPLTFGAGTKLELK
41 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-H1 DTYMH
42 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-H2 RIDPANGNSKYVPKFQG
43 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-H3 FGYYVSDYAMAY
44 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-L1 RAGESVDIFGVGFLH
45 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-L2 RASNRAT
46 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-L3 QQTNEDPYT
47 CEA (T84.66-LCHA) VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS
48 CEA (T84.66-LCHA) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIK
49 CEA (CH1A1A 98/99)- CDR-H1 EFGMN
50 CEA (CH1A1A 98/99)- CDR-H2 WINTKTGEATYVEEFKG
51 CEA (CH1A1A 98/99)- CDR-H3 WDFAYYVEAMDY
52 CEA (CEA 2F1)- CDR-L1 KASAAVGTYVA
53 CEA (CEA 2F1)- CDR-L2 SASYRKR
54 CEA (CEA 2F1)- CDR-L3 HQYYTYPLFT
55 CEA (CH1A1A 98/99) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSS
56 CEA (CEA 2F1) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIK
57 CD19 (8B8-2B11) CDR-H1 DYIMH
58 CD19 (8B8-2B11) CDR-H2 YINPYNDGSKYTEKFQG
59 CD19 (8B8-2B11) CDR-H3 GTYYYGPQLFDY
60 CD19 (8B8-2B11) CDR-L1 KSSQSLETSTGTTYLN
61 CD19 (8B8-2B11) CDR-L2 RVSKRFS
62 CD19 (8B8-2B11) CDR-L3 LQLLEDPYT
63 CD19 (8B8-2B11) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSS
64 CD19 (8B8-2B11) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGTTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDPYTFGQGTKLEIK
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參表1
66 VLCH1 (4B9) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參表1
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參表1
68 VHCL-輕鏈(4B9) 參表1
69 Fc臼鏈 參表3
70 人類4-1BB抗原Fc杵鏈 參表3
71 VHCH1 (20H4.9)- 重鏈 HC1 (Fc臼) -VH (4B9) 參表4
72 VHCH1 (20H4.9)-重鏈HC2 (Fc杵) -VL (4B9) 參表4
73 VLCL-輕鏈(20H4.9) 參表4
74 VHCH1 (20H4.9)- 重鏈 HC1 (Fc臼) -VH (DP47) 參表6
75 VHCH1 (20H4.9)-重鏈HC2 (Fc杵) -VL (DP47) 參表6
76 VLCH1 (A5B7) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參表7
77 VHCL-輕鏈(A5B7) 參表7
78 VLCH1 (MFE23) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參表8
79 VHCL-輕鏈(MFE23) 參表8
80 VLCH1 (T84.66-LCHA) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參表9
81 VHCL-輕鏈(T84.66-LCHA) 參表9
82 VLCH1 (CEA 2F1) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參表10
83 VHCL-輕鏈(CEA CH1A1 98/99) 參表10
84 VLCH1 (2B11) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參表30
85 VHCL-輕鏈(2B11) 參表30
86 人類(hu) FAP UniProt編號Q12884
87 hu FAP胞外域+聚離胺酸標籤+his6 -標籤 RPSRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
88 小鼠FAP UniProt編號P97321
89 鼠類FAP胞外域+聚離胺酸標籤+his6 -標籤 RPSRVYKPEGNTKRALTLKDILNGTFSYKTYFPNWISEQEYLHQSEDDNIVFYNIETRESYIILSNSTMKSVNATDYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLQNGEFVRGYELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITYTGRENRIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPDGKFLAYVEFNDSDIPIIAYSYYGDGQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRVFIVDTTYPHHVGPMEVPVPEMIASSDYYFSWLTWVSSERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWHAWECPKNQEHVEESRTGWAGGFFVSTPAFSQDATSYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAIYIFRVTQDSLFYSSNEFEGYPGRRNIYRISIGNSPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSYKAKYYALVCYGPGLPISTLHDGRTDQEIQVLEENKELENSLRNIQLPKVEIKKLKDGGLTFWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVKSVFAVNWITYLASKEGIVIALVDGRGTAFQGDKFLHAVYRKLGVYEVEDQLTAVRKFIEMGFIDEERIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASIYSERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGILSGRSQNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
90 食蟹獼猴FAP胞外域+聚離胺酸標籤+his6 -標籤 RPPRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPFVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEDYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
91 人類CEA UniProt編號P06731
92 人類MCSP UniProt編號Q6UVK1
93 人類EGFR UniProt編號P00533
94 人類CD19 UniProt編號P15391
95 人類CD20 Uniprot編號P11836
96 人類CD33 UniProt編號P20138
97 人類4-1BB UniProt編號Q07011
98 鼠類4-1BB UniProt編號P20334
99 食蟹獼猴4-1BB Uniprot編號F6W5G6
100 肽連接子(G4S) GGGGS
101 肽連接子(G4S)2 GGGGSGGGGS
102 肽連接子(SG4)2 SGGGGSGGGG
103 肽連接子G4(SG4)2 GGGGSGGGGSGGGG
104 肽連接子 GSPGSSSSGS
105 (G4S)3 肽連接子 GGGGSGGGGSGGGGS3
106 (G4S)4 肽連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
107 肽連接子X GSGSGSGS
108 肽連接子X1 GSGSGNGS
109 肽連接子X2 GGSGSGSG
110 肽連接子X3 GGSGSG
111 肽連接子X4 GGSG
112 肽連接子X5 GGSGNGSG
113 肽連接子X6 GGNGSGSG
114 肽連接子X7 GGNGSG
115 CEA (A5H1EL1D)- CDR-H1 DYYMN
116 CEA (A5H1EL1D)- CDR-H2 FIGNKANAYTTEYSASVKG
117 CEA (A5H1EL1D)- CDR-H3 DRGLRFYFDY
118 CEA (A5H1EL1D)- CDR-L1 RASSSVTYIH
119 CEA (A5H1EL1D)- CDR-L2 ATSNLAS
120 CEA (A5H1EL1D)- CDR-L3 QHWSSKPPT
121 CEA (A5H1EL1D) VH (3-23A5-1E) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
122 CEA (A5H1EL1D) VL (A5-L1D) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
123 CEA (MFE-H24 to H29)- CDR-H1 DSYMH
124 CEA (MFE-H24, H25, H27, H28, H29)- CDR-H2 WIDPENGDTEYAPKFQG
125 CEA (MFE-H26)- CDR-H2 WIDPENGGTNYAQKFQG
126 CEA (MFE-H24 to H29)- CDR-H3 GTPTGPYYFDY
127 CEA (MFE-L24, L25, L27, L28, L29)- CDR-L1 RASSSVSYMH
128 CEA (MFE-H26)- CDR-L1 RASQSISSYM
129 CEA (MFE-L24, L25, L27, L28)- CDR-L2 STSNLAS
130 CEA (MFE-L26)- CDR-L2 YTSNLAS
131 CEA (MFE-L29)- CDR-L2 STSSLQS
132 CEA (MFE-L24, L25, L27, L26, L28, L29)- CDR-L3 QQRSSYPLT
133 MFE-H24 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS
134 MFE-H25 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS
135 MFE-H26 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGGTNYAQKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS
136 MFE-H27 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS
137 MFE-H28 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS
138 MFE-H29 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTITTDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS
139 MFE-L24 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK
140 MFE-L25 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK
141 MFE-L26 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK
142 MFE-L27 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK
143 MFE-L28 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWLQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK
144 MFE-L29 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWLQQKPGKAPKLLIYSTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK
145 PD-L1 CDR-H1 GFTFSDSWIH
146 PD-L1 CDR-H2 AWISPYGGSTYYADSVKG
147 PD-L1 CDR-H3 RHWPGGFDY
148 PD-L1 CDR-L1 RASQDVSTAVA
149 PD-L1 CDR-L2 SASFLYS
150 PD-L1 CDR-L3 QQYLYHPAT
151 PD-L1 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS
152 PD-L1 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK
153 IGHV3-23-02 參見表12
154 IGHV3-15*01 參見表12
155 3-23A5-1    參見表12
156 3-23A5-2 參見表12
157 3-23A5-3 參見表12
158 3-23A5-4 參見表12
159 3-23A5-1A (全部回復突變) 參見表12
160 3-23A5-1C (A93T)    參見表12
161 3-23A5-1D (K73)    參見表12
162 3-15A5-1    參見表12
163 3-15A5-2 參見表12
164 3-15A5-3 參見表12
165 IGKV3-11 參見表13
166 A5-L1 參見表13
167 A5-L2 參見表13
168 A5-L3 參見表13
169 A5-L4 參見表13
170 A5-L1A (全部回復突變) 參見表13
171 A5-L1B (Q1T2) 參見表13
172 A5-L1C (FR2) 參見表13
173 VLCH1 (CEA A5H1EL1D) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參見表16
174 VHCL-輕鏈(CEA A5H1EL1D) 參見表16
175 IGHV1-2-02 參見表18
176 IGHV1-69-01 參見表18
177 IGHV1-69-05 參見表18
178 IGKV1-39-01 參見表19
179 VLCH1 (CEA huMFE23-L28-H24) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參見表22
180 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23-L28-H24) 參見表22
181 VLCH1 (CEA huMFE23-L28-H28) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參見表23
182 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23-L28-H28) 參見表23
183 VLCH1 (CEA huMFE23-L28-H25) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參見表24
184 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23-L28-H25) 參見表24
185 VLCH1 (CEA huMFE23- L27-H29) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參見表25
186 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23- L27-H29) 參見表25
187 VLCH1 (CEA huMFE23-L27-H28) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參見表26
188 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23-L27-H28) 參見表26
189 VLCH1 (CEA huMFE23- L27-H26) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參見表27
190 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23- L27-H26) 參見表27
191 VLCH1 (CEA huMFE23-L27-H24) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參見表28
192 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23-L27-H24) 參見表28
193 VLCH1 (PD-L1) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) 參見表43
194 VHCL-輕鏈(PD-L1) 參見表43
195 VLCH1 (PD-L1) -重鏈HC2 (Fc杵) 參見表44
196 人類PD-L1 UniProt編號Q9NZQ7
呈現的所有核苷酸序列不具有各別終止密碼子序列。 本發明之態樣
以下編號段落(段)描述本發明之態樣。
1. 一種雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及 (d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在Fab重鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)之Fab重鏈之N端，該第一Fab片段(a)之Fab重鏈繼而在其C端融合至該第一Fc域子單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域子單元之N端，且其中在能夠特異性結合至靶細胞抗原之該第二Fab片段中，(i)可變域VL及VH相互置換，或(ii)恆定域CL及CH1相互置換。
2. 如第1段之雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子提供與4-1BB之二價結合及與該靶細胞抗原之單價結合。
3. 如第1段或第2段之雙特異性抗原結合分子，其中包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之該Fc域為IgG Fc域，特定言之IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。
4. 如第1段至第3段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中根據杵-臼方法，該Fc域之該第一子單元包含杵且該Fc域之該第二子單元包含臼。
5. 如第1段至第4段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域包含一或多個降低該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應子功能的胺基酸取代，特定言之胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。
6. 如第1段至第5段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段及第三Fab片段為一致的。
7. 如第1段至第6段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至4-1BB之該第一Fab片段及該第三Fab片段各自包含 重鏈可變區(VH 4-1BB)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL 4-1BB)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之CDR-L3。
8. 如第1段至第7段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至4-1BB之該第一Fab片段及該第三Fab片段各自包含：重鏈可變區(VH 4-1BB)，其包含與SEQ ID NO:7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL 4-1BB)，其包含與SEQ ID NO:8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
9. 如第1段至第8段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中在能夠特異性結合至4-1BB之該第一Fab片段及該第三Fab片段之該恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K) (根據Kabat EU索引編號)取代，且位置123處之胺基酸經精胺酸(R)或離胺酸(K) (根據Kabat EU索引編號)取代，且其中在能夠特異性結合至4-1BB之該第一Fab片段及該第三Fab片段之該恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E) (根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E) (根據Kabat EU索引編號)取代。
10. 如第1段至第9段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中在能夠特異性結合至靶細胞抗原之該第二Fab片段中，該Fab輕鏈及該Fab重鏈之可變域VL及VH相互置換。
11. 如第1段至第10段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之該第二Fab片段選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20及CD33。
12. 如第1段至第11段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之該第二Fab片段為能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)之Fab片段。
13. 如第1段至第12段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)之該Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之CDR-L3。
14. 如第1段至第13段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)之該Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:21之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:22之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
15. 如第1段至第11段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之該Fab片段為能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段。
16. 如第1段至第11段或第15段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之該Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列之CDR-L3，或 (c)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之CDR-L3，或 (d)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列之CDR-L3。
17. 如第1段至第11段或第15段或第16段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之該Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (c)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (d)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
18. 如第1段至第11段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之Fab片段為能夠特異性結合至CD19之Fab片段。
19. 如第1段至第11段或第18段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD19之Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之CDR-L3。
20. 如第1段至第11段或第18段或第19段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD19之該Fab片段包含：重鏈可變區(VH CD19)，其包含與SEQ ID NO:63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含與SEQ ID NO:64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
21. 一種聚核苷酸，其編碼如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子。
22. 一種宿主細胞，其包含如第21段之聚核苷酸。
23. 一種產生如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子之方法，其包含在適用於表現該雙特異性抗原結合分子之條件下培養如第22段之宿主細胞。
24. 一種醫藥組合物，其包含如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
25. 如第24段之醫藥組合物，其用於治療癌症。
26. 如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子，或如第24段之醫藥組合物，其用作藥物。
27. 如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其用於 (i)刺激T細胞反應， (ii)支持活化T細胞之存活， (iii)治療癌症， (iv)延遲癌症惡化，或 (v)延長罹患癌症之患者的存活期。
28. 如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子，或如第24段之醫藥組合物，其用於治療癌症。
29. 如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其用於治療癌症，其中該雙特異性抗原結合分子與用於癌症免疫療法之化學治療劑、輻射療法及/或其他藥劑組合投與。
30. 一種如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子或如第24段之醫藥組合物之用途，其用於製造用以治療癌症或傳染病之藥物。
31. 一種抑制個體之腫瘤細胞生長之方法，其包含向個體投與有效量之如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子，或如第24段之醫藥組合物，以抑制腫瘤細胞生長。
32. 一種治療癌症或傳染病之方法，其包含向個體投與治療有效量之如第1段至第20段中任一段之雙特異性抗原結合分子，或如第24段之醫藥組合物。 *** 實例
以下為本發明之方法及組合物的實例。應理解，考慮到上文提供之一般說明，可實踐各種其他實施例。重組 DNA 技術
使用標準方法以如Sambrook等人，Molecular cloning: A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所描述操縱DNA。分子生物試劑根據製造商之說明書使用。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊在Kabat, E.A.等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, NIH公開案第91-3242號中給出。DNA 測序
藉由雙股測序法測定DNA序列。基因合成
所要基因區段係使用適當模板藉由PCR產生，或藉由自動化基因合成法，藉由Geneart AG (Regensburg, Germany)自合成寡核苷酸及PCR產物合成。在確切基因序列無法獲得的情況下，基於來自最近同源物的序列來設計寡核苷酸引子且藉由RT-PCR自來源於適當組織之RNA分離基因。將側接有單數個限制性核酸內切酶裂解位點的基因區段選殖至標準選殖/測序載體中。自經轉型之細菌純化出質體DNA且藉由UV光譜分析來測定濃度。經次選殖之基因片段之DNA序列藉由DNA測序來證實。基因區段經設計以具有允許次選殖至各別表現載體中的適合的限制位點。所有構建體經設計以具有5'端DNA序列，該序列編碼靶向真核細胞中分泌之蛋白質的前導肽。蛋白質純化
參考標準方案，自經過濾之細胞培養物上清液純化蛋白質。簡言之，將抗體應用於蛋白A瓊脂糖凝膠管柱(GE Healthcare)且用PBS洗滌。在pH 2.8下實現抗體之溶離，隨後立即中和樣品。在PBS或20 mM組胺酸、150 mM NaCl pH 6.0中藉由尺寸排阻層析(Superdex 200，GE Healthcare)將聚集之蛋白質與單體抗體分離。單體抗體餾分經彙集、使用例如MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO)離心濃縮器濃縮(必要時)、冷凍且在-20℃或-80℃下儲存。提供部分樣品以用於例如藉由SDS-PAGE、尺寸排阻層析法(SEC)或質譜分析進行後續蛋白質分析及分析型表徵。SDS-PAGE
根據製造商說明書使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統(Invitrogen)。特定言之，使用10%或4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast凝膠(pH 6.4)及NuPAGE® MES (還原性凝膠，具有NuPAGE® Antioxidant操作緩衝液添加劑)或MOPS (非還原性凝膠)操作緩衝液。分析型尺寸排阻層析
藉由HPLC層析進行用於測定抗體之聚集及寡聚狀態之尺寸排阻層析(SEC)。簡言之，將蛋白A純化抗體應用於Agilent HPLC 1100系統上之300 mM NaCl、50 mM KH2 PO4 /K2 HPO4 ，pH 7.5中之Tosoh TSKgel G3000SW管柱或Dionex HPLC系統上2 × PBS中之Superdex 200管柱(GE Healthcare)。藉由UV吸光度及峰面積之積分來定量溶離之蛋白質。將BioRad凝膠過濾標準151-1901用作標準。質譜分析
此部分描述具有VH/VL或CH/CL交換(互換單抗)之多特異性抗體之表徵，其中強調其正確組裝。藉由去糖基化完整互換單抗及去糖基化/纖維蛋白溶酶消化或以其他方式去糖基化/受限LysC消化互換單抗之電噴霧電離質譜分析(ESI-MS)來分析預期主要結構。
在蛋白質濃度為1 mg/ml下，互換單抗在磷酸鹽或Tris緩衝液中，在37℃下用N-糖苷酶去糖基化17 h。纖維蛋白溶酶或受限LysC (Roche)消化用100 µg去糖基化VH/VL互換單抗在Tris緩衝液pH 8中分別在室溫下進行120小時及在37℃下進行40 min。在質譜分析之前，在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上經由HPLC將樣品去鹽。在配備有TriVersa NanoMate來源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上經由ESI-MS測定總質量。 實例1 具有與4-1BB之二價結合及與FAP之單價結合之雙特異性抗體之製備、純化及表徵 1.1產生具有與合4-1BB之二價結合及與FAP之單價結之雙特異性抗體
如圖 1 中所描繪製備具有針對4-1BB之二價結合及針對FAP之單價結合之雙特異性促效性4-1BB抗體。此構建體亦稱為頭對頭(H2H) 2+1形式或2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1或4-1BB (20H.9) × FAP 2+1 H2H。
構建體之第一重鏈HC1包含以下組分：抗4-1BB結合子(純系20H4.9)之VHCH1，隨後Fc臼。第二重鏈HC2包含抗FAP結合子(呈交叉Fab形式之純系4B9)之VLCH1，隨後為抗4-1BB (純系20H4.9)之VHCH1，且隨後為Fc杵。FAP結合子4B9之產生及製備描述於WO 2012/020006 A2中，其以引用之方式併入本文中。對於4-1BB結合子，根據US 7,288,638 B2或US 7,659,384 B2獲得純系20H4.9之VH及VL序列。兩個重鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括FAP結合交叉Fab及兩個4-1BB結合Fab (圖 1 )。
為改善正確配對，已在抗4-1BB Fab分子之CH-CL中引入以下突變：CL中之E123R及Q124K以及CH1中之K147E及K213E。抗FAP結合子(純系4B9)之第二輕鏈LC2包含VHCL (交叉Fab)。
藉由在第一重鏈HC1 (Fc臼重鏈)中引入Y349C/T366S/L368A/Y407V突變及在第二重鏈HC2 (Fc杵重鏈)中引入S354C/T366W突變來應用杵-臼技術，以允許產生雜二聚體。
根據國際專利申請公開案第WO2012/130831A1號中描述之方法，在杵及臼重鏈之恆定區中引入Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變以消除與Fcγ受體之結合。
雙特異性抗體4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1 2+1 (H2H)之胺基酸序列可見於表 1 中。表 1 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗FAP人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
66 VLCH1 (4B9) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
68 VHCL-輕鏈(4B9) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
1.2產生具有與合4-1BB之二價結合及與FAP之單價結之雙特異性抗體 產生 HEK293 EBNA 或 CHO EBNA 細胞中之 IgG 樣蛋白質
抗體及雙特異性抗體係藉由暫時轉染HEK293 EBNA細胞或CHO EBNA細胞產生。離心細胞，且培養基經預溫熱CD CHO培養基(Thermo Fisher, Cat N° 10743029)置換。在CD CHO培養基中混合表現載體，添加PEI (聚乙烯亞胺，Polysciences, Inc, Cat N° 23966-1)，將溶液渦旋且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞(2 Mio/ml)與載體/PEI溶液混合，轉移至燒瓶中且在具有5% CO2 氛圍的培育箱中搖晃，在37℃培育3小時。培育後，添加具有補充劑(總體積之80%)之Excell培養基(W. Zhou及A. Kantardjieff, Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, DOI: 10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。轉染後一天，添加補充劑(進料，總體積之12%)。7天後藉由離心及隨後過濾(0.2 μm過濾器)收集細胞上清液，且藉由如下文所指示之標準方法自所收集之上清液純化蛋白質。 產生 CHO K1 細胞中之 IgG 樣蛋白質
可替代地，本文所述之抗體及雙特異性抗體藉由Evitria使用其專用載體系統利用習知(基於非PCR)選殖技術且使用懸浮液適用的CHO K1細胞(最初自ATCC接收且適於在Evitria下在懸浮培養物中無血清生長)來製備。對於產生，Evitria使用其專用的無動物組分及無血清的培養基(eviGrow及eviMake2)及其專用的轉染劑(eviFect)。藉由離心及隨後過濾(0.2 μm過濾器)收集上清液，且藉由標準方法自所收集之上清液純化蛋白質。 純化 IgG 樣蛋白質
參考標準方案，自經過濾之細胞培養物上清液純化蛋白質。簡言之，含有Fc之蛋白質藉由蛋白A-親和力層析法(平衡緩衝液：20 mM檸檬酸鈉，20 mM磷酸鈉，pH 7.5；溶離緩衝液：20 mM檸檬酸鈉，pH 3.0)自細胞培養物上清液純化。在pH 3.0下實現溶離，隨後立即pH中和樣品。藉由離心(Millipore Amicon® ULTRA-15，Cat N°：UFC903096)濃縮蛋白質，且藉由尺寸排阻層析在pH 6.0之20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉中將聚集之蛋白質與單體蛋白質分離。 分析 IgG 樣蛋白質
藉由使用根據Pace,等人，Protein Science, 1995, 4, 2411-1423基於胺基酸序列計算之質量消光係數量測280 nm下之吸收測定經純化蛋白質之濃度。蛋白質之純度及分子量在存在及不存在還原劑之情況下使用LabChipGXII (Perkin Elmer)藉由CE-SDS分析。聚集體含量之測定在25℃下使用分析型尺寸排阻管柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)，在操作緩衝液(分別為25 mM K2 HPO4 ，125 mM NaCl，200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽，pH 6.7或200 mM KH2 PO4 ，250 mM KCl pH 6.2)中平衡，藉由HPLC層析進行。表 2 -2+1 H2H抗4-1BB、抗FAP huIgG1 P329GLALA抗原結合分子之生物化學分析
分子 單體[%] 產量[mg/l] CE-SDS (非還原性)
2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1 100 4.7 98
製備抗原及篩檢工具人類 4-1BB Fc (kih) ：
框內次選殖編碼人類IgG1重鏈CH2及CH3域在杵上之人類4-1BB (根據Q07011合成)的胞外域的DNA序列。在抗原胞外域與人類IgG1之Fc之間引入AcTEV蛋白酶裂解位點。在抗原-Fc杵之C端入用於引導生物素標記之Avi標籤。含有S354C/T366W突變之抗原-Fc杵鏈與含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之Fc臼鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括含有4-1BB胞外域之鏈之單一複本，因此形成Fc連接之抗原之單體形式。表 3 展示抗原Fc-融合構建體之胺基酸序列。表 3 ：單體抗原Fc (kih)融合分子之胺基酸序列(藉由組合一個Fc臼鏈與一個抗原Fc杵鏈產生)
SEQ ID NO: 抗原 序列
69 Fc臼鏈 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
70 人類4-1BB抗原Fc杵鏈 LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQVDEQLYFQGGSPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE
1.3製備具有與4-1BB之二價結合及與FAP之單價結合之雙特異性抗體，其中FAP之VH及VL在重鏈之C端融合(對照)
製備具有4-1BB之二價結合及FAP之單價結合之雙特異性促效性4-1BB抗體，亦稱為4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1 2+1 VH/VL (C端)，其中FAP(4B9)結合子之VH及VL分別在各重鏈之C端處融合。藉由在第一重鏈HC1 (Fc杵重鏈)中引入S354C/T366W突變及在第二重鏈HC2 (Fc臼重鏈)中引入Y349C/T366S/L368A/Y407V突變來應用杵-臼技術，以允許產生雜二聚體。
在此實例中，構建體之第一重鏈HC1包含以下組分：抗4-1BB結合子(純系20H4.9)之VHCH1，隨後為Fc杵，在該C端融合抗FAP結合子之VL。第二重鏈HC2包含抗4-1BB之VHCH1，隨後為Fc臼，在該C端融合抗FAP結合子(純系4B9)之VH。兩個重鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括FAP結合部分及兩個4-1BB結合Fab。
根據國際專利申請公開案第WO2012/130831A1號中描述之方法，在杵及臼重鏈之恆定區中引入Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變以消除與Fcγ受體之結合。
a-FAP VH融合於Fc杵重鏈且VL融合於Fc臼重鏈的2+1抗4-1BB、抗FAP構建體之胺基酸序列可見於表 4 中。表 4 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗FAP人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(a-FAP VH融合於Fc臼鏈且VL融合於Fc杵鏈之構建體，稱為2+1 VH/VL)之序列
SEQ ID NO: 描述 序列
71 VHCH1 (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) -VH (4B9) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS
72 VHCH1 (20H4.9)- 重鏈HC2 (Fc杵) -VL (4B9) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK
73 VLCL-輕鏈(20H4.9) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表 5 ： 具有與4-1BB之二價結合及與FAP之單價結合之雙特異性抗原結合分子(2+1 VH/VL 4-1BB/FAP人類IgG1 P329GLALA)之生物化學分析
分子 單體[%] 產量[mg/l] CE-SDS (非還原性)
4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1 2+1 VH/VL 97.7 14 90
1.4製備具有與4-1BB之二價結合及非靶向VH及VL部分(DP47生殖系對照)之雙特異性抗體，其中DP47之VH及VL在重鏈之C端處融合(對照)
製備具有4-1BB之二價結合及單價非靶向DP47生殖系對照之雙特異性促效性4-1BB抗體，亦稱為4-1BB (20H4.9)/非靶向(DP47) P329GLALA IgG1 2+1 VH/VL (C端)，其中非結合純系(DP47)之VH及VL分別在各重鏈之C端處融合。藉由在第一重鏈HC1 (Fc杵重鏈)中引入S354C/T366W突變及在第二重鏈HC2 (Fc臼重鏈)中引入Y349C/T366S/L368A/Y407V突變來應用杵-臼技術，以允許產生雜二聚體。
在此實例中，構建體之第一重鏈HC1包含以下組分：抗4-1BB結合子(純系20H4.9)之VHCH1，隨後為Fc杵，在該C端融合DP47之VL。第二重鏈HC2包含抗4-1BB之VHCH1，隨後為Fc臼，在該C端融合DP47之VH。兩個重鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括DP47代替FAP結合部分及兩個4-1BB結合Fab。
根據國際專利申請公開案第WO2012/130831A1號中描述之方法，在杵及臼重鏈之恆定區中引入Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變以消除與Fcγ受體之結合。
a-DP47VH融合於Fc杵重鏈且VL融合於Fc臼重鏈的2+1抗4-1BB、非靶向(DP47)構建體之胺基酸序列可見於表 6 中。表 6 ： 雙特異性二價抗4-1BB /非靶向(DP47)人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(DP47 VH融合於Fc臼鏈且DP47 VL融合於Fc杵鏈之構建體，稱為C端)之序列
SEQ ID NO: 描述 序列
74 VHCH1 (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) -VH (DP47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSS
75 VHCH1 (20H4.9)- 重鏈HC2 (Fc杵) -VL (DP47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIK
73 VLCL-輕鏈(20H4.9) 參見表4
實例2 具有與4-1BB之二價結合及與CEA之單價結合之雙特異性抗體之製備、純化及表徵 2.1產生及製備具有與4-1BB之二價結合及與CEA之單價結合之雙特異性抗體
亦可藉由用抗CEA交叉Fab置換抗FAP交叉Fab來製備具有4-1BB之二價結合及CEA之單價結合之雙特異性促效性4-1BB抗體。此構建體亦稱為頭對頭(H2H) 2+1形式。
構建體之第一重鏈HC1包含以下組分：抗4-1BB結合子(純系20H4.9)之VHCH1，隨後為Fc臼。第二重鏈HC2包含抗CEA結合子(呈交叉Fab形式)之VLCH1，隨後為抗4-1BB (純系20H4.9)之VHCH1，且隨後為Fc杵。親本CEA結合子A5B7描述於WO 92/01059中。CEA結合子MFE23之序列描述於WO 2007/071422中。對於4-1BB結合子，根據US 7,288,638 B2或US 7,659,384 B2獲得純系20H4.9之VH及VL序列。兩個重鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括CEA結合交叉Fab及兩個4-1BB結合Fab (圖 1 )。
為改善正確配對，已在抗4-1BB Fab分子之CH-CL中引入以下突變：CL中之E123R及Q124K以及CH1中之K147E及K213E。抗CEA結合子之第二輕鏈LC2包含VHCL (交叉Fab)。
藉由在第一重鏈HC1 (Fc臼重鏈)中引入Y349C/T366S/L368A/Y407V突變及在第二重鏈HC2 (Fc杵重鏈)中引入S354C/T366W突變來應用杵-臼技術，以允許產生雜二聚體。
根據國際專利申請公開案第WO2012/130831A1號中描述之方法，在杵及臼重鏈之恆定區中引入Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變以消除與Fcγ受體之結合。
針對2+1抗4-1BB抗FAP huIgG1 P329GLALA抗體，如實例1.2中所述產生雙特異性2+1 H2H抗4-1BB抗CEA huIgG1 P329GLALA抗體。
雙特異性4-1BB (20H4.9)/CEA (A5B7) P329GLALA IgG1 2+1 (H2H)抗體之胺基酸序列可見於表 7 中，而雙特異性4-1BB (20H4.9)/CEA (MFE23) P329GLALA IgG1 2+1 (H2H)抗體之胺基酸序列可見於表 8 中。
如實例1.2中所述產生及純化蛋白質。表 7 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗CEA(A5B7)人類IgG1 P329GLALA抗體(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
76 VLCH1 (A5B7) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
77 VHCL-輕鏈(A5B7) EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTLTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表 8 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗CEA(MFE23)人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
78 VLCH1 (MFE23) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) ENVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPLTFGAGTKLELKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
79 VHCL-輕鏈(MFE23) QVKLQQSGAELVRSGTSVKLSCTASGFNIKDSYMHWLRQGPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
具有4-1BB之二價結合及CEA之單價結合之其他雙特異性促效性4-1BB抗體可利用抗CEA結合子純系抗CEA (T84.66-LCHA)或純系抗CEA(CH1A1A 98/99 SF1)製備。雙特異性4-1BB (20H4.9) × CEA (T84.66-LCHA) P329GLALA IgG1 2+1 (H2H)抗體之胺基酸序列可見於表 9 中，而雙特異性4-1BB (20H4.9) × CEA (CH1A1A 98/99 SF1) P329GLALA IgG1 2+1 (H2H)抗體之胺基酸序列可見於表 10 中。表 9 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗CEA(T84.66-LCHA)人類IgG1 P329GLALA抗體(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
80 VLCH1 (T84.66-LCHA) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
81 VHCL-輕鏈(T84.66-LCHA) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表 10 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗CEA(CH1A1A 98/99 2F1)人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
82 VLCH1 (CEA 2F1) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
83 VHCL-輕鏈(CEA CH1A1A 98/99) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
2.2產生抗CEA抗體A5B7之人類化變異體 2.2.1方法
抗CEA抗體A5B7例如由M. J. Banfield等人，Proteins 1997, 29(2), 161-171揭示，且其結構可作為PDB ID:1CLO見於蛋白質結構資料庫PDB (www.rcsb.org, H.M. Berman等人，The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 235-242)中。此條目包括重鏈及輕鏈可變域序列。對於在人類化抗CEA結合子A5B7期間鑑別出適合人類受體構架，藉由檢索具有高序列同源性之受體架構、在此構架上移植CDR及評估可設想之哪些回復突變來採取經典方法。更明確而言，基於對結合子之結構完整性的影響判斷所鑑別之構架與親本抗體的各胺基酸差異，且適當時引入回復至親本序列之回復突變。結構評估係基於親本抗體及其人類化版本l兩者之Fv區同源性模型，其利用使用Biovia Discovery Studio Environment，4.5版實施之內部抗體結構同源性建模工具形成。 2.2.2受體架構及其適應性之選擇
受體架構如下表 11 中所述選擇：表 11 ： 受體架構
   最近鼠類 V區生殖系 人類受體V區生殖系之選擇
A5B7 VH    mu-IGHV7-3-02 IGHV3-23-01或IGHV3-15-01
A5B7 VL    mu-IGKV4-72-01 IGKV3-11-01
後CDR3構架區適合於重鏈之人類J-元件生殖系IGJH6，且適合於輕鏈之與κ J-元件IGKJ2類似之序列。
基於結構考慮因素，在重鏈之位置93及94處引入自人類受體構架至親本結合子中之胺基酸之回復突變。 2.2.3所得人類化CEA抗體之VH及VL區
人類化CEA抗體之所得VH域可見於下表12中，且人類化CEA抗體之所得VL域列於下表13中。 表12：基於人類受體構架IGHV3-23或IGHV3-15，人類化CEA抗體之VH域之胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
A5B7 VH 鼠類供體序列 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS 31
IGHV3-23-02 人類受體序列 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK 153
人類化變異體      
3-23A5-1    EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 155
3-23A5-2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 156
3-23A5-3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 157
3-23A5-4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 158
3-23A5-1A (全部回復突變) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 159
3-23A5-1C (A93T)    EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 160
3-23A5-1D (K73)    EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 161
3-23A5-1E (G54A)    EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 121
        
IGHV3-15*01 人類受體序列 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTT 154
人類化變異體      
3-15A5-1    EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 162
3-15A5-2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTEYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 163
3-15A5-3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 164
對於重鏈，發現初始變異體3-23A5-1在結合檢定中適合(但比起親本鼠類抗體展示略微較少結合)，且經選擇作為開始點以用於進一步修飾。基於IGHV3-15之變異體展示與人類化變異體3-23A5-1相比較低的結合活性。
為恢復親本嵌合抗體之完全結合活性，形成變異體3-23A5-1A、3-23A5-1C及3-23A5-1D。針對變異體3-23A5-1，亦測試CDR-H2之長度是否可適於人類受體序列，但此構建體完全失去結合活性。因為推定去醯胺熱點存在於CDR-H2 (Asn53-Gly54)中，吾等將該基元變為Asn53-Ala54。另一可能的熱點Asn73-Ser74回復突變至Lys73-Ser74。因此，形成變異體3-23A5-1E。 表13：基於人類受體構架IGKV3-11，人類化CEA抗體之VL域之胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
A5B7 VL 鼠類供體序列 QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGGGTKLEIK 32
IGKV3-11 人類受體序列 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP 165
人類化變異體   
A5-L1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK 166
A5-L2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYIHWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK 167
A5-L3 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK 168
A5-L4 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSKPPTFGQGTKLEIK 169
A5-L1A (全部回復突變) QTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK 170
A5-L1B (Q1T2) QTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK 171
A5-L1C (FR2) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK 172
A5-L1D (46,47) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK 122
基於人類IGKV3-11受體架構人類化輕鏈。在系列A5-L1至A5-L4中，習得變異體A5-L1展示良好的結合活性(但略微低於親本抗體)。CDR-L1 (變異體A5-L2；Kabat位置30及31)之部分人類化完全消除結合。同樣，CDR-H2 (變異體A5-L3；Kabat位置50至56)之人類化亦完全消除結合。位置90 (變異體A5-L4)展示對結合特性之顯著貢獻。此位置處之組胺酸對於結合係重要的。因此，選擇變異體A5-L1以進行進一步修飾。
系列A5-L1A至A5-L1D解決以下問題：需要哪些回復突變來恢復親本嵌合抗體之完全結合可能。變異體A5-L1A展示Kabat位置1、2、整個構架2及Kabat位置71處之回復突變不增加任何其他結合活性。變異體A5-L1B及A5-L1C定址彼等位置之子集且確認其不改變結合特性。在Kabat位置46及47處具有回復突變之變異體A5-L1D展示最佳結合活性。 2.2.4人類化A5B7抗體之選擇
基於VH及VL之新穎人類化變異體，根據WO 2012/130831 A1中所述之方法，新穎CEA抗體表現為具有效應沉默Fc (P329G；L234，L235A)之huIgG1抗體以消除與Fcγ受體之結合，且在MKN45細胞上表現之其與CEA之結合經測試，且與各別親本鼠類A5B7抗體進行比較。 表14：表現為huIgG1_LALA_PG抗體之VH/VL組合
   A5-L1A A5-L1B A5-L1C A5-L1D
3-23A5-1A P1AE2164 P1AE2165 P1AE2166 P1AE2167
3-23A5-1C - - P1AE2176 P1AE2177
3-23A5-1D P1AE2179 - P1AE2181 P1AE2182
MKN45 (DSMZ ACC 409)為表現CEA之人類胃腺癌細胞株。細胞提前在RPMI + 2% FCS + 1% Glutamax中培養。檢查MKN-45細胞之活力，且將細胞再懸浮且調整成密度為1百萬個細胞/毫升。將100 µl之此細胞懸浮液(含有100000個細胞)接種至96孔圓底盤中。使盤在400×g下離心4 min且移除上清液。隨後將40 µl之稀釋抗體或FACS緩衝液添加至細胞中且在4℃下培育30 min。培育後，每孔用150 µl FACS緩衝液洗滌細胞兩次。隨後將20 μl稀釋之PE抗人類Fc特異性二級抗體(109-116-170，Jackson ImmunoResearch)添加至細胞中。在4℃下再培育細胞30 min。為移除未結合抗體，用150 µl每孔FACS緩衝液再次洗滌細胞兩次。為固定細胞，將含有1% PFA之100 µl FACS緩衝液添加至該等孔中。在量測之前，將細胞再懸浮於150 µl FACS緩衝液中。使用BD流式細胞儀來量測螢光。
在圖 7 中，展示人類化A5B7變異體之結合曲線。所有測試結合子能夠結合至MKN45細胞，但結合力與親本A5B7抗體相比略微降低。純系P1AE2167具有所有測試變異體之最佳結合，且選擇以用於進一步發展。 2.2.5使用表面電漿子共振(BIACORE)測定鼠類CEA-抗體A5B7對人類CEA之人類化變異體之Fab片段之親和力
使用BIACORE T200儀器藉由表面電漿子共振評估鼠類CEA抗體A5B7對人類CEA之人類化變異體之Fab片段之親和力。在CM5晶片上，人類CEA (hu N(A2-B2)A-avi-His B)在40 nM濃度下藉由標準胺偶合固定在流動細胞2上30 s至約100RU。隨後在500-0.656 nM範圍內之3倍稀釋液中，接觸時間為120 s，解離時間為250或1000 s，且在30 µl/min之流動速率下注射鼠類CEA抗體A5B7之人類化變異體之Fab片段作為分析物。在人類CEA (hu N(A2-B2)A-avi-His B)之含量下再生藉由pH 2.0下2次脈衝10 mM甘胺酸/HCl 60 s來達成。資料針對未固定之流動細胞1及分析物之零濃度進行雙重參考。將分析物之感測器圖譜安裝成簡單1:1朗格繆爾(Langmuir)相互作用模型。人類CEA (A2域)之親和力常數[KD ]概述於下表15中。 表15：表示鼠類CEA抗體A5B7至人類CEA (A2域)之不同人類化變異體之Fab片段之親和力常數.
Tapir ID 名稱 對人類N(A2-B2)A-avi-His B 之親和力 [M]
P1AE0289 CEA (A5B7) Fab (親本鼠類抗體) 5.59 E-10
P1AE4135 衍生自P1AE2164之Fab 1.70 E-09
P1AE4136 衍生自P1AE2165之Fab 1.25 E-09
P1AE4137 衍生自P1AE2166之Fab 1.13 E-08
P1AE4138 衍生自P1AE2167之Fab 1.47 E-09
P1AE4139 衍生自P1AE2176之Fab 7.58 E-09
P1AE4140 衍生自P1AE2177之Fab 7.62 E-09
P1AE4141 衍生自P1AE2179之Fab 1.83 E-09
P1AE4142 衍生自P1AE2181之Fab 2.64 E-09
P1AE4143 衍生自P1AE2182之Fab 2.92 E-09
鼠類CEA抗體A5B7之人類化變異體之親和力比親本鼠類抗體之親和力低。選擇衍生自P1AE2167 (具有VH變異體3-23A5-1A之重鏈及具有VL變異體A5-L1D之Cκ輕鏈)之fab片段P1AE4138作為最終人類化變異體。另外，將Kabat位置54 (G54A)處之甘胺酸至丙胺酸突變引入VH域中以移除去醯胺位點，從而產生VL變異體3-23A5-1E。最終人類化抗體(具有VH變異體3-23A5-1E之重鏈及具有VL變異體A5-L1D之Cκ輕鏈)已命名為A5H1EL1D或huA5B7。 2.2.6產生及製備具有與4-1BB之二價結合及與CEA (A5H1EL1D)之單價結合之雙特異性抗體
針對2+1抗4-1BB抗CEA (A5B7) huIgG1 P329GLALA抗體，如實例2.1中所述產生雙特異性2+1 H2H抗4-1BB抗CEA huIgG1 P329GLALA抗體。
雙特異性4-1BB (20H4.9)/CEA (A5H1EL1D) P329GLALA IgG1 2+1 (H2H)抗體之胺基酸序列可見於表 16 中。如實例1.2中所述產生及純化蛋白質。表 16 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗CEA(A5H1EL1D)人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
173 VLCH1 (CEA A5H1EL1D) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
174 VHCL-輕鏈(CEA A5H1EL1D) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
2.3產生抗CEA抗體MFE23之人類化變異體 2.3.1方法
抗CEA抗體MFE23例如由M. K. Boehm等人，Biochem. J. 2000, 346, 519-528揭示，且其結構可作為PDB ID:11QOK見於蛋白質結構資料庫PDB (www.rcsb.org, H.M. Berman等人，The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 235-242)中。此條目包括重鏈及輕鏈可變域序列。對於在人類化抗CEA結合子MFE23期間鑑別出適合人類受體構架，藉由檢索具有高序列同源性之受體架構、在此構架上移植CDR及評估可設想之哪些回復突變來採取經典方法。更明確而言，基於對結合子之結構完整性的影響判斷所鑑別之構架與親本抗體的各胺基酸差異，且適當時引入回復至親本序列之回復突變。結構評估係基於親本抗體及其人類化版本l兩者之Fv區同源性模型，其利用使用Biovia Discovery Studio Environment，4.5版實施之內部抗體結構同源性建模工具形成。
為提高回復突變之選擇之可信度，吾等鑑別出最近鼠類同源序列，此抗體可已衍生自其中。吾等尋找在鼠類B細胞中此抗體之成熟期間已經歷廣泛體細胞超突變之位置。彼等突變將對併入人類化構建體中具有潛在重要性。 2.3.2受體架構及其適應性之選擇
受體架構如下表 17 中所述選擇：表 17 ： 受體架構
   最近鼠類 V區生殖系 人類受體V區生殖系之選擇
MFE23 VH m-IGHV14-4-02 IGHV1-2-02
MFE23 VL m-IGKV4-57-01 IGKV1-39-01
後CDR3構架區適合於重鏈之人類J-元件生殖系IGHJ4-01，且適合於輕鏈之與κ J-元件IGKJ4-01類似之序列。基於結構考慮因素，在重鏈之Kabat位置71及93處引入自人類受體構架至親本結合子中之胺基酸之回復突變。基於鼠類生殖系中產生最終成熟MFE23序列之構架突變將具有重要性的考慮因素，VH之Kabat位置94處之殘基變回鼠類序列。
為評估MFE23序列之進一步親和力及/或穩定性改善，吾等在輕鏈序列中併入以下突變：Phe26Leu、Ser30Pro或Tyr、Leu78Val，如由C.P. Graff等人，Protein Engineering, Design & Selection 2004, 17(4), 293-304所述。 2.3.3 所得人類化CEA抗體之VH及VL域
人類化CEA抗體之所得VH域可見於下表18中，且人類化CEA抗體之所得VL域列於下表19中。 表18：基於人類受體構架IGHV1-2-02，人類化CEA抗體之VH域之胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
MFE23 VH 鼠類供體序列 QVKLQQSGAELVRSGTSVKLSCTASGFNIKDSYMHWLRQGPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTTVTVSS 39
IGHV1-2-02 人類受體序列 QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR 175
IGHV1-69-01 人類受體序列 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR 176
IGHV1-69-05 人類受體序列 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITTDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR 177
人類化變異體      
MFE-H24    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS 133
MFE-H25    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS 134
MFE-H26    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGGTNYAQKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS 135
MFE-H27    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS 136
MFE-H28    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS 137
MFE-H29 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTITTDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS 138
表19：基於人類受體構架IGKV1-39-01，人類化CEA抗體之VL域之胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
MFE23 VL 鼠類供體序列 ENVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPLTFGAGTKLELK 40
IGKV1-39-01 人類受體序列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP 178
人類化變異體      
MFE-L24    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK 139
MFE-L25    EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK 140
MFE-L26    EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK 141
MFE-L27    EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK 142
MFE-L28    EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWLQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK 143
MFE-L29 EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWLQQKPGKAPKLLIYSTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK 144
圖 8 展示分別如表18及19中所列之序列之比對。
框內次選殖編碼人類化CEA結合子之六個重鏈及六個輕鏈DNA序列之可變區，其中人類IgG1之恆定重鏈或恆定輕鏈含有P239G、L234A及L235A突變以消除與Fcγ受體之結合(WO 2012/130831 A1)。如下文所述產生抗體。針對MKN45細胞上之結合測試所得36個變異體(表20)；且選擇7個變異體以用於進一步發展。 表20：表現為huIgG1_LALA_PG抗體之VH/VL組合之命名法
   MFE-L24 MFE-L25 MFE-L26 MFE-L27 MFE-L28 MFE-L29
MFE-H24 P1AE3125 P1AE3119 P1AE3113 P1AE3107 P1AE3101 P1AE3095
MFE-H25 P1AE3124 P1AE3118 P1AE3112 P1AE3106 P1AE3100 P1AE3094
MFE-H26 P1AE3123 P1AE3117 P1AE3111 P1AE3105 P1AE3099 P1AE3093
MFE-H27 P1AE3122 P1AE3116 P1AE3110 P1AE3104 P1AE3098 P1AE3092
MFE-H28 P1AE3121 P1AE3115 P1AE3109 P1AE3103 P1AE3097 P1AE3091
MFE-H29 P1AE3120 P1AE3114 P1AE3108 P1AE3102 P1AE3096 P1AE3090
2.3.4人類化MFE23抗體之選擇
將36個人類化MFE23 huIgG1 P329G LALA變異體與在MKN45細胞上表現之CEA之結合與各別親本鼠類MFE23 huIgG1 P329G LALA抗體進行比較。17個純系失去其與表現MKN45細胞之人類CEACAM5之結合力(圖 9A )。八個純系展示若與親本純系MFE23進行比較則結合降低(圖 9B )。十一個純系展示若與親本純系MFE23進行比較則結合類似(圖 9C )。此等結合曲線之擬合EC50 值及曲線下面積值(AUC)顯示於表21中。 表21：圖8A、8B及8C中顯示之不同人類化MFE23 huIgG1 P329G LALA抗體之結合曲線之EC50 值及曲線下面積(AUC)
與 MKN45 之結合 EC50 [nM] AUC
P1AD5108-002 DP47 huIgG1 PG LALA (同型對照) n.d. 420
P1AE0096-001 MFE23 huIgG1 PG LALA (親本) 9.36 83489
P1AE3104 n.d. 414
P1AE3122 n.d. 422
P1AE3116 n.d. 443
P1AE3092 n.d. 482
P1AE3110 n.d. 547
P1AE3112 n.d. 551
P1AE3118 n.d. 559
P1AE3111 n.d. 578
P1AE3109 n.d. 695
P1AE3113 n.d. 757
P1AE3124 n.d. 847
P1AE3123 n.d. 1090
P1AE3106 n.d. 1126
P1AE3117 n.d. 1181
P1AE3098 n.d. 1191
P1AE3108 n.d. 2086
P1AE3125 n.d. 3145
P1AE3094 47.57 6908
P1AE3115 20.68 10177
P1AE3119 41.90 10327
P1AE3114 30.60 12769
P1AE3121 17.13 17464
P1AE3120 12.37 24181
P1AE3105 7.92 55868
P1AE3090 42.00 61809
P1AE3093 16.14 68082
P1AE3100 9.89 74137
P1AE3091 14.60 83061
P1AE3095 11.12 84917
P1AE3096 10.46 87775
P1AE3107 5.83 91203
P1AE3102 5.41 91481
P1AE3103 5.88 92448
P1AE3099 10.21 95311
P1AE3097 6.45 98656
P1AE3101 6.58 103966
2.3.5產生及製備具有與4-1BB之二價結合及與人類化CEA (MFE23)之單價結合之雙特異性抗體
針對2+1抗4-1BB抗CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA抗體，如實例2.1中所述產生雙特異性2+1 H2H抗4-1BB抗CEA huIgG1 P329GLALA抗體。
雙特異性4-1BB (20H4.9)/CEA (huMFE23-L28-H24) P329GLALA IgG1 2+1 (H2H)抗體之胺基酸序列可見於表22中，且4-1BB (20H4.9)/CEA (huMFE23-L28-H28) P329GLALA IgG1 2+1 (H2H)抗體之胺基酸序列可見於表23中。如實例1.2中所述產生及純化蛋白質。其他雙特異性構建體展示於表 24 至 28 中。表 22 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗CEA(huMFE23-L28-H24)人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
179 VLCH1 (CEA huMFE23-L28-H24) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWLQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
180 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23-L28-H24) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表 23 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價CEA(huMFE23-L28-H28)人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
181 VLCH1 (CEA huMFE23-L28-H28) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWLQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
182 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23-L28-H28) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表 24 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗CEA(huMFE23-L28-H25)人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
183 VLCH1 (CEA huMFE23-L28-H25) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWLQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
184 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23-L28-H25) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表 25 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗CEA(huMFE23- L27-H29)人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
185 VLCH1 (CEA huMFE23- L27-H29) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
186 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23- L27-H29) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTITTDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表 26 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗CEA(huMFE23-L27-H28)人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
187 VLCH1 (CEA huMFE23-L27-H28) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
188 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23-L27-H28) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表 27 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗CEA(huMFE23- L27-H26)人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
189 VLCH1 (CEA huMFE23- L27-H26) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
190 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23- L27-H26) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGGTNYAQKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表 28 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗CEA(huMFE23-L27-H24)人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
191 VLCH1 (CEA huMFE23-L27-H24) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) EIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVPYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
192 VHCL-輕鏈(CEA huMFE23-L27-H24) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDSYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTTDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
如實例1.2中所述進行雙特異性抗體之產生。所獲得產物之例示性分析展示於下表29中。表 29 -2+1 H2H抗4-1BB、抗CEA huIgG1 PGLALA雙特異性抗體之生物化學分析
分子 單體[%] 產量[mg/l] CE-SDS (非還原性，主峰)
2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/ CEA(A5B7)人類IgG1 PGLALA 98 7.4 95
2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/ CEA(MFE23)人類IgG1 PGLALA 98 7 94
2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/ CEA(A5H1EL1D)人類IgG1 PGLALA 97 6.6 97
實例3 具有與4-1BB之二價結合及與CD19之單價結合之雙特異性抗體之製備、純化及表徵 2.1產生及製備具有與4-1BB之二價結合及與CD19之單價結合之雙特異性抗體
亦可藉由用抗CD19交叉Fab置換抗FAP交叉Fab來製備具有4-1BB之二價結合及CEA之單價結合之雙特異性促效性4-1BB抗體。此構建體亦稱為頭對頭(H2H) 2+1形式。
CD19結合子純系2B11之產生及製備描述於WO 2017/055328 A1中。2+1 H2H二價雙特異性4-1BB (20H4.9) × CD19(2B11) P329GLALA IgG1 2+1 (H2H)抗體huIgG1 PGLALA之胺基酸序列可見於下表 30 中。表 30 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗CD19 (2B11)人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
84 VLCH1 (2B11) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGTTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDPYTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
85 VHCL-輕鏈(2B11) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
實例4 具有FAP之單價結合之2+1 H2H雙特異性促效性4-1BB抗原結合分子之功能性表徵 4.1表面電漿子共振(同時結合)
藉由表面電漿子共振(SPR)評估同時結合至人類4-1BB Fc (kih)及人類FAP之能力。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%界面活性劑P20，Biacore, Freiburg/Germany)來進行。人類4-1BB Fc(kih)藉由胺偶合(CM5感測器晶片)直接偶合至流動細胞。使用710共振單位(RU)之固定程度。
經由流動細胞經90秒以200 nM之範圍濃度在30 μL/min之流速下傳遞2+1 H2H抗4-1BB/抗FAP huIgG1 PGLALA構建體，且將解離設置為零秒。經由流動細胞經90秒將人類FAP以500 nM之濃度在30 μL/min之流速下注射作為第二分析物(參見圖 2A 中之檢定之設置) 監測解離120秒。藉由減去在參考流動細胞(其中未固定蛋白質)中獲得之反應來校正整體折射率差異。
如圖 2B 之曲線圖中可見，2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1抗體構建體可同時結合人類4-1BB及人類FAP。 4.2藉由TagLite競爭檢定以確認與hu4-1BB之二價結合
為確認針對hu 4-1BB之雙特異性2+1 H2H抗4-1BB、抗FAP huIgG1 P329GLALA抗體之二價結合，進行使用時差式螢光共振能量轉移(TR-FRET) (稱作TagLite)之競爭檢定。
在經轉染Hek細胞上表現之d2標記之4-1BB (純系20H4.9) IgG1針對hu4-1BB-SNAP Tb標記之結合產生TR-FRET信號。對於競爭檢定，結合之d2標記之4-1BB (純系20H4.9) IgG1藉由未標記之2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1抗體(抗4-1BB之Fab中之一者不具有游離N端)或藉由2+1 VH/VL (C端) 4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1抗體(抗4-1BB之兩個「游離Fab」)置換，從而引起TR-FRET信號減少(表31)。 表31：競爭檢定中所用之樣品
用供體標記之結合抗體
樣品 濃度 (mg/ml) 形式
4-1BB (純系20H4.9) huIgG1 - d2 0.515 2+0 IgG
用於競爭之未標記之構建體
樣品 濃度 (mg/ml) 形式
2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1 1.92 2+1 Bsp
2+1 VH/VL (C端) 4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1 1.27 2+1 Bsp
簡言之，將預標記之Tb hu4-1BB-SNAP表現細胞解凍、洗滌，且將10 μl中每孔5000個細胞與5 μl之0.6 nM之受體(d2)標記之4-1BB (純系20H4.9) IgG1及5 μl未標記之競爭構建體以1:3濃度混合，稀釋度在0.006-1000 nM範圍內；最終體積為384個孔盤中之20 μl。在RT下0 h、2 h及4 h後，螢光信號在620 nm下針對螢光供體(Tb)且在665 nm下針對螢光受體(d2)染料量測(M1000 Pro, Tecan)。計算665/620×10000 (R)之比率，且減去參考(僅細胞)之比率，引起標繪之ΔR值。對於IC50 測定，使用Graph Pad Prism6中之一個位點擬合log IC50 分析結果(表32)。一式兩份地進行檢定。 表32：在95%信賴區間下4小時後之Ki 值
用於競爭之未標記之構建體
樣品 IC50 nM (95% CI) 形式
4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1 2+1 (H2H) 1.9 (1.6 - 2.4) 2+1 Bsp
4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA IgG1 2+1 (C端) 2.5 (1.9 - 3.3) 2+1 Bsp
結果指示4-1BB FAP雙特異性構建體兩者可類似地(類似IC50 )與4-1BB (純系20H4.9) IgG競爭以結合至hu4-1BB。此表明，針對雙特異性2+1 H2H抗4-1BB、抗FAP huIgG1 P329GLALA抗體之4-1BB之Fab臂均可結合至4-1BB。因此，2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA抗體可二價結合至4-1BB (圖 3 )。 4.3與表現人類FAP之細胞株之結合
為了測試，使用與表現人類纖維母細胞活化蛋白(FAP) NIH/3T3-huFAP純系19細胞之細胞表面之結合。藉由在CMV啟動子下用編碼人類FAP之表現pETR4921質體轉染小鼠胚胎纖維母細胞NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)來產生NIH/3T3-huFAP純系19。將細胞維持在供應有胎牛血清(FBS，Life Technologies之GIBCO，目錄號16000-044，第941273批，游離γ輻照之黴漿菌(mycoplasma)，熱滅活)、2 mM L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸二肽(Gluta-MAX-I，Life Technologies之GIBCO，目錄號35050-038)及1.5 μg/mL嘌呤黴素(InvivoGen，目錄號：ant-pr-5)之DMEM (life technologies之GIBCO，目錄號：42340-025)中。對於結合檢定，將2 × 105 之NIH/3T3-huFAP純系19細胞添加至圓底懸浮液細胞96孔盤(Greiner bio-one, cellstar，目錄號650185)之各孔中。細胞用200 µL DPBS洗滌一次，且將集結粒再懸浮於含有1:5000稀釋之可固定的活力染料eFluor 450 (eBioscience，目錄號65 0863 18)之100微升/孔之4℃低溫DPBS緩衝液中。盤在4℃下培育30分鐘且用200 µL 4℃低溫DPBS緩衝液洗滌一次。然後將細胞再懸浮於含有不同滴定濃度之具有FAP之單價結合的2+1 H2H雙特異性促效性4-1BB (20H4.9)/FAP (4B9) P329GLALA抗體(亦稱為抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) 2+1 H2H)或對照分子之50微升/孔之4℃低溫FACS緩衝液中，隨後在4℃下在暗處培育1小時。在用200 μL DPBS/孔洗滌四次之後，將細胞在4℃下用含有2.5 μg/mL PE綴合之親和純化抗人類IgG Fcγ-片段-特異性山羊F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-098)之50微升/孔之4℃低溫FACS緩衝液染色30分鐘。細胞用200 µL 4℃ DPBS緩衝液洗滌兩次且隨後再懸浮於含有1%甲醛之50微升/孔DPBS中以用於固定。在同一天或第二天將細胞再懸浮於100 µL FACS緩衝液中且使用MACSQuant分析儀10 (Miltenyi Biotec)獲得。
如圖 4 中所示，FAP靶向之分子而非FAP非靶向之hu IgG1 P293G LALA形式有效結合至表現人類FAP之NIH/3T3-huFAP純系19細胞。因此，N端融合抗FAP 交叉Fab (黑色實心圓及線)比起C端融合之抗FAP VH/VL結合域(灰色實心方形及點線)以較高親和力結合至FAP。此由2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA抗體之較低EC50 值反映，且亦在飽和度下在較高gMFI中產生較高曲線下面積(AUC)值。擬合EC50 值及曲線下面積值列於表33中，且擬合AUC值列於表34中。 表33：結合至表現FAP之細胞株NIH/3T3-huFAP純系19之EC50 值
EC50 [nM] 2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) 2+1 VH/VL抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) 2+1 VH/VL抗4-1BB (20H4.9) ×非靶向(DP47) 非靶向(DP47) huIgG1 P329GLALA
NIH/3T3-huFAP純系19 1.813 3.944 n.d. 2.292
表34：結合至表現FAP之細胞株NIH/3T3-huFAP純系19之曲線下面積(AUC)值
AUC 2+1 H2H 抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) 2+1 VH/VL 抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) 2+1 VH/VL 抗4-1BB (20H4.9) ×非靶向(DP47) 非靶向(DP47) huIgG1 P329GLALA
NIH/3T3-huFAP 純系19 40184 21211 799 362
4.4與表現人類4-1BB之報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2之結合
為判定與人類4-1BB (CD137)所表現之細胞表面之結合，使用Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株(Promega, Germany)。將細胞作為懸浮液細胞維持在供應有10% (v/v)胎牛血清(FBS，Life Technologies之GIBCO，目錄號16000-044，第941273批，游離γ輻照之黴漿菌，熱滅活)、2 mM L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸二肽(Gluta-MAX-I，Life Technologies之GIBCO，目錄號35050-038)、1 mM丙酮酸鈉(SIGMA-Aldrich目錄號S8636)、1% (v/v) MEM-非必需胺基酸溶液100× (SIGMA-Aldrich，目錄號M7145)、600 μg/ml G-418 (Roche，目錄號04727894001)、400 μg/ml潮黴素B (Hygromycin B) (Roche，目錄號：10843555001)及25 mM HEPES (Sigma Life Sience，目錄號：H0887-100 mL)之RPMI 1640培養基(Life Technologies之GIBCO，目錄號42401-042)中。對於結合檢定，將2 × 105 之Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2添加至圓底懸浮液細胞96孔盤(Greiner bio-one, cellstar，目錄號650185)之各孔中。細胞用200 µL DPBS洗滌一次，且將集結粒再懸浮於含有1:5000稀釋之可固定的活力染料eFluor 450 (eBioscience，目錄號65 0863 18)之100微升/孔之4℃低溫DPBS緩衝液中。盤在4℃下培育30分鐘且用200 µL 4℃低溫DPBS緩衝液洗滌一次。然後將細胞再懸浮於含有不同滴定濃度之2+1 H2H促效性抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA抗體或對照分子之50微升/孔之4℃低溫FACS緩衝液中，隨後在4℃下在暗處培育1小時。在用200 μL DPBS/孔洗滌四次之後，將細胞在4℃下用含有2.5 μg/mL PE綴合之親和純化抗人類IgG Fcγ-片段-特異性山羊F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-098)之50微升/孔之4℃低溫FACS緩衝液染色30分鐘。細胞用200 µL 4℃ DPBS緩衝液洗滌兩次且隨後再懸浮於含有1%甲醛之50微升/孔DPBS中以用於固定。在同一天或第二天將細胞再懸浮於100 µL FACS緩衝液中且使用MACSQuant分析儀X (Miltenyi Biotec)獲得。
如圖 5 中所示，2+1 H2H促效性抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA抗體類似結合至4-1BB作為其對照抗4-1BB (20H4.9) huIgG1 P329G LALA。因此，抗FAP 交叉Fab之N端頭對頭融合未影響與4-1BB之結合。結合曲線之EC50 值及AUC分別列於表35及表36中。 表35：如圖5中所示之人類4-1BB所表現之細胞的結合曲線之EC50 值之概述
EC50 [nM] Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA 0.062
抗4-1BB (20H4.9) huIgG1 P329GLALA 0.073
表36：如圖5中所示之人類4-1BB所表現之細胞之結合曲線之AUC值之概述
AUC Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA 16912
抗4-1BB (20H4.9) huIgG1 P329GLALA 16011
4.5表現人類4-1BB及NFκB螢光素酶報導基因之報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NF-κB活化
4-1BB (CD137)受體與其配位體(4-1BBL)之促效性結合經由活化核因子κB (NFκB)誘導4-1BB下游信號傳導且促進CD8 T細胞之存活及活性(Lee HW, Park SJ, Choi BK, Kim HH, Nam KO, Kwon BS. 4-1BB promotes the survival of CD8 (+) T lymphocytes by increasing expression of Bcl-x(L) and Bfl-1. J Immunol 2002；169:4882-4888)。為監測2+1 H2H抗4-1BB、抗FAP huIgG1 PGLALA雙特異性抗體介導之此NFκB活化，自Promega (Germany)購得Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株。如上文所述培養細胞(結合至表現人類4-1BB之報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2)。對於檢定，將細胞收集且再懸浮於供應有10% (v/v) FBS及1% (v/v) GlutaMAX-I之檢定培養基RPMI 1640培養基中。10 μl含有2 × 103 個Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞轉移至具有蓋子之無菌白色384孔平坦底部組織培養盤(Corning，目錄號：3826)之各孔中。添加含有滴定濃度之具有FAP之單價結合之2+1 H2H雙特異性促效性抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA抗體(亦稱為抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) 2+1 H2H)或對照分子之10 μL之檢定培養基。最終，供應單獨或含有1 × 104 個細胞FAP表現細胞、人類黑色素瘤細胞株WM-266-4 (ATCC CRL-1676)或NIH/3T3-huFAP純系19 (如上文所述)之10 μL檢定培養基，且在細胞培育箱中在37℃及5% CO2 下培育盤6小時。將6 µl新鮮解凍之One-Glo螢光素酶檢定偵測溶液(Promega，目錄號：E6110)添加至各孔且立即使用Tecan微量盤讀取器(500 ms積分時間，無濾波器收集所有波長)量測Luminescence發光。
如圖 6 中所示，在無FAP表現細胞存在下，分子中無一者能夠在Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株中誘導強烈的人類4-1BB受體活化，從而引起NFκB活化及因此螢光素酶表現。在如WM-266-4 (人類黑色素瘤細胞株，中間FAP表現)或NIH/3T3-huFAP純系19 (人類FAP轉殖基因小鼠纖維母細胞細胞株)之FAP表現細胞存在下，雙特異性2+1抗4-1BB、抗FAP huIgG1 PGLALA抗體(2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9)抗體(黑色實心圓及線)或2+1 VH/VL抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9)抗體(灰色實心方形及點線)之交聯使得Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株中之NFκB活化之螢光素酶活性之增長強烈，其高於由非靶向對照抗4-1BB (20H4.9) ×非靶向(DP47) 2+1 VH/VL (空心灰色方形及小點線)介導之活化。因此，雙特異性2+1 H2H抗4-1BB ×抗FAP huIgG1 P329GLALA抗體(抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) 2+1 H2H，黑色實心圓及線)展示略微較佳活化(較低EC50 值)，其可反映對FAP之較高親和力。活化曲線之EC50 值及曲線下面積(AUC)列於表 37 及表 38 中。表 37 ：圖 6 中所示之活化曲線之 EC50 值
EC50 [nM] WM-266-4 NIH/3T3-huFAP純系19
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA 0.060 0.020
2+1 VH/VL (C端)抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA 0.028 0.008
2+1 VH/VL (C端)抗4-1BB (20H4.9) ×非靶向(DP47) huIgG1 P329GLALA 0.253 0.313
抗FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA n.d. n.d.
非靶向(DP47) huIgG1 P329GLALA n.d. n.d.
表 38 ： 圖 6 中所示之活化曲線之曲線下面積 (AUC) 的值
AUC 無FAP+ 細胞 WM-266-4 NIH/3T3-huFAP純系19
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA 715 49406 109410
2+1 VH/VL (C端)抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA 4363 30910 95104
2+1 VH/VL (C端)抗4-1BB (20H4.9) ×非靶向(DP47) huIgG1 P329GLALA 5778 8840 27218
抗FAP (4B9) huIgG1 P329GLALA 181 191 195
非靶向(DP47) huIgG1 P329G LALA 286 384 521
實例5 具有CEA之單價結合之2+1 H2H雙特異性促效性4-1BB抗原結合分子之功能性表徵 5.1表面電漿子共振(同時結合)
藉由表面電漿子共振(SPR)評估呈NABA構建體形式之人類4-1BB Fc(kih)及人類CEA之同時結合的能力。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%界面活性劑P20，Biacore, Freiburg/Germany)來進行。人類N(A2B2)A或(NA1)BA蛋白質藉由胺偶合直接偶合至CM5晶片之流動細胞。使用大約600 RU之固定程度。
經由流動細胞經90秒以200 nM之範圍濃度在30 μL/min之流速下傳遞CEA靶向之4-1BB促效劑構建體，且將解離設置為零秒。經由流動細胞經90秒將人類4-1BB Fc(kih)以500 nM之濃度在30 μL/min之流速下注射作為第二分析物(圖 10A )。監測解離120秒。藉由減去在參考流動細胞(其中未固定蛋白質)中獲得之反應來校正整體折射率差異。
如圖 10B 及10C 中可見，2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/CEA (A5B7) P329GLALA IgG1及2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/CEA (A5H1EL1D) huIgG1 P329GLALA可同時結合人類CEA (呈N(A2B2)A構建體形式)及人類4-1BB。圖 10D 展示同時結合人類CEA (呈(NA1)BA構建體形式)及人類4-1BB之2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA。 5.2與表現食蟹獼猴及人類CEACAM5之細胞株之結合
產生表現食蟹獼猴CEACAM5或人類CEACAM5之第一細胞株。將編碼人類及食蟹獼猴CEACAM5之全長cDNA次選殖至哺乳動物表現載體中。使用脂染胺LTX試劑(Invitrogen，#15338100)根據製造商方案將質體轉染至CHO-K1 (ATCC CRL-9618)細胞中。將穩定地經轉染CEACAM5陽性CHO細胞維持在補充有10%胎牛血清(FBS，Life Technologies之GIBCO，目錄號16000-044，第941273批，游離γ輻照之黴漿菌，熱滅活)及2 mM L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸二肽(Gluta-MAX-I，Life Technologies之GIBCO，目錄號35050-038)之DMEM/F-12 (Lifetechnologies之GIBCO，#11320033)中。轉染後兩天，將嘌呤黴素(Invivogen；#ant-pr-1)添加為6 µg/mL，且將細胞培養若干繼代。初始選擇後，藉由BD FACSAria II細胞分選儀(BD Biosciences)分選具有人類及食蟹獼猴CEACAM5 (偵測抗體抗CD66純系CD66AB.1.1)之高細胞表面表現之細胞，且培養其以建立穩定細胞純系。藉由流動式細胞量測術分析經4週之時段證實表現量及穩定性。對於結合檢定，收集CHO-k1-cynoCEACAM5純系8、CHO-k1-huCEACAM5純系11、CHO-k1-huCEACAM5純系12或CHO-k1-huCEACAM5純系13，用DPBS (life technologies之GIBCO，#14190-136)洗滌，在4℃下在含有DPBS之可固定的活力染料eF450 (eBioscience #65-0863-18)中染色30 min。洗滌細胞，且將其接種至384孔盤(Corning #3830)中至3 × 104 個細胞/孔。離心細胞(350×g，5 min)，移除上清液且將細胞再懸浮於含有滴定濃度之2+1 H2H雙特異性促效性4-1BB (20H4.9) × CEA huIgG1 P329GLALA抗體或對照物(起始濃度300 nM)之10微升/孔FACS緩衝液(供應有2% FBS、5 nM EDTA、7.5 mM疊氮化鈉之DPBS)中。在4℃下培育細胞30分鐘，且隨後用80微升/孔DPBS洗滌兩次。將細胞在4℃下再懸浮於含有2.5 μg/mL PE綴合之親和純化抗人類IgG Fcγ-片段-特異性山羊F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-098)之10微升/孔FACS緩衝液中30分鐘。將細胞用80微升/孔DPBS洗滌兩次，且隨後固定在含有1%甲醛之30微升/孔DPBS中至少15分鐘。在同一天或第二天將細胞再懸浮於50微升/孔FACS緩衝液中且使用MACSQuant分析儀X (Miltenyi Biotec)獲得。
如圖 12A 至12D 中所示，2+1 H2H雙特異性促效性4-1BB (20H4.9) × CEA huIgG1 P329GLALA抗體而非CEA非靶向之huIgG1 P293G LALA格式有效結合至表現人類CEACAM5之CHO-k1純系12及純系13細胞。相比之下，僅2+1 H2H雙特異性促效性4-1BB (20H4.9) × CEA (A5B7) huIgG1 P329GLALA抗體良好地結合至表現食蟹獼猴CEACAM5之CHO-k1-cynoCEACAM5細胞株。2+1 H2H雙特異性促效性4-1BB (20H4.9) × CEA (A5H1EL1D) huIgG1 P329GLALA抗體與表現食蟹獼猴CECAM5之CHO-k1-cynoCEACAM5之結合非常弱，而2+1 H2H雙特異性促效性4-1BB (20H4.9) × CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA抗體不結合至CHO-k1-cynoCEACAM5，因為MFE23純系不具人類/食蟹獼猴交叉反應性。擬合EC50 值及曲線下面積值列於表39中，且擬合AUC值列於表40中。 表39：圖9中所示之結合至表現CEACAM5之細胞株之EC50 值
EC50 [nM] CHO-k1-cynoCEACAM5純系8 CHO-k1-人類CEACAM5純系11 CHO-k1-人類CEACAM5純系12 CHO-k1-人類CEACAM5純系13
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA n.d. 3 8.1 14.6
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (A5B7) huIgG1 P329GLALA 48.8 11.4 13.9 12.9
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (A5H1EL1D) huIgG1 P329GLALA n.d. n.d. n.d. n.d.
抗4-1BB (20H4.9) huIgG1 P329G LALA n.d. n.d. n.d. n.d.
DP47 huIgG1 P329GLALA n.d. n.d. n.d. n.d.
表40：圖9中所示之結合至表現CEACAM5之細胞株之曲線下面積(AUC)值
AUC CHO-k1-cynoCEACAM5純系8 CHO-k1-人類CEACAM5純系11 CHO-k1-人類CEACAM5純系12 CHO-k1-人類CEACAM5純系13
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA 169 25740 85983 102116
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (A5B7) huIgG1 P329GLALA 4850 15517 50894 66183
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (A5H1EL1D) huIgG1 P329GLALA 614 6797 25024 38663
抗4-1BB (20H4.9) huIgG1 P329GLALA 136 474 754 842
DP47 huIgG1 P329GLALA 219 746 1187 1866
5.3表現人類4-1BB及NFκB螢光素酶報導基因之報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NF-κB活化
4-1BB (CD137)受體與其配位體(4-1BBL)之促效性結合經由活化核因子κB (NFκB)誘導4-1BB下游信號傳導且促進CD8 T細胞之存活及活性(Lee HW, Park SJ, Choi BK, Kim HH, Nam KO, Kwon BS. 4-1BB promotes the survival of CD8 (+) T lymphocytes by increasing expression of Bcl-x(L) and Bfl-1. J Immunol 2002；169:4882-4888)。為監測2+1 H2H抗4-1BB、抗CEA huIgG1 PGLALA雙特異性抗體介導之此NFκB活化，自Promega (Germany)購得Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株。如上所述培養細胞。對於檢定，將細胞收集且再懸浮於供應有10% (v/v) FBS及1% (v/v) GlutaMAX-I之檢定培養基RPMI 1640培養基中。10 μl含有2 × 103 個Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞轉移至具有蓋子之無菌白色384孔平坦底部組織培養盤(Corning，目錄號：3826)之各孔中。添加含有滴定濃度之具有CEA之單價結合之2+1 H2H雙特異性促效性抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA huIgG1 P329GLALA抗體(不同純系，例如A5B7、A5H1EL1D或MFE23)或對照分子之10 μL之檢定培養基。最終，供應單獨或含有1 × 104 個細胞之經不同CHO-k1細胞轉染之食蟹獼猴或人類CEACAM5之10 μL檢定培養基，且在細胞培育箱中在37℃及5% CO2 下培育盤6小時。將6 µl新鮮解凍之One-Glo螢光素酶檢定偵測溶液(Promega，目錄號：E6110)添加至各孔且立即使用Tecan微量盤讀取器(500 ms積分時間，無濾波器收集所有波長)量測Luminescence發光。
如圖 13A 至13D 中所示，在無表現CEACAM5之細胞存在下，分子中無一者能夠在Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株中誘導強烈的人類4-1BB受體活化，從而引起NFκB活化及因此螢光素酶表現。在如CHO-k1-人類CEACAM5純系11及CHO-k1-人類CEACAM5純系12之表現人類CEACAM5之細胞存在下，雙特異性2+1抗4-1BB、抗CEA huIgG1 PGLALA抗體(2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (MFE23)抗體(黑色實心圓及點線)或2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (A5B7)抗體(黑色實心菱形及線)或2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (A5H1EL1D)抗體(灰色面向下三角形)之交聯使得Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株中之NFκB活化之螢光素酶活性之增長強烈，其高於由非靶向對照抗4-1BB (20H4.9) huIgG1 P329GLALA (空心灰色方形及點線)介導之活化。在CHO-k1-cynoCEACAM5純系8存在下，僅2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (A5B7) huIgG1 P329GLALA抗體(黑色實心菱形及線)及2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (A5H1EL1D) huIgG1 P329GLALA抗體(灰色面向下三角形)誘導Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株中之NFκB活化之螢光素酶活性之增長強烈，而非2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA抗體(黑色實心圓及點線)，因為MFE23結合子不具人類/食蟹獼猴交叉反應性。
活化曲線之EC50 值及曲線下面積(AUC)列於表 41 及表 42 中。表 41 ：圖 10 中所示之活化曲線之 EC50 值
EC50 [nM] 無CEA+細胞 CHO-k1-cynoCECAM5純系8 CHO-k1-人類CECAM5純系11 CHO-k1-人類CECAM5純系12
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA 0.1 0.14 0.02 0.02
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (A5B7) huIgG1 P329GLALA 0.04 0.07 0.04 0.03
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (A5H1EL1D) huIgG1 P329GLALA 0.09 0.1 0.05 0.04
抗4-1BB (20H4.9) huIgG1 P329GLALA 0.19 0.17 0.18 0.19
DP47 huIgG1 P329GLALA n.d. n.d. n.d. n.d.
表 42 ： 圖 10 中所示之活化曲線之曲線下面積 (AUC) 的值
AUC 無CEA+細胞 CHO-k1-cynoCECAM5純系8 CHO-k1-人類CECAM5純系11 CHO-k1-人類CECAM5純系12
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA 774 802 76184 72254
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (A5B7) huIgG1 P329GLALA 1325 43107 65721 58883
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA (A5H1EL1D) huIgG1 P329GLALA 1131 26476 58133 56614
抗4-1BB (20H4.9) huIgG1 P329GLALA 5067 4918 15362 11937
DP47 huIgG1 P329GLALA 47 77 264 313
實例6 具有與4-1BB之二價結合及與PD-L1之單價結合之雙特異性抗體之製備、純化及表徵 2.1產生及製備具有與4-1BB之二價結合及與PD-L1之單價結合之雙特異性抗體
亦可藉由用抗PD-L1交叉Fab置換抗FAP交叉Fab來製備具有4-1BB之二價結合及PD-L1之單價結合之雙特異性促效性4-1BB抗體。此構建體亦稱為頭對頭(H2H) 2+1形式。
構建體之第一重鏈HC1包含以下組分：抗4-1BB結合子(純系20H4.9)之VHCH1，隨後為Fc臼。第二重鏈HC2包含抗PD-L1結合子(呈交叉Fab形式之純系YW243.55.S70)之VLCH1，隨後為抗4-1BB (純系20H4.9)之VHCH1，且隨後為Fc杵。PD-L1結合子YW243.55.S70描述於WO 2010/077634中。對於4-1BB結合子，根據US 7,288,638 B2或US 7,659,384 B2獲得純系20H4.9之VH及VL序列。兩個重鏈之組合允許產生雜二聚體，其包括PD-L1結合交叉Fab及兩個4-1BB結合Fab (圖 1E )。具有與4-1BB之單價結合之另一雜二聚體由包含抗4-1BB結合子(純系20H4.9)之VHCH1之第一重鏈HC1隨後為Fc臼及包含抗PD-L1結合子(呈交叉Fab形式之純系YW243.55.S70)之VLCH1之第二重鏈HC2隨後為Fc杵解釋(圖 1F )。
為改善正確配對，將以下突變引入抗4-1BB Fab分子之CH-CL中：CL中之E123R及Q124K以及CH1中之K147E及K213E。抗PD-L1結合子之第二輕鏈LC2包含VHCL (交叉Fab)。藉由在第一重鏈HC1 (Fc臼重鏈)中引入Y349C/T366S/L368A/Y407V突變及在第二重鏈HC2 (Fc杵重鏈)中引入S354C/T366W突變來應用杵-臼技術，以允許產生雜二聚體。
此外，根據國際專利申請公開案第WO2012/130831A1號中描述之方法，在杵及臼重鏈之恆定區中引入Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變以消除與Fcγ受體之結合。
針對2+1抗4-1BB抗FAP huIgG1 P329GLALA抗體，如實例1.2中所述產生雙特異性2+1 H2H抗4-1BB抗PD-L1 huIgG1 P329GLALA抗體。
雙特異性4-1BB (20H4.9)/PD-L1 P329GLALA IgG1 2+1 (H2H)抗體之胺基酸序列可見於表 43 中，而雙特異性4-1BB (20H4.9)/ PD-L1 P329GLALA IgG1 1+1抗體之胺基酸序列可見於表 44 中。
如實例1.2中所述產生及純化蛋白質。表 43 ： 雙特異性二價抗4-1BB /單價抗PD-L1人類IgG1 P329GLALA抗體(2+1 H2H)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
193 VLCH1 (PD-L1) VHCH1(EE) (20H4.9) -重鏈HC2 (Fc杵) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
194 VHCL-輕鏈(PD-L1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表 44 ： 雙特異性單價抗4-1BB /單價抗PD-L1人類IgG1 P329GLALA抗原結合分子(1+1)之胺基酸序列
SEQ ID NO: 描述 序列
65 VHCH1(EE) (20H4.9)-重鏈HC1 (Fc臼) 參見表1
195 VLCH1 (PD-L1) -重鏈HC2 (Fc杵) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 VLCL(RK)-輕鏈(20H4.9) 參見表1
194 VHCL-輕鏈(PD-L1) 參見表43
如實例1.2中所述進行雙特異性抗體之產生。所獲得產物之例示性分析展示於下表45中。表 45 -抗4-1BB、抗PD-L1 huIgG1 PGLALA之生物化學分析
分子 單體[%] 產量[mg/l] CE-SDS (非還原性，主峰)
2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/ PD-L1人類IgG1 PGLALA 100 13.8 90
1+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/ PD-L1人類IgG1 PGLALA 100 14.3 84
實例7 具有PD-L1之單價結合之2+1 H2H雙特異性促效性4-1BB抗原結合分子之功能性表徵 7.1表面電漿子共振(同時結合)
藉由表面電漿子共振(SPR)評估同時結合人類4-1BB Fc(kih)及人類PD-L1之能力。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%界面活性劑P20，Biacore, Freiburg/Germany)來進行。人類4-1BB-Fc(kih)蛋白質藉由胺偶合直接偶合至CM5晶片之流動細胞。使用大約900 RU之固定程度。
經由流動細胞經90秒以150 nM之範圍濃度在10 μL/min之流速下傳遞PD-L1靶向之4-1BB促效劑構建體，且將解離設置為零秒。經由流動細胞經90秒將人類PD-L1-Fc (重組人類PD-L1/B7-H1 Fc嵌合體蛋白質，156-B7-100：R&D Systems)以200 nM之濃度在30 μL/min之流速下注射作為第二分析物(圖 14A )。監測解離240秒。藉由減去在參考流動細胞(其中未固定蛋白質)中獲得之反應來校正整體折射率差異。
如圖 14B 及14C 中可見，2+1H2H及1+1 4-1BB (20H4.9)/ PD-L1人類IgG1 PGLALA抗體均可同時結合人類PD-L1及人類4-1BB。 7.2與表現人類PD-L1之細胞株之結合
首先產生表現人類PD-L1之細胞株。將編碼人類PD-L1之全長cDNA次選殖至哺乳動物表現載體中。使用脂染胺LTX試劑(Invitrogen，#15338100)根據製造商方案將質體轉染至MKN45 (DSMZ 409)細胞中。將穩定地經轉染PD-L1陽性PD-L1細胞維持在補充有10%胎牛血清(FBS，Life Technologies之GIBCO，目錄號16000-044，第941273批，游離γ輻照之黴漿菌，熱滅活)及2 mM L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸二肽(Gluta-MAX-I，Life Technologies之GIBCO，目錄號35050-038)之RPMI 1640培養基 (Life Technologies之GIBCO，目錄號42401-042)中，且維持在200 μg/mL潮黴素B (Roche，目錄號10843555001)及1.5 μg/mL嘌呤黴素(Life Technologies之Gibco，目錄號A11138-02)之選擇下。對於結合檢定，收集MKN45細胞及MKN45-huPD-L1，用DPBS (GIBCO by life technologies, #14190-136)洗滌，在4℃下在含有DPBS之可固定的活力染料eF450 (eBioscience #65-0863-18)中染色30 min。洗滌細胞，且將其接種至384孔盤(Corning #3830)中至3 × 104 個細胞/孔。離心細胞(350×g，5 min)，移除上清液且將細胞再懸浮於含有滴定濃度之2+1 H2H雙特異性促效性4-1BB (20H4.9) × PD-L1 huIgG1 P329GLALA、1+1雙特異性促效性4-1BB (20H4.9) × PD-L1 huIgG1 P329GLALA抗體或對照物(起始濃度300 nM)之10微升/孔FACS緩衝液(供應有2% FBS、5 nM EDTA、7.5 mM疊氮化鈉之DPBS)中。在4℃下培育細胞30分鐘，且隨後用80微升/孔DPBS洗滌兩次。將細胞在4℃下再懸浮於含有2.5 μg/mL PE綴合之親和純化抗人類IgG Fcγ-片段-特異性山羊F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-098)之10微升/孔FACS緩衝液中30分鐘。將細胞用80微升/孔DPBS洗滌兩次，且隨後固定在含有1%甲醛之30微升/孔DPBS中至少15分鐘。在同一天或第二天將細胞再懸浮於50微升/孔FACS緩衝液中且使用MACSQuant分析儀X (Miltenyi Biotec)獲得。
如圖 15B 中所示，2+1 H2H雙特異性促效性4-1BB (20H4.9) × PD-L1 huIgG1 P329GLALA抗體(黑色三角形及線)及1+1雙特異性促效性4-1BB (20H4.9) × PD-L1 (灰色三角形及線)而非PD-L1非靶向之huIgG1 P293GLALA形式有效結合至表現人類PD-L1之MKN45-huPD-L1細胞而不結合至親本細胞株MKN45。擬合EC50 值及曲線下面積值列於表46中，且擬合AUC值列於表47中。 表46：圖15B中所示之結合至表現PD-L1之細胞株之EC50 值
EC50 [nM] MKN45-huPD-L1
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗PD-L1 huIgG1 P329GLALA 1.95
1+1抗4-1BB (20H4.9) ×抗PD-L1) huIgG1 P329GLALA 1.54
表47：圖15B中所示之結合至表現PD-L1之細胞株之曲線下面積(AUC)值
AUC MKN45-huPD-L1
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗PD-L1 huIgG1 P329GLALA 66296
1+1抗4-1BB (20H4.9) ×抗PD-L1) huIgG1 P329GLALA 63744
7.3表現人類4-1BB及NFκB螢光素酶報導基因之報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中的NF-κB活化
4-1BB (CD137)受體與其配位體(4-1BBL)之促效性結合經由活化核因子κB (NFκB)誘導4-1BB下游信號傳導且促進CD8 T細胞之存活及活性(Lee HW, Park SJ, Choi BK, Kim HH, Nam KO, Kwon BS. 4-1BB promotes the survival of CD8 (+) T lymphocytes by increasing expression of Bcl-x(L) and Bfl-1. J Immunol 2002；169:4882-4888)。為監測2+1 H2H抗4-1BB×抗PD-L1 huIgG1 PGLALA雙特異性抗體介導之此NFκB活化，自Promega (Germany)購得Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株。如上所述培養細胞。對於檢定，將細胞收集且再懸浮於供應有10% (v/v) FBS及1% (v/v) GlutaMAX-I之檢定培養基RPMI 1640培養基中。10 μl含有2 × 103 個Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞轉移至具有蓋子之無菌白色384孔平坦底部組織培養盤(Corning，目錄號：3826)之各孔中。添加含有滴定濃度之2+1 H2H雙特異性促效性抗4-1BB (20H4.9) ×抗PD-L1 huIgG1 P329GLALA抗體、1+1雙特異性促效性抗4-1BB (20H4.9) ×抗PD-L1 huIgG1 P329GLALA抗體或對照分子之10 μL之檢定培養基。最終，供應單獨或含有1 × 104 個細胞之經人類PD-L1轉染之親本MKN45或MKN45細胞之10 μL檢定培養基，且在細胞培育箱中在37℃及5% CO2 下培育盤6小時。將6 µl新鮮解凍之One-Glo螢光素酶檢定偵測溶液(Promega，目錄號：E6110)添加至各孔且立即使用Tecan微量盤讀取器(500 ms積分時間，無濾波器收集所有波長)量測Luminescence發光。
如圖 16A 至16C 中所示，在無表現PD-L1之細胞存在下，分子中無一者能夠在Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株中誘導強烈的人類4-1BB受體活化，從而引起NFκB活化及因此螢光素酶表現。在表現人類PD-L1之MKN45細胞存在下，雙特異性2+1 H2H抗4-1BB、抗PD-L1 huIgG1 PGLALA抗體(黑色三角形及線)或雙特異性1+1抗4-1BB、抗PD-L1 huIgG1 PGLALA抗體(灰色三角形及線)之交聯使得Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株中之NFκB活化之螢光素酶活性之增長強烈，其高於由非靶向對照抗4-1BB (20H4.9) huIgG1 P329GLALA (實心灰色圓及線)介導之活化。活化曲線之EC50 值及曲線下面積(AUC)列於表 48 及表 49 中。表 48 ：圖 16B 中所示之活化曲線之 EC50 值
EC50 [nM] MKN45-huPD-L1
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗PD-L1 huIgG1 P329GLALA 0.04
1+1抗4-1BB (20H4.9) ×抗PD-L1) huIgG1 P329GLALA 0.10
表 49 ： 圖 16B 中所示之活化曲線之曲線下面積 (AUC) 的值
AUC MKN45-huPD-L1
2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗PD-L1 huIgG1 P329GLALA 134607
1+1抗4-1BB (20H4.9) ×抗PD-L1) huIgG1 P329GLALA 122416
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圖 1A 展示本發明之雙特異性抗原結合分子之實例。雙特異性抗原結合分子呈huIgG1 P329GLALA形式，其包含兩個抗4-1BB Fab片段(與4-1BB二價結合)及一個抗FAP 交叉Fab片段(一種Fab片段，其中VH及VL區交換)，該Fab片段在其重鏈之C端融合至4-1BB Fab片段中之一者之重鏈之N端。此形式在本文中稱為頭對頭(H2H) 2+1形式。大黑點象徵杵-臼突變，而CH1/CL域中之小黑點象徵胺基酸突變，其改善重鏈與抗4-1BB輕鏈之正確配對。 在圖 1B 中展示呈huIgG1 P329GLALA形式之另一種雙特異性抗原結合分子，其分別包含能夠特異性結合至在重鏈之C端融合之FAP的兩個抗4-1BB Fab片段(與4-1BB二價結合)及VH及VL域。此形式在本文中稱為2+1 VH/VL形式，且在本文用作對照分子。在圖 1C 中 ，展示呈huIgG1 P329GLALA形式之雙特異性抗原結合分子，其包含兩個抗4-1BB Fab片段(與4-1BB二價結合)及生殖系對照DP47 (非靶向對照)之VH及VL域。圖 1D 展示包含兩個抗4-1BB Fab片段(與4-1BB二價結合)之呈huIgG1 P329GLALA形式之標準抗體。圖 1E 展示本發明之雙特異性抗原結合分子之另一實例。雙特異性抗原結合分子呈huIgG1 P329GLALA形式，其包含兩個抗4-1BB Fab片段(與4-1BB二價結合)及一個抗人類PD-L1 (稱為抗PD-L1)交叉Fab片段(一種Fab片段，其中VH及VL區交換)，該Fab片段在其重鏈之C端融合至4-1BB Fab片段中之一者之重鏈之N端。此形式在本文中稱為頭對頭(H2H) 2+1形式。大黑點象徵杵-臼突變，而CH1/CL域中之小黑點象徵胺基酸突變，其改善重鏈與抗4-1BB輕鏈之正確配對。圖 1F 展示呈huIgG1 P329GLALA形式之雙特異性抗原結合分子，其包含一個抗4-1BB Fab片段(與4-1BB單價結合)及一個抗人類PD-L1 (稱為抗PD-L1)交叉Fab片段(一種Fab片段，其中VH及VL區交換)。此形式在本文稱為1+1形式。大黑點象徵杵-臼突變，而CH1/CL域中之小黑點象徵胺基酸突變，其改善重鏈與抗4-1BB輕鏈之正確配對。圖 2A 及2B 係關於雙特異性2+1 H2H抗4-1BB ×抗FAP huIgG1 P329GLALA抗原結合分子與4-1BB及FA之同時結合。圖 2A 為檢定設置之象形圖。圖 2B 展示雙特異性H2H抗4-1BB ×抗FAP抗原結合分子(分析物1)與固定人類4-1BB及人類FAP (分析物2)之同時結合。圖 3 展示基於FRET之競爭檢定以評估2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9)抗原結合分子之二價結合。在經轉染Hek細胞上表現之hu4-1BB-SNAP Tb標記之與d2標記之4-1BB(純系20H4.9) IgG之間的相互作用藉由添加未標記之2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) huIgG1 PGLALA構建體(針對4-1BB之Fab中之一者不具有游離N端，實心方形)或藉由未標記之2+1 VH/VL (C端) 4-1BB (20H4.9) × FAP (4B9)雙特異性構建體(兩個針對4-1BB之「游離Fab」，空心方形)競爭。競爭使得TR-FRET信號減少。 在圖 4 中，展示與表現人類FAP之NIH/3T3-huFAP純系19細胞之結合。2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP(4B9)抗原結合分子(黑色實心圓及線)或其對照分子之濃度針對PE綴合之二級偵測抗體之螢光強度之幾何平均值(gMFI)進行繪圖。所有值藉由減去空白對照(例如無一級偵測抗體，僅二級偵測抗體)之基線值進行基線校正。僅含有FAP抗原結合域之構建體，如抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) 2+1 H2H huIgG1 P329GLALA (黑色實心圓及線)及抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) 2+1 VH/VL huIgG1 P329GLALA (灰色實心方形及線)有效地與表現FAP之細胞結合。可以看出，抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) 2+1 H2H huIgG1 P329GLALA (黑色實心圓及線)之N端融合的抗FAP 交叉Fab片段展示比起抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) VH/VL 2+1 huIgG1 P329GLALA (灰色實心方形及線)之C端融合的VH/VL抗FAP抗原結合域更高的gMFI及更低的EC50 。圖 5 展示與表現人類4-1BB (CD137)之報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2之結合。2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP(4B9)抗原結合分子(黑色實心圓及線)或其對照物之濃度針對PE綴合之二級偵測抗體之螢光強度之幾何平均值(gMFI)進行繪圖。所有值藉由減去空白對照(例如無一級偵測抗體，僅二級偵測抗體)之基線值進行基線校正。抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9) 2+1 H2H huIgG1 P329GLALA (黑色實心圓及線)類似地與4-1BB結合作為其對照抗4-1BB (20H4.9) huIgG1 P329GLALA (灰色星形及線)。圖 6A 至6C 展示表現4-1BB之報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中之NFκB介導之螢光素酶表現活性。為了測試2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP(4B9)抗原結合分子(黑色實心圓及線)相對於2+1 VH/VL抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP (4B9)抗原結合分子(灰色實心方形及線)相對於對照之功能性，在表現人類FAP之細胞株不存在或存在下將分子與報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2以1:5比率一起培育5 h。2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP(4B9)抗原結合分子或其對照物之濃度針對培育及添加螢光素酶偵測溶液5 h後量測之釋放的光之單元(RLU)進行繪圖。所有值藉由減去空白對照(例如不添加抗體)之基線值進行基線校正。在圖 6A 中展示與FAP靶向無關之4-1BB活化，而4-1BB結合在無任何FAP介導之交聯存在下誘導報導體細胞株中之NFκB受控螢光素酶表現。在圖 6B 中添加表現FAP之人類黑色素瘤細胞株WM-266-4人類黑色素瘤細胞株(中間產物FAP表面表現)。表現FAP之WM-266-4細胞使得雙特異性4-1BB (20H4.9) × FAP (4B9)抗原結合分子交聯。雙特異性FAP靶向之2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗FAP(4B9)抗原結合分子(黑色實心圓及線)展示略微較佳活化(較低EC50值)，其可反映與FAP之較高親和力。此可甚至更好地見於圖 6C 中，該圖展示在高表現FAP之細胞株 NIH/3T3-huFAP純系19 (人類-FAP-轉殖基因小鼠纖維母細胞細胞株)存在下NFκB誘導之螢光素酶活化。圖 7 展示與親本鼠類A5B7抗體之結合相比，人類化A5B7 huIgG1 P329G LALA變異體與MKN-45之結合。用螢光標記之二級抗體偵測抗體且藉由流動式細胞量測術量測螢光。圖 8A 及8B 展示人類化MFE23抗體變異體之VH胺基酸序列(圖8A)及VL胺基酸序列(圖8B)之比對。圖 9A 、 9B 及 9C 展示與親本鼠類MFE23抗體之結合相比，人類化MFE23 huIgG1 P329G LALA變異體與MKN-45之結合。用螢光標記之二級抗體偵測抗體且藉由流動式細胞量測術量測螢光。將曲線圖分成顯示與親本MFE23純系之低結合、中間結合及類似結合之三個曲線圖。圖 10A 至10D 係關於CEA靶向三聚體分離4-1BBL分子與hu4-1BB及huN(A2-B2)A或hu(NA1)BA之同時結合。圖 10A 展示檢定設置。圖 10B 展示2+1 H2H抗人類4-1BB (20H4.9) × CEA (A5B7) huIgG1 P329GLALA (分析物1)與固定人類N(A2-B2)A及人類4-1BB (分析物2)之同時結合。圖 10C 展示2+1 H2H 4-1BB (20H4.9) × CEA (A5H1EL1D) huIgG1 P329GLALA (分析物1)與固定人類N(A2-B2)A及人類4-1BB (分析物2)之同時結合。圖 10D 展示2+1 H2H 4-1BB (20H4.9) × CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA (分析物1)與固定人類(NA1)BA及人類4-1BB (分析物2)之同時結合。展示一式兩份。 用於結合檢定之不同CEACAM5表現純系之細胞表面CEACAM5表現量展示於圖 11 中。稱為CHO-k1 (ATCC CRL-9618)之中國倉鼠卵巢細胞株經食蟹獼猴CEACAM5 (CHO-k1-cynoCEACAM5純系8)或人類CEACAM5 (CHO-k1-huCEACAM5純系11、純系12及純系13)轉染。藉由流動式細胞量測術使用滴定APC標記之抗CD66特異性偵測抗體(純系CD66AB.1.1)測定表現量。展示螢光強度相對於偵測抗體之濃度之中值，其中螢光強度之中值與結合偵測抗體之量、且因此與細胞表面上之CEACAM5分子之表現量正相關。CHO-k1-cynoCEACAM5純系8及CHO-k1-huCEACAM5純系11顯示類似細胞表面CEACAM5表現，而CHO-k1-huCEACAM5純系12及13展示高細胞表面CEACAM5表現量。 在圖 12A 至12D 中，展示與表現食蟹獼猴CEACAM5或人類CEACAM5之CHO-k1細胞之結合。2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA(4B9)抗原結合分子或對照分子之濃度針對PE綴合之二級偵測抗體之螢光強度之中值進行繪圖。所有值藉由減去空白對照(例如無一級偵測抗體，僅二級偵測抗體)之基線值進行基線校正。僅含有CEACAM5抗原結合域之構建體，例如，抗4-1BB (20H4.9) × CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (黑色實心圓、點線)、抗4-1BB (20H4.9) × CEA (A5B7) huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (黑色實心菱形、黑線)及4-1BB (20H4.9) × (A5H1EL1D) huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (灰色面向下三角形、灰線)有效結合至表現人類CEACAM5之細胞(圖 12B 、 12C 及12D )。相比之下，僅4-1BB (20H4.9) × CEA (A5B7) huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (黑色實心菱形、黑線)可偵測地結合至食蟹獼猴CEACAM5，4-1BB (20H4.9) × (A5H1EL1D) huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (灰色面向下三角形、灰線)僅展示非常弱的食蟹獼猴CEACAM5，且4-1BB (20H4.9) × CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (黑色實心圓、點線)展示無結合，因為MFE23不具人類/獼猴交叉反應性( 圖 12A) 。圖 13A 至13D 展示表現4-1BB之報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中之NFκB介導之螢光素酶表現活性。為了測試2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA抗原結合分子相對於對照物之功能性，在表現食蟹獼猴或人類CEACAM5之CHO-k1細胞株之不存在或存在下以1:5比率將分子與報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2一起培育5 h。2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗CEA抗原結合分子或其對照物之濃度針對培育及添加螢光素酶偵測溶液5 h後量測之釋放的光之單元(RLU)進行繪圖。所有值藉由減去空白對照(例如不添加抗體)之基線值進行基線校正。與對表現CEACAM5之CHO-k1細胞之結合檢定相關，含有所有CEACAM5抗原結合域之構建體，例如，抗4-1BB (20H4.9) × CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (黑色實心圓、點線)、抗4-1BB (20H4.9) × CEA (A5B7) huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (黑色實心菱形、黑線)及抗4-1BB (20H4.9) × (A5H1EL1D) huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (灰色面向下三角形、灰線)在人類CEACAM5表現CHO-k1細胞株存在下誘導增加之Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株活化(圖 13C 及圖 13D )。而在食蟹獼猴CEACAM5存在下，僅抗4-1BB (20H4.9) × CEA (A5B7) huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (黑色實心菱形、黑線)及抗4-1BB (20H4.9) × (A5H1EL1D) huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (灰色面向下三角形、灰線)而非抗4-1BB (20H4.9) × CEA (MFE23) huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (黑色實心圓、點線)誘導Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株活化，因為MFE23不具人類/食蟹獼猴交叉反應性(圖 13B )。在表現CEACAM5之細胞不存在下，無4-1BB (20H4.9) × CEA 2+1 H2H之交聯出現，且不活化Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2報導體細胞株。圖 14A 展示評估PD-L1靶向之4-1BB促效劑構建體與hu4-1BB及huPD-L1-Fc之同時結合之設置。圖 14B 展示2+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/ PD-L1人類IgG1 PGLALA與huPD-L1-Fc及hu4-1BB-Fc(kih)之同時結合。圖 14C 展示1+1 H2H 4-1BB (20H4.9)/ PD-L1人類IgG1 PGLALA與huPD-L1-Fc及hu4-1BB-Fc(kih)之同時結合。展示一式三份。 在圖 15A 及 15B 中，展示與MKN45及PD-L1經轉染MKN45 (MKN45-huPD-L1)細胞之結合。2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) ×抗人類PD-L1抗原結合分子、1+1抗4-1BB (20H4.9) ×抗人類PD-L1抗原結合分子或對照分子之濃度針對PE綴合之二級偵測抗體之螢光強度之幾何平均值進行繪圖。所有值藉由減去空白對照(例如無一級偵測抗體，僅二級偵測抗體)之基線值進行基線校正。僅含PD-L1抗原結合域之構建體，例如，4-1BB (20H4.9) × PD-L1 huIgG1 P329GLALA 2+1 H2H (黑色面向上三角形及線)及抗4-1BB (20H4.9) × PD-L1 huIgG1 P329GLALA 1+1 (灰色面向下三角形及線)有效結合至表現人類PD-L1之MKN45-huPD-L1細胞( 圖 15B) 而不結合至親本細胞株MKN45( 圖 15A) 。圖 16A 至16C 展示表現4-1BB之報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2中之NFκB介導之螢光素酶表現活性。為了測試2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) × PD-L1及1+1抗4-1BB (20H4.9) × PD-L1抗原結合分子相對於對照物之功能性，在表現人類PD-L1之MKN45細胞株之不存在或存在下以1:5比率將分子與報導體細胞株Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2一起培育5 h。2+1 H2H抗4-1BB (20H4.9) × PD-L1及1+1抗4-1BB (20H4.9) × PD-L1抗原結合分子或其對照物之濃度針對培育及添加螢光素酶偵測溶液5 h後量測之釋放的光之單元(RLU)進行繪圖。所有值藉由減去空白對照(例如不添加抗體)之基線值進行基線校正。如由1+1抗4-1BB (20H4.9) × PD-L1 huIgG1 P329GLALA顯示之與4-1BB之單價結合產生略微較低EC50 值。
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Figure 12_A0101_SEQ_0162
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Claims (32)

  1. 一種雙特異性抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至4-1BB之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至靶細胞抗原之第二Fab片段， (c)能夠特異性結合至4-1BB之第三Fab片段，及 (d)包含能夠穩定締合之第一及第二子單元之Fc域，其中該第二Fab片段(b)在Fab重鏈之C端融合至該第一Fab片段(a)之Fab重鏈之N端，該第一Fab片段(a)之Fab重鏈繼而在其C端融合至該第一Fc域子單元之N端，且該第三Fab片段(c)在Fab重鏈之C端融合至該第二Fc域子單元之N端，且 其中在能夠特異性結合至靶細胞抗原之該第二Fab片段中，(i)可變域VL及VH相互置換，或(ii)恆定域CL及CH1相互置換。
  2. 如請求項1之雙特異性抗原結合分子，其中該雙特異性抗原結合分子提供與4-1BB之二價結合及與該靶細胞抗原之單價結合。
  3. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中由能夠穩定締合之第一及第二子單元組成的該Fc域為IgG Fc域，特定言之IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。
  4. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中根據杵-臼方法，該Fc域之該第一子單元包含杵且該Fc域之該第二子單元包含臼。
  5. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域包含一或多個胺基酸取代，該(等)取代降低該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應子功能，特定言之胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。
  6. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至4-1BB之該第一Fab片段及該第三Fab片段各自包含 重鏈可變區(VH 4-1BB)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL 4-1BB)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之CDR-L3。
  7. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至4-1BB之該第一Fab片段及該第三Fab片段各自包含：重鏈可變區(VH 4-1BB)，其包含與SEQ ID NO:7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL 4-1BB)，其包含與SEQ ID NO:8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  8. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中在能夠特異性結合至4-1BB之該第一Fab片段及該第三Fab片段之該恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K) (根據Kabat EU索引編號)取代，且位置123處之胺基酸經精胺酸(R)或離胺酸(K) (根據Kabat EU索引編號)取代，且其中在能夠特異性結合至4-1BB之該第一Fab片段及該第三Fab片段之該恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E) (根據Kabat EU索引編號)取代，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E) (根據Kabat EU索引編號)取代。
  9. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之該第二Fab片段選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、CD33及PD-L1。
  10. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之該第二Fab片段為能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)之Fab片段。
  11. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)之該Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之CDR-L3。
  12. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)之該Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:21之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:22之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO:23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO:24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  13. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之該Fab片段為能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之Fab片段。
  14. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之該Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列之CDR-L3，或 (c)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之CDR-L3，或 (d)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:54之胺基酸序列之CDR-L3，或 (e)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列之CDR-L3，或 (f)重鏈可變區(VH CEA)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:125之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:129或SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:131之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:132之胺基酸序列之CDR-L3。
  15. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之該Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (c)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (d)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (e)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:121之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:122之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (f)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (g)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:133之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:143之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (h)重鏈可變區(VH CEA)，其包含與SEQ ID NO:137之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含與SEQ ID NO:143之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  16. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)之該Fab片段包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144之胺基酸序列。
  17. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之該Fab片段為能夠特異性結合至CD19之Fab片段。
  18. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD19之該Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之CDR-L3。
  19. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD19之該Fab片段包含：重鏈可變區(VH CD19)，其包含與SEQ ID NO:63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含與SEQ ID NO:64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  20. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至靶細胞抗原之該Fab片段為能夠特異性結合至PD-L1之Fab片段。
  21. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至PD-L1之該Fab片段包含 (a)重鏈可變區(VH PD-L1)，其包含：(i)包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列之CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列之CDR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列之CDR-H3；及輕鏈可變區(VL PD-L1)，其包含：(iv)包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列之CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:149之胺基酸序列之CDR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:150之胺基酸序列之CDR-L3。
  22. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至PD-L1之該Fab片段包含：重鏈可變區(VH PD-L1)，其包含與SEQ ID NO:152之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL PD-L1)，其包含與SEQ ID NO:153之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  23. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至22中任一項之雙特異性抗原結合分子。
  24. 一種載體，其包含如請求項23之聚核苷酸。
  25. 一種宿主細胞，其包含如請求項23之聚核苷酸或如請求項24之載體。
  26. 一種產生如請求項1至22中任一項之雙特異性抗原結合分子之方法，其包含在適用於表現該雙特異性抗原結合分子之條件下培養如請求項25之宿主細胞。
  27. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至22中任一項之雙特異性抗原結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
  28. 如請求項1或2之雙特異性抗原結合分子，其用作藥物。
  29. 如請求項27之醫藥組合物，其用作藥物。
  30. 一種如請求項1至22中任一項之雙特異性抗原結合分子之用途，其用於製造用以治療癌症之藥物，其中該藥物與用於癌症免疫療法之化學治療劑、輻射療法及/或其他藥劑組合投與。
  31. 一種如請求項1至22中任一項之雙特異性抗原結合分子或如請求項27之醫藥組合物之用途，其用於製造用以治療癌症或傳染病之藥物。
  32. 一種如請求項1至22中任一項之雙特異性抗原結合分子或如請求項27之醫藥組合物之用途，其用於製造用以抑制腫瘤細胞生長之藥物。
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