DE60022369T2

DE60022369T2 - Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff

Info

Publication number: DE60022369T2
Application number: DE60022369T
Authority: DE
Inventors: Louis-Philippe Vezina; Marc-Andre D'aoust
Original assignee: Medicago Inc
Current assignee: Medicago Inc
Priority date: 1999-10-04
Filing date: 2000-10-02
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2020-10-03
Also published as: MXPA02003456A; CN1377419A; WO2001025454A3; JP2003512821A; PT1222292E; EP1222292B1; CA2385347A1; US6420548B1; BR0014480A; WO2001025454A2; CA2385347C; CN100427603C; ES2248127T3; KR100797667B1; NZ517906A; DE60022369D1; EP1222292A2; AU7635800A; AU782626B2; KR20020057967A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(a) Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Regulierung der Transkription eines Transgens in genetisch veränderten Organismen. Ausdrücklicher betrifft die Erfindung die Verwendung von Expressionsvektoren, die die codierende Sequenz eines interessierenden Gens beherbergen, unter der transkriptionellen Kontrolle von fördernden Sequenzen (Promotersequenzen), für welche die Aktivität durch die Anwesenheit von Stickstoff reguliert wird. Vorzugsweise werden diese Konstrukte in transgenen Hülsenartigen Pflanzen verwendet (zum Beispiel Sojabohne, Alfalfa, Klee, gemeiner Hornklee, Bohnen, Erbsen, Erdnüsse), wo das Wachstum nicht durch das Fehlen von mineralischem Stickstoff beeinträchtigt wird und bei welchen die Induktion der Expression zu irgendeiner gegebenen Zeit während der Entwicklung durchgeführt werden könnte durch die Zugabe einer geeigneten Stickstoffquelle. In einer breiteren Perspektive könnte die Erfindung verwendet werden, um die Expression von irgendeinem gegebenen Transgen durch die Zugabe von irgendeiner Stickstoffquelle zu induzieren, vorausgesetzt dass der Organismus in der Abwesenheit von diesem Stickstoffinduktor geeignet aufgezogen werden kann; als ein Beispiel innerhalb des Pflanzenreichs kann sich die kleine Wasserlinse (Lemna minor) anpassen, um entweder auf Nitrat oder Ammonium als Stickstoffquelle zu wachsen; eine transgene kleine Wasserlinse könnte deshalb auf Nitrat als einer einzigen Stickstoffquelle aufgezogen werden und die Expression des Transgens durch die Zugabe von Ammonium ausgelöst werden, vorausgesetzt dass die Kassette einen Promoter von einem natürlichen Gen enthält, für welchen die Expression durch die Zugabe von Ammonium eingeschaltet wird. Die Erfindung stellt deshalb ein Mittel bereit zum Regulieren der Expression eines transgenen Merkmals in irgendeinem Organismus durch die Zugabe von verschiedenen Stickstoffinduktoren.
(b) Beschreibung des Stands der Technik
Stickstoff ist ein Molekül, das für das Leben wesentlich ist. Alle lebenden Organismen benötigen Stickstoff, um Aminosäuren, die Bausteine von Proteinen, und Nukleotide, die Bausteine von Nukleinsäuren, zu synthetisieren. Ammoniumnitrat ist die bevorzugte Form von mineralischem Stickstoff, die Kulturpflanzen in der Form von Dünger bereitgestellt wird. Nitrat-Stickstoff wird zuerst zu Nitrit reduziert und dann zu Ammonium durch die Aktivität eines Stoffwechselwegs, der für die meisten Krautpflanzen gemeinsam ist. Abhängig von der Spezies wird ein Teil oder das gesamte absorbierte Nitrat durch das Xylem zu Blattzellen wandern, bevor es zu Ammonium reduziert wird. Ammonium oder andere reduzierte Formen von Stickstoff werden ebenfalls durch das Wurzelsystem absorbiert (wenn auch normalerweise bei niedrigeren Raten), aber ihre Assimilation erfordert keine Reduktion. Diese neu absorbierten Ammonium- oder Ammonium-haltigen Moleküle verbinden sich mit den endogenen Reservoiren in den Zellen, welche gebildet werden durch Ammonium, das durch Aminosäuren und andere Stickstoffmoleküle zirkuliert. Einige Spezies metabolisieren Nitrat-Stickstoff nicht leicht und können sich deshalb nicht auf Nitrat als einzige Stickstoffquelle verlassen; viele Koniferenarten fallen in diese letztere Kategorie. Leguminosen und andere symbiotische Pflanzenarten bilden eine dritte große Klasse von Stickstoffverbrauchern innerhalb des Pflanzenreichs; sie bilden eine metabolische Allianz mit einem mikrobiellen Organismus, durch welchen sie gasförmigen Stickstoff binden können. Dieser reduzierte Stickstoff wird von der Pflanze wirksam zum Wachstum verwendet und deshalb können sich diese Kulturpflanzen unabhängig von der Verfügbarkeit von mineralischem Stickstoff im Boden entwickeln.
Viele Mikroben und wilde Pflanzenarten werden sich extensiv an die Verfügbarkeit von Stickstoffquellen anpassen und können deshalb ihren Lebenszyklus in der Abwesenheit einer molekularen Form von Stickstoff vervollständigen, welchen sie ausschließlich und wirksam verwendet könnten, falls er in einer anderen Wachstumsumgebung verfügbar wäre. Wie für die meisten Assimilationswege ist die Stickstoffassimilation streng in Zellen reguliert. Als ein Beispiel ist die Expression von Genen, die Nitratreduktase (NaR) und Nitritreduktase (NiR) codieren, welche verantwortlich sind für die Reduktion von Nitrat zu Ammonium, in verschiedenen mikrobiellen Spezies und Pflanzenarten ausführlich beschrieben worden (für einen Überblick siehe Miflin und Lea, Books 5 und 12, in The Biochemistry of plants). Wenn auch Nitrat nicht das einzige regulierende Molekül ist, das in die Kontrolle der NaR- und NiR-Expression verwickelt ist, ist seine Anwesenheit wesentlich, um die Kaskade der Transduktion zu initiieren, die schließlich zu anhaltender Transkription und Translation dieser Gene führt. Es ist gezeigt worden, dass die Expression von NaR- und NiR-Genen in Hülsen-artigen Pflanzen unterdrückt wird, wenn sie in der Abwesenheit von mineralischem Stickstoff aufgezogen werden.
NiR-Promoter sind in einigen Pflanzenarten charakterisiert worden (Back et al., 1991, Plant Molecular Biology 17: 9–18; Sander et al., 1995, Plant Molecular Biology 27: 165–177). Die Induzierbarkeit dieser Promoter ist ebenfalls charakterisiert worden unter Verwendung von Markergenen in transgenen Pflanzen, wo gezeigt wurde, dass die Verfügbarkeit von Nitrat für die volle Aktivierung der Transkription erforderlich ist.
Assimilationswege für andere Stickstoffquellen sind ebenfalls beschrieben worden und Promoter für Gene, die in einige dieser Wege verwickelt sind, sind ebenfalls charakterisiert worden.
Die Übertragung genetischer Informationen von Mikroben ist für mehr als 15 Jahre genutzt worden, um nützliche rekombinante Moleküle zu produzieren, und Anwendungen in der pharmazeutischen, kosmetisch pharmazeutischen und dermaceutischen Industrie werden gerade ausgebeutet. Diese Technologie hat sich in den letzten zehn Jahren von Mikroben auf Pflanzen und Tiere ausgeweitet mit der Entwicklung von Techniken, die erforderlich sind, um dieses allgemeine Konzept an komplexe eukaryotische Organismen anzupassen. Grundsätzlich wird ein Gen, das für ein interessierendes Protein codiert, oder ein Gen, das für ein Enzym codiert, das für eine Modifikation eines Stoffwechselwegs verantwortlich ist, der zu einem interessierenden Molekül führt, auf eine geeignete Weise mit cis- und trans-wirkenden regulierenden Sequenzen verknüpft und zu einer Zielzelle überführt, wo es in die Molekülmaschinerie (auf eine vorübergehende oder dauerhafte Art und Weise) eingelagert wird. Die transgene Zelle oder ein Gewebe oder Organismus, der aus der transgenen Zelle regeneriert wird, wird dann die Transkription und Translation des Transgens durchführen und deshalb befähigt sein, das interessierende Protein anzuhäufen oder die neue metabolische Reaktion durch die Aktivität des interessierenden Enzyms durchzuführen.
Die aufstrebende Industrie der Molekülzucht (Herstellung von rekombinanten Molekülen in Tieren oder Kulturpflanzen) ist eine der vielversprechendsten Branchen des kommenden Jahrhunderts. Ihre Ankündigung ist, sichere und erneuerbare Molekül-Fabriken für die Industrie bereitzustellen. Unter den Anwendungen, die derzeit entwickelt werden, befinden sich die Produktion von billigen monoklonalen Antikörpern für therapeutische und diagnostische Verwendungen, die Produktion unbegrenzter Mengen von Hormonen, Zytokinen und anderen biologisch aktiven Molekülen für die Behandlung von chronischen oder tödlichen Krankheiten, die Produktion von biologisch sicheren Substituenten für verschiedene Blutkomponenten, die Produktion unbegrenzter Mengen von Prozessenzymen für die Nahrungs- und Zellstoffindustrie, die Produktion von billigen Enzymen für Abwasserbehandlungen und die Produktion von sicheren biologisch aktiven Molekülen für die Kosmetikindustrie.
Begrenzungen für die Anwendung dieser Technologie sind häufig aus dem Unvermögen transgener Organismen gekommen, geeignete Mengen des rekombinanten Produkts zu akkumulieren, als ein Ergebnis niedriger Transkriptionsraten, unkorrekten Spleißens der Messenger-RNA, Instabilität der Fremd-mRNA, geringer Translationsraten, Überempfindlichkeit des rekombinanten Proteins gegenüber der Aktion von endogenen Proteasen oder Überempfindlichkeit des rekombinanten Organismus gegenüber dem fremden Protein, was zu unkorrektem und begrenztem Wachstum oder in den schlimmsten Fällen zu stark schädigenden Wirkungen auf den Wirtsorganismus führt. Eine Unzulänglichkeit der Produktionshöhe hat eine direkte Auswirkung auf die Entwicklung von Anwendungen, wenn Gewinnmargen eng sind, oder wenn Behandlung und/oder Entsorgung von Restmaterial biologische Sicherheits- oder Umweltprobleme hervorrufen. Eine Verbesserung der Akkumulationshöhe des erwünschten rekombinanten Produkts scheint somit ein kritischer Faktor zu sein, der eine Kommerzialisierung von vielen Anwendungen der Molekülzucht gewährleistet.
Die Verwendung von induzierbaren Promotern ist vorgeschlagen und in einigen Fällen erfolgreich verwendet worden, um der kombinierten Wirkung all der oben genannten Faktoren entgegen zu wirken. Starke induzierbare Promoter können erfolgreich sein bei der Bildung hoher ephemerer Transkriptionsraten, welche zu hoher transitorischer Akkumulation von Fremd-mRNA und Translationsprodukt führen. Als ein Ergebnis ist, wenn die Induzierbarkeit der Expression gepaart ist mit geeignet synchronisierten Proteinwiedergewinnungsprozeduren, die Ausbeute pro Einheit, die erhalten wird, höher als bei der Verwendung der konstitutiven Expression.
Mehrere Expressionskassetten, die induzierbare Promoter beherbergen, sind für mikrobielle Produktionssysteme entwickelt worden, und einige sind derzeit für Forschungszwecke verfügbar. Einige induzierbare Promoter werden aktuell in Pflanzensystemen (Wundinduzierbarkeit) oder Tiersystemen (Spezifität für Zellen der Brustdrüsen, PPL) verwendet, auch wenn keine der berichteten Promoter billige und biologisch sichere chemische Induktoren wie Nitratsalze verwenden.
Es wäre stark wünschenswert, mit einem Verfahren zur Regulierung der Transkription von Transgen in genetisch veränderten Organismen versorgt zu werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Regulieren der Transkription eines Transgens in genetisch veränderten Organismen bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Verwendung von Expressionsvektoren, die die codierende Sequenz eines interessierenden Gens beherbergen, unter der Transkriptionskontrolle von Promotersequenzen bereitzustellen, für welche die Aktivität durch die Anwesenheit von Stickstoff reguliert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Stickstoff-induzierbaren Expressionskassette für die kontrollierte Expression von fremden Genen in Pflanzen. Es wird aus der folgenden Beschreibung heraus gezeigt werden, dass das Isolieren einer solchen regulierenden Sequenz so durchgeführt werden kann, dass wenn cis-wirkende Sequenzen mit dem offenen Leseraster eines interessierenden Gens geeignet verbunden werden, die Transkription kontrolliert werden kann durch die Zugabe von spezifischen Stickstoffquellen.
Nach einem Aspekt dieser Erfindung verwendet das abgezielte System Hülsen-artige Pflanzenarten, so dass Konstrukte, die einen Nitrat-induzierbaren Promoter enthalten, während der Wachstumsperiode transkriptionell niedrig gehalten werden, falls die transgene Pflanze auf einem Nitrat-freien Medium gehalten wird, und folglich die Entwicklung der Pflanzen-Biomasse ohne Störung durch das transgene Merkmal ermöglicht wird. Nach Zugabe von Nitrat zu dem Wachstumsmedium wird die Transkription in einem relativ großen Anteil der Biomasse über die folgenden Tage hinweg induziert. Optimierung der Induktionszeit und Protein-Akkumulation wird dann durchgeführt, um die Wiedergewinnung des gewünschten rekombinanten Produkts zu maximieren.
Wenn auch die folgende Beschreibung deutlich machen wird, dass diese Erfindung einfach auf Nitrat-Induktion an Nitrat-verarmten Hülsen-artigen transgenen Pflanzen angepasst werden kann, sollte daran gedacht werden, dass dieses generelle Konzept auch auf die Entwicklung anderer Produktionssysteme angepasst werden kann, wodurch die große Vielfalt von Stickstoffassimilationssystemen in dem Mikroben-, Pflanzen- und Tierreich genutzt werden kann.
Nach einem anderen Aspekt dieser Erfindung kann Stickstoff-Induzierbarkeit außerdem genutzt werden, um die Proteinproduktion in Organismen zu maximieren, welche keine Stickstoffbindung durch symbiotische Assoziation durchführen, sondern die verschiedene Quellen für Stickstoff (reduziert oder oxidiert) zum Wachstum verwenden können und folglich die Fähigkeit besitzen, sich geeignet zu entwickeln, während einer ihrer Stickstoffassimilationswege inaktiv ist aufgrund des Mangels eines Stickstoff-artigen Substrats in der Wachstumsumgebung. Die Verwendung einer Expressionskassette, die die Transkription irgendeines Gens in diesem inaktiven Weg kontrolliert, um die Expression eines interessierenden Gens in einem solchen Organismus zu veranlassen, wird die induzierbare Expression des transgenen Merkmals nach Zugabe der zuvor fehlenden Stickstoff-artigen Verbindung ermöglichen. Als ein Beispiel ist die kleine Wasserlinse eine Pflanzenart, die alternativ auf Nitrat oder Ammonium wachsen kann; diese Erfindung könnte verwendet werden, um eine Expressionskassette zu entwickeln, die einen Ammonium-induzierbaren Promoter beherbergt, der mit einem interessierenden Gen verknüpft ist, so dass die Induktion an auf Nitrat aufgezogenen transgenen kleinen Wasserlinsen-Pflanzen durchgeführt werden würde.
Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte Promotersequenz gemäß Ansprüchen 1–4 bereit und Verwendungen dieser Promotersequenz gemäß Ansprüchen 5–18.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die cis-wirkende Sequenz aus einer 5'-stromaufwärts-Region eines exprimierten NiR-Gens in Alfalfa isoliert werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Organismus eine Pflanze, bevorzugter eine Dikotyledon-Pflanze.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Organismus Alfalfa oder Tabak.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Stickstoff-Induktor Nitrat.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Organismus eine Pflanze, ein Pilz, ein Bakterium, eine Hefe oder ein Tier.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die cis-wirkende Sequenz aus der 5'-stromaufwärts-Region irgendeines Gens isoliert, das in einen Stickstoffassimilationsweg verwickelt ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die cis-wirkende Sequenz aus der 5'-stromaufwärts-Region irgendeines Gens isoliert, für welches die Transkription durch die Verfügbarkeit einer gegebenen Stickstoffquelle moduliert wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die cis-wirkende Sequenz irgendeine Sequenz, für welche die transkriptionelle Aktivität durch Zugabe oder Entfernung von irgendeiner Stickstoffquelle in oder aus der Umgebung von irgendeinem lebenden Organismus reguliert wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Organismus, aus dem die cis-wirkende Sequenz isoliert wird, irgendeine Pflanze, irgendein Pilz, irgendeine Hefe, irgendein Bakterium oder irgendein Tier.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Promotersequenz bereitgestellt zur Förderung der Transkription eines fremden Gens in einen transgenen Organismus, welche einen Stickstoff-induzierbaren Promoter mit oder ohne cis-wirkende Sequenz umfasst für die Expression dieses Gens, und welche angepasst ist, um für die transkriptionelle Expression dieses Gens durch die Zugabe oder Entfernung eines Stickstoff-Induktors moduliert zu werden, wobei dieser Promoter die Nukleinsäuresequenz hat, die in Sequenzidentifikationsnummer 1 bis 13 dargestellt ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird dieser Promoter in Kombination mit einem Terminator verwendet, welcher eine Polyadenylierung-Signalendstelle für die Insertion an dem 3'-Ende dieses Gens umfasst, worin dieser Terminator operativ in Bezug auf dieses Gen und diesen Promoter angeordnet ist und dadurch die Expression dieses Gens erlaubt.
Vorzugsweise hat der Terminator eine Sequenz, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenzidentifikationsnummern 14 bis 16.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht die GUS-Expressionsstärke unter Verwendung von Promoter NiR (Sequenzidentifikationsnummern 2–13) und Terminator NOS in dem Laub von transgenen Tabakpflanzen vor (leere Säulen) und nach (gefüllte Säulen) Nitratdüngung der Pflanzen. Tabakpflanzen wurden transformiert mit Voll-Länge und Deletionen des Alfalfa-NiR-Promoters und NOS-Terminators, die funktionell positioniert waren, um die Transkription und Termination des GUS-Reportergens zu kontrollieren, wie in Methoden beschrieben. Die GUS-Aktivität wurde gemäß Jefferson et al. (1987, EMBO J. 13: 3901–3907) vor und nach Induktion durch Nitrat gemessen.
2 veranschaulicht die GUS-Expressionsstärke unter Verwendung von Promoter NiR (Sequenzidentifikationsnummern 2, 3, 5–6) und Terminator NiR (Sequenzidentifikationsnummern 15–16) in dem Laub von transgenen Tabakpflanzen vor (leere Säulen) und nach (gefüllte Säulen) Nitratdüngung der Pflanzen. Tabakpflanzen wurden transformiert mit Voll-Länge und Deletionen des Alfalfa-NiR-Promoters und NiR-Terminators, die funktionell positioniert waren, um die Transkription und Termination des GUS-Reportergens zu kontrollieren, wie in Materialien und Methoden unten beschrieben. Die GUS-Aktivität wurde gemäß Jefferson et al. (1987, EMBO J. 13: 3901–3907) vor und nach Induktion durch Nitrat gemessen.
3 veranschaulicht die GUS-Expressionsstärke unter Verwendung von Promoter NiR und Terminator NOS in dem Laub von transgenen Alfalfapflanzen mit Knöllchenbildung vor (leere Säulen) und nach (gefüllte Säulen) Nitratdüngung. Alfalfagenotyp 11.9 wurde transformiert mit Konstrukten GC2-E, GC2-B, DC1-D und 35S, die funktionell positioniert waren, um die. Expression von Reportergen GUS anzutreiben, wie beschrieben in Khoudi et al. (1997, Gene 197: 343–351). Im Anschluss an die Regeneration wurden transgene Pflanzen auf sterilen Vermiculit überführt und mit Rhizobium-Stamm Balzac (Nitragin) beimpft. Pflanzen wurden 3 Wochen lang wachsen gelassen mit wiederholten Zugaben Nitrat-freier Hoagland-Lösung; die GUS-Aktivität wurde dann in erst voll entfaltetem Laub gemessen gemäß Jefferson et al. (1987, EMBO J. 13: 3901–3907). Pflanzen wurden dann mit 40 mM Nitrat zwei Tage lang gedüngt. Die GUS-Aktivität wurde dann wieder in erst voll entfaltetem Laub gemessen. Daten, die hier gezeigt werden, sind Verhältnisse zwischen spezifischen GUS-Aktivitäten nach und vor Nitrat-Induktion.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Folgende ist eine ausführliche Beschreibung des Verfahrens, das verwendet wurde, um transgene Tabak- und Alfalfalinien zu erzeugen, die in ihrer Expression eines Reportergens moduliert werden können. Es sollte bedacht werden, dass Variationen in das Verfahren eingebracht werden könnten, durch welche Stickstoff-induzierbare Promoter isoliert werden könnten, durch welche sie mit ORFs in dem Konstrukt verknüpft werden könnten, das zur Expression in Pflanzen verwendet wird, durch welche unterschiedliche cis- und trans-wirkende Elemente der Konstrukte verwendet und räumlich angeordnet werden könnten, durch welche die Induzierbarkeit durch Stickstoff gezeigt und verwendet werden könnte, während innerhalb des Rahmens der Erfindung geblieben wird.
In dieser Ausführungsform wurde ein NiR-cDNA-Strang zuerst aus Alfalfa isoliert unter Verwendung von RT-PCR mit Primern, die aus einer Pflanzen-NiR-Consensus-Sequenz abgeleitet wurden. Diese cDNA-Strecke wurde dann verwendet, um entweder Stromaufwärts- oder Stromabwärts-Genome-Walking durchzuführen. Die NiR-Promoter-Region und Deletionen, die 5'UTR und der NiR-Terminator wurden dann funktionell positioniert, um Transkription und Termination von Reportergen GUS zu kontrollieren. Diese Konstrukte wurden in geeignete Expressionsvektoren eingefügt für einen DNA-Beschuss an Tabak- und Alfalfalaub und für einen Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer wie beschrieben durch Desgagnes et al. (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42: 129–140). Diese zwei DNA-Transferverfahren wurden verwendet, um zu zeigen, dass die Expression des Reportergens durch Zugabe oder Entfernung von Nitrat in oder von dem Wachstumsmedium moduliert werden kann.
Materialien und Methoden
Biologisches Material
E. coli-Stamm DH5-a wurde verwendet, um alle Klonierungsschritte durchzuführen. Kälteresistenter Alfalfa-Genotyp 11.9 wurde für alle Experimente verwendet einschließlich stabiler Transformation unter Verwendung von A. tumefaciens-Infektion (Desgagnes et al. (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42: 129–140)).
Isolierung von Gesamt-RNA
Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines heißen Phenol-Verfahrens extrahiert, im Wesentlichen wie beschrieben durch de Vries et al. (1986, B6, Seite 1, in : Gevin SB und Shilperoot RA Herausgeber, Plant Molecular Biology Manual, Dordrecht: Kluwer Academic Publisher).
RT-PCR
RT-PCR wurde verwendet, um ein DNA-Fragment herzustellen, das einer reichlich vorhandenen NiR-mRNA-Molekülart von Blatt-Gesamt-mRNA entspricht. Eine konservierte Region wurde zuerst aus 5 öffentlichen Pflanzen-NiR-ORFs identifiziert, nämlich Genbank-Sequenzen Nr. AB006032 (Arabidopsis NiR-mRNA), Nr. X66145 (partielle Tabak-Nir-mRNA), Nr. U10419 (komplettes Bohnen-Nir-cds), Nr. X07568 (Spinat-Nir-mRNA) und Nr. U90429 (Glycin-max.-Nir-komplettes cds). Degenerierte Oligonukleotide wurden abgeleitet von zwei konservierten Regionen, nämlich Nir5 – 5' GATATTGATGTTAGACTCAAGTGGC 3' (Sequenzidentifikationsnummer 17) an dem 5'-Ende und Nir3 – 5' CACYSATTCCACTTCCTWGGC 3' (Sequenzidentifikationsnummer 18) an dem 3'-Ende des codierenden Strangs. Eine Umkehrtranskriptionsreaktion wurde zuerst durchgeführt mit 200 Einheiten M-MLV-Umkehrtranskriptase (RT) 1 Stunde lang bei 37°C unter Verwendung von 1 μg Gesamt-Blatt-RNA, 4 mM dNTP (1 mM jeweils), 5 μM Zufallshexamer-Primer in einem 1-fachen M-MLV-RT-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂). Die PCR-Reaktion wurde in einem Perkin Elmer Cetus GenAmp PCR-System 9600 (EG&G, Wellesley, MA) durchgeführt unter Verwendung von 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase, 2 μM Nir5-Primer, 2 μM Nir3-Primer, 800 μM dNTPs (200 μM jeweils) in einem 1-fachen PCR-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂).
Das verwendete Kreislaufführungsprogramm war: anfängliche 4 min bei 94°C, 30 Zyklen von 1 min bei 94°C, 30 s bei 55°C und 3 min bei 72°C. Eine Verlängerungsperiode von 7 min bei 72°C war in das Programm eingeschlossen.
DNA-Sequenzierung
DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt wie beschrieben durch Sanger et al. (1977, P. N. A. S. USA, 74: 5643–5647).
Genome Walking
Wandern stromaufwärts des Alfalfa-Nir-cDNA-Fragments, das von der RT-PCR-Reaktion kloniert wurde, wurde durchgeführt unter Verwendung des Universal Genome Walker-Kits von Clontech Laboratories (Palo Alto, CA) (Kat.-Nr. 1807-1). Die NiR-spezifischen angepassten Primer, die verwendet wurden, um Sequenzen stromaufwärts der codierenden Sequenz zu amplifizieren, waren:
Nir1106r – 5' TTGTCACATCAGCACATCCGTCTTTGC 3' (Sequenzidentifikationsnummer 19) und
Nir1061r – 5' TCGCCAAGTATCTTGTTTGAGCACTTG 3' (Sequenzidentifikationsnummer 20).
Das amplifizierte 3775-Basenpaar-Fragment wurde in pGEM-T Easy-Vektor (Promega, Madison, WI) (Katalog-Nr. A1360) für weitere Analyse subkloniert. Das resultierende Plasmid erhielt den Namen pGNir4c.
Das stromabwärts-Wandern wurde wie das stromaufwärts-Wandern durchgeführt unter Verwendung der folgenden NiR-spezi fischen Primer:
Nir1c – 5' ATGTCTTCCTTCTCAGTACGTTTCCTC 3' (Sequenzidentifikationsnummer 28) und
Nir138c – 5' CAAGTTGATGCATCAAGGTGGGAGCCTAGA 3' (Sequenzidentifiaktionsnummer 29).
Das amplifizierte 3508-Basenpaar-Fragment wurde in pGEM-T Easy-Vektor (Promega, Madison, WI) (Katalog-Nr. A1360) für weitere Analyse subkloniert. Das resultierende Plasmid erhielt den Namen pGN3'1.
Konstruktion von Expressionskassetten und -vektoren
Die Kassetten für die Expressionsanalyse unter Verwendung des GUS-Reportergens wurden folgendermaßen zusammengesetzt. Eine promoterlose GUS-Kassette wurde von pBI101 mit HindIII und EcoRI aufgeschlossen und wurde in die HindIII- und EcoRI-Stellen der pUC19-Polyklonierungsstelle eingesetzt. Das resultierende Plasmid erhielt den Namen pBI201 und wurde für weitere Konstrukte verwendet. Die Nir-Stromaufwärtssequenzen wurden PCR-amplifiziert unter Verwendung des Primers AP2 von dem Universal Genome Walking Kit als stromaufwärts positionierter Primer und irgendeinem der angepassten Stromabwärtsprimer, die mit einer Smal-Restriktionsstelle enden. Die 4 Primer wurden positioniert in der 5'UTR-Region des Gens (Nir-23r-Sma-5' AGAGCCCGGGAGAAGAGAGT GTGTTTG 3' (Sequenzidentifikationsnummer 21)), an dem Ende der Transitpeptid-codierenden Sequenz (Nir51r-Sma – 5' TTCTCCCGGGGG ACGAGAGATGGATGGT 3' (Sequenzidentifikationsnummer 22)), 50 Basenpaare nach der Transitpeptid-codierenden Sequenz (Nir103r-Sma – 5' TTCTCCCGGGGTTGAAACAGGTGCAACTGA 3' (Sequenzidentifikationsnummer 23)) und 100 Basenpaare nach der Transitpeptid-codierenden Sequenz (Nir158r-Sma – 5' TTCTCCCGGGTAACCATCTTTTTCCTCA 3' (Sequenzidentifikationsnummer 24)). Amplifikation wurde unter Standardbedingungen mit pGNir4c-Plasmid als Matrize durchgeführt.
Die amplifizierten Fragmente wurden mit spezifischen Restriktionsenzymen aufgeschlossen, um 5'-Deletionen des Nir-Promoters herzustellen. Das pNir3k-23 wurde hergestellt durch Aufschließen des Fragments, das zuvor amplifiziert wurde, durch AP2 und der Nir-23r-Sma-Primer mit Xmal und Einsetzen des resultierenden Fragments in pBI201, das zuvor mit Xmal aufgeschlossen wurde. Eine ähnliche Strategie wurde verwendet, um die Plasmide pNir3k51, pNir3k103 und pNir3k158 herzustellen, außer dass die Stromabwärts-Primer, die verwendet wurden, Nir51r-Sma, Nir103r-Sma bzw. Nir158r-Sma waren. Das pNir2.2k-23 wurde hergestellt aus einem Smal-BgIII-Aufschluss des AP2 – Nir-23-Sma-amplifizierten Fragments, das in das pBI201 eingesetzt wurde, das zuvor mit Smal und BamH1 aufgeschlossen wurde. Die gleiche Strategie wurde verwendet, um die Plasmide pNir2.2k51, pNir2.2k103 und pNir2.2k158 herzustellen, außer dass die Stromabwärts-Primer, die verwendet wurden, Nir51r-Sma, Nir103r-Sma bzw. Nir158r-Sma waren. Genauigkeit (Standorttreue) und Orientierung der Insertionen wurden durch Aufschluss mit Restriktionsenzymen verifiziert. Diese Deletionsfragmente wurden an den 5'-Terminus des GUS-Reportergens in pBI201 ligiert und für Übergangsexpressionsstudien unter Verwendung von DNA-Beschuss verwendet. Nach Identifizierung der geeigneten Deletionsfragmente wurden sie in einen binären Pflanzen-Expressionsvektor wie pBI101 (Clonetech) subkloniert.
Für die Konstruktion der Kassetten, die den NiR-Terminator stromabwärts des GUS-Gens zusätzlich zu dem NiR-Promoter enthalten, wurden die folgenden NiR-spezifischen Primer verwendet:
Nir2514c-Sac – 5' AGAAGRGCTCAGTATATAGGTATTTGGTGA 3' (Sequenzidentifikationsnummer 30).
Nir2728c-Sac – 5' AGAAGAGCTCTTGTACATTTGGATAAGTCA 3' (Sequenzidentifikationsnummer 31)
Nir3029r-Eco – 5' AGAAGARTTCGTTTTCCCGATACTTCAACT 3' (Sequenzidentifikationsnummer 32).
Ein 617-Basenpaar-Terminatorfragment wurde PCR-amplifiziert unter Verwendung der Primer Nir2514c-Sac und Nir3029r-Eco, und ein 503-Basenpaar-Terminatorfragment wurde PCR-amplifiziert unter Verwendung der Primer Nir2728c-Sac und Nir3029r-Eco. Die Fragmente, die erhalten wurden, wurden mit Sacl und EcoRI aufgeschossen und in die Plasmide eingesetzt, die die NiR-GUS-Konstrukte enthielten, nach Deletion des NOS-Terminators zwi schen den Sacl- und EcoRI-Stellen.
Diese rekombinanten Plasmide wurden für die stabile Integration durch A. tumfaciens-Infektion verwendet, wie unten beschrieben.
Agrobacterium-vermittelter DNA-Transfer und Regeneration von transgenen Alfalfa-Linien
Die rekombinanten Plasmide wurden in Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 durch Elektroporation eingeführt wie beschrieben in Khoudi et al. (1997, Gene 197: 343–351). Ausgewählte Agrobacterium-Stämme wurden dann mit Blattscheiben von Genotyp C5-1 4 Tage lang in der Abwesenheit von Selektionsdruck (Kanamycin) ko-kultiviert. Im Anschluss an diesen Inkubationszeitraum wurden Blattscheiben gewaschen und verwöhnt und es wurde ihnen dann erlaubt, Kalli auf Medium B5H zu bilden. Kalli wurden dann für 21 Tage auf SH-Medium überführt für die Fruchtkeiminduktion und für 28 Tage auf BOi2Y für die Fruchtkeimentwicklung. Torpedo-förmige Fruchtkeime wurden aus BOi2Y entfernt und auf MS-Medium zur Regeneration gelegt. Kanamycin war in allen Kulturmedien vorhanden außer für die Ko-Kultivierung und Regeneration auf MS. Dieses Verfahren ist ausführlich beschrieben in Desgagnes et al. (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42: 129–140). Bewurzelte Pflänzchen wurden bis zur Reife im Gewächshaus aufgezogen. Integration des Transgens wurde verifiziert durch PCR-Amplifikation eines NIR-GUS-Fragments von genomischer DNA. Die Primer, die verwendet wurden, waren:
Nir-102c – 5' CACACTTCTTCACTCACCTCTCAA 3' (Sequenzidentifikationsnummer 25)
Nir-2016c – 5' ATCTAGGAGGGGCAGACATTG 3' (Sequenzidentifikationsnummer 26)
GUS228r – 5' TCGGTATAAAGACTTCGCGCTGAT 3' (Sequenzidentifikationsnummer 27)
Agrobacterium-vermittelter DNA-Transfer und Regeneration von transgenen Tabak-Linien
Die rekombinanten Plasmide wurden in Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 durch Elektroporation eingeführt wie beschrieben in Khoudi et al. (1997, Gene 197: 343–351). Ausgewählte Stämme wurden dann mit Blattscheiben 2 Tage lang auf MS-Medium ohne Kanamycin ko-kultiviert. Nach diesem Zeitraum wurden die Explantate auf das Selektionsmedium (MS mit Kanamycin) überführt. Die Explantate wurden auf diesem Medium 3 Wochen lang gehalten, um die Bildung von Kalli und Schösslingen von den transfizierten Zellen zu erlauben. Die Kanamycin-resistenten Schösslinge wurden in das Wurzelbildungs-MS-Medium überführt. Bewurzelte Pflänzchen wurden bis zur Reife im Gewächshaus aufgezogen. Die Integration des Transgens wurde durch PCR-Amplifikation eines NIR-GUS-Fragments von genomischer DNA verifiziert. Die Primer, die verwendet wurden, waren:
Nir-102c – 5' CACACTTCTTCACTCACCTCTCAA 3' (Sequenzidentifikationsnummer 25)
Nir-2016c – 5' ATCTAGGAGGGGCAGACATTG 3' (Sequenzidentifikationsnummer 26)
GUS228r – 5' TCGGTATAAAGACTTCGCGCTGAT 3' (Sequenzidentifikationsnummer 27)
Nitrat-Induktion
Transgene und nicht-transgene Tabak- und Alfalfa-Pflanzen wurden in Vermiculit-Medium ohne Nitrat aufgezogen. Das Mineral-Gleichgewicht wurde durch wiederholte Zugaben von Nitrat-freien Hoagland-Lösungen gehalten (Hoagland und Vamon, 1950, Circular 347, California Agr. Exp. Stat. Berkeley). Nitrat-Induktion wurde durch Begießen der Pflanzen mit 20-20-20-Dünger bei einer Konzentration von 5 g/l durchgeführt oder als eine Alternative mit Hoagland-Lösung, die mit 40 mM Nitrat ergänzt war.
NiR-Promoteraktivität in Tabak-Laub
Die NiR-abgeleiteten Promoter wurden stromaufwärts von dem GUS-Reportergen in transkriptionellen und translationellen Fusionen platziert. Die 5'-Deletionen des NiR-Promoters, die hier analysiert wurden, bestanden aus (1) einem Promoter vermeintlich voller Länge, der 2813 Basenpaare umfasst, stromaufwärts von dem anfänglichen ATG der codierenden Region, (2) einer 1905-Basenpaar-Version des Promoters und (3) einer kürzeren 1111- Basenpaar-Version des Promoters. Das 3'-Ende des Promoters wurde an das 5'-Ende der GUS-codierenden Region fusioniert, um transkriptionelle und translationelle Fusionen zu bilden. Translationelle Fusionen, die analysiert wurden, erlaubten die Bildung von b-Glucuronidase, die (1) das NiR Chloroplast-Transitpeptid, (2) das NiR-Transitpeptid mit zusätzlichen 17 Aminosäuren von NiR und (3) das NiR-Transitpeptid mit zusätzlichen 36 Aminosäuren von NiR enthielt. Die zwölf Kombinationen von 5'- und 3'-Deletionen des NiR-Promoters, die in Tabakpflanzen eingeführt wurden, sind in 1 dargestellt.
Die Genkonstrukte wurden in Tabakpflanzen überführt unter Verwendung des Agrobacterium-vermittelten Transfektionsverfahrens (Khoudi et al., 1997, Gene 197: 343–351). Transgene Pflanzen wurden in Wachstumskammern überführt und auf ihren Blatt-b-Glucuronidase-Gehalt vor und nach Nitratdüngung analysiert. 1 stellt die mittlere Stärke der b-Glucuronidase-Aktivität dar, die in dem ersten entfalteten Laub der Pflänzchen gemessen wurde.
Alle NiR-abgeleiteten Promoter zeigten Reaktivität gegenüber Nitratinduktion. Eine zwischen 5- und 10-fache Zunahme der b-Glucuronidase-Expression wurde allgemein beobachtet, ungeachtet der Promoter-Stutzung, wodurch angezeigt wird, dass wichtige auf Nitrat reagierende Elemente innerhalb der ersten 1,1 kb stromaufwärts der anfänglichen ATG enthalten sind. Sowohl 5'- als auch 3'-Deletionen des NiR-Promoters führten zu bedeutenden Modifikationen der b-Glucuronidase-Aktivität. Die größte Stärke der GUS-Expression wurde mit dem 2,8-kb-Promoter erhalten, was anzeigt, dass die weit stromaufwärts liegenden Regionen eine regulierende Rolle für die Stärke der NiR-Expression in dem Laub haben.
Die translationellen Fusionen des Promoters an die GUS-codierende Region führten zu variabler Expressionsstärke, abhängig von der Verlängerung des 5'-Endes des Promoters. Jedoch führte die kürzeste Fusion (die das 17-a.a-NiR-Transitpeptid enthielt, das an das Amino-terminale Ende der b-Glucuronidase fusioniert war) regelmäßig zu der größten Stärke der Aktivität für alle drei 5'-Ende-Stutzungen. Diese kurze translationelle Fusion, kombiniert mit der längsten Verlängerung von stromaufwärtigen Promoterregionen, ergab den stärksten Promoter (3 kb + 50). Nach Induktion führte dieses spezielle Konstrukt zu mehr als dem 13-fachen der Stärke der GUS-Expression, die mit dem 35S-GUS-NOS-Konstrukt erhalten wurde.
Bei Betrachtung der längsten 5'-Verlängerung des Promoters war die transkriptionelle Fusion des GUS-Gens (3 kb – 5) ~7 mal weniger wirksam als die kurze translationelle Fusion (3 kb + 50). Jedoch im induzierten Zustand war die Stärke der GUS-Expression in den Pflanzen, die die 3kb – 5-Promoter-Deletion beherbergten, mehr als das 1,8-fache der Expression, die in den 35S-GUS-NOS-Pflanzen beobachtet wurde.
Zusammengenommen zeigen die hier dargestellten Ergebnisse klar an, dass die Sequenzen stromaufwärts des Alfalfa-NiR-Gens die Fähigkeit haben, eine hohe und induzierbare Expression eines exogenen Gens in Tabak-Laub anzutreiben.
Wirksamkeit des NiR-Terminators
Tabakpflanzen wurden mit Konstrukten transformiert, die aus Promoter-NiR und Deletionen (Sequenzidentifikationsnummern 2, 3, 5 und 6) und 355, zusammen mit 3'UTR-Sequenzen und Terminator (Sequenzidentifikationsnummern 15 und 16) bestanden, die funktionell positioniert waren, um Transkription und Termination von Reportergen GUS anzutreiben. Wachstum, Nitratinduktion und GUS-Aktivitätsmessungen wurden wie für das Experiment, das in 1 veranschaulicht ist, durchgeführt. Ergebnis, die in 2 gezeigt sind, zeigen, dass die Terminatorsequenz von Nir eine Termination der Transkription in eine translatierbare Messenger-RNA hinein erlaubt.
NiR-Promoteraktivität in Alfalfa-Laub
Transgene Alfalfa-Pflanzen, die die Genkonstrukte enthielten, die in 3 dargestellt sind, wurden erhalten unter Verwendung des Agrobacterium-vermittelten Transfektionsverfahrens von Desgagnes et al. (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42: 129–140). Die in vitro-Pflanzen wurden in Wachstumskammern überführt, um ein normales vegetatives Wachstum zu ermöglichen.
Stecklinge von jeder transgenen Linie wurden in Vermiculit aufgezogen und mit Nitrat-freiem Hoagland-Medium gedüngt. Nach zwei Wochen wurden die Wurzeln mit Nitragin (LiphaTech Inc., Milwaukee, WI) beimpft. Zwei Wochen nach der Beimpfung hatten sich Knöllchen an den Wurzeln entwickelt. Pflanzen mit Knöllchenbildung wurde erlaubt, ihr vegetatives Wachstum mindestens eine weitere Woche fortzusetzen, bevor die fluorometrische Messung der b-Glucuronidase-Aktivität (vor Induktion) durchgeführt wurde. Nach der Messung wurden die Pflanzen mit Hoagland-Medium begossen, das 40 mmol KNO₃ enthielt. Zwei Tage nach Induktion wurde die Blatt-b-Glucuronidase-Aktivität gemessen, um die Nitrat-Induzierbarkeit des NiR-Promoters in Alfalfa-Laub zu bewerten. Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass Promoter NiR die Expression des GUS-Reportergens nach Zugabe von Nitrat in Alfalfa-Pflanzen mit Knöllchenbildung induziert. Zusammengenommen zeigt diese letzte Ergebnisreihe, dass NiR-Promoterinduzierbarkeit verwendet werden kann, um die Expression eines fremden Gens in Alfalfa-Pflanzen positiv zu regulieren, wenn die Bindung von atmosphärischem Stickstoff ersetzt wird durch Nitratassimilation.
Während die Erfindung in Verbindung mit speziellen Ausführungsformen davon beschrieben worden ist, versteht es sich, dass sie zu weiteren Modifikationen in der Lage ist und dass diese Anmeldung beabsichtigt, alle Variationen, Verwendungen oder Adaptionen der Erfindung abzudecken, die generell die Prinzipien der Erfindung befolgen und solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung einschließen, wie sie innerhalb bekannter oder üblicher Praxis innerhalb des technischen Gebiets vorkommen, zu welchem die Erfindung gehört, und wie sie auf die wesentlichen Merkmale, die hierin zuvor ausgeführt wurden und wie sie in dem Schutzumfang der anliegenden Ansprüche folgen, angewendet werden können.
SEQUENZLISTE

Claims

Eine isolierte Promotersequenz zur Förderung der Transkription eines fremden Gens in transgenen Organismen, welche einen Stickstoff-induzierbaren Promoter mit oder ohne cis-wirkender Sequenz umfasst, für die Expression des fremden Gens, und welche angepaßt ist, um für die transkriptionelle Expression des fremden Gens moduliert zu werden durch Zugabe oder Entfernung eines Stickstoffinduktors, wobei der isolierte Promoter die Nukleinsäuresequenz hat, die in Sequenzidentifikationsnr. 1 bis 13 dargestellt ist.
Der isolierte Promoter von Anspruch 1, worin der Organismus gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Pflanze, einem Pilz, einem Bakterium, einer Hefe und einem Tier.
Der isolierte Promoter von Anspruch 2, worin die Pflanze ein Dikotyledon ist.
Der isolierte Promoter von Anspruch 3, worin der Dikotyledon Alfalfa oder Tabak ist.
Verwendung eines isolierten Promoters wie in Anspruch 1 beschrieben, in der Herstellung eines transgenen Organismus für die Expression eines rekombinanten Proteins.
Die Verwendung von Anspruch 5, die weiterhin die Regulierung der Transkription des fremden Gens durch Zugabe oder Entfernen eines Stickstoffinduktors umfasst.
Die Verwendung von Anspruch 5, worin der Organismus gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Pflanze, einem Pilz, einem Bakterium, einer Hefe und einem Tier.
Die Verwendung von Anspruch 7, wobei die Pflanze ein Dikotyledon ist.
Die Verwendung von Anspruch 8, worin der Dikotyledon Alfalfa oder Tabak ist.
Die Verwendung von Anspruch 1, worin der Stickstoffinduktor Nitrat ist.
Die Verwendung von Anspruch 5, worin der Promoter mit mindestens einem cis- oder trans-wirkenden Element operativ verbunden ist.
Die Verwendung von Anspruch 11, worin das cis-wirkende Element aus der 5'-stromaufwärts Region von irgendeinem Gen isoliert wird, das in einen Stickstoffassimilationsweg involviert ist.
Die Verwendung von Anspruch 11, worin das cis-wirkende Element aus der 5'-stromaufwärts Region von irgendeinem Gen isoliert wird, für welches die Transkription durch die Verfügbarkeit einer Stickstoffquelle moduliert wird.
Die Verwendung von Anspruch 11, worin das cis-wirkende Element irgendeine Sequenz ist, für welche die transkriptionelle Aktivität moduliert wird durch die Zugabe oder die Entfernung von irgendeiner Stickstoffquelle in oder aus der Umgebung von irgendeinem lebenden Organismus.
Die Verwendung von Anspruch 11, worin das cis-wirkende Element aus irgendeiner Pflanze, einem Pilz, einer Hefe, einem Bakterium oder einem Tier isoliert wird.
Die Verwendung von Anspruch 11, worin das cis-wirkende Element aus einer 5'-stromaufwärts-Region eines exprimierten Nlr-Gens in Alfalfa isoliert wird.
Die Verwendung von Anspruch 5, worin der Promoter in Kombination mit einem Terminator verwendet wird, welcher eine Polyadenylierung-Signalendstelle für die Insertion an dem 3'-Ende des fremden Gens umfasst, worin der Terminator operativ in Bezug auf das fremde Gen und den isolierten Promoter angeordnet ist und dadurch die Expression des fremden Gens erlaubt.
Die Verwendung von Anspruch 17, worin der Terminator eine Sequenz hat, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 14 bis 16.
Ein isolierter Terminator zur Regulierung der Expression eines Gens in einem transgenen Organismus, worin die Sequenz des isolierten Terminators gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sequenzen wie in SEQ ID NR. 14 bis 16 veranschaulicht.