JP5981853B2

JP5981853B2 - ニューレグリンアンタゴニスト及び癌の治療におけるそれらの使用

Info

Publication number: JP5981853B2
Application number: JP2012554013A
Authority: JP
Inventors: エリカジャクソン，; エリック，アレハンドロスゥィート−コルデロ，
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2010-02-18
Filing date: 2011-02-17
Publication date: 2016-08-31
Anticipated expiration: 2031-02-17
Also published as: US9556249B2; AU2011218125A1; ZA201204423B; WO2011103242A1; HK1179997A1; EP2536748B1; BR112012017405A2; SG183333A1; ES2519348T3; SI2536748T1; CN102892779B; EP2536748A1; KR20130000384A; RU2012139825A; AU2016201848A1; MY160556A; US20110229493A1; PL2536748T3; RU2587619C2; CN102892779A

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年２月１８日に出願された米国仮出願第６１／３０５８７８号の利益を主張し、その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、ニューレグリンアンタゴニストによる癌の治療に関する。

癌幹細胞（ＣＳＣが）の固有性と特性は、近年、激しい研究分野となっている。腫瘍が異なる生物学的性質を有する細胞の不均一な混合物であるとする証拠が蓄積している。多数の血液悪性腫瘍および固形腫瘍について、腫瘍の成長を開始するユニークな能力を持つ異なる細胞集団の単離が、報告されている。しかしながら、将来を見越してＣＳＣを同定するための特異的な細胞表面マーカーの使用において、矛盾が生じている。例えば、幹細胞の表現型上の異なる知見が、白血病、膵臓癌、結腸直腸癌、脳癌及び乳癌について報告されている（Brennan and Matsui 2009に総説される）。さらにＣＳＣの頻度の推定値は、腫瘍の種類と患者の間で劇的に変わる。樹立された腫瘍の増殖を維持する、又は原発部位または遠隔部位で化学療法後に腫瘍が再発することにおけるＣＳＣの役割は決定されていない。

大部分の癌患者にとって、化学療法後の疾患の再発は、死亡の主要な原因である。従って、再発に関与する腫瘍再発生細胞（ＴＲＩＣｓ）のより良い理解が、最初に化学療法治療に応答した後に癌の再発を経験している患者をより望ましく治療するために必要とされる。このことは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の場合に特に重要であり、その理由はＮＳＣＬＣ患者の３分の２以上が外科的切除の候補ではないためである。進行した疾患を持つ患者の大半は、化学療法、放射線療法または２つの組み合わせで治療される（肺癌での原則と実践）。しかし、治療に対する良好な初期応答にもかかわらず、局所進行癌の５年生存率は２３．７パーセントで、進行疾患については３．５％にとどまっている(Horner et al. SEER)。

過剰発現または活性化変異を介するＥＧＦＲのシグナル伝達の調節解除は、非小細胞肺癌における頻繁な事象であることが示されている(Dahabreh et al., 2010)に総説される）。ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲ（Ｈｅｒ１）、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３およびＨｅｒ４を含むチロシンキナーゼのＨＥＲファミリーの原型メンバーである。Ｈｅｒ２は機能性リガンド結合ドメインを欠いており(Graus-Porta 1997)、ＨＥＲ３はチロシンキナーゼ活性を欠いており(Guy 1994)、これらの受容体はヘテロダイマーとして機能するに違いない。最近の証拠によれば、他のＨｅｒファミリーもまたＮＳＣＬＣにおける役割を果たし得ることを示している。しかし、疾患に対するその寄与はあまり特徴つけらておらず、研究はしばしばＥＧＦＲ活性化との相互作用に焦点が当てられている(Kuyama et al. 2008, Hirsch 2009, Zhou 2006, Johnson 2006, Ding 2008)。

ニューレグリンはＨｅｒ３およびＨｅｒ４受容体チロシンキナーゼのリガンドである。４つの既知のニューレグリンファミリーのメンバー、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、及びＮＲＧ４(Falls 2003)がある。ＮＲＧ１転写産物は、少なくとも１５の異なるアイソフォームを生じる大規模な選択的スプライシングを受ける。全ての活性なアイソフォームが、活性に必要かつ十分であるＥＧＦ様ドメインを共有している。ＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達は、肺上皮細胞増殖(Jinbo 2002)を調節し、ヒト肺の成長で役割を果たすことが示されており(Patel 2000)、ＥＧＦＲ阻害剤に対するＮＳＣＬＣの非感受性に関与している(Zhou 2006)。

耐性癌や癌の再発を経験している患者の治療に有効な治療を提供するための必要性が存在している。

本発明の一態様は、患者にニューレグリンアンタゴニストの有効量を投与することを含む、癌患者の腫瘍再発までの時間を増やすための方法を提供する。一実施形態では、本方法、患者への治療薬を投与することを更に含む。一実施態様において、治療薬は、化学療法剤または抗体である。所定の実施態様において、化学療法剤はパクリタキセル又はシスプラチン、又はパクリタキセルとシスプラチンの組み合わせである。

所定の実施態様において、抗体はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４抗体である。所定の実施態様において、患者が罹患している癌は非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、前立腺癌、または大腸癌である。

一実施態様において、腫瘍再発までの期間の増加は、ニューレグリンアンタゴニストの非存在下における再発までの期間より少なくとも１．２５倍大きい。一実施態様において、腫瘍再発までの期間の増加は、ニューレグリンアンタゴニストの非存在下における再発までの期間より少なくとも１．５０倍大きい。

所定の実施態様において、ニューレグリンアンタゴニストは、抗体、小分子、イムノアドヘシン、またはＲＮＡである。一実施態様において、ニューレグリンアンタゴニストは、ＮＲＧ１アンタゴニストである。一実施態様において、ＮＲＧアンタゴニストは、ＮＲＧ１抗体である。

腫瘍再発生細胞（ＴＲＩＣｓ）を研究するためのインボボモデルの概略図。無胸腺ヌードマウスにおけるＣａｌｕ３ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデルであり、ここでは化学療法がパクリタキセルとシスプラチンから成る。データは、平均腫瘍体積±ＳＥＭ、ｎ＝１２のマウス／群として提示される。化学療法がパクリタキセルとシスプラチンを含む、無胸腺ヌードマウスにおけるＨ４４１ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデル。データは平均腫瘍体積±ＳＥＭ、ｎ＝１２のマウス／群として提示される。化学療法がパクリタキセルを含む、ＳＣＩＤ／ｂｅｉｚマウスの乳腺脂肪パッドへの腫瘍細胞の同所移植を有するＫＬＰ４ヒト乳房モデル。データは平均腫瘍体積±ＳＥＭ、ｎ＝１２のマウス／群として提示される。Ｋ−ｒａｓ^{ＬＳＬＧ１２Ｄ}、ＣＡＧ−ＬＳＬ−ＧＦＰを遺伝子的に操作されたマウスのＮＳＣＬＣモデルのシスプラチンによる処置。データは、肺あたりのＧＦＰ陽性細胞の数±ＳＥＭ、ｎ＝６のマウス／群として提示される。Ｃａｌｕ３異種移植モデルのＴＲＩＣにおけるＮＲＧ１のｍＲＮＡの濃縮は、マイクロアレイ解析における２つの独立したプローブによって実証された。濃縮は独立した腫瘍サンプルから単離されたＲＮＡを用いて、ＮＲＧ１ａとＮＲＧ１ｂについて定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって検証された。二つの異なるマイクロアレイプローブによって示されるＨ４４１異種移植モデルのＴＲＩＣにおけるＮＲＧ１のｍＲＮＡの濃縮。これは、マイクロアレイ解析に使用したのと同じ腫瘍サンプルからのＲＮＡを用いる、ＮＲＧ１ａ及びＮＲＧ１ｂについてのｑＰＣＲにより検証した。二つの異なるマイクロアレイプローブによって示されるＫＰＬ４乳癌異種移植モデルのＴＲＩＣにおけるＮＲＧ１のｍＲＮＡの濃縮。１マイクロアレイプローブによって示され、ｑＰＣＲで検証された、Ｋ−ｒａｓ^{ＬＳＬＧ１２Ｄ}マウスのＮＳＣＬＣモデルのＴＲＩＣにおけるＮＲＧ１のｍＲＮＡの濃縮。化学療法後に、様々な大きさと時間における、腫瘍の腫瘍細胞ＮＲＧ１のｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ解析により明らかにされるように、ＮＲＧ１濃縮は残存細胞に特異的である。適宜摂取する飲料水中にビークル（スクロース）又はｄｏｘ（２ｍｇ／Ｌ）を投与され、樹立Ｃａｌｕ３−ｓｈＮＲＧ１異種移植腫瘍を持つマウスの腫瘍増殖曲線を示すグラフ。腫瘍体積は、研究期間中週２回測定した。線形混合効果（ＬＭＥ）として示されるデータは、自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積の適合を作成した。グラフは、化学療法＋スクロースまたは化学療法＋ｄｏｘで治療された樹立されたＣａｌｕ３−ｓｈＮＲＧ１異種移植腫瘍を有するマウスの腫瘍増殖曲線を示す。ＬＭＥとして示されるデータは、自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積の適合を作成した。グラフは、スクロースまたはｄｏｘで治療された樹立されたＨ４４１−ｓｈＮＲＧ１異種移植腫瘍を有するマウスの腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝１２／群）。データは、自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積のＬＭＥ適合解析として示される。グラフは、化学療法＋スクロースまたは化学療法＋ｄｏｘで治療された樹立されたＨ４４１−ｓｈＮＲＧ１異種移植腫瘍を有するマウスの腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝１２／群）。データは、自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積のＬＭＥ適合解析として示される。グラフは、スクロースまたはｄｏｘで治療された樹立されたＨ１２９９−ｓｈＮＲＧ１異種移植腫瘍を有するマウスの腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝１２／群）。データは、自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積のＬＭＥ適合解析として示される。グラフは、化学療法＋スクロースまたは化学療法＋ｄｏｘで治療された樹立されたＨ１２９９−ｓｈＮＲＧ１異種移植腫瘍を有するマウスの腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝１２／群）。データは、自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積のＬＭＥ適合解析として示される。ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄの平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭを示すグラフ。ビヒクル＋コントロールのＩｇＧで処置したマウス（ｎ＝６）、シスプラチン＋コントロールのＩｇＧで処置したマウス（ｎ＝６）、又はシスプラチン＋ＨＥＲ４ＥＣＤ−Ｆｃで処置したｐ５３^Ｆｌ／＋マウス（ｎ＝６）。ブタクサ、コントロールマウスＩｇＧ２ａ抗体。９５％信頼区間を用いた治療レジメンによる腫瘍量の日々の倍率変化を示すグラフ。ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄのベースライン±ＳＥＭからの腫瘍量の平均増減率を示すグラフ。ビヒクル＋コントロールのＩｇＧで処置したｐ５３Ｆｌ／Ｆｌマウス（ｎ＝１０）、シスプラチン＋コントロールのＩｇＧで処置したマウス（ｎ＝１１）、シスプラチン＋ＨＥＲ４−ＥＣＤで処置したｐ５３^Ｆｌ／＋マウス（ｎ＝８）、又はビヒクル＋ＨＥＲ４−ＥＣＤで処置したｐ５３^Ｆｌ／＋マウス（ｎ＝７）。

本発明の実施態様の詳細な記述
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク”に由来する”アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。

「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。

用語「抗ＮＲＧ抗体」及び「ＮＲＧに特異的に結合する抗体」は、抗体がＮＲＧを標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＮＲＧに結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗ＮＲＧ抗体の、無関係な非ＮＲＧタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＮＲＧへの結合の約１０％未満である。所定の実施態様において、ＮＲＧへ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍから１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍから１０^−１３Ｍ）。所定の実施態様において、抗ＮＲＧ抗体は、異なる種由来のＮＲＧ間で保存されているＮＲＧのエピトープに結合する。

用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。

参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイは、本明細書で提供される。

用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種から由来する抗体を指す。

用語「癌」及び「癌性」は、無秩序な細胞成長/細胞増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を記述する。癌の例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む。そのような癌のより具体的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、神経膠腫を含む、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病、及びその他のリンパ増殖性疾患、及び様々な型の頭頸部癌を包含する。

抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩＧＡ_１、及びＩｇＡ_２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

本明細書で用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。細胞障害性剤は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。

「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化を含む。

薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。

用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。

用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。

「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。

「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), 第１−３巻にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全てまたは実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げている抗体を指す。

本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲＳを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).)ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、略称(abbreviated-)ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633(2008)を参照のこと)特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。

「イムノコンジュゲート」は、１つ以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害剤を含む。

「個体」又は「被検体」又は「患者」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体又は患者はヒトである。

「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上または９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。

「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。

「抗ＮＲＧ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖および軽鎖（又はその断片）をコードする一つ以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。

「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。

「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。

用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている指示書を指すために使用される。

参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。

アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように、得られる。

用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。

「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。

特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＮＲＧ」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ニューレグリン（ヘレグリンとしても知られる）を指す。その用語は、細胞内でのプロセシングから生じた「完全長」、未処理ＮＲＧ並びにＮＲＧの任意の形態を含む。その用語はまた、天然に存在するＮＲＧの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。ＮＲＧの４つの既知の型がある：ＮＲＧ１(Holmes, W.E. et al., Science 256:1205-1210 (1992));ＮＲＧ２(Caraway, K.L. et al., Nature 387:512-516 (1997)); ＮＲＧ３(Zhang, E. et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:9562-9567)); 及びＮＲＧ４(Harari, D. et al., Oncogene 18:2681-2689)).選択的スプライシングに起因する、ＮＲＧ１ａｌｐｈａ（ＮＲＧ１α）とＮＲＧ１ｂｅｔａ（ＮＲＧβ）と呼ばれる、受容体結合に必要とされるＮＲＧ１のＥＧＦ様ドメインの２つの活性なアイソフォームがある。例示的なヒトＮＲＧ１の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＫ０００３８３(Falls, D. L., Ex Cell Res, 284:14-30 (2003)及び米国特許第５３６７０６０号に示されている。

本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明のＮＲＧアンタゴニストは疾患の発症を遅らせ、疾患の進行を遅らせ、再発を防ぎ、または腫瘍の再発までの時間を増加させるために使用される。所定の実施態様において、処置は、腫瘍再発生細胞の数の減少又は完全な消失、腫瘍再発生細胞でない腫瘍の細胞に対する固形腫瘍中の腫瘍再発生細胞の数の減少、及び／又は腫瘍再発生細胞の増殖の阻害をもたらす。所定の実施態様において、ＮＲＧアンタゴニストによる処置は、腫瘍再発までの時間を、ＮＲＧアンタゴニストによる処置無しにおける腫瘍再発までの時間よりも、少なくとも１．２５、１．５０、１．７５、２．０倍長く増加させる。

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照)。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために抗原を特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、 Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。

本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」として参照される。

ＩＩ．組成物および方法
本発明は、ＮＲＧ自己分泌シグナル伝達が、他の化学療法感受性腫瘍における化学療法後の腫瘍細胞の小集団の生存及び増殖において重要な役割を果たしているという知見に基づくものである。本明細書ではこれらの生き残った腫瘍細胞は、「腫瘍再発生細胞」又は「ＴＲＩＣ」と呼ばれ、以前に治療薬で治療された患者では、癌の再発（relapse）と再発（recurrence）に関与している。一実施態様において、患者を治療するために使われる治療薬は化学療法剤である。その他の実施態様において、患者を治療するために使用される治療薬は、抗体又はその断片などの抗原結合剤である。

ＮＲＧシグナル伝達の阻害は、治療薬による治療後の腫瘍再発又は再発の遅延もしくは予防を生じる。従って、本発明の一態様は、ＮＲＧ誘導性シグナル伝達を阻害するＮＲＧアンタゴニストを提供する。一実施態様において、ＮＲＧアンタゴニストは、ＮＲＧ１アンタゴニストである。ＮＲＧアンタゴニストは、治療薬による治療後の癌の抵抗性予防及び／又は癌の再発予防に用途を見出している。本発明の別の態様は、患者にＮＲＧアンタゴニストを投与することにより、患者における治療薬による治療に対する抵抗性を予防するための方法を提供する。本発明の別の態様は、患者にＮＲＧアンタゴニストを投与することにより、治療薬による治療後に癌の再発を予防するための方法を提供する。本発明の更に別の態様では、ＴＲＩＣを特徴づけるモデルを提供する。実施例および添付の図面に記載されているように、このモデルは、有意な腫瘍の縮退を生じる治療に対して堅牢な応答を示し、治療の中断後に疾患の再発が起きる細胞を含む。このモデルは、ＴＲＩＣを標的とするために使用可能な化合物のスクリーニングと、ＴＲＩＣの分子的基盤の決定において用途を見いだしている。

特定の態様は、患者にＮＲＧアンタゴニストの有効量を投与することを含む、腫瘍の再発を予防または再発までの時間を増加させる方法を含む。一実施態様において、患者は、化学療法剤または抗体などの抗原結合剤などの治療薬で治療されている。一実施態様において、癌は、腫瘍再発生細胞を含む。一実施態様において、癌は非小細胞肺癌である。一実施態様において、癌は乳癌である。一実施態様において、患者は、化学療法剤で治療された。一実施態様において、化学療法剤は癌の治療処置の標準として使用される薬剤である。一実施態様において、化学療法剤はパクリタキセル又はシスプラチン、又はパクリタキセルとシスプラチンの組み合わせである。一実施態様において、化学療法剤は、チロシンキナーゼ阻害剤ではない。その他の実施態様において、化学療法剤は、チロシンキナーゼ阻害剤である。一実施態様において、化学療法剤は、阻害剤のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４である。その他の実施態様では、ＮＲＧアンタゴニストと組み合わせて患者に化学療法剤を付加的に投与することを含む。

その他の実施態様において、患者は、抗体で治療された。一実施態様において、抗体は、抗チロシンキナーゼ抗体である。一実施態様において、抗体はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及び／又はＨＥＲ４抗体である。その他の実施態様では、ＮＲＧアンタゴニストと組み合わせて患者に抗体を付加的に投与することを含む。

所定の実施態様において、腫瘍再発までの時間は、ニューレグリンアンタゴニストの欠損下での腫瘍の再発までの時間よりも、少なくとも１．２５倍、１．５０倍、１．７５倍、２．０倍、２．５倍、５．０倍、１０倍、２０倍、又は５０倍長い。

その他の態様は、ＮＲＧアンタゴニストの有効量を患者に投与することを含む、抵抗性の癌に罹患した患者を治療する方法を提供する。一実施態様において、癌は、腫瘍再発生細胞を含む。一実施態様において、癌は非小細胞肺癌である。一実施態様において、癌は乳癌である。一実施態様において、癌は化学療法剤による治療に対して耐性がある。一実施態様において、癌は、パクリタキセル又はシスプラチン、又はパクリタキセルとシスプラチンの組み合わせによる治療に耐性がある。一実施態様において、癌はチロシンキナーゼ阻害剤による治療に対して耐性がある。一実施態様において、癌はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及び／又はＨＥＲ４阻害剤による治療に耐性がある。その他の実施形態は、患者に化学療法剤を付加的に投与することを含む。一実施態様において、化学療法剤はパクリタキセル又はシスプラチン、又はパクリタキセルとシスプラチンの組み合わせである。一実施態様において、化学療法剤は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４阻害剤である。

一実施態様において、癌は治療用抗体による治療に対して耐性がある。一実施態様において、癌はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４抗体による治療に耐性がある。その他の実施形態は、患者に抗体を付加的に投与することを含む。一実施態様において、抗体は、トラスツズマブまたはペルツズマブである。

その他の態様は、ＮＲＧアンタゴニスト及び治療薬の有効量を癌を有する患者に投与することを含む、癌における耐性を予防する方法を提供する。一実施態様において、癌は、腫瘍再発生細胞を含む。一実施態様において、癌は非小細胞肺癌である。一実施態様において、癌は乳癌である。一実施態様において、癌は化学療法剤による治療に対して耐性がある。一実施態様において、癌は、パクリタキセル又はシスプラチン、又はパクリタキセルとシスプラチンの組み合わせによる治療に耐性がある。一実施態様において、化学療法剤は、チロシンキナーゼ阻害剤ではない。その他の実施態様において、化学療法剤は、チロシンキナーゼ阻害剤である。一実施態様において、化学療法剤は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４の阻害剤である。その他の実施形態は、患者に化学療法剤を付加的に投与することを含む。一実施態様において、化学療法剤はパクリタキセル又はシスプラチン、又はパクリタキセルとシスプラチンの組み合わせである。

治療的用途のこれらの方法において、ＮＲＧアンタゴニストは、抗体、小分子、イムノアドヘシン、またはＲＮＡである。一実施態様において、ＮＲＧアンタゴニストは、ＮＲＧ１アンタゴニストである。一実施態様において、ＮＲＧアンタゴニストは、ＮＲＧ１抗体である。

更なる態様にて、本発明は、医薬の製造または調製におけるニューレグリンアンタゴニストの使用を提供する。一実施態様において、ニューレグリンアンタゴニスト、又はニューレグリンアンタゴニストを用いて製造された医薬は、患者の腫瘍再発までの時間を増やすために使われる。その他の実施態様において、ニューレグリンアンタゴニスト、又はニューレグリンアンタゴニストを用いて製造された医薬は、治療薬に耐性である癌に罹患した患者を治療するために使われる。

Ａ．ＮＲＧアンタゴニスト
本発明の方法において有用なＮＲＧアンタゴニストは、ＮＲＧに特異的に結合するポリペプチド、ＮＲＧに特異的に結合する、ＮＲＧ抗体（抗ＮＲＧ抗体）、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ、小分子、受容体分子、及び誘導体、例えばイムノアドヘシンが含まれる。（例えば、米国特許第６６９６２９０号及び第７６５９３６８号、米国特許出願公開第２０１００５５０９３号及び第２０１００２７８８０１号を参照）及び融合タンパク質。ＮＲＧのアンタゴニストはまた、ＮＲＧのポリペプチド、ＲＮＡアプタマー及びＮＲＧに対するペプチボディのアンタゴニスト変異体を含む。これらのそれぞれの例が以下に記載される。一実施態様において、ＮＲＧアンタゴニストは、ＮＲＧ１アンタゴニストである。他の実施態様では、ＮＲＧアンタゴニストは、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、またはＮＲＧ４アンタゴニストである。

１．抗体
本発明の方法において有用な抗ＮＲＧ抗体は、ＮＲＧに十分な親和性と特異性で結合し、ＮＲＧシグナル伝達を減少又は阻害することができる任意の抗体が含まれている。ＮＲＧアンタゴニストは、国際公開第１９９２０２０７９８号、米国特許第６９５３８４２号、及び米国特許第６２５２０５１号に記載される。

ａ）抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍから１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍから１０^−１３Ｍ）。

一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の力価測定系の存在下で、最小濃度の（^１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（ＣａｐｐｅｌＬａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［^１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０^ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ^ＴＭγ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。

他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅＩｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０^ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) （ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、 Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０^６Ｍ−^１ｓ−^１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗｅｑｕｉｐｐｅｄｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（ＡｖｉｖＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ^ＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。

ｂ）抗体断片
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃFv断片の総説については、例えば、 Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照;また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。

ダイアボディは２価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。所定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照）。

抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌やファージ）による生産を含む。

ｃ）キメラ及びヒト化抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。所定の実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。

ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号及び第７０８７４０９号;Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (「リサーフェシング」を記述); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (「FRシャッフリング」を記述);及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。

ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域(例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照); ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域 (例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照); 及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域 (例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照)を含む。

ｄ）ヒト抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。

ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つまたはインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び第６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−ＭＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、さらに種々のヒト定常領域と組み合わせることにより、例えば、更に改変される可能性がある。

ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって製造することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照)。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している)及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (ヒト-ヒトハイブリドーマを記載している)に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。

ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。

ｅ）ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性または活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。

所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが個別ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性なしで免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号を含む。

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体の断片とみなされる。

ｆ）多重特異性抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。所定の実施態様において、結合特異性の一つはＮＲＧに対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。所定の実施態様において、二重特異性抗体は、ＮＲＧの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたＮＲＧを発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。

多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照)及び“ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ”エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照)、２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること(例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照)、二重特異性抗体フラグメントを作製するため、 "ダイアボディ"技術を使用すること(例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること(例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照)、及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。

「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。

本明細書中の抗体又は断片はまた、ＮＲＧ並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（ＤｕａｌＡｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。

ｇ）抗体変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成され得る。

ｈ）置換、挿入、および欠失変異体
所定の実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「例示的置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、関心の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされた。

アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．

非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。

置換変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、さらなる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。

変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、またはモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。

所定の実施態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で発生する可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個または３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。

突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基またはグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。

アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。

ｉ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成または削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。

抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐糖鎖構造の”幹”のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は一定の改善された特性を有する抗体変異型を作成するために行われ得る。

一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、または２０％から４０％であり得る。

フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流または下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（ＫｙｏｗａＨａｋｋｏＫｏｇｙｏＣｏ．，Ｌｔｄ）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。フコース非修飾抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、アルファ-1、6 - フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞(例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照)を含む。

抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖とともに更に与えられる。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。

ｊ）Ｆｃ領域変異体
所定の実施態様において、１つまたは複数のアミノ酸改変が、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。

所定の実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイでは、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号(例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照) 及びHellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができるＣ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる(例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定ではまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる(例えば、Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。

エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。

ＦｃＲへの改善又は減少させた結合を持つ特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。)

所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。

幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。

増加した半減期および胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基の１以上の置換を有するものが含まれる：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）。

Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。

ｋ）システイン改変抗体変異体
所定の実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン改変抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。所定の実施態様において、以下の残基のいずれかまたは複数がシステインに置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
ｌ）抗体誘導体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造において好都合である。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、１つより多い重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。

その他の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗体と非タンパク質部分のコンジュゲートが、提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。

ｍ）組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法および組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗ＮＲＧの抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は〜を含む（例えば、〜で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＮＲＧ抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、および必要に応じて、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。

抗ＮＲＧ抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニングおよび／または発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物または真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で製造することができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003),頁245-254,も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、さらに精製することができる。

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。

グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。

植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載）を参照。

脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞系は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), 頁255-268 (2003)を参照。

ｎ）アッセイ
本明細書で提供されるＮＲＧアンタゴニストは、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質および／または生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。

一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。

その他の態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらのＮＲＧアンタゴニストを同定するために設けられている。生物学的活性は、例えば、ＮＲＧ誘導性受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達の阻害、腫瘍増殖の阻害、細胞増殖の阻害を含むことができる。インビボ及び／又はインビトロにおいてそうした生物学的活性を有するアンタゴニストもまた提供される。

所定の実施態様において、本発明のアンタゴニストは、そのような生物学的活性について試験される。一実施態様では、ＮＲＧ誘導性受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達を阻害するアンタゴニストの能力は、潜在的なＮＲＧアンタゴニストの存在下および非存在下で、受容体チロシンキナーゼのチロシン残基のＮＲＧ誘導性リン酸化のレベルを決定することによって測定することができる。Ｈｏｌｍｅｓら、１９９２年。以下は、受容体チロシンキナーゼのリン酸化状態を決定するための例示的なアッセイである。Ｈｅｒ２及びＨｅｒ３を発現する細胞は（例えば、Ｃａｏｖ３細胞、またはＨｅｒ２とＨｅｒ３を発現するように操作された細胞など）、潜在的なＮＲＧアンタゴニスト又はバッファー（コントロール）のいずれかで６０分間プレインキュベーションの後に、１０ｎＭのＮＲＧで刺激される。チロシンリン酸化のレベルを決定するために、全細胞溶解物を抗リン酸化チロシン抗体でプローブされるウェスタンブロット法で分析する。ブロットは抗リン酸化シグナルを定量するためにスキャンされ得る。バッファ・コントロールに比べて、ＮＲＧのアンタゴニストは、チロシンリン酸化のレベルを減少させるであろう。一実施態様において、ＮＲＧアンタゴニストは、未処置コントロールのと比較して、ＮＲＧ誘導性チロシンキナーゼシグナル伝達を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％阻害する。

所定の実施態様において、本発明の抗体は、インビトロでの細胞の成長または増殖を阻害するその能力について試験される。細胞の成長や増殖を阻害するためのアッセイは、当該分野で周知である。本明細書中に記載される「細胞の死滅」アッセイによって例示される、細胞増殖についての特定のアッセイは、細胞の生存率を測定する。そのようなアッセイの一つは、プロメガ社（ウィスコンシン州マディソン）から市販されている、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭ発光細胞生存率アッセイである。そのアッセイは、代謝活性細胞の指標である存在するＡＴＰの定量に基づき、培養液中で生存細胞の数を決定する。Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88,米国特許第６６０２６７７号を参照。アッセイは、自動化ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適するように、９６穴形式又は３８４穴形式で行うことができる。Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404を参照。アッセイ法では、直接培養細胞に単一試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を追加することを含む。これにより、細胞溶解とルシフェラーゼ反応により生成した発光シグナルの生成を生じる。発光シグナルは、培養中に存在する生存細胞の数に直接的に比例しているＡＴＰの存在量に比例する。データは、ルミノメーター又はＣＣＤカメラ撮像装置により記録することができる。発光出力は相対光単位（ＲＬＵ）として表される。

他の細胞増殖アッセイは、「ＭＴＴ」アッセイであり、ミトコンドリア還元酵素による３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物のホルマザンへの酸化を測定する比色アッセイである。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭアッセイの様に、このアッセイは細胞培養中に存在する代謝的に活性な細胞数を示す。例えばMosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63及びZhang et al. (2005) Cancer Res. 65: 3877-3882を参照のこと。

一態様において、ＮＲＧアンタゴニストはインビトロでの細胞死誘導能力について試験される。細胞死を誘導するためのアッセイは、当該分野で周知である。いくつかの実施態様において、そのようなアッセイは、例えば、よう化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11を参照）又は７ＡＡＤの取り込みによって示される膜統合性の損失を測定する。例示的なＰＩ取り込みアッセイにおいて、細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）：１０％の熱不活性ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び２ｍＭＬ−グルタミンが補充されたＨａｍ’ｓＦ−１２（５０：５０）において培養される。したがって、アッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の非存在下で行われる。細胞は、１００×２０ｍｍのディッシュにおいてディッシュにつき３×１０^６の密度で播種され、オーバーナイトで付着することができる。培地は取り除かれ、培地のみ、又は様々な濃度の抗体又はイムノコンジュゲートを含む培地で交換される。細胞は、３日間インキューベートされる。処理に続いて、単層はＰＢＳで洗浄され、トリプシン処理によって分離される。細胞は４℃で、５分間１２００ｒｐｍで遠心分離され、ペレットが３ｍｌの低温Ｃａ^２＋結合緩衝液（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ_２）中に再懸濁され、細胞凝集塊の除去のために３５ｍｍの濾過器キャップの(strainer-capped)１２×７５ｍｍのチューブ（１ｍｌ／チューブ、処理群につき３つのチューブ）に等分される。そして、チューブにＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）を加える。サンプルはＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析される。ＰＩ取り込みによって決定される統計的に有意な水準の細胞死を誘導する抗体がこのように同定される。

一態様において、ＮＲＧアンタゴニストはインビトロでのアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導能力について試験される。アポトーシスを誘導する抗体またはイムノコンジュゲートの例示的なアッセイは、アネキシン結合アッセイである。前項で説明したように、典型的なアネキシン結合アッセイでは、細胞が培養され皿に播種される。培地は取り除かれ、培地のみ、又は０．００１から１０μｇ／ｍｌの抗体又はイムノコンジュゲートを含む培地で交換される。３日間のインキュベーションに続いて、単層はＰＢＳで洗浄され、トリプシン処理によって分離される。次いで、細胞は遠心分離され、Ｃａ^２＋結合バッファーに再懸濁し、前項で説明したように、チューブに等分される。チューブは、標識されたアネキシン（例えばアネキシンＶ−ＦＩＴＣ）（１ｇ／ｍｌ）を受け取る。サンプルはＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析される。コントロールに比較して、アネキシン結合の統計的に有意な水準を誘導する抗体が、このように同定される。アポトーシスを誘導する抗体又はイムノコンジュゲートについてのその他の例示的なアッセイは、ゲノムＤＮＡのヌクレオソーム劣化を検出するためのヒストンＤＮＡのＥＬＩＳＡ比色アッセイである。そのようなアッセイは例えば、細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（ロシュ、パロアルト、カリフォルニア州）を用いて行うことができる。

インビトロアッセイにおいて、上記のいずれかで使用するための細胞は、自然にＮＲＧを発現するか、又はＮＲＧを発現するように操作されている細胞または細胞株が含まれる。そのような細胞は、同じ組織起源の正常細胞に比較してＮＲＧを過剰発現する腫瘍細胞を含む。そのような細胞はまた、ＮＲＧを発現する細胞株（腫瘍細胞株を含む）、及びＮＲＧを通常発現しないが、核酸をコードするＮＲＧでトランスフェクトされている細胞株を含む。

一態様において、ＮＲＧアンタゴニストはインビボでの細胞成長又は増殖を阻害するその能力について試験される。所定の実施態様において、ＮＲＧアンタゴニストはインビボでの腫瘍増殖を阻害するその能力について試験される。インビボのモデル系、例えば異種移植モデルを、そうした試験に使用することができる。例示的な異種移植システムでは、ヒト腫瘍細胞は、適当に免疫が低下した非ヒト動物、例えば、無胸腺「ヌード」マウスに導入される。本発明の抗体は、動物に投与される。腫瘍増殖を阻害または減少させる抗体の能力が測定される。上記の異種移植システムの特定の実施態様では、ヒト腫瘍細胞はヒト患者由来の腫瘍細胞である。このような異種移植モデルはＯｎｃｏｔｅｓｔ社（フライブルク、ドイツ）から市販されている。所定の実施態様において、ヒト腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞株由来の細胞である。所定の実施態様において、ヒト腫瘍細胞は、乳房脂肪パッドのような適当な部位に皮下注射または移植によって、適切に免疫不全非ヒト動物に導入される。

所定の実施態様において、ＮＲＧアンタゴニストは、未処置コントロールと比較して、細胞増殖を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％阻害する。他の実施態様において、ＮＲＧアンタゴニストは、未処置コントロールと比較して、腫瘍増殖を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％阻害する。

２．ＮＲＧ結合ポリペプチド
特異的にＮＧＲに結合するＮＲＧ結合ポリペプチドまたはその断片は、例えば、ＮＧＲタンパク質に結合して隔離することで、シグナル伝達からそれを阻止するために、本発明の方法で使用することができる。好ましくは、ＮＲＧポリペプチド又はその断片は、水溶性の形態である。幾つかの実施態様において、ポリペプチドの可溶性形態は、ＮＧＲに結合することによりその天然の結合パートナーと会合することを防ぐことによって、ＮＧＲの生物活性に対する阻害効果を発揮する。

３．アプタマー
アプタマーは、ＮＲＧのポリペプチドなどの標的分子に特異的に結合する三次元構造を形成する核酸分子である。アプタマーの生成と治療上の使用は、当技術分野で確立されている。米国特許第５４７５０９６号を参照。アプタマーに関する更なる情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号に見いだすことができる。

４．ペプチボディ
ペプチボディは、免疫グロブリン分子の断片または一部をコードするアミノ酸配列に連結されたペプチド配列である。ポリペプチドは、限定されないが、ファージディスプレイ技術を含む、特異的結合のための任意の方法によって選択されたランダム化された配列に由来し得る。好ましい実施態様において、選択されたポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ部分をコードするアミノ酸配列に連結させることができる。ＮＲＧに特異的に結合して拮抗するペプチボディは、本発明の方法においても有用である。

５．拮抗性核酸
他のＮＲＧアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトであり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、タンパク質の翻訳を防止することにより、直接ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように作用する。アンチセンス技術は、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡによって遺伝子発現を制御するために使用することができ、どちらの方法も、ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本明細書で成熟したＮＲＧポリペプチドコード化するヌクレオチド配列の５'コーディング部分を、長さ約１０から４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用することができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計されており（三重らせん−Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)を参照)、それによって転写及びＮＲＧポリペプチドの産生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＮＲＧポリペプチドへの翻訳を遮断する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56:560 (1991); 遺伝子発現のアンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＲＣＰｒｅｓｓ：ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ，１９８８）。上記のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがＮＲＧポリペプチドの産生を阻害するためにインビボで発現され得るように細胞に送達することができる。アンチセンスＤＮＡを用いる場合には、例えば、標的遺伝子の塩基配列の約−１０と＋１０の位置の間の翻訳開始部位に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、長さが３０ヌクレオチドよりも一般的に小さく、標的遺伝子の発現を減少させる二重鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、小分子または抗体などの伝統的なアンタゴニストが機能しない遺伝子発現を調節する研究のツールとして有用であることが証明されている。(Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003))。インビトロで合成された、長さが２１から２３ヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡは、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）として機能することができ、遺伝子発現を特異的阻害することができる(Fire A., Trends in Genetics 391; 806-810 (1999))。これらｉＲＮＡはその標的ＲＮＡの分解を媒介することで作用する。しかしながら、それらは長さ３０ヌクレオチド以下であるため、それらは細胞の抗ウイルス防御機構をトリガーしない。本発明の幾つかの実施態様において、ｓｉＲＮＡは、ＮＲＧをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体のコード配列の一部と、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。

６．オリゴペプチド
本発明のＮＲＧ結合オリゴペプチドは、好ましくは特異的に、本明細書に記載したようにＮＲＧに結合するオリゴペプチドである。ＮＲＧ結合オリゴペプチドは既知のオリゴペプチド合成手法を用いて化学的に合成することができるか、組換え技術を用いて調製され、精製することができる。ＮＲＧ結合オリゴペプチドは、通常長さが少なくとも５個のアミノ酸であり、あるいは長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００アミノ酸かそれ以上であり、本明細書に記載されるように、好ましくは、特異的に、ＮＲＧにすることが可能であるオリゴペプチドである。ＮＲＧ結合オリゴペプチドは、周知の技術を用いて過度の実験なしに同定することができる。この点に関して、特異的に標的ポリペプチドに結合することができるオリゴペプチドについてオリゴペプチドライブラリーをスクリーニングするための技術が、当技術分野において周知であることが留意される（例えば、米国特許第５５５６７６２号、第５７５０３７３号、第４７０８８７１号、第４８３３０９２号、第５２２３４０９号、第５４０３４８４号、第５５７１６８９号、第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開番号国際公開第８４／０３５０６号及び国際公開第８４／０３５６４号; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, and Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668)。

この点に関して、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは１つの周知の技術であり、ポリペプチド標的に特異的に結合することができるこれらのライブラリのメンバーを同定するため、大規模なオリゴペプチドライブラリーをスクリーニングすることができる。ファージディスプレイは、変異体ポリペプチドが、バクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質への融合タンパク質として表示される技術である (Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386)。ファージディスプレイ法の有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（またはランダムにクローニングされたｃＤＮＡ）の大規模なライブラリーを、高親和性で標的分子に結合するそれらの配列について迅速かつ効率的にソートすることができるという事実にある。ファージ上のペプチド (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378)又はタンパク質 (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363)のライブラリーの表示は、特定の結合特性を有するものについて、何百万ものポリペプチドまたはオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668)。ランダム変異体のファージライブラリーをソートすることは、多数の変異体を構築して増殖するための戦略、標的受容体を用いた親和性精製のための手順、及び結合濃縮の結果を評価する方法が必要である。米国特許第５２２３４０９号、第５４０３４８４号、第５５７１６８９号、及び第５６６３１４３号。

ペプチドライブラリーを作製し、これらのライブラリーをスクリーニングする方法もまた、米国特許第５７２３２８６号、第５４３２０１８号、第５５８０７１７号、第５４２７９０８号、第５４９８５３０号、第５７７０４３４号、第５７３４０１８号、第５６９８４２６号、第５７６３１９２号、及び第５７２３３２３号に開示されている。

７．小分子
ＮＲＧ結合小分子とは、いくつかの実施態様では、本明細書に定義されたオリゴペプチド又は抗体以外の、本明細書に記載されるように好ましくは特異的にＮＲＧに結合する、有機分子である。ＮＲＧ結合有機小分子が同定され、化学的に既知の方法論を用いて合成することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第００／００８２３号及び国際公開第００／３９５８５号を参照）。ＮＲＧ結合有機小分子は、通常約２０００ダルトン未満の大きさであり、あるいは、１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトンより小さい大きさであって、本明細書に記載されるように、好ましくは特異的にＮＲＧに結合することができるそうした有機小分子は、周知の技術を用いて過度の実験なしに同定することができる。この点に関して、標的ポリペプチドに結合することができる分子について、有機小分子ライブラリーをスクリーニングするための技術は、当技術分野において周知であることが特記される（例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第００／００８２３号及び国際公開第００／３９５８５号を参照）。ＮＲＧの結合有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、第一アミン、第二級アミン、第３級アミン、Ｎ−置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸塩、アルキルハライド、アルキルスルホン酸塩、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物、等であり得る。

８．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中のＮＲＧアンタゴニストを含むイムノコンジュゲートを提供する。

一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン、カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号を参照;Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993);及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン (Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002);及び米国特許第６６３０５７９号を参照）；メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。

その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。

その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のためにコンジュゲートを使用する場合は、それはシンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。

抗体と細胞毒性薬剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）など、を使って作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992);米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。

本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを限定されないが明示的に意図している。

Ｂ．診断及び検出のための方法および組成物
所定の実施態様において、本明細書で提供されるＮＲＧアンタゴニストは、生物学的サンプル中のＮＲＧの存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。所定の実施態様において、生物学的サンプルは、肺組織又は乳房組織などの細胞または組織を含む。

一実施態様において、診断または検出の方法で使用するための抗ＮＲＧ抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のＮＲＧの存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様において、本方法は、抗ＮＲＧ抗体のＮＲＧへの結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ＮＲＧの抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び複合体が抗ＮＲＧ抗体とＮＲＧの間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの法であり得る。一実施態様において、例えばＮＲＧが患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＮＲＧ抗体が抗ＮＲＧ抗体による治療にふさわしい被検体を選択するために使用される。

一実施態様において、患者が治療に耐性を持つかその可能性が高い癌を持っている場合には、患者はＮＲＧアンタゴニストによる治療のために選択される。本発明の一態様は、患者が治療に耐性を持つかその可能性が高い癌を有するかを決定するアッセイを提供する。一実施態様において、アッセイは、ＮＲＧの発現について、患者から採取した腫瘍細胞をアッセイすることを含み、そこではＮＲＧの発現が、患者が治療に耐性を持つか又はその可能性が高い癌を持っていることを示す。一実施態様において、腫瘍におけるＮＲＧの発現レベルが、腫瘍のＴＲＩＣにおけるＮＲＧの発現レベル未満である場合、患者は治療に耐性を持つか又はその可能性がある癌を有するものとして選択される。

一実施態様において、患者が治療薬による治療後に再発する可能性のある癌を持っている場合には、患者はＮＲＧアンタゴニストによる治療のために選択される。本発明の一態様は、患者が治療薬による治療後に再発する可能性がある癌を有するかを決定するアッセイを提供する。一実施態様において、アッセイは、ＮＲＧの発現について、患者から採取した腫瘍細胞をアッセイすることを含み、そこではＮＲＧの発現が、患者が治療薬による治療後に再発する可能性がある癌を持っていることを示す。一実施態様において、腫瘍におけるＮＲＧの発現レベルが、腫瘍のＴＲＩＣにおけるＮＲＧの発現レベル未満である場合、患者は治療薬による治療後に再発する可能性がある癌を有するものとして選択される。

所定の実施態様において、診断アッセイは、例えば、免疫組織化学、インサイツハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲを使用して、腫瘍細胞におけるニューレグリンの発現を決定することを含む。他の実施態様において、診断アッセイは、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、腫瘍細胞におけるニューレグリンの発現レベルを決定することを含む。幾つかの実施態様において、診断アッセイは、例えば、非癌性隣接組織などのコントロール組織と比較して、ニューレグリンの発現レベルを決定することを包含する。

所定の実施態様において、標識された抗ＮＲＧ抗体が与えられる。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光、発色、高電子密度の化学発光、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応や分子間相互作用を介して間接的に検出されるような酵素やリガンドのような部分が含まれる。このような標識の例には、ラジオアイソトープの^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化する過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。

Ｃ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供されるＮＲＧアンタゴニストを、治療方法で使用することができる。

一態様では、医薬として使用するためのＮＲＧアンタゴニストが提供される。更なる態様では、癌の治療に使用するためのＮＲＧアンタゴニストが提供される。所定の実施態様において、治療の方法における使用のためＮＲＧアンタゴニストが提供される。所定の実施態様において、本発明は、個体にＮＲＧアンタゴニストの有効量を投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法における使用のためのＮＲＧアンタゴニストを提供する。一つのそのような実施態様において、この方法は、例えば後述するように、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、癌の再発を経験している患者の治療に使用するためのＮＲＧアンタゴニストを提供する。所定の実施態様において、本発明は、治療薬への耐性を防ぐために個体にＮＲＧアンタゴニストの有効量を投与することを含む、個体において治療薬による治療に対する抵抗性を予防するための方法で使用するためのＮＲＧアンタゴニストを提供する。

更なる態様にて、本発明は、医薬の製造または調製におけるＮＲＧアンタゴニストの使用を提供する。一実施態様において、本医薬は癌の治療のためのものである。更なる実施態様において、本医薬は、癌を有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、癌を治療する方法で使用するためのものである。一つのそのような実施態様において、この方法は、例えば後述するように、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本医薬は、患者における治療薬による治療に対する抵抗性を防止するためのものである。更なる実施態様において、本医薬は、患者における癌の再発を防止するためのものである。

更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかで使用するために、本明細書で提供されるＮＲＧアンタゴニストのいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供されるＮＲＧアンタゴニストのいずれかと、薬学的に許容される担体を含む。その他の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供されるＮＲＧアンタゴニストのいずれかと、少なくとも１つのさらなる治療剤を、例えば後述するように含む。

一実施態様では、ＮＲＧアンタゴニスト及び治療上不活性な担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物又は医薬、並びにそのような組成物及び医薬を調製するために本発明の化合物を使用する方法を提供する。一例において、化合物は、生理学的に許容される担体、すなわち本草薬投与形態へ用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性である担体と共に、適切なｐＨで、かつ所望の程度の純度で、常温で混合して製剤化することができる。製剤のｐＨは、特定の用途や化合物の濃度に主に依存するが、好ましくは約３から約８の何れかの範囲である。一例では、化合物はｐＨ５で、酢酸緩衝液中に処方される。その他の実施態様において、化合物は無菌である。化合物は、例えば、凍結乾燥製剤として、または水溶液として、固体または非晶質組成物として、保存することができる。

本明細書に記載のＮＲＧアンタゴニストの薬学的処方物は、所望の程度の純度を有するそのようなアンタゴニストと任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980))とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、ＢａｘｔｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。

典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。

組成物は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の患者、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。

投与のための医薬組成物（又は製剤）は、薬物を投与するために使用される方法に応じて様々な方法で包装されてもよい。一般的には、配布用品は、その中に医薬製剤を適切な形態で貯蔵した容器を含む。適切な容器は、当業者によく知られており、ボトル（プラスチック及びガラス）、サシェ、アンプル、ビニール袋、金属シリンダー等の物品を含んでいる。また、容器は、パッケージの内容物への無分別なアクセスを防止するために、不正開封防止用組み合わせ品（ｔａｍｐｅｒ−ｐｒｏｏｆａｓｓｅｍｂｌａｇｅ）を含むことができる。更に、容器の内容物を記載するラベルがその上に付着されている。ラベルは適切な警告をも含み得る。

徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、化合物を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ^ＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能なマイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−（Ｄ）−（−）−３−ヒドロキシブチル酸が含まれる。

一例において、用量当たりの非経口的に投与されるＮＲＧアンタゴニストの薬学的有効量は、１日当たり患者の体重の約０．０１−１００ｍｇ／ｋｇ、あるいは約０．１から２０ｍｇ／ｋｇであり、化合物の典型的な初期範囲は０．３から１５ｍｇ／ｋｇ／日である。その他の実施態様において、錠剤、カプセル剤等の経口単位剤形は、好ましくは、本発明の化合物の５ｍｇから１００ｍｇ程度を含有する。

ＮＲＧアンタゴニストは、経口、局所（口腔および舌下を含む）、直腸、膣、経皮、経口、皮下、腹腔内、肺内、皮内、髄腔内、硬膜外および鼻腔内、及び局所治療が所望される場合における病巣内投与を含む任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。

投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、、様々な時間ポイント上の単一または複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。

ＮＲＧアンタゴニストは、任意の好都合な投与形態、例えば、錠剤、散剤、カプセル剤、溶液、分散液、懸濁剤、シロップ剤、スプレー剤、坐剤、ゲル、エマルジョン、パッチなどで投与することができる。そのような組成物は、薬学的製剤における従来の成分、例えば、希釈剤、担体、ｐＨ調整剤、甘味料、増量剤、及び更なる活性剤を含有することができる。

典型的な製剤は、本発明の化合物と担体又は賦形剤を混合することによって調製される。適当な担体および賦形剤は、当業者に知られており、例えば、 Ansel, Howard C., et al., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; Gennaro, Alfonso R., et al. Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; and Rowe, Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Chicago, Pharmaceutical Press, 2005に詳細に記載されている。製剤は、一又は複数のバッファー、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、滑剤、乳化剤、懸濁剤、保存料、抗酸化剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色料、甘味料、香料、フレーバー、及び薬物（すなわち、本発明の化合物又はその薬学的組成物）を見栄え良く提供するための又は薬学的製品（すなわち、医薬）の製造を補助する他の既知の添加剤を含みうる。

適切な経口剤形の例としては、約９０から３０ｍｇの無水ラクトース、約５から４０ｍｇのナトリウムクロスカルメロース、約５から３０ｍｇのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）Ｋ３０、１から１０ｍｇのステアリン酸マグネシウムを配合された本発明の化合物を約２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇまたは５００ｍｇを含有する錠剤である。粉末成分が最初に一緒に混合され、次にＰＶＰの溶液と混合する。得られた組成物を乾燥し、顆粒化し、ステアリン酸マグネシウムを混合し、通常の装置を使用して錠剤の形に圧縮することができる。エアゾール製剤は、リン酸バッファー等の適切なバッファー溶液に、例えば５から４００ｍｇの本発明の化合物を溶解させ、所望するならば、塩類、例えば塩化ナトリウム等の等張剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）を添加することにより調製することができる。不純物及び汚染物を除去するために、例えば０．２ミクロンのフィルターを使用して溶液が濾過されうる。

実施態様は、従って、化合物、又は立体異性体又はその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物を含む。更なる実施態様では、薬学的に許容される担体または賦形剤と一緒に、化合物、又は立体異性体又はその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物を含む。

抗体の場合には、抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療に渡って適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量用法も使用してよい。この治療法の進行は従来の手法及びアッセイにより容易にモニタリングされる。

上記の製剤または治療方法のいずれかが、ＮＲＧアンタゴニストの代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。

発明のＮＲＧアンタゴニストは、治療において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明のＮＲＧアンタゴニストが少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与することができる。

所定の実施態様において、更なる治療薬は、チロシンキナーゼ受容体経路を阻害する薬剤である。一実施態様において、更なる治療薬は、ＨＥＲ経路を阻害する。一実施態様において、更なる治療薬は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４の阻害剤である。

本明細書で使用される場合、用語「ＥＧＦＲ阻害剤」は、ＥＧＦＲに結合するか又はそうでなければＥＧＦＲに直接相互作用し、そのシグナル伝達活性を妨げるか又は減少させる化合物を意味するか、あるいは、「ＥＧＦＲアンタゴニスト」と呼ばれる。このような薬剤の例は、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子を含む。ＥＧＦＲに結合する抗体の例は、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣＣＲＬＨＢ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣＣＲＬＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣＣＲＬ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣＣＲＬ８５０９）（米国特許第４９４３５３３号，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎらを参照）及びその変異体、例えばキメラ化２２５（Ｃ２２５又はセツキシマブ；ＥＲＢＩＴＵＸ(登録商標)）及び再形成ヒト２２５（Ｈ２２５）（国際公開第９６／４０２１０号，ＩｍｃｌｏｎｅＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．を参照）；ＩＭＣ−１１Ｆ８，完全ヒトＥＧＦＲ標的抗体（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；タイプＩＩ変異体ＥＧＦＲに結合する抗体（米国特許第５２１２２９０号）；米国特許第５８９１９９６号に記載されているようなＥＧＦＲに結合するヒト化及びキメラ化抗体；及びＥＧＦＲに結合するヒト抗体、例えばＡＢＸ−ＥＧＦ又はパニツムマブ（国際公開第９８／５０４３３，Ａｂｇｅｎｉｘ／Ａｍｇｅｎを参照）；ＥＭＤ５５９００（Stragliottoら Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)）；ＥＭＤ７２００（マツズマブ），ＥＧＦＲ結合についてＥＧＦ及びＴＧＦ-α双方と競合するＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ（ＥＭＤ／Ｍｅｒｃｋ）；ヒトＥＧＦＲ抗体，ＨｕＭａｘ−ＥＧＦＲ（ＧｅｎＭａｂ）；Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３及びＥ７．６．３として知られ、米国特許第６２３５８８３号に記載されている完全なヒト抗体；ＭＤＸ−４４７（ＭｅｄａｒｅｘＩｎｃ）；及びｍＡｂ８０６又はヒト化ｍＡｂ８０６（Johnsら、 J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)）を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は細胞傷害剤とコンジュゲートされ得、よってイムノコンジュゲートを生じる（例えば、欧州特許出願公開第６５９４３９Ａ２号，ＭｅｒｃｋＰａｔｅｎｔＧｍｂＨを参照）。ＥＧＦＲアンタゴニストは小分子、例えば米国特許第５６１６５８２号、同第５４５７１０５号、同第５４７５００１号、同第５６５４３０７号、同第５６７９６８３号、同第６０８４０９５号、同第６２６５４１０号、同第６４５５５３４号、同第６５２１６２０号、同第６５９６７２６号、同第６７１３４８４号、同第５７７０５９９号、同第６１４０３３２号、同第５８６６５７２号、同第６３９９６０２号、同第６３４４４５９号、同第６６０２８６３号、同第６３９１８７４号、同第６３４４４５５号、同第５７６００４１号、同第６００２００８号、及び同第５７４７４９８、並びに次のＰＣＴ公報：国際公開第９８／１４４５１号、国際公開第９８／５００３８号、国際公開第９９／０９０１６号、及び国際公開第９９／２４０３７号に記載されている化合物を含む。特定の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＯＳＩ-７７４(ＣＰ-３５８７７４、エルロチニブ，タルセバ(登録商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＰＤ１８３８０５（ＣＩ１０３３、２−プロペンアミド、Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］−６−キナゾリニル］−，二塩酸塩，ＰｆｉｚｅｒＩｎｃ．）；ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ^ＴＭ）４−（３’−クロロ−４’−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＺＭ１０５１８０（（６−アミノ−４−（３−メチルフェニル−アミノ）−キナゾリン、Ｚｅｎｅｃａ）；ＢＩＢＸ−１３８２（Ｎ８−（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）−Ｎ２−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）−ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン−２，８−ジアミン，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ＰＫＩ−１６６（（Ｒ）−４−［４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール）；（Ｒ）−６−（４−ヒドロキシフェニル）−４−［（１−フェニルエチル）アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）；ＣＬ−３８７７８５（Ｎ−［４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−６−キナゾリニル］−２−ブチナミド）；ＥＫＢ−５６９（Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド）（Ｗｙｅｔｈ）；ＡＧ１４７８（Ｐｆｉｚｅｒ）；及びＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｐｆｉｚｅｒ）、二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ラパチニブ（タイケルブ（ＴＹＫＥＲＢ）（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６又はＮ−［３−クロロ−４−［（３フルオロフェニル）メトキシ］フェニル］６［５［［［２メチルスルホニル）エチル］アミノ］メチル］−２−フラニル］−４−キナゾリンアミン；グラクソスミスクライン）を含む。

本明細書で使用される場合、用語「ＨＥＲ２阻害剤」は、ＨＥＲ２に結合するか又はそうでなければＨＥＲ２に直接相互作用し、そのシグナル伝達活性を妨げるか又は減少させる化合物を意味するか、あるいは、「ＨＥＲ２アンタゴニスト」と呼ばれる。このような薬剤の例は、ＨＥＲ２に結合する抗体及び小分子を含む。特定のＨＥＲ２抗体は、ペルツズマブとトラスツズマブを含む。本明細書で使用される場合、用語「ＨＥＲ３阻害剤」は、ＨＥＲ３に結合するか又はそうでなければＨＥＲ３に直接相互作用し、そのシグナル伝達活性を妨げるか又は減少させる化合物を意味するか、あるいは、「ＨＥＲ３アンタゴニスト」と呼ばれる。このような薬剤の例は、ＨＥＲ３に結合する抗体及び小分子を含む。本明細書で使用される場合、用語「ＨＥＲ４阻害剤」は、ＨＥＲ４に結合するか又はそうでなければＨＥＲ４に直接相互作用し、そのシグナル伝達活性を妨げるか又は減少させる化合物を意味するか、あるいは、「ＨＥＲ４アンタゴニスト」と呼ばれる。このような薬剤の例は、ＨＥＲ４に結合する抗体及び小分子を含む。

ＨＥＲ抗体に関連した特許公報は、米国特許第５６７７１７１号、米国特許第５７２０９３７号、米国特許第５７２０９５４号、米国特許第５７２５８５６号、米国特許第５７７０１９５号、米国特許第５７７２９９７号、米国特許第６１６５４６４号、米国特許第６３８７３７１号、米国特許第６３９９０６３号、米国特許出願公開第２００２／０１９２２１１Ａ１号、米国特許第６０１５５６７号、米国特許第６３３３１６９号、米国特許第４９６８６０３号、米国特許第５８２１３３７号、米国特許第６０５４２９７号、米国特許第６４０７２１３号、米国特許第６７１９９７１号、米国特許第６８００７３８号、米国特許出願公開第２００４／０２３６０７８Ａ１号、米国特許第５６４８２３７号、米国特許第６２６７９５８号、米国特許第６６８５９４０号、米国特許第６８２１５１５号、国際公開第９８／１７７９７号、米国特許第６３３３３９８号、米国特許第６７９７８１４号、米国特許第６３３９１４２号、米国特許第６４１７３３５号、米国特許第６４８９４４７号、国際公開第９９／３１１４０号、米国特許出願公開第２００３／０１４７８８４Ａ１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０２３４Ａ１号、米国特許出願公開第２００５／０００２９２８Ａ１号、米国特許第６５７３０４３号、米国特許出願公開第２００３／０１５２９８７Ａ１号、国際公開第９９／４８５２７号、米国特許出願公開第２００２／０１４１９９３Ａ１号、国際公開第０１／００２４５号、米国特許出願公開第２００３／００８６９２４号、米国特許出願公開第２００４／００１３６６７Ａ１号、国際公開第００／６９４６０号、国際公開第０１／００２３８号、国際公開第０１／１５７３０号、米国特許第６６２７１９６Ｂ１号、米国特許第６６３２９７９Ｂ１号、国際公開第０１／００２４４号、米国特許出願公開第２００２／００９０６６２Ａ１号、国際公開第０１／８９５６６号、米国特許出願公開第２００２／００６４７８５号、米国特許出願公開第２００３／０１３４３４４号、国際公開第０４／２４８６６号、米国特許出願公開第２００４／００８２０４７号、米国特許出願公開第２００３／０１７５８４５Ａ１号、国際公開第０３／０８７１３１号、米国特許出願公開第２００３／０２２８６６３号、国際公開第２００４／００８０９９Ａ２号、米国特許出願公開第２００４／０１０６１６１号、国際公開第２００４／０４８５２５号、米国特許出願公開第２００４／０２５８６８５Ａ１号、米国特許第５９８５５５３号、米国特許第５７４７２６１号、米国特許第４９３５３４１号、米国特許第５４０１６３８号、米国特許第５６０４１０７号、国際公開第８７／０７６４６号、国際公開第８９／１０４１２号、国際公開第９１／０５２６４号、欧州特許出願第４１２１１６Ｂ１号、欧州特許出願第４９４１３５Ｂ１号、米国特許第５８２４３１１号、欧州特許出願第４４４１８１Ｂ１号、欧州特許出願第１００６１９４Ａ２号、米国特許出願公開第２００２／０１５５５２７Ａ１号、国際公開第９１／０２０６２号、米国特許第５５７１８９４号、米国特許第５９３９５３１号、欧州特許出願第５０２８１２Ｂ１号、国際公開第９３／０３７４１号、欧州特許出願第５５４４４１Ｂ１号、欧州特許出願第６５６３６７Ａ１号、米国特許第５２８８４７７号、米国特許第５５１４５５４号、米国特許第５５８７４５８号、国際公開第９３／１２２２０号、国際公開第９３／１６１８５号、米国特許５８７７３０５号、国際公開第９３／２１３１９号、国際公開第９３／２１２３２号、米国特許第５８５６０８９号、国際公開第９４／２２４７８号、米国特許第５９１０４８６号、米国特許第６０２８０５９号、国際公開第９６／０７３２１号、米国特許第５８０４３９６号、米国特許第５８４６７４９号、欧州特許出願第７１１５６５号、国際公開第９６／１６６７３号、米国特許第５７８３４０４号、米国特許第５９７７３２２号、米国特許第６５１２０９７号、国際公開第９７／００２７１号、米国特許第６２７０７６５号、米国特許第６３９５２７２号、米国特許第５８３７２４３号、国際公開第９６／４０７８９号、米国特許第５７８３１８６号、米国特許第６４５８３５６号、国際公開第９７／２０８５８号、国際公開第９７／３８７３１号、米国特許第６２１４３８８号、米国特許第５９２５５１９号、国際公開第９８／０２４６３号、米国特許第５９２２８４５号、国際公開第９８／１８４８９号、国際公開第９８／３３９１４号、米国特許第５９９４０７１号、国際公開第９８／４５４７９号、米国特許第６３５８６８２Ｂ１号、米国特許出願公開第２００３／００５９７９０号、国際公開第９９／５５３６７号、国際公開第０１／２００３３号、米国特許出願公開第２００２／００７６６９５Ａ１号、国際公開第００／７８３４７号、国際公開第０１／０９１８７号、国際公開第０１／２１１９２号、国際公開第０１／３２１５５号、国際公開第０１／５３３５４号、国際公開第０１／５６６０４号、国際公開第０１／７６６３０号、国際公開第０２／０５７９１号、国際公開第０２／１１６７７号、米国特許第６５８２９１９号、米国特許出願公開第２００２／０１９２６５２Ａ１号、米国特許出願公開第２００３／０２１１５３０Ａ１号、国際公開第０２／４４４１３号、米国特許出願公開第２００２／０１４２３２８号、米国特許第６６０２６７０Ｂ２号、国際公開第０２／４５６５３号、国際公開第０２／０５５１０６号、米国特許出願公開第２００３／０１５２５７２号、米国特許出願公開第２００３／０１６５８４０号、国際公開第０２／０８７６１９号、国際公開第０３／００６５０９号、国際公開第０３／０１２０７２号、国際公開第０３／０２８６３８号、米国特許出願公開第２００３／００６８３１８号、国際公開第０３／０４１７３６号、欧州特許出願第１３５７１３２号、米国特許出願公開第２００３／０２０２９７３号、米国特許出願公開第２００４／０１３８１６０号、米国特許第５７０５１５７号、米国特許第６１２３９３９号、欧州特許出願第６１６８１２Ｂ１号、米国特許出願公開第２００３／０１０３９７３号、米国特許出願公開第２００３／０１０８５４５号、米国特許第６４０３６３０Ｂ１号、国際公開第００／６１１４５号、国際公開第００／６１１８５号、米国特許第６３３３３４８Ｂ１号、国際公開第０１／０５４２５号、国際公開第０１／６４２４６号、米国特許出願公開第２００３／００２２９１８号、米国特許出願公開第２００２／００５１７８５Ａ１号、米国特許第６７６７５４１号、国際公開第０１／７６５８６号、米国特許出願公開第２００３／０１４４２５２号、国際公開第０１／８７３３６号、米国特許出願公開第２００２／００３１５１５Ａ１号、国際公開第０１／８７３３４号、国際公開第０２／０５７９１号、国際公開第０２／０９７５４号、米国特許出願公開第２００３／０１５７０９７号、米国特許出願公開第２００２／００７６４０８号、国際公開第０２／０５５１０６号、国際公開第０２／０７０００８号、国際公開第０２／０８９８４２号、国際公開第０３／８６４６７号、及び米国特許出願公開第２０１０／０２５５０１０号を含む。

所定の実施態様において、更なる治療薬は、化学療法剤である。「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物を指す。化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド(ＣＹＴＯＸＡＮ(登録商標))；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン(piposulfan)；アジリジン類、例えばベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)；アルトレトアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ-９-テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）を含む）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９-アミノカンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照）；ＣＤＰ３２３、経口α−４インテグリン阻害剤；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン（ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、リポソームドキソルビシンＴＬＣＤ-９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標）、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン類(ansamitocins)のようなメイタンシノイド類(maytansinoids)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantron)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリジンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANE^TM)、及びドキセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン（例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））及びカルボプラチン；ビンカ類でチューブリン重合の微小管形成を阻害するもの、例えばビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標)、ビンクリスチン(ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標))、ビンデシン(ＥＬＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))、及びビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボビン(leucovovin)；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド、例えば、ベキサロテン(ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ(登録商標))；ビスホスホネート、例えばクロドロネート(例えばＢＯＮＥＦＯＳ(登録商標)又はＯＳＴＡＣ(登録商標))、エチドロン酸(ＤＩＤＲＯＣＡＬ(登録商標))、ＮＥ-５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ＺＯＭＥＴＡ(登録商標))、アレンドロネート(ＦＯＳＡＭＡＸ(登録商標))、パミドロン酸(ＡＲＥＤＩＡ(登録商標))、チルドロン酸(ＳＫＥＬＩＤ(登録商標))、又はリセドロン酸(ＡＣＴＯＮＥＬ(登録商標))；トロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子受容体(ＥＧＦ-Ｒ)；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害薬(例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標))；ＢＡＹ４３９００６(ソラフェニブ；Bayer)；ＳＵ-１１２４８(スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)、Pfizer)；ペリフォシン(perifosine)、ＣＯＸ-２阻害剤(例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ)、プロテオゾーム阻害剤(例えばＰＳ３４１)；ボルテゾミブ(ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標))；ＣＣＩ-７７９；チピファルニブ(tipifarnib)(Ｒ１１５７７)；オラフィニブ(orafenib)、ＡＢＴ５１０；ＢＣＬ-２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム(oblimersen sodium)(ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標))；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照）；チロシンキナーゼ阻害剤；セリン-スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ(登録商標)）；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばロナファーニブ（ＳＣＨ６６３６，ＳＡＲＡＳＡＲ^ＴＭ）；及び上述したものの何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組合せ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロンの併用療法の略称であるＣＨＯＰ；及び５−ＦＵ及びロイコボリンとオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ^ＴＭ）を組合せた治療法の略称であるＦＯＬＦＯＸが含まれる。

ここで定義された化学療法剤には、癌の増殖を促進しうるホルモンの効果を調節、低減、ブロック、又は阻害するように働く「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療剤」が含まれる。それらはそれ自体がホルモンであってもよく、限定するものではないが、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを持つ抗エストロゲン、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)）、４-ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標)）、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)（ＥＶＩＳＴＡ(登録商標)）、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、及びＳＥＲＭ３などの選択的なエストロゲン受容体調節因子(ＳＥＲＭ)；アゴニスト特性を有さない純粋な抗エストロゲン類、例えばフルベストラント(ＦＡＳＬＯＤＥＸ(登録商標))、及びＥＭ８００(このような薬剤はエストロゲン受容体(ＥＲ)二量体化をブロックし、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、及び／又はＥＲレベルを抑制しうる)；アロマターゼインヒビター、例えば、ホルメスタン及びエキセメスタン(ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標))などのステロイド系アロマターゼインヒビター、及びアナストロゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標))、レトロゾール(ＦＥＭＡＲＡ(登録商標))及びアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼインヒビター、及びボロゾール(ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標))、メゲストロールアセテート(ＭＥＧＡＳＥ(登録商標))、ファドロゾール及び４(５)-イミダゾールを含む他のアロマターゼインヒビター；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばロイプロリド(ＬＵＰＲＯＮ(登録商標)及びＥＬＩＧＡＲＤ(登録商標))、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプトレリン；性ステロイド、例えばプロゲスチン、例えばメゲストロールアセテート及びメドロキシプロゲステロンアセテート、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びプレマリン、及びアンドロゲン／レチノイド、例えばフルオキシメステロン、全てのトランスレチオニン酸及びフェンレチニド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方制御因子(ＥＲＤ)；抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド；及び上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せを含む。

そのような併用療法は、（ｉ）脂質キナーゼ阻害剤、（ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ＰＫＣ−α、ＲａｌｆおよびＨ−Ｒａｓなどの接着細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）などのリボザイム、及びＨＥＲ２発現阻害剤、（ｉｖ）遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、（ｖ）ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）などの抗血管新生剤、及び薬学的に許容可能な塩類、酸類又は上記のいずれかの誘導体が挙げられる。

上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の製剤に含まれている）、及び、本発明のＮＲＧアンタゴニストの投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明のＮＲＧアンタゴニストはまた放射線治療と併用して用いることができる。

Ｄ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にあるまたは容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；および（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質のさらに含んでもよい。

ＩＩＩ．実施例
以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
実施例１：方法
細胞株
ＮＳＣＬＣ細胞株Ｃａｌｕ３、Ｈ４４１、Ｈ１２９９、Ｈ１９９３、Ａ５４９およびＨ５９６、およびＫＰＬ４乳癌細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、マナッサスから得た。これらの細胞株は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを含有するＰＲＭＩで維持された。Ｃａｌｕ３は、ＲＰＭＩの代わりにＡＴＣＣ培地で培養された。Ｃａｌｕ３、Ｈ４４１及びＫＰＬ４細胞株はＴＺＶ−ｂ−アクチンｅＧＦＰのレンチウイルスで形質導入した。複数回の継代後、高ＧＦＰ発現細胞が選別されて増幅され、約９５％のＧＦＰ陽性細胞を得て、これらの下位株はＣａｌｕ３−ＧＦＰおよびＨ４４１−ＧＦＰおよびＫＰＬ４−ＧＦＰと記載された。マウスＮＳＣＬＣ細胞株のＬＫＰＨ１とＬＫＰＨ２は、Ｋｒａｓ^{ＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋}、ｐ５３^ＦＬ／＋、Ｚ／ＥＧ肺腫瘍担持マウスからの２つの独立した腫瘍由来であった。細胞株は、はじめに、５％のＦＢＳ、ウシ下垂体抽出物、Ｎ２サプリメント、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で樹立された。ＬＫＰＨ１及びＬＫＰＨ２は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ高グルコース培地で培養した。

誘導性ｓｈＲＮＡレンチウイルス：本研究で使用したヘアピンオリゴヌクレオチドは、以下のとおりである。
ｓｈＮＲＧ１：５’−ＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＧＣＧＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’（センス）（配列番号１）
及び
５’−ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧ−３’（アンチセンス）（配列番号２）。
ｓｈＮＲＧ１．２：５’ＧＡＴＣＣＣＣＧＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＴＴＴＧＣＡＣＡＴＡＴＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’（センス）（配列番号３）及び
５’−ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＣＡＣＴＴＴＧＣＡＣＡＴＡＴＡＣＴＣＧＧＧ−３’（アンチセンス）（配列番号４）。
ｓｈＥｒｂＢ４：５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＴＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３”（センス）（配列番号５）及び
５’ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＴＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＧＡＴＣＧＧＧ−３’（アンチセンス）（配列番号６）。
ｓｈＥｒｂＢ３：５’−ＧＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＧＴＴＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＡＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’（センス）（配列番号７）及び
５’−ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＡＡＣＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＣＴＴＧＧＧ−３’（アンチセンス）（配列番号８）。
マウスｓｈＮＲＧ１：５”−ＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＧＣＧＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’（センス）（配列番号９）及び
５’−ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧ−３”（アンチセンス）（配列番号１０）。

相補的な二本鎖のｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチドは、記載されているようにＴｅｔ誘導ウイルス遺伝子導入ベクターに挿入した(Hoeflich et al. Cancer Res. 2006)。ベクター系は、シャトルベクター及び、コドン最適Ｔｅｔリプレッサー内部リボソーム進入部位−ＤｓＲｅｄカセットを含む、ＤｓＲｅｄを発現するウイルスベクター骨格を含み、Ｔｅｔ調節ｓｈＲＮＡ発現を可能とする。ルシフェラーゼｓｈＲＮＡコンストラクトは、以前に記載されている（Ｈｏｅｆｌｉｃｈら）。

ウイルスパッケージング及び細胞株の生成：誘導性ｓｈＲＮＡを有するレンチウイルスコンストラクトが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のエンベロープ糖タンパク質及びＨＩＶ−１パッケージングタンパク質（ＧＡＧ−ＰＯＬ）を、リポフェクタミン（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に発現するプラスミドを有する所望のｓｈＲＮＡを含む、ｐＨＵＳＨ−レンティ−ＤｓＲｅｄコンストラクトをコ−トランスフェクトすることにより、前述の方法に基づいて作成された。標的細胞は、これらのウイルスで形質導入した。＞３継代後、収集され、プールされ、拡張された、上位約２０％のｄｓＲｅｄ発現細胞を選択するためにＦＡＣＳソーティングが用いられた。

インビトロでの研究：ｓｈＲＮＡ発現を誘導するために、ドキシサイクリン誘導性ｓｈＮＲＧ１またはｓｈルシフェラーゼを保有する安定な細胞株を、計６日間、１ｕｇ／ｍｌのドキシサイクリンで増殖させた。誘導の初日に、細胞は１０％のＦＢＳで増殖させ、続いて、更に４日間にわたりＦＢＳの滴定が行われた。細胞は、増殖の最後の６時間の間は完全に血清飢餓であった。次いで、細胞はＲＮＡ抽出またはウェスタンブロッティングのために処理された。マウスの肺腫瘍細胞株におけるＨＥＲ４ＥＣＤ研究のために、ＬＫＰＨ細胞が２ｍｇ／ｍＬの濃度でのＨＥＲ４ＥＣＤの添加前に、２４時間、血清飢餓状態で増殖させた。ＬＫＰＨ細胞は、その後、ウエスタンブロット法において処理する前に、さらに４８時間インキュベートした。Ｈ４４１細胞に対する外因性ＮＲＧ１の添加は以下のように行った：Ｈ４４１細胞は、１ｕＭ換えヒトＮＲＧ１β−１細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）、又は対照として１ｕＭ抗ブタクサＩｇＧ２Ａの添加前に１８時間血清飢餓であった。ＮＲＧ１またはブタクサの添加から１０分後に、細胞はウェスタンブロット法のために処理された。

ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ調製及びｑＰＣＲ：ＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙマイクロキットを用いて単離した。相補的ＤＮＡは、製造元の指示に従って、ＡＢＩの高忠実度キットを用いて全ＲＮＡから調製した。ＮＲＧ１アルファ、ＮＲＧ１ベータ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４の発現は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＡＢＩ７５００）によって、ＡＢＩの遺伝子特異的プライマー／プローブを用いて決定した。遺伝子発現は、ＧＡＰＤＨ又はＲＡＢ１４ハウスキーピング遺伝子を用いて正規化した。

インビボでの異種移植腫瘍の研究：腫瘍細胞（１０００万〜２０００万個）が無胸腺ヌードマウスの右脇腹に移植された。腫瘍の大きさが約２００立方ミリメートルに達したときに、マウスは異なる治療群に分けられた。マウスは、初期の研究のために、ビヒクル又は化学療法（パクリタキセル、静脈内＋シスプラチン、腹腔内）で処置された。化学療法の投与レジメンは、パクリタキセルを２０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与を一日おきに５用量、シスプラチンを、Ｃａｌｕ３モデルにおいては第１日と第７日に、Ｈ４４１モデルにおいては第１日と第１４日に、５ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与であった。退行腫瘍及び時間を一致させたビヒクルコントロールが、化学療法の最終投与後少なくとも１週間で収集された。腫瘍はディスパーゼ／コラゲナーゼを用いて分離し、サンプルは、ＧＦＰ陽性腫瘍細胞を収集するために、ＦＡＣＳソートした。ＮＲＧ１ノックダウン研究について、治療群は次のとおりだった：スクロース、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）、化学療法＋スクロース、及び化学療法＋ドキシサイクリン。スクロース又はドキシサイクリンによる処置は、化学療法の初回投与と同時に開始され、研究の期間継続した。５％スクロース水がビヒクル群に対して自由に与えられ、５％ショ糖中の１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンがドキシサイクリン群において与えられた。

異種移植腫瘍増殖解析：時間をかけて同じ動物からの腫瘍体積の反復測定を分析するために、混合モデリングアプローチを用いた（Ｐｉｎｈｅｉｒｏら、２００９）。このアプローチは、反復測定と研究終了前の動物の無処置関連終結による適度な脱落率の両方を扱うことができる。キュービック回帰スプラインが、各処置群についてｌｏｇ２腫瘍体積の経時変化に非線形プロファイルを適合するために使用された。

インビボでのＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３^Ｆｌ／＋及びＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３^{Ｆｌ／Ｆｌ}Ｈｅｒ４ＥＣＤ研究：ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３^Ｆｌ／＋はアデノＣｒｅウイルスで感染させ、腫瘍誘導後１６週間熟成させた。ベースラインＣＴスキャンが腫瘍誘導後１６週目（研究の０日目）に実施され、マウスは開始時の腫瘍体積の平均値が等しいようにグループ化された。マウスは研究期間中、３週間に一回シスプラチン（７ｍｇ／ｋｇ）、またはリン酸緩衝生理食塩水を、隔週でＨＥＲ４ＥＣＤ−ＦＣ（２５ｍｇ／ｋｇ）または抗ブタクサＩｇＧ２Ａ（２５ｍｇ／ｋｇ）を投与された。シリアルＣＴスキャンが第１４日、第４５日、第６６日に行われた。

Ｘ線マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）：２つのマイクロＣＴシステム（ｖｉｖａＣＴ４０とｖｉｖａＣＴ７５、ＳｃａｎｃｏＭｅｄｉｃａｌ、スイス）が、縦方向の肺イメージングのために利用された。動物は、マイクロＣＴシステム間で無作為に割り付けられ、ベースラインのイメージングに使用されるのと同じシステム上で再スキャンされた。データは３８μｍ（ｖｉｖａＣＴ４０）又は５０μｍ（ｖｉｖａＣＴ７５）の等方性ボクセルサイズで、１０００画像、２５０ミリ秒（ｖｉｖａＣＴ４０）または２００ミリ秒（ｖｉｖａＣＴ７５）の積分時間で、４５ｋｅＶの光子エネルギー、１７７ミリアンペアの電流で得られた。生体内イメージングの期間中、動物は、２％イソフルランを含む医療空気で麻酔され、３７℃の定常温度で制御された暖かい空気流によって維持された。各セッションの撮像時間は動物あたり約１５分（ｖｉｖａＣＴ７５）または２５分（ｖｉｖａＣＴ４０）であり、推定された放射線量は、約０．２Ｇｙ（ｖｉｖａＣＴ７５）または０．１Ｇｙ（ｖｉｖａＣＴ４０）であった。画像データは、画像解析ソフトウェアパッケージのＡＮＡＬＹＺＥ（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ、Ｌｅｎｅｘａ、カンザス州、米国）を使って冠状面で評価された。一度各腫瘍の最大断面が同定されると、最大の腫瘍直径（ｄ１）と最大垂直直径（ｄ２）の推定値が決定された。総腫瘍量は、すべての腫瘍の指向性推定値の外積（ｄ１×ｄ２）の和として算出した。インビボマイクロＣＴ腫瘍の分析は以前に検証され、エクスビボマイクロＣＴ分析によって決定されるように、十分に総腫瘍体積と相関することが見出された (Singh et al., 2010)。

マイクロアレイ解析：２ラウンドのＴ７増幅プロトコルで使用される全ＲＮＡの量は、サンプルあたり１０ｎｇから５０ｎｇの範囲であった。第一ラウンドの増幅及び第二ラウンドのｃＤＮＡ合成は、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐＩＩａＲＮＡ増幅キット（アプライドバイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア州）を使用して行われた。Ｃｙｅ−５色素が次いでＡｇｉｌｅｎｔのクイックアンプラベリングキット（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、パロアルト、カリフォルニア州）を用いてＩＶＴ反応により取り入れられた。各ＣＹ−５標識した試験サンプルは、ＣＹ−３標識ユニバーサルヒューマンリファレンスＲＮＡ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、パロアルト、カリフォルニア州）でプールされ、製造業者のプロトコールに記載されているようアジレントのヒト全ゲノム４ｘ４４Ｋアレイ上へハイブリダイズさせた。アレイは、洗浄し、乾燥し、アジレントのＤＮＡマイクロアレイスキャナでスキャンした。アジレントのＦｅａｔｕｒｅＥｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア９．５が、得られたアレイ画像を分析するために使用され、バックグランドを差し引かれたシグナル強度の個別のｌｏｇ２比が得られた。改変Ｃｙｂｅｒｔ−Ｔテスト(Baldi and Long, 2001)が、ビヒクル処置と化学療法群の間の発現プロファイルを比較するために行われた。偽の発見率（ｑ値(qvalue)）を、複数の試験補正に適用した (Storey and Tibshirani, 2003)。

ｓｉＲＮＡ：ＨＥＲ３（Ｍ−００３１２７−０３）、ＨＥＲ１（Ｍ−００３１１４−０１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４、及び非標的コントロールの低分子干渉ＲＮＡオリゴ（ｓｉＲＮＡ）のプールは、ＤｈａｒｍａｃｏｎＬａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯから購入した。ｓｉＲＮＡは、リバーストランスフェクションによってＨ５２２細胞に導入した。細胞／ウェルは、製造元の推奨に従って、５０ｎｍｏｌ／ＬでプールされたＲＮＡｉオリゴとＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に希釈されたＤｈａｒｍａＦＥＣＴ＃（Ｔ−２００１−０２，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）トランスフェクション試薬を事前にインキュベートした混合物を含む、９６穴マイクロタイタープレートに播種された。９６時間のトランスフェクション後、細胞増殖への影響はＡｌａｍａｒＢｌｕｅ染色によって測定した。

ウェスタンブロッティング：インビトロでの細胞培養液のウエスタンブロットのために、付着細胞を氷冷した１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＲＩＰＡバッファー（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ホルトプロテアーゼ阻害剤、及びホルトホスファターゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解した。溶解液を回収し、ホモジナイズし、１０分間遠心分離することによって明らかにした。マウスの主腫瘍溶解物は、上記のようにＰＢＳ洗浄せずに、調製した。上清タンパク質は、４から１２％のＮｕＰＡＧＥＮｏｖｅｘビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分画した。ブロッティングは、製造業者の仕様に従ってｉＢｌｏｔドライブロッティングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ニトロセルロース膜のブロッキングと抗体染色は、製造者の指示に従って、オデッセイウエスタンブロット分析と赤外線撮像システム（ＬＩ−ＣＯＲＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。ブロットはオデッセイスキャナー（ＬＩ−ＣＯＲＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で可視化した。

抗体：以下の一次抗体をウェスタンブロッティング実験に使用した：抗アクチン（６１２６５６、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＧＡＰＤＨ（ｓｃ−２５７７８，ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＥＧＦ受容体（２２３２，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ノイ（ｓｃ−２８４，ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＥｒｂＢ３（ｓｃ−２８５，ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホＨＥＲ３（４７９１，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＥｒｂＢ４（ｓｃ−２８３，ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホＨＥＲ４（４７５７，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ａｋｔ（４６９１，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホＡｋｔ（４０５８，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、Ｓｔａｔ／ホスホＳｔａｔ抗体サンプラーキット（９９３９／９９１４，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＭＥＫ１／２（９１２６，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ホスホ−ＭＥＫ１／２（２３３８，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ＬＩ−ＣｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの次の二次抗体を使用した：ＩＲＤｙｅ６８０結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ。

実施例２：残存する病変と再発の研究のためのインビボモデルの最適化
化学療法に応答して著しい回帰を示し、その後治療の中止後に腫瘍の再発が起きる幾つかの癌のモデルが作成され、腫瘍再発生に関与する細胞の研究に用いられた。これらの細胞は、腫瘍再発生細胞（ＴＲＩＣ）である。モデルを作成するために、ＧＦＰ標識ヒト腫瘍細胞が皮下移植され、それぞれのモデルに示すように、腫瘍の大きさが約２００立方ミリメートルに達したときに、マウスをビヒクル又は化学療法のいずれかで処置した。ＧＦＰ＋腫瘍細胞が、酵素消化と解離後に、ＦＡＣＳソーティングによって退行腫瘍又はビヒクル処置腫瘍から単離した。腫瘍は、化学療法の最終投与後、腫瘍増殖の再開前の最低１週間収集した。

ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の細胞株Ｃａｌｕ３とＨ４４１のＧＦＰを発現する亜系統を、異種移植モデルを生成するために胸腺ヌードマウスに移植した。Ｃａｌｕ３モデルについて、化学療法は、パクリタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与、５用量を隔日）及びシスプラチン（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与、２用量を７日ごと）で構成された。図２Ａ（平均腫瘍体積±ＳＥＭ、ｎ＝１５／群として提示されたデータ）。Ｈ４４１モデルについて、化学療法は、パクリタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与、５用量を隔日）及びシスプラチン（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与、２用量を１４日ごと）から成る。図２Ｂ（平均腫瘍体積±ＳＥＭとして提示されたデータ；ビヒクル処置についてｎ＝９／群、化学療法処置についてはｎ＝１４／群）。

ＧＦＰを発現するヒト乳癌細胞株ＫＰＬ４の亜系統が、ＳＣＩＤ／ｂｅｉｚマウスの乳腺脂肪パッドに同所性に移植された。ＫＰＬ４モデルについて、化学療法は、パクリタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与、５用量を隔日）から成る。図２Ｃ（平均腫瘍体積±ＳＥＭ、ｎ＝１２マウス／群として提示されたデータ）。

化学療法レジメンの完了後、化学療法で処置したマウスの腫瘍は、ビヒクルで処置したマウスよりも有意に小さかった。退行は、化学療法の最終投与後数週間持続したが、その後に腫瘍が再発した。図２ＡーＣ。

また、非小細胞肺癌のＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄ遺伝子改変マウスモデル (Jackson et al., 2001)が、Ｚ／ＥＧのＣｒｅ−レポーター株(Novak et al., 2000)と交配され、本研究で使用した。シスプラチン（７ｍｇ／ｋｇを腹腔内、３用量を７日ごと）が、肺のＡｄｅｎｏＣｒｅ感染（すなわち腫瘍発生）後１２週間で開始された。肺が化学療法の最終投与後１週間で回収され、腫瘍細胞は酵素消化と解離後にＦＡＣＳによって単離された。シスプラチンの最終投与後１週間で肺に存在するＧＦＰ陽性腫瘍細胞のＦＡＣＳ分析は、ビヒクルのコントロールと比較してシスプラチンを投与したマウスにおける腫瘍細胞数の有意な減少を明らかにした。図２Ｄ（データは肺あたりのＧＦＰ陽性細胞数の平均値±ＳＥＭ、ｎ＝６／群として提示される）。従って、ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄマウスのシスプラチン処置は、腫瘍量を大幅に減少させたが、生存期間の延長をもたらさず、腫瘍が治療後に再発することを示している(Oliver et al., 2010)。

上記モデルの各々は、化学療法に応答したが、腫瘍は、ほぼ完全な切除にもかかわらず、治療後の様々な時期に再発した。腫瘍再増殖の発症前の化学療法を生き延びたＧＦＰ標識細胞は、ＴＲＩＣを含んでおり、更なる研究のために単離された。

実施例３ＴＲＩＣにおけるＮＲＧ１の濃縮
各モデルの所定の成長曲線に基づいて、退行またはビヒクルで処置した腫瘍は、最後の治療後１−３週間の間で、化学療法で処置した腫瘍の再増殖の発症前に採取された。腫瘍組織を酵素的に消化し、解離し、ＧＦＰ陽性腫瘍細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により単離した。

ビヒクル処置腫瘍細胞と残存腫瘍細胞の遺伝子発現プロファイルの違いを特徴付けるために、ＲＮＡを腫瘍細胞（ＰＩ⁻＆ＧＦＰ^＋）から単離し、発現プロファイリングを行った。Ｃａｌｕ３とＨ４４１両方のモデルのマイクロアレイ解析は、ＮＲＧ１発現がビヒクル処置腫瘍細胞に比べて、残存する化学療法処置された腫瘍細胞において有意に高かったことを明らかにした（図３Ａ−Ｂ）。残存する化学療法処置細胞の濃縮は、２つの独立したマイクロアレイのプローブを用いて決定された。Ｃａｌｕ３異種移植モデルについて、８．６倍濃縮（ｐ＝０．００３、ｑ＝０．００３）が、第一プローブを用いて測定され（図３Ａ、左のマイクロアレイパネル）、５．３倍濃縮（Ｐ＝０．００１、ｑ＝０．００２（ｎ＝８／群））が第二プローブを用いて測定された（図３Ａ、右マイクロアレイパネル）。Ｈ４４１異種移植モデルについて、４．９倍濃縮（ｐ＜０．００１、ｑ＝０．００９）が、第一プローブを用いて決定され（図３Ｂ、左のマイクロアレイパネル）、２．８倍濃縮（Ｐ＝０．００１、ｑ＝０．０１３（ｎ＝８／群））が第二プローブを用いて決定された（図３Ｂ、右マイクロアレイパネル）。

選択的スプライシングに起因する、ＮＲＧ１ａｌｐｈａ（ＮＲＧ１α）とＮＲＧ１ｂｅｔａ（ＮＲＧβ）と呼ばれる、受容体結合に必要とされるＮＲＧ１のＥＧＦ様ドメインの２つの活性なアイソフォームがある。我々は、ＮＲＧ１α及びＮＲＧ１βの濃縮を定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により確認した（図３ＡーＢ）。Ｃａｌｕ３異種移植モデルについて、独立した腫瘍サンプルを用いて、ＮＲＧ１αの発現が４．７倍濃縮され（ｐ＝０．０２）（図３Ａ、左のｑＰＣＲのパネル）、ＮＲＧ１βが３．４倍濃縮された（ｐ＝０．０４）（図３Ａ、右のｑＰＣＲパネル）（ｎ＝６／群）。Ｈ４４１異種移植モデルについて、マイクロアレイ解析と同じ腫瘍サンプルを用いて、ＮＲＧ１αが１１．４倍濃縮され（図３Ｂ、左のｑＰＣＲのパネル）、ＮＲＧ１βが１２．１倍濃縮された（図３Ｂ、右のｑＰＣＲパネル）。

ＮＲＧ１のｍＲＮＡはＫＰＬ４乳癌異種移植モデルからのＴＲＩＣに富んでいる。濃縮は、２つの独立したマイクロアレイプローブを用いて決定した（図３Ｃ）。

ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄモデルでは、ＮＲＧ１の発現は、マイクロアレイに基づくバルクビヒクルで処置した腫瘍細胞に比して残存する化学療法処置された腫瘍細胞において有意に高かった。１３．７倍濃縮（ｐ＜０．００１、ｑ＝１）（ｎ＝６／群）がマイクロアレイ解析を用いて決定された（図３Ｄ、マイクロアレイパネル）。濃縮は独立したサンプルについて、ｑＰＣＲで検証され、９倍濃縮を示した（ｐ＝０．０４）（図３Ｄ、ｑＰＣＲのパネル）。

ＮＲＧ１は、Ｃａｌｕ３、Ｈ４４１およびＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄの全３モデルにおいて、残存する処置細胞中に著しく富む少数の遺伝子の一つであった。興味深いことに、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体の発現はどちらも、全モデルにおいて一貫して高められてはいなかった。

ＮＲＧ１受容体、ＨＥＲ３、の活性化は、ホスホＨＥＲ３について腫瘍の免疫染色によってアクセスされた。残存腫瘍における腫瘍細胞の大多数は、ｐ−ＨＥＲ３陽性であったが、ビヒクル処置した腫瘍は、ｐ−ＨＥＲ３陽性細胞の散在クラスターのみを示した。他のＨＥＲ３リガンド、ＮＲＧ２の発現は、残存腫瘍細胞内は見いだされなかった。従って、残存腫瘍細胞はＮＲＧ１を発現し、受容体の活性化の増大を示し、ＮＲＧ１自己分泌活性を増大することが実証された。

実施例４−ＮＲＧ１発現の調節
残存腫瘍細胞で観察されるＮＲＧ１の発現の増加は、原発腫瘍に存在する細胞のＮＲＧ１発現亜集団の濃縮から生じる可能性がある。あるいは、化学療法は、細胞毒性効果にその後耐性がある細胞でＮＲＧ１発現を誘導する可能性があり、または発現レベルが、腫瘍の大きさや増殖速度に影響される可能性がある。これらの可能性を区別するために、ＮＲＧ１発現レベルが、化学療法の後にｑＰＣＲによって、異なる体積の腫瘍で様々な時点で評価された。ＮＲＧ１のｍＲＮＡレベルは、化学療法（シスプラチン＋パクリタキセル）の単回投与の後には増加しなかった。実際には、残存腫瘍を除いて、ＮＲＧ１レベルは試験された全ての時間と体積において同等であった。これらの結果は、ＮＲＧ１の発現が化学療法によって誘発されないか、または腫瘍の大きさに影響されないことを示しており、ＮＲＧ１発現細胞の既存の亜集団の濃縮と一致している。

実施例５−ＮＳＣＬＣにおける自己分泌ＮＲＧ１−ＨＥＲシグナル伝達
リガンドとその受容体の両方を共発現するモデルを同定するために、親のＣａｌｕ３細胞とＨ４４１細胞並びに更なるヒトＮＳＣＬＣ細胞株のパネルにおいて、ＮＲＧ１とその受容体の発現を調べた。ＮＲＧ１αとＮＲＧ１βの転写産物の発現レベルは細胞株間で異質であったが、それらは正常な肺と比較した場合、細胞株の大半ではるかに高かった。驚いたことに、Ｈ４４１細胞では、ＮＲＧ１転写物は、細胞がインビボで腫瘍として増殖されたときだけ存在していた。培養されたＨ４４１細胞は、検出可能なＮＲＧ１α又はＮＲＧ１β転写産物を発現せず、インビトロ及びインビボで増殖した細胞の特性の違いを強調している。４つのＨＥＲ受容体のウェスタン分析は、６つのヒトＮＳＣＬＣ株のなかで異種発現を明らかにした。Ｃａｌｕ３は、他の細胞株に比して４つの受容体全てにおいて、インビトロ発現の最高レベルを持っていた。

ＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達の可能性のある下流メディエーターを評価するために、ＮＲＧ１（ｓｈＮＲＧ１）にドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡ (Gray et al., 2007) を運ぶＣａｌｕ３、Ｈ４４１及びＨ１２９９親細胞株の安定した亜系統、及び恒常的に発現されるｄｓＲＥＤレポーター遺伝子が生成された。ＮＲＧ１遺伝子は複数のプロモーターを含有し、少なくとも１５の異なるアイソフォームを生じる大規模な選択的スプライシングを受ける。全ての活性なアイソフォームは、ＲＴＫの活性化のために必要かつ十分であるＥＧＦ様ドメインを含んでいる(Holmes et al., 1992; Yarden and Peles, 1991)。ｓｈＮＲＧ１は、すべての可能なアイソタイプのノックダウンを可能にするために、共通のＥＧＦ様ドメインを標的とした。ドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡを持つルシフェラーゼ（ｓｈＬｕｃ）に適合した安定な細胞株が、コントロールとして生成された。ＮＲＧ１αとＮＲＧ１βの転写物の効果的かつ特異的な減少（〜９０％）は、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）の存在下で培養した場合に、Ｃａｌｕ３−ｓｈＮＲＧ１細胞内でのみであった。ｄｏｘの存在下で培養した血清飢餓Ｃａｌｕ３−ｓｈＮＲＧ１細胞において、関連するｐ−ＨＥＲ３レベル、ｐ−ＡＫＴレベルの減少、及びｐ−ＨＥＲ４のわずかな減少が測定された。これらの溶解物におけるｐ−Ｓｔａｔ３またはｐ−Ｍｅｋ１／２のレベルにおいて検出可能な変化は認められなかった。

Ｈ４４１細胞はインビトロで任意ＮＲＧ１転写物を発現していなかったので、これらの細胞内のＮＲＧ１シグナル伝達のメディエーターは、外因性ＮＲＧ１リガンドで刺激することによって評価した。血清飢餓細胞のＮＲＧ１刺激により、ｐ−ＨＥＲ３及びｐ−ＡＫＴの増加があった。ｐ−Ｓｔａｔ３またはｐ−Ｍｅｋ１／２のレベルにおいて検出可能な変化は認められなかった。

ＮＲＧ１エフェクター経路もまたマウス肺癌細胞で評価した。二つの独立した細胞株、ＬＫＰＨ１及びＬＫＰＨ２は、ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄ肺腫瘍；ｐ５３^Ｆｌ／＋肺腫瘍から由来し、総称してＬＫＰＨ株と称された（実施例１を参照）。ｄｏｘ誘導性ｓｈＮｒｇ１またはｓｈＬｕｃを運搬する安定した亜系統が生成された。ＮＲＧ１転写物の減少は、ｄｏｘの存在下でＬＫＰＨｓｈＮｒｇ１細胞株においてのみ見られた。さらに、ｄｏｘの存在下で培養した血清飢餓ＬＫＰＨ−ｓｈＮＲＧ１細胞におけるｐ−ＨＥＲ３およびｐ−ＡＫＴのレベルの低下があった。ＮＲＧ１のｍＲＮＡを欠いた培養液におけるｐ−Ｍｅｋ１／２及びｐ−Ｓｔａｔ３のレベルの変化は、ウェスタンブロットで検出可能ではなく、これらのエフェクター経路はＮｒｇ１により係合されていなかったことを示唆している。

共に、Ｈ４４１細胞のＮＲＧ１刺激とＣａｌｕ３及びＬＫＰＨ１／２細胞におけるＮＲＧ１ノックダウンからのデータは、ＰＩ３Ｋ経路がＮＳＣＬＣ細胞内のＮＲＧ１シグナル伝達の主要な下流エフェクターであることを示唆している。ヒトとマウスのＮＳＣＬＣモデルの両方におけるＮＲＧ１転写産物とＨＥＲ受容体の発現の増大、及びＮＲＧ１ノックダウン時に培養された腫瘍細胞におけるＨＥＲ３シグナル伝達の活性の減少は、ＮＳＣＬＣにおける自己分泌性ＮＲＧ１−ＨＥＲ３シグナル伝達のループがあることを示唆している。加えて、残存腫瘍細胞におけるその発現の増大は（図３）、ＮＲＧ１自己分泌性シグナル伝達が、化学療法抵抗性及び／又は疾患の再発において役割を果たし得ることを示唆している。

実施例６−ＮＲＧ１ノックダウンは化学療法後の腫瘍の再発を遅延する
化学療法後の原発腫瘍の増殖や再発におけるＮＲＧ１ノックダウンの影響を、ＮＲＧ１ノックダウン単独または化学療法との併用での影響を評価することにより決定した。ＨＥＲファミリー受容体の異なる発現パターンを示す３つのヒトＮＳＣＬＣのモデルが、この研究で用いられた。Ｃａｌｕ３モデルは、すべての受容体の高タンパク質レベルを有し、Ｈ４４１は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の強い発現、及びＨＥＲ１の中程度の発現を示し、Ｈ１２９９は、ＨＥＲ１、Ｈｅｒ２及びＨｅｒ３の中程度の発現レベルを示している。

Ｃａｌｕ３モデルにおけるＮＲＧ１ターゲティングの有効性を決定するためにＣａｌｕ３−ｓｈＮＲＧ１の瘍を有するマウスが４つのグループに割り当てられた；１）ビヒクル＋スクロース、２）ビヒクル＋ｄｏｘ、３）化学療法＋スクロース、及び４）化学療法＋ｄｏｘ。上記の実施例２に記載したのと同じ化学療法レジメンを用いて、５％スクロースまたはｄｏｘ（２ｇ／Ｌ）が適宜飲料水中に経口投与された。腫瘍体積を研究期間中週２回測定した。腫瘍増殖曲線が本研究で使用した個々のマウスについて作成され（ビヒクル＋スクロースについてｎ＝１２匹のマウス、ビヒクル＋ｄｏｘについてｎ＝１３匹のマウス）、図５Ａ及び５Ｂの自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍堆積の適合を生成した線形混合効果（ＬＭＥ）として提示される。ビヒクル＋ｄｏｘ群（２倍になる時間（ＴＤＴ）＝４４．５日）対ビヒクル＋スクロース（ＴＤＴ＝１７日）において、腫瘍体積倍加時間の大幅な遅延が発生し、ＮＲＧ１ノックダウンは部分的に腫瘍の成長を阻害することを示唆している（図５Ａ）。

腫瘍の再発におけるＮＲＧ１の影響を、化学療法＋ｄｏｘ群と化学療法＋スクロース群における腫瘍の増殖とを比較することで評価した。化学療法＋スクロース（ＴＤＴ＝１２４日）に対して化学療法＋ｄｏｘ群（ＴＤＴ＞１８１日、研究の終了までに到達しなかった）において腫瘍再発に著しい遅延があった（図５Ｂ）。更に、化学療法によるかよらないかに関わらず、ｄｏｘで処置されたマウスからの再発腫瘍の多くは、生存可能な腫瘍組織はごくわずかな領域であって主に茶色／黒の粘液状の液体で構成されていた。したがって、測定された体積はｄｏｘ処置群における実際の腫瘍体積よりもかなり大きかった。Ｃａｌｕ３−ｓｈＬｕｃコントロール研究のグループのいずれの間にも違いは観察されなかった。更に、化学療法の最終投与３日後のＣａｌｕ３腫瘍において、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）が増殖マーカーＫｉ６７について行なわれた。化学療法＋スクロース腫瘍と比較して、化学療法＋ｄｏｘ処理腫瘍におけるＫｉ６７陽性細胞の割合が著しく低く、ＮＲＧ１シグナル伝達が化学療法後の残存腫瘍細胞の増殖を刺激することを示唆している。

初期および後期の時点で収集された腫瘍細胞におけるＮＲＧ１αとＮＲＧ１βアイソフォームのｍＲＮＡレベルが測定された。ＮＲＧ１転写物は後期の時点で増加し、ノックダウンがインビボで維持されていないことを示している。

Ｈ４４１異種移植モデルにおいて、ＮＲＧ１ノックダウンの影響も調べられた。原発腫瘍増殖において最小限度の影響であったが（自動決定されたノットによるキュービックスプラインとしてグラフ化された腫瘍体積のＬＭＥ適合解析として示された図６Ａ（ｎ＝１２／群）の腫瘍増殖曲線）、化学療法＋スクロース（ＴＤＴ＝９４日）に対して、化学療法＋ｄｏｘ群（ＴＤＴ＞１５０日、研究の終了までに到達せず）における腫瘍の再発に著しい遅延があった（図６Ｂ）。インビボ研究でＨ４４１−ｓｈＬｕｃの腫瘍体積にはそのような差は認められなかった。Ｃａｌｕ３異種移植モデルと同様に、Ｈ４４１モデルはまた、後半の時点でＮＲＧ１転写産物のレベルを増加を示した。

ＮＲＧ１レベルの回復の背後にあるメカニズムを調べるために、腫瘍細胞をレンチウイルスで形質導入した遺伝子の発現について分析した。ｓｈＲＮＡで細胞を形質導入するために使用されるレンチウイルスはまた、ｄｓＲｅｄマーカー遺伝子を含んでいるので、初期および後期の時点でのｄｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞の割合が、フローサイトメトリーによって比較された。レンチウイルス遺伝子発現のインビボでの損失が、早期（５日）及び後期の時点（＞１００日）での腫瘍について、レンチウイルスのｄｓＲｅｄ導入遺伝子を発現する腫瘍細胞（ヒト特異的ＥＳＡ陽性）の割合を調べるＦＡＣＳ解析により評価された。初期の時点でマウスはスクロース又はｄｏｘを投与され、後期の時点でマウスは化学療法＋スクロースまたは化学療法＋ｄｏｘを投与された。スクロースおよびｄｏｘで処置した腫瘍の両方において、後期の時点でのｄｓＲｅｄ陽性細胞の割合が有意な減少が観察され、その減少はｄｏｘ処置腫瘍について著しく大きかった（１．８倍対４．１倍、ｐ＝０．００７）。これは、ウイルス導入遺伝子発現の損失が、ＮＲＧ１レベルの回復と相関していることを示唆している。

Ｃａｌｕ３及びＨ４４１両方の細胞がＨＥＲ３タンパク質レベルの増大を示しており、腫瘍再発におけるＮＲＧ１の役割が受容体の過剰発現を伴う腫瘍に特異的であるかどうかの質問を提起している。この問題に対処するために、ＨＥＲ３のはるかに低いレベルを持っているＨ１２９９異種移植モデルが用いられた。ＮＲＧ１単独のノックダウンは、Ｈ４４１モデルに類似して、原発腫瘍増殖へのわずかな影響があった。対照的に、Ｈ１２９９腫瘍の非常に高悪性な増殖にもかかわらず、ＮＲＧ１ノックダウンは化学療法への応答の増強をもたらし、化学療法＋スクロース（ＴＤＴ＝１１．５日）（ｎ＝１２／群）に対して化学療法＋ｄｏｘ群（ＴＤＴ＝３０．４５日）において腫瘍再発の有意な遅延を生じた。

更に、ＮＲＧ１に対して異なるｓｈＲＮＡを発現するＨ１２９９の安定な亜系統が生成され、ＮＲＧ１のｍＲＮＡレベルにおいてより穏やかな減少を生じた。Ｈ１２９９−ｓｈＮＲＧ１．２を用いたインビボ研究においても、ＮＲＧ１ノックダウン時の化学療法への応答の増強が示された。しかし、増殖阻害の程度は、このモデルではより小さく、ＮＲＧ１ノックダウンの小さな程度と一致している。インビトロ研究におけるＨ１２９９−ｓｈＬｕｃの化学療法を伴うか又は伴わないスクロース及びｄｏｃ処置群間の腫瘍体積において、差は認められなかった。

ｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンによるＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達の阻害は、原発腫瘍増殖に控えめから中程度の影響のみを与えたが、化学療法後の腫瘍再発の大幅な遅延を与えた。異種移植モデルにおいてＮＲＧ１の長期的なノックダウンを維持することができないにもかかわらず、我々は、ＮＲＧ１ノックダウンによって腫瘍再発の有意な遅延を観察した。これらの知見は、原発腫瘍の増殖を調節する鍵となる経路の違い、及び化学療法抵抗性、及び再発があることを示唆している。

実施例７−リガンドトラップを使用するＮＲＧ１シグナル伝達の阻害は腫瘍の再発を遅延する
ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３^Ｆｌ／＋マウスモデルにおける化学療法後に再発を促進する上でＮＲＧ１シグナル伝達の役割をテストするために、ＮＲＧ１を隔離し、インビボでの受容体へのその結合を防止するために、リガンド−トラップ・アプローチを採用した。マウスＩｇＧ２ＡのＦｃに融合したヒトＨＥＲ４細胞外ドメインの融合（ＨＥＲ４−ＥＣＤ）が生成された。ＨＥＲ４はＮＲＧ１の高親和性結合を示している(Tzahar et al., 1994)。ＨＥＲ４−ＥＣＤが、インビトロで血清飢餓ＬＫＰＨ１とＬＫＰＨ２細胞に添加した場合、ＮＲＧ１／ＨＥＲ３シグナル伝達の阻害は、減少したＰ−ＨＥＲ３レベルにより示されるように観察された。したがって、インビトロで、分子は、自己分泌媒介ＮＲＧ１シグナル伝達を妨害するにおいて期待されるように振る舞った。

肺腫瘍を有するＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３^Ｆｌ／＋マウスは、研究の開始時（０日目）にＸ線マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）により撮像され、等しい開始腫瘍量の三つのグループに分けて、次のように扱われた：１）ＰＢＳ＋コントロールのＩｇＧ２Ａ、２）シスプラチン＋コントロールのＩｇＧ２Ａ、及び３）シスプラチン＋ＨＥＲ４−ＥＣＤ。マウスは、腫瘍量の変化を測定するために、縦のマイクロＣＴスキャンを受けた。平均腫瘍量の分析（図８Ａ（グラフは、平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭ、ブタクサ、コントロールマウスＩｇＧ２ａ抗体を表わす））、および腫瘍増殖率（（図８Ｂ（グラフは９５％信頼区間を用いた治療レジメンによる腫瘍量におけるで毎日の倍率変化を示す））は、シスプラチン単独でなくシスプラチン＋ＨＥＲ４−ＥＣＤの併用のみで、腫瘍増殖の有意な阻害をもたらしたことが明らかになった。シスプラチンを投与したマウスでは、化学療法後の最初のマイクロＣＴスキャンで腫瘍増殖の静止状態を示したが、研究の終了時の平均収容量と全体的な腫瘍増殖速度は、ビヒクルおよびシスプラチン処置群との間に有意差は認められなかった（図８ＡーＢ）。

第二の研究が、上記のように、ＬＳＬ−Ｋ−ｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３^{Ｆｌ／Ｆｌ}マウスで実施された。しかし、この研究では、上記のグループに加えてＨＥＲ４−ＥＣＤ単剤群が含まれた。２８日目のマイクロＣＴによる腫瘍量の分析は、シスプラチン＋ビヒクル処置したマウスおよび他のすべてのグループに比べて、シスプラチン＋ＨＥＲ４−ＥＣＤで処置したマウスにおける腫瘍量の有意な減少を明らかにした。これとは対照的に、腫瘍増殖においてＨＥＲ４−ＥＣＤ処置単独では効果が無く、化学療法及び／又は腫瘍の再増殖におけるＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達の固有の役割を更に支持している。この研究では、ＬＳＬ−Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；ｐ５３^{Ｆｌ／Ｆｌ}マウスが、ビヒクル＋コントロールＩｇＧ（ｎ＝１０）で、シスプラチン＋コントロールＩｇＧ（ｎ＝１１）と、シスプラチン＋ＨＥＲ４−ＥＣＤ（ｎ＝８）又はビヒクル＋ＨＥＲ４−ＥＣＤ（ｎ＝７）で処置された。図８Ｃ中のグラフは、ベースライン±ＳＥＭからの腫瘍量の平均変更率を表している。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定が、ビヒクルコントロールの^＊＊ｐ＝０．００１６に対して処置群のすべてを比較するために利用された。組合せ活性は、その単独療法^＊ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１に対して対応のないｔ−検定を用いて評価した。

実施例８−ＮＳＣＬＣにおけるＮＲＧ１受容体
どのＨＥＲ受容体が、ＮＳＣＬＣのＮＲＧ１自己分泌性シグナル伝達で使用されているかを理解するために、我々はＨＥＲ３及びＨＥＲ４のノックダウンの影響を評価した。Ｃａｌｕ３ＮＳＣＬＣモデルは、他の細胞株と比較して、すべてのＨＥＲファミリー受容体を高レベルで発現した。安定したｄｏｘ誘導性ｓｈＨＥＲ３（Ｃａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ３）とｓｈＨＥＲ４（Ｃａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ４）Ｃａｌｕ３細胞亜系統、並びにルシフェラーゼにｄｏｘ誘導性ｓｈＲＮＡを運ぶコントロール細胞株が生成された。ｑＰＣＲのによって測定されるようにＨＥＲ３およびＨＥＲ４転写レベルは、ｄｏｘ（２μｇ／ｍｌの）の存在下でＣａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ３とＣａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ４のそれぞれにおいて減少し、ウェスタンブロット法による測定でタンパク質量の減少をもたらした。興味深いことには、ｄｏｘの存在下でＣａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ３で観察されたｐ−ＡＫＴのダウンレギュレーションの程度はＣａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ４に見られるはるかに大きく、ＨＥＲ３がＣａｌｕ３モデルでＮＲＧ１自己分泌シグナル伝達を仲介する優勢な受容体であることを示唆している。

インビボでこの役割を確かめるために、スクロース又はｄｏｘの何れかで処置されたＣａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ４異種移植モデルを用いた研究が実施された。Ｃａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ３またはＣａｌｕ３−ｓｈＨｅｒ４異種移植腫瘍が樹立されたマウスは、それらの飲料水中に、適宜、ビヒクル（スクロース）又はｄｏｘ（２ｍｇ／Ｌ）が投与された（ｎ＝１４／群）。ｄｏｘの処置を受けたマウス（ＴＤＴ＝１９日）で、スクロース処置を受けたもの（ＴＤＴ＝１１日）に比べて、Ｃａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ３腫瘍成長の実質的な阻害があった。しかし、インビボ研究において、Ｃａｌｕ３−ｓｈＨＥＲ４における腫瘍増殖の顕著な阻害は無かった。

インビトロでの受容体解析及びインビボ研究は、高いＨＥＲ４レベルにもかかわらず、ＮＲＧ１自己分泌性シグナリングは、このモデルで主にＨＥＲ３を通して起こることを示している。

ＮＲＧ１自己分泌性シグナル伝達は、ＨＥＲ４高レベルを発現するかＨＥＲ３を検出できないＨ５２２ヒトＮＳＣＬＣ細胞株において評価された。Ｈ５２２−ｓｈＮＲＧ１亜系統が生成された。血清飢餓Ｈ５２２−ｓｈＮＲＧ１細胞へのｄｏｘの投与は、ホスホ−ＨＥＲ４およびホスホ−Ｓ６のレベルの低下をもたらす。差はＨ５２２−ｓｈＬｕｃコントロール細胞では観察されず、ｓｉＲＮＡを介したニノックダウンが各ＨＥＲファミリーの必要性を試験するために用いられた。ＨＥＲ４のノックダウンのみで、細胞増殖の減少を生じ、他のＨＥＲファミリー受容体では無かった。これらのデータはＮＲＧ１自己分泌性シグナル伝達は、Ｈ５２２細胞におけるＨＥＲ４を通して起こることを示唆している。従って、ＮＳＣＬＣにおけるＮＲＧ１自己分泌性シグナル伝達はＨＥＲ３およびＨＥＲ４両方によって媒介され得る。

前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。

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Claims

ニューレグリン１（ＮＲＧ１）アンタゴニストを含む、癌患者の腫瘍再発までの時間を増やすための剤であって、該剤は化学療法剤と組み合わせて投与され、該化学療法剤がパクリタキセル又はシスプラチン、又はパクリタキセルとシスプラチンの組み合わせであり、ＮＲＧ１アンタゴニストがＮＲＧ１に結合する抗ＮＲＧ１抗体、ＲＮＡ、又はＮＲＧ１受容体分子であり、ここでＮＲＧ１受容体分子がイムノアドヘシンである、剤。
癌が非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頸部癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、前立腺癌、及び大腸癌からなる群から選択される、請求項１に記載の剤。
ＲＮＡが、アンチセンスＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はＲＮＡアプタマーである、請求項１又は２に記載の剤。