ES2394630T3 - Método de determinación de la expresión génica del receptor del factor de crecimiento epidérmico y HER2-NEU y niveles de correlación de la misma con las tasas de supervivencia - Google Patents

Abstract

Método para determinar el nivel de expresión de EGFR en una muestra de tejido fijada incrustada en parafina,pudiéndose usar dicho método para determinar un régimen quimioterápico que comprende:(a) desparafinizar la muestra de tejido para obtener una muestra desparafinizada;(b) aislar ARNm de la muestra desparafinizada mediante calentamiento en presencia de una cantidad eficaz de unagente caotrópico hasta una temperatura en el intervalo de 75 a aproximadamente 100ºC durante un periodo detiempo de aproximadamente a aproximadamente 120 minutos y recuperación de dicho ARNm de la disolucióncaotrópica;(c) someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores oligonucleotídicos que consiste en un cebadoroligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 o una secuencia al menos el 80% idéntica a la misma,y un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:2 o una secuencia al menos el 80% idénticaa la misma para obtener una muestra amplificada; y(d) determinar la cantidad de ARNm de EGFR en relación con la cantidad de ARNm de un gen de control interno.

Description

Método de determinación de la expresión génica del receptor del factor de crecimiento epidérmico y her2-neu y niveles de correlación de la misma con las tasas de supervivencia

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos de pronóstico que son útiles en medicina, particularmente en quimioterapia del cáncer. Más particularmente, la invención se refiere a la evaluación de la capacidad de supervivencia de un paciente en el que se analiza la expresión génica de células tumorales. Adicionalmente, se somete a ensayo la sensibilidad de células tumorales a un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa examinando la expresión de ARNm

10 de los genes de EGFR y Her2-neu en seres humanos.

Antecedentes de la invención

El cáncer de pulmón es la principal causa de muertes relacionadas con cáncer entre tanto hombres como mujeres en países occidentales. En los Estados Unidos, se diagnostican aproximadamente 171.000 nuevos casos de cáncer de pulmón y 160.000 individuos mueren de esta enfermedad cada año. A pesar de las mejoras en la detección y el trata15 miento del cáncer de pulmón en las últimas dos décadas, la supervivencia a 5 años global sigue siendo inferior al 15%. Ginsberg, et al., en: DeVita, et al., Cancer. Principles in Practice of Oncology, ed. 5, págs. 858-910. Filadelfia: Lipincott-Raven Publishers, 1997. Para mejorar adicionalmente la tasa de supervivencia en pacientes con carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), su clasificación de pronóstico basado en alteraciones moleculares es crucial. Tal clasificación proporcionará herramientas de diagnóstico más exactas y útiles y, finalmente, opciones terapéuticas más efi

20 caces.

El cáncer surge cuando una célula normal experimenta transformación neoplásica y se convierte en una célula maligna. Las células transformadas (malignas) escapan de los controles fisiológicos normales que especifican el fenotipo celular y restringen la proliferación celular. Por tanto, las células transformadas en el cuerpo de un individuo proliferan, formando un tumor. Cuando se encuentra un tumor, el objetivo clínico es destruir las células malignas selectivamente mientras

25 que se mitiga cualquier daño provocado a células normales en el individuo que se somete a tratamiento.

La quimioterapia se basa en el uso de fármacos que son selectivamente tóxicos (citotóxicos) para células cancerosas. Se han desarrollado varias clases generales de fármacos quimioterápicos, incluyendo fármacos que interfieren con la síntesis de ácido nucleico, la síntesis de proteínas y otros procesos metabólicos vitales. Estos se denominan generalmente fármacos antimetabolitos. Otras clases de fármacos quimioterápicos infligen daño sobre el ADN celular. Los

30 fármacos de estas clases se denominan generalmente genotóxicos. Adicionalmente, una clase de agentes quimioterápicos inhiben específicamente la señalización mitogénica a través de receptores tirosina cinasa (RTK), en células en las que los RTK están sobreactivados. (Drugs of the Future, 1992, 17, 119).

La susceptibilidad de un neoplasma individual a un fármaco quimioterápico deseado o una combinación de fármacos, sin embargo, puede evaluarse de manera exacta sólo tras un periodo de tratamiento de ensayo. El tiempo invertido en 35 un periodo de ensayo insatisfactorio representa un riesgo significativo en el manejo clínico de tumores malignos agresivos. Por tanto, es de importancia evaluar el estado de expresión de determinantes genéticos seleccionados como diana por agentes quimioterápicos específicos. Por ejemplo, si un tumor expresa altos niveles de genes de reparación del ADN, es probable que el tumor no responda bien a dosis bajas de agentes genotóxicos que dañan el ADN. Por tanto, el estado de expresión de determinantes genéticos de un tumor ayudará al médico a desarrollar un régimen quimioterápico

40 apropiado específico para el repertorio genético del tumor.

Los receptores tirosina cinasa (RTK) son importantes en la transducción de señales mitogénicas. Los RTK son proteínas grandes que abarcan la membrana que tienen un dominio de unión a ligando extracelular para factores de crecimiento tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF) y una parte intracelular que funciona como cinasa para fosforilar residuos de aminoácido tirosina en proteínas del citosol mediando de ese modo la proliferación celular. Se conocen diver

45 sas clases de receptores tirosina cinasa basándose en las familias de factores de crecimiento que se unen a diferentes receptores tirosina cinasa. (Wilks, Advances in Cancer Research, 1993, 60, 43-73)

Las cinasas de clase I tales como la familia EGF-R de receptores tirosina cinasa incluyen los receptores de EGF, HER2neu, erbB, Xmrk, DER y let23. Estos receptores están presentes frecuentemente en cánceres humanos comunes tales como cáncer de mama (Sainsbury et al., Brit. J. Cancer, 1988, 58, 458; Guerin et al., Oncogene Res., 1988, 3, 21), 50 cáncer de células escamosas del pulmón (Hendler et al., Cancer Cells, 1989, 7, 347), cáncer de vejiga (Neal et al., Lancet, 1985, 366), cáncer de esófago (Mukaida et al, Cancer, 1991, 68, 142), cáncer gastrointestinal tal como cáncer de colon, rectal o de estómago (Bolen et al., Oncogene Res., 1987, 1, 149), leucemia (Konaka et al., Cell, 1984,37, 1035) y cáncer de ovarios, bronquial o pancreático (memoria descriptiva de la patente europea n.º 0400586). A medida que se someten a prueba tejidos tumorales humanos adicionales para detectar la familia de EGF de receptores tirosina cinasa,

55 se espera que su prevalencia extendida se establezca en otros cánceres tales como cáncer de tiroides y uterino.

Específicamente, la actividad EGFR tirosina cinasa raramente se detecta en células normales, mientras que puede detectarse más frecuentemente en células malignas (Hunter, Cell, 1987, 50, 823). Se ha mostrado más recientemente que

EGFR se sobreexpresa en muchos cánceres humanos tales como tumores de cerebro, de células escamosas del pulmón, de vejiga, gástrico, de mama, de cabeza y cuello, esofágico, ginecológico y de tiroides. (W J Gullick, Brit. Med. Bull., 1991, 47, 87). Los receptores tirosina cinasa también son importantes en otras enfermedades de proliferación celular tales como psoriasis. Los trastornos de EGFR son los caracterizados por expresión de EGFR por células que normalmente no expresan EGFR, o aumento de la activación de EGFR que conduce a proliferación celular no deseada, y/o la existencia de niveles de EGFR inapropiados. Se sabe que el EGFR se activa mediante su ligando EGF así como factor de crecimiento transformante-alfa (TGF-a).

La proteína Her2-neu es también un miembro de la familia de receptores tirosina cinasa (RTK) de clase I. Yarden y Ullrich, Annu. Rev. Biochem. 57:443, 1988; Ullrich y Schlessinger, Cell 61:203, 1990. La proteína Her2-neu está estructuralmente relacionada con EGFR. Carraway, et al., Cell 78:5, 1994; Carraway, et al., J. Biol. Chem. 269:14303, 1994. Estos receptores comparten una arquitectura molecular común y contienen dos regiones ricas en cisteína dentro de sus dominios citoplasmáticos y regiones enzimáticas estructuralmente relacionadas dentro de sus dominios citoplasmáticos.

Se cree que la activación dependiente de ligando de la proteína Her2-neu está mediada por el factor de activación de neu (NAF) que puede unirse directamente a p165(Her2-neu) y estimular la actividad enzimática. Dougall et al., Oncogene 9:2109, 1994; Samata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1711, 1994. La homodimerización independiente de ligando de la proteína Her2-neu y la activación del receptor resultante se ve facilitada por la sobreexpresión de la proteína Her2-neu. Un complejo de Her2-neu activado actúa como fosfocinasa y fosforila diferentes proteínas citoplasmáticas. Los trastornos de HER2-neu que se caracterizan por una actividad inapropiada o sobreactividad de HER2-neu tienen una expresión de HER2-neu aumentada que conduce a proliferación celular no deseada tal como cáncer.

Se emplean inhibidores de receptores tirosina cinasa EGFR y HER2-neu como inhibidores selectivos del crecimiento de células cancerosas de mamífero (Yaish et al. Science, 1988, 242, 933). Por ejemplo, la erbstatina, un inhibidor del receptor tirosina cinasa de EGF, redujo el crecimiento de células de carcinoma mamario humano que expresan EGFR inyectadas en ratones desnudos atímicos, aunque no tuvo efecto sobre el crecimiento de tumores que no expresaban EGFR (Toi et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 1990, 26, 722). También se establece que diversos derivados de estireno tienen propiedades inhibidoras de tirosina cinasas (solicitudes de patente europea n.os 0211363, 0304493 y 0322738) y que son de uso como agentes antitumorales. Dos derivados de estireno de este tipo son inhibidores de RTK de clase I cuya eficacia se ha demostrado al atenuar el crecimiento de carcinoma de células escamosas humano inyectado en ratones desnudos (Yoneda et al., Cancer Research, 1991, 51, 4430). También se sabe de las solicitudes de patente europea n.os 0520722 y 0566226 que determinados derivados de 4-anilinoquinazolina son útiles como inhibidores de receptores tirosina cinasa. Las relaciones de estructura-actividad muy estrechas mostradas por estos compuestos sugieren un modo de unión claramente definido, en el que el anillo de quinazolina se une en el bolsillo de adenina y el anillo de anilino se une en un bolsillo lipófilo único, adyacente. Se han evaluado clínicamente tres análogos de 4anilinoquinazolina (dos inhibidores reversibles y uno irreversible) como fármacos anticancerígenos. Denny, Farmaco enero-febrero de 2001; 56(1-2):51-6. Recientemente, la FDA de los EE.UU. aprobó el uso de anticuerpo monoclonal trastazumab (Herceptin®) para el tratamiento de cánceres de mama metastásicos que sobreexpresan HER2-neu. Scheurle, et al., Anticancer Res 20:2091-2096, 2000.

Debido a que una quimioterapia eficaz contra tumores requiere a menudo una combinación de agentes, la identificación y cuantificación de determinantes de resistencia o sensibilidad a cada fármaco individual se ha convertido en una importante herramienta para diseñar la quimioterapia de combinación individual. Diversos estudios han intentado insatisfactoriamente correlacionar de manera fiable los niveles relativos de expresión de EGFR y/o HER2-neu en células malignas de pacientes con cáncer con la capacidad de supervivencia.

La importancia para el pronóstico de EGFR en NSCLC sigue siendo controvertida hasta la fecha. Estudios usando ensayos de unión correlacionaron el aumento de la expresión de EGFR con NSCLC en estadio avanzado y supervivencia global acortada, mientras que estudios usando técnicas semicuantitativas para medir la expresión de proteína o ARNm de EGFR no pudieron mostrar una correlación constante con el desenlace clínico. Veale et al., Br. J. Caner 68:162-165, 1993; Fujino et al., Eur. Cancer 32:2070-2074, 1996; Rusch, et al., Cancer Res 53:2379-2385, 1993; Pfeiffer, et al., Br J Cancer 74:86-91, 1996; Pastorino, et al., J Clin Oncol 15:2858-2865, 1997. Estudios de expresión de EGFR en tumores de NSCLC usando métodos inmunohistoquímicos han mostrado frecuencias para la sobreexpresión de EGFR de entre el 32% y el 47% en tumores de NSCLC. Veale et al., Br. J. Caner 55:513-516, 1987; Veale et al., Br. J. Caner 68:162165, 1993; Fujino et al., Eur. Cancer 32:2070-2074, 1996; Rusch, et al., Cancer Res 53:2379-2385, 1993; Pastorino et al., J. Clin. Onc. 15:2858-2865, 1997; Tateishi, et al., Eur J Cancer 27:1372-75, 1991; Rachwal, et al., Br J Cancer 72:56-64, 1995; Rusch, et al., Cancer Res 15:2379-85, 1993; Pfeiffer, et al., Br J Cancer 78:96-9, 1998; Ohsaki, et al., Oncol Rep 7:603-7, 2000. Además, se han notificado diferencias significativas en la expresión de EGFR entre subtipos histológicos, generalmente con expresión de EGFR superior en SCC en comparación con AC y LC. Fujino et al., Eur. Cancer 32:2070-2074, 1996; Veale et al., Br. J. Caner 55:513-516, 1987; Pastorino et al., J. Clin. Onc. 15:2858-2865, 1997; Pfeiffer, et al., Br J Cancer 78:96-9, 1998; Ohsaki et al., Oncol. Rep. &:603-7, 2000. Sin embargo, estos estudios no notificaron ninguna correlación constante de la sobreexpresión de FGFR con la supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón.

Se hicieron observaciones de una supuesta correlación de la sobreexpresión de EGFR con una disminución de la supervivencia de los pacientes en algunos estudios no concluyentes. Veale et al., 1987; Ohsaki et al., 2000. Sin embargo, Veale et al. analizaron una población de sólo diecinueve pacientes con NSCLC. Ohsaki et al. correlacionaron la expresión de proteína EGFR con un mal pronóstico en pacientes con NSCLC con sobreexpresión de p53 (P=0,024).

Como con EGFR, la importancia para el pronóstico de HER2-neu en NSCLC sigue siendo controvertida hasta la fecha. Se ha demostrado la sobreexpresión de proteína HER2-neu en NSCLC, incluyendo carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de células grandes. Veale et al., 1987; Schneider, et al., Cancer Res 49:4968-4971, 1989; Kern et al., Cancer Res. 50:5184-5191, 1990; Weiner, et al., Cancer Res 50:421-425, 1990; Scheurle, et al., Anticancer Res. 20: 2091-2096, 2000. Estudios anteriores, usando ensayos de proteínas, notificaron una asociación de la sobreexpresión de proteína HER2-neu y una supervivencia global inferior en adenocarcinomas pulmonares (AC). Kern, et al., Cancer Res 50:5184-5191, 1990; Kern et al., J Clin Invest 93:516-20, 1994. Sin embargo, estudios contradictorios no notificaron ninguna correlación de la sobreexpresión de proteína HER2-neu con una supervivencia global inferior en adenocarcinomas pulmonares (AC). Pfeiffer et al., Br. J. Cancer 74:86-91, 1996.

Otra cuestión crítica es la evaluación de las interrelaciones entre la sobreexpresión conjunta de HER2-neu y EGFR como factores de pronóstico de cáncer. Tateishi et al., (Eur. J. Cancer 27:1372-75, 1991), midieron la coexpresión de proteína EGFR y HER2-neu, en el 13% de los AC analizados, y encontraron que la sobreexpresión conjunta de estos dos genes se correlacionaba con una supervivencia a 5 años inferior. Sin embargo, como con la sobreexpresión de HER2neu sola, no se ha notificado asociación entre la coexpresión de HER2-neu y EGFR y la supervivencia en carcinoma de células escamosas (SCC) y carcinoma de células grandes (LCC) del pulmón.

Metodologías inconstantes para la determinación de los niveles de expresión de EGFR y HER2-neu han estado en la raíz del problema en la determinación de hasta qué grado la expresión de estos genes puede usarse para pronosticar la capacidad de supervivencia de pacientes con cáncer. Hasta la fecha, las investigaciones de la expresión de HER2-neu y EGFR en NSCLC han dado como resultado enormes variaciones en las frecuencias de tumores de NSCLC con puntuación positiva para la expresión de tanto EGFR como HER2-neu. Se notificó sobreexpresión de HER2-neu, definida como tinción positiva para la proteína en adenocarcinomas (AC), en el 13-80%, en el 2-45% en carcinomas de células escamosas (SCC) y en el 0-20% en carcinomas de células grandes (LC) usando un tejido incrustado en parafina en portaobjetos para microscopio óptico y antisuero frente a HER2-neu. Pfeiffer et al., 1996; Kern et al., 1990; Kern et al., 1994; Tateishi et al., 1991; Shi, et al., Mol Carcing 5:213-8, 1992; Bongiorno, et al., J Thorac Cardiovasc Surg 107:590-5,1994; Harpole, et al., Clin Cancer Res 1:659-64, 1995; Volm et al., Anticancer Res 12:11-20,1992. Además, un reciente informe ilustra la no especificidad de los protocolos actuales diseñados para evaluar los niveles de expresión de HER2-neu. Se mostró que el HercepTest® para la medición de la expresión de HER2-neu en cánceres de mama invasivos tenía una falsa positividad muy alta. Jacobs et al., J Clin Oncol 17: 1983-1987, 1999.

Si existiese un método preciso, exacto y constante para determinar los niveles de expresión de EGFR y HER2-neu, podría determinarse qué niveles de expresión se correlacionan con la capacidad de supervivencia de los pacientes y si una quimioterapia dirigida a receptores tirosina cinasa es apropiada o no. Es deseable una demostración constante de la sobreexpresión de EGFR y/o HER2-neu en NSCLC, usando un método normalizado, en el establecimiento de ensayos clínicos para quimioterapias dirigidas a receptores tirosina cinasa actuales y futuras, por ejemplo, agentes quimioterápicos, fármacos a base de anticuerpos, para tratar cánceres que sobreexpresan estos receptores.

Los protocolos actuales para medir la expresión génica de EGFR y/o HER2-neu, además de ser insuficientemente exactos para el pronóstico del tumor, padecen una segunda limitación porque requieren una cantidad significativa de tejido fresco que contenga ARNm no degradado. La mayoría de las muestras patológicas derivadas de pacientes se fijan y se incrustan en parafina (FPE) rutinariamente para permitir su análisis histológico y su posterior almacenamiento en archivo. Por tanto, la mayoría de las muestras de tejido de biopsia no son útiles para el análisis de la expresión génica porque tales estudios requieren una alta integridad del ARN para que pueda hacerse una medición exacta de la expresión génica. Actualmente, los niveles de expresión génica pueden monitorizarse sólo cuantitativamente en tales muestras fijadas e incrustadas usando tinción inmunohistoquímica para monitorizar los niveles de expresión de proteína.

El uso de tejido congelado por profesionales sanitarios representa inconvenientes sustanciales. Una rápida entrega de la biopsia para evitar la degradación del tejido y el ARN posterior es el problema primario cuando se planea cualquier ensayo de marcadores genéticos cuantitativo basado en ARN. El profesional sanitario que realiza la biopsia debe entregar apresuradamente la muestra de tejido a una instalación equipada para realizar un protocolo de extracción de ARN inmediatamente tras la recepción de la muestra de tejido. Si no está disponible tal instalación, el médico debe congelar inmediatamente la muestra con el fin de prevenir la degradación del ARNm. Con el fin de que la instalación de diagnóstico realice un protocolo de extracción de ARN útil antes de la degradación del tejido y el ARN, la muestra de tejido debe permanecer congelada hasta que llegue a la instalación de diagnóstico, esté lo lejos que esté. El mantenimiento de la integridad del tejido congelado durante el transporte usando mensajeros especializados equipados con nitrógeno líquido y nieve carbónica se logra sólo con un gran gasto.

Las biopsias rutinarias comprenden generalmente una mezcla heterogénea de tejido estromal y tumoral. A diferencia del tejido fresco o congelado, las muestras de tejido de biopsias FPE se microdiseccionan y separan fácilmente en tejido estromal y tumoral y, por tanto, ofrecen una ventaja con respecto al uso de tejido fresco o congelado. Sin embargo, el aislamiento de ARN a partir de tejido fijado, y especialmente tejido fijado e incrustado en parafina, da como resultado ARN altamente degradado, que se cree generalmente que no puede aplicarse a estudios de expresión génica.

Existen varias técnicas para la purificación de ARN a partir de muestras biológicas, pero ninguna es fiable para el aislamiento de ARN a partir de muestras FPE. Por ejemplo, Chomczynski (patente estadounidense n.º 5.346.994) describe un método para purificar ARN a partir de tejidos basado en una separación en fase líquida usando fenol e isotiocianato de guanidina. Se homogeneiza una muestra biológica en una disolución acuosa de fenol e isotiocianato de guanidina y después de eso el homogenado se mezcla con cloroformo. Tras la centrifugación, el homogenado se separa en una fase orgánica, una interfase y una fase acuosa. Se secuestran las proteínas en la fase orgánica, el ADN en la interfase y el ARN en la fase acuosa. El ARN puede precipitarse de la fase acuosa. Desafortunadamente, este método no puede aplicarse a muestras de tejido fijadas e incrustadas en parafina (FPE).

Otras técnicas conocidas para aislar ARN utilizan normalmente o bien sales de guanidina o bien extracción con fenol, tal como se describe por ejemplo en Sambrook, J. et al., (1989) en las págs. 7.3-7.24, y en Ausubel, F. M. et al., (1994) en las págs. 4.0.3-4.4.7. Koopmans et al. describen métodos para aislar ARN a partir de una muestra de tejido incrustado en parafina que requieren mucho tiempo o que usan proteinasa K. De nuevo, ninguno de los métodos conocidos proporciona resultados cuantitativos reproducibles en el aislamiento de ARN a partir de muestras de tejido incrustadas en parafina.

Por tanto, se necesitan particularmente técnicas para el aislamiento de ARN a partir de tejidos incrustados en parafina para el estudio de la expresión génica en tejidos tumorales, puesto que los niveles de expresión de determinados receptores o enzimas pueden usarse entonces para determinar la probabilidad de éxito o conveniencia de un tratamiento particular.

Se notifica en el presente documento una asociación significativa entre altos niveles del ARNm de EGFR intratumoral y altos niveles del ARNm de HER2-neu intratumoral con una capacidad de supervivencia inferior. Por consiguiente, el objeto de la invención es proporcionar un método de cuantificación de ARNm de EGFR y/o HER2-neu a partir de tejido tumoral con el fin de proporcionar un pronóstico temprano para quimioterapias dirigidas a receptores tirosina cinasa. El objetivo de la invención es también proporcionar un método para evaluar los niveles de EGFR y/o HER2-neu en tejidos fijados e incrustados en parafina (FPE) y predecir la probable sensibilidad del tumor de un paciente al tratamiento con quimioterapia dirigida a receptores tirosina cinasa examinando la cantidad de ARNm de EGFR y/o HER2-neu en células tumorales de un paciente y comparándola con un nivel de expresión umbral predeterminado.

Sumario de la invención

En un aspecto de la invención, se proporciona un método para evaluar los niveles de expresión de ARNm de EGFR obtenido a partir de células tumorales frescas, congeladas, fijadas o fijadas e incrustadas en parafina (FPE).

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para evaluar los niveles de expresión de ARNm de HER2neu obtenido a partir de células tumorales frescas, congeladas, fijadas o fijadas e incrustadas en parafina (FPE).

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método de cuantificación de la cantidad de expresión de ARNm de EGFR en relación con un control interno a partir de una muestra de tejido fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina (FPE). Este método incluye el aislamiento de ARNm total a partir de dicha muestra y la determinación de la cantidad de ARNm de EGFR en relación con la cantidad de ARNm de un gen de control interno.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método de cuantificación de la cantidad de expresión de ARNm de HER2-neu en relación con un control interno a partir de una muestra de tejido fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina (FPE). Este método incluye el aislamiento de ARNm total a partir de dicha muestra y la determinación de la cantidad de ARNm de HER2-neu en relación con la cantidad de ARNm de un gen de control interno.

Además, se proporcionan cebadores oligonucleotídicos que tienen la secuencia de EGFR-1753F (SEQ ID NO:1) o EGFR-1823R (SEQ ID NO:2) y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas.

Se proporcionan cebadores oligonucleotídicos que tienen una secuencia que se hibrida con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o sus complementos en condiciones rigurosas.

Además, se proporcionan cebadores oligonucleotídicos que tienen la secuencia de HER2-neu 267-1F (SEQ ID NO:4) o HER2-neu 2699R (SEQ ID NO:5) y secuencias sustancialmente idénticas a las mismas.

Se proporcionan cebadores oligonucleotídicos que tienen una secuencia que se hibrida con SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 o sus complementos en condiciones rigurosas.

Aún en otro aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa para un paciente, que comprende aislar ARN a partir de una muestra de tumor fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina (FPE); aislar ARN a partir de una muestra de tejido no maligno coincidente fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina (FPE); determinar un nivel de expresión génica de EGFR en ambas muestras; dividir el nivel de expresión de EGFR en la muestra de tumor entre el nivel de expresión de EGFR en la muestra de tejido no maligno coincidente para determinar un nivel de expresión diferencial; comparar el nivel de expresión génica de EGFR diferencial con un nivel umbral predeterminado para el gen EGFR; y determinar un régimen quimioterápico basándose en los resultados de la comparación del nivel de expresión génica de EGFR diferencial con el nivel umbral predeterminado.

Aún en otro aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa para un paciente, que comprende aislar ARN a partir de una muestra de tumor fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina (FPE); aislar ARN a partir de una muestra de tejido no maligno coincidente fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina (FPE); determinar un nivel de expresión génica de HER2-neu en ambas muestras; dividir el nivel de expresión de HER2-neu en la muestra de tumor entre el nivel de expresión de HER2-neu en la muestra de tejido no maligno coincidente para determinar un nivel de expresión diferencial; comparar los niveles de expresión génica de HER2-neu diferencial con un nivel umbral predeterminado para el gen HER2-neu; y determinar un régimen quimioterápico basándose en los resultados de la comparación del nivel de expresión génica de HER2-neu diferencial con el nivel umbral predeterminado.

Aún en otro aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa para un paciente, que comprende aislar ARN a partir de una muestra de tumor fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina (FPE); aislar; ARN a partir de una muestra de tejido no maligno coincidente fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina; determinar los niveles de expresión génica de HER2-neu y EGFR en ambas muestras; dividir el nivel de expresión de EGFR en la muestra de tumor entre el nivel de expresión de EGFR en la muestra de tejido no maligno coincidente para determinar un nivel de expresión diferencial de EGFR; dividir el nivel de expresión de HER2-neu en la muestra de tumor entre el nivel de expresión de HER2-neu en la muestra de tejido no maligno coincidente para determinar un nivel de expresión de HER2-neu diferencial; comparar los niveles de expresión génica de HER2-neu y EGFR diferencial con un nivel umbral predeterminado para cada uno de los genes HER2-neu y EGFR; y determinar un régimen quimioterápico basándose en los resultados de la comparación de los niveles de expresión génica de HER2-neu y EGFR diferencial con los niveles umbral predeterminados.

Aún en otro aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar la capacidad de supervivencia de un paciente, que comprende aislar ARN a partir de una muestra de tumor fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina (FPE); aislar ARN a partir de una muestra de tejido no maligno coincidente fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina; determinar un nivel de expresión génica de EGFR en ambas muestras; dividir el nivel de expresión de EGFR en la muestra de tumor entre el nivel de expresión de EGFR en la muestra de tejido no maligno coincidente para determinar un nivel de expresión diferencial; comparar el nivel de expresión génica de EGFR diferencial con un nivel umbral predeterminado para el gen EGFR; y determinar la capacidad de supervivencia de un paciente basándose en los resultados de la comparación de los niveles de expresión génica de EGFR diferencial con el nivel umbral predeterminado.

Aún en otro aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar la capacidad de supervivencia de un paciente, que comprende aislar ARN a partir de una muestra de tumor fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina (FPE); aislar ARN a partir de una muestra de tejido no maligno coincidente fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina; determinar un nivel de expresión génica de HER2-neu en ambas muestras; dividir el nivel de expresión de HER2-neu en la muestra de tumor entre el nivel de expresión de EGFR en la muestra de tejido no maligno coincidente para determinar un nivel de expresión diferencial; comparar los niveles de expresión génica de HER2-neu diferencial con un nivel umbral predeterminado para el gen HER2-neu; y determinar la capacidad de supervivencia de un paciente basándose en el resultado de la comparación del nivel de expresión génica de HER2-neu diferencial con el nivel umbral predeterminado.

Aún en otro aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar la capacidad de supervivencia de un paciente, que comprende aislar ARN a partir de una muestra de tumor fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina (FPE); aislar ARN a partir de una muestra de tejido no maligno coincidente fresca, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina; determinar los niveles de expresión génica de HFR2-neu y EGFR en ambas muestras; dividir el nivel de expresión de EGFR en la muestra de tumor entre el nivel de expresión de EGFR en la muestra de tejido no maligno coincidente para determinar un nivel de expresión diferencial de EGFR; dividir el nivel de expresión de HER2-neu en la muestra de tumor entre el nivel de expresión de HER2-neu en la muestra de tejido no maligno coincidente para determinar un nivel de expresión diferencial de HER2-neu; comparar los niveles de expresión génica de HER2-neu y EGFR diferencial con un nivel umbral predeterminado para cada uno de los genes HER2-neu y EGFR; y determinar la capacidad de supervivencia de un paciente basándose en los resultados de la comparación de los niveles de expresión génica de EGFR y HER2-neu con los niveles umbral predeterminados.

Se describe un método de normalización de la expresión génica no corregida (UGE) de EGFR y HER2-neu en relación con un gen de control interno en una muestra de tejido analizada usando tecnología TaqMan® para saber los niveles de expresión de EGFR y HER2-neu en relación con un control interno a partir de muestras analizadas mediante tecnología anterior a TaqMan®.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Probabilidad de supervivencia estimada de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas resecado de manera curativa frente al estado de expresión de ARNm de HER2-neu. No se alcanzó la mediana de la supervivencia en el grupo de baja expresión de HER2-neu en comparación con 31,1 meses (I.C. del 95%: 21,96-40,24) en el grupo de alta expresión de HER2-neu (P=0,004).

Figura 2. Probabilidad de supervivencia estimada de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas resecado de manera curativa frente al estado de expresión de ARNm de EGFR. Podía observarse una tendencia hacia una supervivencia global inferior para el grupo de alta expresión de EGFR, pero no alcanzó significación estadística. No se alcanzó la mediana de la supervivencia en el grupo de baja expresión de EGFR en comparación con 32,37 meses (I.C. del 95%: 8,43-56,31) en el grupo de alta expresión de EGFR (P=0,176).

Figura 3. Probabilidad de supervivencia estimada de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas resecado de manera curativa frente a patrones combinados de coexpresión de EGFR y HER2-neu en NSCLC. No se alcanzó la mediana de la supervivencia en el grupo que mostró baja expresión de HER2-neu y EGFR, en comparación con 45,47 meses en el grupo de alta expresión de EGFR, 31,10 meses (I.C. del 95%: 14,77-47,43) en el grupo de alta expresión de HER2-neu y 22,03 meses (I.C. del 95%: 2,30-41,76; P=0,003) en el grupo de alta expresión de HER2-neu y EGFR.

Figura 4. Tabla que muestra alta y baja expresión de EGFR y HER2-neu en pacientes y tumores.

Figura 5. Tabla que muestra la supervivencia de pacientes basándose en parámetros clínicos y moleculares.

Figura 6. Tabla que muestra modelos de regresión de riesgos proporcionales de Cox. Doble marcador se refiere a expresión de tanto EGFR como HER2-neu.

La figura 7 es un diagrama que ilustra cómo calcular la expresión de EGFR en relación con un gen de control interno. El diagrama contiene datos obtenidos con dos muestras de prueba, (desconocidas 1 y 2), e ilustra cómo determinar los datos de expresión génica no corregida (UGE). El diagrama también ilustra cómo normalizar la UGE generada mediante el instrumento TaqMan® con valores de EGFR relativos conocidos determinados mediante tecnología anterior a Taq-Man®. Esto se logra multiplicando UGE por un factor de corrección KEGFR. El gen de control interno en la figura es �actina y el ARN calibrador es ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017).

La figura 8 es un diagrama que ilustra cómo calcular la expresión de HER2-neu en relación con un gen de control interno. El diagrama contiene datos obtenidos con dos muestras de prueba, (desconocidas 1 y 2), e ilustra cómo determinar los datos de expresión génica no corregida (UGE). El diagrama también ilustra cómo normalizar la UGE generada mediante el instrumento TaqMan® con valores de HER2-neu publicados previamente. Esto se logra multiplicando UGE por un factor de corrección KHER2-neu. El gen de control interno en la figura es �-actina y el ARN calibrador es ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017).

La figura 9 es un gráfico que muestra los valores de expresión de EGFR corregida de tumores de 5 pacientes con cáncer de colon diferentes. Los pacientes seguían un régimen de tratamiento dirigido a receptores tirosina cinasa CPT11/C225. Se determinó que el paciente 1 tenía un nivel de expresión de EGFR corregida de 2,08 x 10-3 y tenía una respuesta completa (RC). El paciente 2 tenía un nivel de expresión de EGFR corregida de 8,04 x 10-3 y tenía una respuesta parcial (RP). El paciente 3 tenía un nivel de expresión de EGFR corregida de 1,47 x 10-3 y también mostraba una respuesta parcial (RP). El paciente 4 tenía un nivel de expresión de EGFR corregida de 0,16 x 10-3 y tenía enfermedad estable (EE) sin mostrar respuesta. El paciente 5 no tenía expresión de EGFR (0,0 x 10-3) y tenía enfermedad progresiva (EP).

Descripción detallada de la invención

Se considera que tumores que expresan altos niveles de ARNm de HER2-neu y/o EGFR probablemente son sensibles a quimioterapia dirigida a receptores tirosina cinasa. A la inversa, los tumores que expresan bajas cantidades de ARNm

de HER2-neu y EGFR no es probable que sean sensibles a quimioterapia dirigida a receptores tirosina cinasa. Se determina un estado de expresión de ARNm de HER2-neu y EGFR diferencial del paciente comparándolo con un nivel de expresión umbral predeterminado.

La invención proporciona un método de cuantificación de la cantidad de expresión de ARNm de HER2-neu y/o EGFR en tejido fresco, congelado, fijado o fijado e incrustado en parafina (FPE) en relación con la expresión génica de un control interno. Los presentes inventores han desarrollado cebadores oligonucleotídicos que permiten la evaluación exacta de la expresión génica de HER2-neu y EGFR en tejidos frescos, congelados, fijados o fijados e incrustados en parafina. Los cebadores oligonucleotídicos, EGFR-1753F (SEQ ID NO:1), EGFR-1823R (SEQ ID NO:2), o cebadores oligonucleotídicos sustancialmente idénticos a los mismos, se usan preferiblemente junto con ARN extraído de muestras de tumor frescas, congeladas, fijadas o fijadas e incrustadas en parafina (FPE). Se proporcionan cebadores oligonucleotídicos, HER2-neu 2671F (SEQ ID NO:4), HER2-neu 2699R (SEQ ID NO:5), o cebadores oligonucleotídicos sustancialmente idénticos a los mismos, se usan preferiblemente junto con ARN extraído de muestras de tumor frescas, congeladas, fijadas o fijadas e incrustadas en parafina (FPE). Esta medición de la expresión génica de HER2-neu y/o EGFR puede usarse entonces para el pronóstico de la quimioterapia dirigida a receptores tirosina cinasa.

Esta realización de la invención implica un método para la extracción fiable de ARN a partir de muestras frescas, congeladas, fijadas o FPE, la determinación del contenido de ARNm de EGFR en la muestra usando un par de cebadores oligonucleotídicos, preferiblemente el par de cebadores oligonucleotídicos EGFR-1753F (SEQ ID NO:1) y EGFR-1823R (SEQ ID NO:2), u oligonucleótidos sustancialmente idénticos a los mismos, para llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa.

Otra realización de la invención implica a método para la extracción fiable de ARN a partir de muestras frescas, congeladas, fijadas o FPE, y la determinación del contenido de ARNm de HER2-neu en la muestra usando un par de cebadores oligonucleotídicos, HER2-neu 2671F (SEQ ID NO:4), HER2-neu 2699R (SEQ ID NO:5), o cebadores oligonucleotídicos sustancialmente idénticos a los mismos.

“Sustancialmente idéntico” en el contexto de ácido nucleico tal como se usa en el presente documento significa hibridación con una diana en condiciones rigurosas, y también que los segmentos de ácido nucleico, o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son iguales cuando se alinean apropiadamente, con las inserciones y deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente el 60% de los nucleótidos, normalmente, al menos aproximadamente el 70%, más normalmente, al menos aproximadamente el 80%, habitualmente, al menos aproximadamente el 90%, y más habitualmente, al menos, aproximadamente el 95-98% de los nucleótidos. Existe hibridación selectiva cuando la hibridación es más selectiva que la falta total de especificidad. Véase, Kanehisa, Nucleic Acids Res., 12:203213 (1984).

Los métodos de la presente invención pueden aplicarse sobre una amplia gama de tipos de tumores. Esto permite la preparación de “perfiles de expresión tumoral” individuales mediante los cuales se determinan los niveles de expresión de HER2-neu y/o EGFR en muestras de pacientes individuales y se predice la respuesta a diversos quimioterápicos. Preferiblemente, los métodos de la invención se aplican a tumores sólidos, lo más preferiblemente tumores de NSCLC.

Un “nivel de expresión diferencial” tal como se define en el presente documento se refiere a la diferencia en el nivel de expresión de o bien EGFR o bien HER2-neu en un tumor con respecto al nivel de expresión de o bien EGFR o bien HER2-neu en una muestra de tejido no maligno coincidente, respectivamente. El nivel de expresión diferencial se determina dividiendo la UGE de un gen particular de la muestra de tumor entre la UGE del mismo gen de una muestra de tejido no maligno coincidente.

Un “nivel umbral predeterminado”, tal como se define en el presente documento refiriéndose a la expresión de EGFR, es un nivel de expresión de EGFR diferencial por encima del cual (es decir, alta), es probable que los tumores sean sensibles a un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa. Un alto nivel de expresión de EGFR diferencial es pronóstico de una capacidad de supervivencia inferior del paciente. Tumores con niveles de expresión por debajo de este nivel umbral no es probable que se vean afectados por un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa. Un bajo nivel de expresión de EGFR diferencial es pronóstico de una capacidad de supervivencia superior del paciente. Si la expresión diferencial está o no por encima o por debajo de un “nivel umbral predeterminado” se determina mediante el método usado por Mafune et al., que calculó las razones de expresión tumoral/normal (T/N) diferencial individuales en tejidos no malignos coincidentes obtenidos de pacientes con carcinoma de células escamosas del esófago. Mafune et al., Clin Cancer Res 5:4073-4078, 1999. Este método de análisis conduce a un valor de expresión preciso para cada paciente, que se basa en la expresión de fondo individual obtenida a partir de tejido no maligno coincidente. La expresión diferencial de EGFR se considera “alta” e indicativa de baja capacidad de supervivencia si la UGE de EGFR l-actina en una muestra de tumor dividida entre la UGE de EGFR: �-actina en una muestra de tejido no maligno coincidente está por encima del valor umbral predeterminado de aproximadamente 1,8. La expresión diferencial de EGFR se considera “baja” e indicativa de alta capacidad de supervivencia si la UGE de EGFR: �-actina en una muestra

de tumor dividida entre la UGE de EGFR: �-actina en una muestra de tejido no maligno coincidente está por debajo del

valor umbral predeterminado de aproximadamente 1,8. Un “nivel umbral predeterminado”, tal como se define en el presente documento refiriéndose a la expresión de HER2neu, es un nivel de expresión de HER2-neu por encima del cual (es decir, alta), es probable que los tumores sean sensibles a un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa. Un alto nivel de expresión de HER2-neu diferencial es pronóstico de una capacidad de supervivencia inferior del paciente. Tumores con niveles de expresión por debajo de este nivel umbral no es probable que se vean afectados por un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa. Un bajo nivel de expresión de HER2-neu diferencial es pronóstico de una capacidad de supervivencia superior del paciente. La expresión diferencial de HER2-neu se considera “alta” e indicativa de baja capacidad de supervivencia si la UGE de HER2-neu:�-actina en una muestra de tumor dividida entre la UGE de HER2-neu:�-actina en una muestra de tejido no maligno coincidente está por encima del valor umbral predeterminado de aproximadamente 1,8. La expresión diferencial de HER2-neu se considera “baja” e indicativa de alta capacidad de supervivencia si la UGE de HER2-neu: -actina en una muestra de tumor dividida entre la UGE de HER2-neu:�-actina en una muestra de tejido no maligno coincidente está por debajo del valor umbral predeterminado de aproximadamente 1,8.

Se determinó un “nivel umbral” para HER2-neu usando los siguientes resultados y método. La expresión de ARNm de HER2-neu corregida, expresada como la razón entre el producto de PCR de HER2-neu y �-actina, era de 4,17 x 10-3 (intervalo 0,28-23,86 x 10-3 en pulmón normal y 4,35 x 10-3 (intervalo: 0,21-68,11 x 10-3) en tejido tumoral (P=0,019 prueba de Wilcoxon). El método de chi-cuadrado máximo por Miller y Siegmund (Miller et al., Biometrics 38:1011-1016, 1982) y Halpern (Biometrics 38:1017-1023, 1982) determinó un valor umbral de 1,8 para pacientes segregados en pacientes con baja y alta expresión de HER2-neu diferencial. Mediante este criterio, 29 (34,9%) pacientes tenían una alta expresión de HER2-neu diferencial y 54 (65,1%) tenían una baja expresión de HER2-neu diferencial.

Se determinó un “nivel umbral” para EGFR usando los siguientes resultados y método. La mediana de la expresión de ARNm de EGFR corregida era de 8,17 x 10-3 (intervalo: 0,31-46,26 x 10-3) en pulmón normal y 7,22 x 10-3 (intervalo: 0,27-97,49 x 10-3) en tejido tumoral (P=n.s.). El método de chi-cuadrado máximo (Miller (1982); Halpern (1982)) determinó un valor umbral de 1,8 para pacientes segregados en pacientes con baja y alta expresión de EGFR diferencial. Mediante este criterio, 28 (33,7%) pacientes tenían una alta expresión de EGFR diferencial y 55 (66,3%) tenían un estado de baja expresión de EGFR diferencial.

Al realizar el método de la presente invención, se someten a ensayo o bien los niveles de expresión de EGFR diferencial

o bien los niveles de expresión de HER2-neu diferencial en un paciente para pronosticar la eficacia de un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa. Además, en el método de la presente invención, se someten a ensayo los niveles de expresión de HER2-neu diferencial en un paciente para pronosticar la eficacia de un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa. Adicionalmente, en el método de la presente invención, se someten a ensayo los niveles de expresión de EGFR diferencial en un paciente para pronosticar la eficacia de un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa. Alternativamente, se someten a ensayo tanto los niveles de expresión de EGFR diferencial como los niveles de expresión de HER2-neu diferencial en un paciente para pronosticar la eficacia de un régimen quimioterápico dirigido a receptores tirosina cinasa.

“Muestra no maligna coincidente” tal como se define en el presente documento se refiere a una muestra de tejido no canceroso derivada del mismo individuo que la muestra de tumor que va a analizarse para determinar la expresión de EGFR diferencial y/o la expresión de HER2-neu diferencial. Preferiblemente, una muestra no maligna coincidente se deriva del mismo órgano que el órgano del que se deriva la muestra de tumor. Lo más preferiblemente, la muestra de tumor no maligno coincidente se deriva de la misma capa de tejido orgánico del que se deriva la muestra de tumor. Además, es preferible tomar una muestra de tejido no maligno coincidente al mismo tiempo que se toma una biopsia de una muestra de tumor. En una realización preferida, se analizan tejidos de las siguientes dos ubicaciones: tejido de tumor de pulmón y de pulmón no maligno tomado de la mayor distancia del tumor y tejido de tumor de colon y de colon no maligno tomado de la mayor distancia del tumor tal como sea posible según las circunstancias.

Al realizar el método de esta realización de la presente invención, se aíslan preferiblemente células tumorales del paciente. Se resecan quirúrgicamente del paciente tumores linfoides o sólidos o partes de los mismos o se obtienen mediante biopsia rutinaria. Se extrae de las células ARN aislado de muestras de tumor congeladas o frescas mediante cualquiera de los métodos típicos en la técnica, por ejemplo, Sambrook, Fischer y Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual, (2ª ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, (1989). Preferiblemente, se tiene cuidado para evitar la degradación del ARN durante el proceso de extracción.

Sin embargo, el tejido obtenido del paciente tras la biopsia se fija a menudo, habitualmente mediante formalina (formaldehído) o glutaralehído, por ejemplo, o mediante inmersión en alcohol. Las muestras biológicas fijadas a menudo se deshidratan y se incrustan en parafina u otros soportes sólidos conocidos por los expertos en la técnica. Véase Plenat et al., Ann Pathol enero de 2001; 21(1):29-47. También puede usarse tejido fijado, no incrustado así como tejido fijado e

incrustado en los presentes métodos. Se prevé que lo soportes sólidos para incrustar tejido fijado puedan eliminarse mediante disolventes orgánicos por ejemplo, permitiendo la rehidratación posterior del tejido conservado.

Se extrae ARN a partir de células de tejido incrustado en parafina (FPE) mediante cualquiera de los métodos descritos en el documento US 6248535, presentado el 20 de diciembre de 1999. Tal como se usa en el presente documento, tejido FPE significa tejido que se ha fijado e incrustado en un soporte sólido eliminable, tal como muestras de tejido de archivo o almacenables. Puede aislarse ARN a partir de una biopsia o muestra patológica de archivo que se desparafiniza en primer lugar. Un método de desparafinización a modo de ejemplo implica lavar la muestra parafinizada con un disolvente orgánico, tal como xileno, por ejemplo. Las muestras desparafinizadas pueden rehidratarse con una disolución acuosa de un alcohol inferior. Los alcoholes inferiores adecuados incluyen, por ejemplo, metanol, etanol, propanoles y butanoles. Las muestras desparafinizadas pueden rehidratarse con lavados sucesivos con disoluciones alcohólicas inferiores de concentración decreciente, por ejemplo. Alternativamente, la muestra se desparafiniza y rehidrata simultáneamente. Entonces se extrae el ARN de la muestra.

Para la extracción de ARN, las muestras fijadas o fijadas y desparafinizadas pueden homogeneizarse usando medios mecánicos, sónicos u otros medios de homogeneización. Pueden homogeneizarse muestras rehidratadas en una disolución que comprende un agente caotrópico, tal como tiocianato de guanidinio (comercializado también como isotiocianato de guanidinio). Las muestras homogeneizadas se calientan hasta una temperatura en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 100ºC en una disolución caotrópica, que contiene una cantidad eficaz de un agente caotrópico, tal como un compuesto de guanidinio. Un agente caotrópico preferido es tiocianato de guanidinio.

Se elige una “concentración eficaz de agente caotrópico” de manera que se purifica ARN a partir de una muestra incrustada en parafina en una cantidad de más de aproximadamente 10 veces de la aislada en ausencia de un agente caotrópico. Los agentes caotrópicos incluyen, por ejemplo: compuestos de guanidinio, urea, formamida, yoduro de potasio, tiocianato de potasio y compuestos similares. El agente caotrópico preferido para los métodos de la invención es un compuesto de guanidinio, tal como isotiocianato de guanidinio (comercializado también como tiocianato de guanidinio) y clorhidrato de guanidinio. Son útiles muchos contraiones aniónicos, y un experto en la técnica puede preparar muchas sales de guanidinio con tales aniones apropiados. La concentración eficaz de la disolución de guanidinio usada en la invención tiene generalmente una concentración en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 M con un valor preferido de aproximadamente 4 M. Si el ARN está ya en disolución, la disolución de guanidinio puede ser de concentración superior de manera que la concentración final lograda en la muestra está en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 M. La disolución de guanidinio se tampona también preferiblemente a un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 6, más preferiblemente de aproximadamente 4, con un tampón bioquímico adecuado tal como Tris-Cl. La disolución caotrópica puede contener también agentes reductores, tales como ditiotreitol (DTT) y mercaptoetanol (BME). La disolución caotrópica puede contener también inhibidores de ARNasa.

Se recupera entonces el ARN a partir de la disolución caotrópica mediante, por ejemplo, extracción con fenolcloroformo, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de exclusión molecular. El ARN puede purificarse adicionalmente entonces usando las técnicas de extracción, electroforesis, cromatografía, precipitación u otras técnicas adecuadas.

La cuantificación de ARNm de HER2-neu o EGFR a partir de ARNm total purificado a partir de tejido fresco, congelado o fijado se lleva a cabo usando métodos de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) comunes en la técnica, por ejemplo. Otros métodos de cuantificación de ARNm de HER2-neu o EGFR incluyen, por ejemplo, el uso de balizas moleculares y otras sondas marcadas útiles en PCR múltiplex. Adicionalmente, la presente invención prevé la cuantificación de ARNm de HER2-neu y/o EGFR mediante el uso de sistemas sin PCR empleando, por ejemplo, sondas marcadas fluorescentemente similares a las del ensayo Invader® (Third Wave Technologies, Inc.). Lo más preferiblemente, la cuantificación de ADNc de HER2-neu y/o EGFR y un gen de mantenimiento o de control interno (por ejemplo -actina) se realiza usando un método de detección en tiempo real basado en fluorescencia (sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700 o 7900 [TaqMan®], Applied Biosystems, Foster City, CA.) o un sistema similar tal como se describe por Heid et al., (Genome Res 1996; 6:986-994) y Gibson et al.(Genome Res 1996;6: 995-1001). La salida del ABI 7700 (instrumento TaqMan®) se expresa en Ct o “umbrales de ciclo” (“cycle thresholds”). Con el sistema TaqMan®, un gen altamente expresado que tiene un número superior de moléculas diana en una muestra genera una señal con menos ciclos de PCR (Ct inferior) que un gen de expresión relativa inferior con menos moléculas diana (Ct superior).

Tal como se usa en el presente documento, un gen de “mantenimiento” o “control interno” es cualquier gen expresado de manera constitutiva o global cuya presencia permite una evaluación de los niveles de ARNm de HER2-neu y/o EGFR. Una evaluación de este tipo comprende una determinación del nivel constitutivo global de transcripción génica y un control para variaciones en la recuperación de ARN. Los genes de “mantenimiento” o “controles internos” pueden incluir, pero no se limitan a, el gen de ciclofilina, el gen de �-actina, el gen del receptor de transferrina, el gen de GAPDH y similares. Lo más preferiblemente, el gen de control interno es el gen de �-actina tal como se describe por Eads et al., Cancer Research 1999; 59:2302-2306.

Un control para variaciones en la recuperación de ARN requiere el uso de “ARN calibrador”. El “ARN calibrador” pretende ser cualquier fuente adecuada de ARN de control precuantificado de manera exacta. Preferiblemente, se usa ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017).

“Expresión génica no corregida (UGE)” tal como se usa en el presente documento se refiere a la salida numérica de la expresión de HER2-neu y/o EGFR en relación con un gen de control interno generada por el instrumento TaqMan®. La ecuación usada para determinar UGE se muestra en los ejemplos 3 y 4, y se ilustra con cálculos de muestras en las figuras 7 y 8.

Estos valores numéricos permiten la determinación de si la expresión génica diferencial (es decir, “UGE” o de una muestra de tumor particular dividida entre la “UGE” de una muestra no tumoral coincidente) se encuentra o no por encima o por debajo del nivel “umbral predeterminado”. El nivel umbral predeterminado para EGFR y HER2-neu es de aproximadamente 1,8.

Un aspecto adicional de esta invención proporciona un método para normalizar los valores de expresión génica no corregida (UGE) adquiridos a partir del instrumento TaqMan® con valores de “expresión génica relativa conocidos” derivados de tecnología distinta de TaqMan®. Preferiblemente, se normalizan valores de UGE de HER2-neu y/o EGFR derivados de TaqMan® con respecto a muestras con valores de expresión de HER2-neu y/o EGFR:�-actina relativa derivados de TaqMan® conocidos.

“Expresión de EGFR relativa corregida” tal como se usa en el presente documento se refiere a expresión de EGFR normalizada mediante lo cual se multiplica UGE por un factor de corrección específico para EGFR (KEGFR), dando como resultado un valor que puede compararse con un intervalo conocido de niveles de expresión de EGFR en relación con un gen de control interno. El ejemplo 3 y la figura 7 ilustran estos cálculos en detalle. KEGFR específico para EGFR, el control interno �-actina y el ARN total de hígado humano calibrador (Stratagene, n.º de cat. 735017), es 26,95 x 10-3. Estos valores numéricos también permiten la determinación de si la “expresión relativa corregida” de una muestra de tumor particular dividida entre la “expresión relativa corregida” de una muestra no tumoral coincidente (es decir, la expresión diferencial) se encuentra o no por encima o por debajo del nivel “umbral predeterminado”. El nivel umbral predeterminado para HER2-neu o EGFR es de aproximadamente 1,8. Al determinar si la expresión diferencial de o bien EGFR o bien HER2-neu en una muestra tumoral es 1,8 veces mayor que en una muestra no tumoral coincidente, se reconocerá fácilmente que pueden usarse o bien los valores de UGE o bien los valores de expresión relativa corregida. Por ejemplo, si se divide el nivel de expresión relativa corregida del tumor entre el de la muestra no tumoral coincidente, el factor K se anula y queda la misma razón que si se hubiesen usado valores de UGE.

Los valores de “expresión génica relativa conocida” se derivan de muestras de tejido analizadas previamente y se basan en la razón de la señal de RT-PCR de un gen diana con respecto a un gen de control interno expresado de manera constitutiva (por ejemplo �-actina, GAPDH, etc.). Preferiblemente, tales muestras de tejido son muestras fijadas con formalina e incrustadas en parafina (FPE) y se extrae el ARN de las mismas según el protocolo descrito en el ejemplo 1. Para cuantificar la expresión génica en relación con un patrón de control interno, se usa tecnología de RT-PCR cuantitativa conocida en la técnica. Se ejecutan reacciones de PCR de tecnología anterior a TaqMan® durante un número de ciclos fijo (es decir, 30) y se notifican valores de criterios de valoración para cada muestra. Estos valores se notifican entonces como una razón de expresión de EGFR con respecto a expresión de �-actina.

Puede determinarse KEGFR para un gen de control interno distinto de �-actina y/o un ARN calibrador diferente de ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017). Para hacer esto, debe calibrarse tanto el gen de control interno como el ARN calibrador con respecto a muestras de tejido para las que los niveles de expresión de EGFR en relación con ese gen de control interno particular ya se han determinado (es decir, “expresión génica relativa conocida”). Preferiblemente, tales muestras de tejido son muestras fijadas con formalina e incrustadas en parafina (FPE) y se extrae el ARN de las mismas según el protocolo descrito en el ejemplo 1. Una determinación de este tipo puede realizarse usando técnicas de RT-PCR cuantitativa anteriores a TaqMan® bien conocidas en la técnica. Tras una determinación de este tipo, tales muestras tienen niveles de “expresión génica relativa conocida” de EGFR útiles en la determinación de un nuevo KEGFR específico para el nuevo control interno y/o ARN calibrador tal como se describe en el ejemplo 3.

“Expresión de HER2-neu relativa corregida” tal como se usa en el presente documento se refiere a expresión de HER2neu normalizada mediante lo cual se multiplica UGE por un factor de corrección específico para HER2-neu (KHER2-neu), dando como resultado un valor que puede compararse con un intervalo conocido de niveles de expresión de HER2-neu en relación con un gen de control interno. El ejemplo 4 y la figura 8 ilustran estos cálculos en detalle. KHER2-neu específico para HER2-neu, el control interno �-actina y el ARN total de hígado humano calibrador (Stratagene, n.º de cat. 735017), es 13,3 x 10-3.

Puede determinarse KHER2-neu para un gen de control interno distinto de �-actina y/o un ARN calibrador diferente de ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017). Para hacer esto, debe calibrarse tanto el gen de control interno como el ARN calibrador con respecto a muestras de tejido para las que los niveles de expresión de HER2-neu en relación con ese gen de control interno particular ya se han determinado (es decir, “expresión génica relativa conocida”). Preferiblemente, tales muestras de tejido son muestras fijadas con formalina e incrustadas en parafina (FPE) y se extrae el ARN de las mismas según el protocolo descrito en el presente documento. Una determinación de este tipo puede realizarse usando técnicas de RT-PCR cuantitativa anteriores a TaqMan® bien conocidas en la técnica, por ejemplo. Tras una determinación de este tipo, tales muestras tienen niveles de “expresión génica relativa conocida” de HER2-neu útiles en la determinación de un nuevo KHER2-neu específico para el nuevo control interno y/o ARN calibrador tal como se describe en el ejemplo 4.

Los métodos de la invención pueden aplicarse a una amplia gama de tipos de tejido y tumor y de ese modo pueden usarse para la evaluación del tratamiento clínico de un paciente y como herramienta de diagnóstico o pronóstico para una gama de cánceres incluyendo de mama, de cabeza y cuello, de pulmón, esofágico, colorrectal y otros. En una realización preferida, los presentes métodos se aplican al pronóstico de tumores de NSCLC.

Las biopsias de tumores antes del tratamiento quimioterápico están disponibles habitualmente sólo como tejidos fijados incrustados en parafina (FPE), que contienen generalmente sólo una cantidad muy pequeña de tejido heterogéneo. Tales muestras FPE pueden someterse fácilmente a microdisección, de modo que puede determinarse la expresión génica de HER2-neu y/o EGFR en tejido tumoral no contaminado con tejido estromal no maligno. Adicionalmente, pueden hacerse comparaciones entre tejido tumoral y estromal no maligno dentro de una muestra de tejido de biopsia, puesto que tales muestras contienen a menudo ambos tipos de tejidos.

Generalmente, cualquier par de oligonucleótidos que flanqueen una región del gen EGFR, tal como se muestra en SEQ ID NO:10, puede usarse para llevar a cabo los métodos de la invención. Cebadores que se hibridan en condiciones rigurosas con una región del gen EGFR para su uso en la presente invención amplificarán un producto de entre 20-1000 pares de bases, preferiblemente de 50-100 pares de bases, lo más preferiblemente de menos de 100 pares de bases.

Se proporcionan pares de cebadores oligonucleotídicos específicos y cebadores oligonucleotídicos sustancialmente idénticos a los mismos, que permiten una evaluación particularmente exacta de la expresión de EGFR usando tejidos frescos, congelados, fijados o FPE. Son preferibles cebadores oligonucleotídicos, EGFR-1753F (SEQ ID NO:1) y EGFR1823R (SEQ ID NO:2), (también denominados en el presente documento par de cebadores oligonucleotídicos de EGFR) y cebadores oligonucleotídicos sustancialmente idénticos a los mismos. Se ha mostrado que los cebadores oligonucleotídicos EGFR-1753F (SEQ ID NO:1) y EGFR-1823R, (SEQ ID NO:2) son particularmente eficaces para medir los niveles de ARNm de EGFR usando ARN extraído de células frescas, congeladas, fijadas o FPE mediante cualquier de los métodos para el aislamiento de ARNm, por ejemplo tal como se describe en el ejemplo 1.

Además, cualquier par de oligonucleótidos que flanqueen una región del gen HER2-neu, tal como se muestra en SEQ ID NO:11, puede usarse para llevar a cabo los métodos de la invención. Cebadores que se hibridan en condiciones rigurosas con una región del gen HER2-neu para su uso en la presente invención amplificarán un producto de entre aproximadamente 20-1000 pares de bases, preferiblemente de aproximadamente 50-100 pares de bases, lo más preferiblemente de menos de aproximadamente 100 pares de bases.

Se proporcionan pares de cebadores oligonucleotídicos específicos y cebadores oligonucleotídicos sustancialmente idénticos a los mismos, que permiten una evaluación particularmente exacta de la expresión de HER2-neu en tejidos frescos, congelados, fijados o FPE. Son preferibles cebadores oligonucleotídicos, HER2-neu 2671F (SEQ ID NO:4) y HER2-neu 2699R (SEQ ID NO:5), (también denominados en el presente documento par de cebadores oligonucleotídicos de HER2-neu) y cebadores oligonucleotídicos sustancialmente idénticos a los mismos. Se ha mostrado que los cebadores oligonucleotídicos HER2-neu 2671F (SEQ ID NO:4) y HER2-neu 2699R (SEQ ID NO:5) son particularmente eficaces para medir los niveles de ARNm de HER2-neu usando ARN extraído de células frescas, congeladas, fijadas o FPE mediante cualquiera de los métodos para el aislamiento de ARNm, por ejemplo tal como se describe en el presente documento.

Se proporcionan oligonucleótidos idénticos que se hibridan en condiciones rigurosas (tal como se define en el presente documento) con toda o una parte de la secuencia de cebador oligonucleotídico de EGFR-1753F (SEQ ID NO:1), su complemento o EGFR-1823R (SEQ ID NO:2), o su complemento o la secuencia de cebador oligonucleotídico de HER2neu 2671F (SEQ ID NO:4), su complemento o HER2-neu 2699R (SEQ ID NO:5), o su complemento.

En condiciones de hibridación rigurosas, sólo se hibridan secuencias altamente complementarias, es decir, secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares tal como se define en el presente documento. Preferiblemente, tales condiciones impiden la hibridación de ácidos nucleicos que tienen 4 o más apareamientos erróneos en 20 nucleótidos contiguos, más preferiblemente 2 o más apareamientos erróneos en 20 nucleótidos contiguos, lo más preferiblemente uno o más apareamientos erróneos en 20 nucleótidos contiguos.

La parte de hibridación de los ácidos nucleicos tiene normalmente al menos aproximadamente 10 (por ejemplo, 15) nucleótidos de longitud. La parte de hibridación del ácido nucleico de hibridación es al menos aproximadamente el 80%, preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, o lo más preferiblemente aproximadamente al menos el 98%, idéntica a la secuencia de una parte o todo el cebador oligonucleotídico EGFR-1753F (SEQ ID NO:1), su complemento

o EGFR-1823R (SEQ ID NO:2), o su complemento o el cebador oligonucleotídico HER2-neu 2671F (SEQ ID NO:4), su complemento o HER2-neu 2699R (SEQ ID NO:5), o su complemento.

La hibridación del cebador oligonucleotídico con una muestra de ácido nucleico en condiciones rigurosas se define a continuación. La estabilidad del híbrido o dúplex de ácido nucleico se expresa como una temperatura de fusión (Tm), que es la temperatura a la que la sonda se disocia del ADN diana. Esta temperatura de fusión se usa para definir las condiciones de rigurosidad requeridas. Si las secuencias que van a identificarse son sustancialmente idénticas a la sonda, en vez de idénticas, entonces es útil establecer en primer lugar la temperatura más baja a la que sólo se produce hibridación homóloga con una concentración particular de sal (por ejemplo, SSC o SSPE). Entonces, suponiendo que un 1% de apareamientos erróneos da como resultado una disminución de 1ºC en la Tm, la temperatura del lavado final en la reacción de hibridación se reduce por consiguiente (por ejemplo, si se buscan secuencias que tienen >95% de identidad con la sonda, la temperatura de lavado final disminuye en 5ºC). En la práctica, el cambio en Tm puede ser de entre 0,5ºC y 1,5ºC por un 1% de apareamientos erróneos.

Las condiciones rigurosas implican hibridar a aproximadamente 68ºC en 5x SSC/5x disolución de Denhart/SDS al 1,0%, y lavar en 0,2x SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente. Las condiciones moderadamente rigurosas incluyen lavar en 3x SSC a aproximadamente 42ºC. Los parámetros de concentración salina y la temperatura se varían para logar un nivel óptimo de identidad entre el cebador y el ácido nucleico diana. Están fácilmente disponible en la técnica directrices adicionales referentes a tales condiciones, por ejemplo, Sambrook, Fischer y Maniatis, Molecular Cloning; a laboratory manual, (2ª ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, (1989) y F. M. Ausubel et al eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons (1994).

Los cebadores oligonucleotídicos dados a conocer en el presente documento pueden permitir una evaluación exacta de la expresión génica de HER2-neu y/o EGFR en un tejido fijado o fijado e incrustado en parafina, así como tejido congelado o fresco. Esto es a pesar del hecho de que el ARN derivado de muestras FPE está más fragmentado en relación con el de tejido fresco o congelado. Por tanto, los métodos de la invención son adecuados para su uso en el ensayo de los niveles de expresión génica de HER2-neu y/o EGFR en todos los tejidos en los que anteriormente no existía ningún modo exacto y constante para someter a ensayo el gen HER2-neu y/o EGFR en tejidos frescos y congelados y ningún modo en absoluto para someter a ensayo la expresión génica de HER2-neu y/o EGFR usando tejidos fijados.

Sobreactividad de HFR2-neu se refiere a o bien una amplificación del gen que codifica para HER2-neu o bien a la producción de un nivel de actividad de HER2-neu que puede correlacionarse con un trastorno proliferativo celular (es decir, a medida que el nivel de HER2-neu aumenta, la gravedad de uno o más de los síntomas del trastorno proliferativo celular aumenta).

Un régimen quimioterápico o quimioterapia dirigida a “receptores tirosina cinasa” en el contexto de la presente invención se refiere a una quimiterapia que comprende agentes que interfieren específicamente con la función de receptores tirosina cinasa de clase I. Preferiblemente, tales agentes inhibirán la actividad de señalización del receptor tirosina cinasa EGFR y/o HER2-neu. Tales agentes incluyen 4-anilinoquinazolinas tales como 6-acrilamido-4-anilinoquinazolina Bonvini et al., Cancer Res. 15 de febrero de 2001; 61(4): 1671-7 y derivados, erbastatina (Toi et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 1990, 26, 722.), geldanamicina, compuestos de bis-arilo monocíclicos, bicíclicos o heterocíclicos (documento PCT WO 92/20642), derivados de vinileno-azaindol (documento PCT WO 94/14808) y 1-ciclopropil-4-piridil-quinolonas (patente estadounidense n.º 5.330.992) que se han descrito generalmente como inhibidores de tirosina cinasas. Además, compuestos de estirilo (patente estadounidense n.º 5.217.999), compuestos de piridilo sustituidos con estirilo (patente estadounidense n.º 5.302.606), determinados derivados de quinazolina (solicitud EP n.º 0 566 266 A1), seleoindoles y selenidas (documento PCT WO 94/03427), compuestos polihidroxilados tricíclicos (documento PCT WO 92/21660) y compuestos de ácido bencilfosfónico (documento PCT WO 91/15495) se han descrito como compuestos para su uso como inhibidores de tirosina cinasas para su uso en el tratamiento del cáncer.

Otros agentes que seleccionan como diana la actividad de señalización de los receptores tirosina cinasa EGFR y/o HER2-neu incluyen anticuerpos que inhiben la función biológica de receptores de factores de crecimiento indirectamente mediando citotoxicidad mediante una función de direccionamiento.

Los anticuerpos que se complejan con el receptor activan el complemento del suero y/o median la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Los anticuerpos que se unen al receptor también pueden conjugarse con una toxina (inmunotoxinas). Ventajosamente, se seleccionan anticuerpos que inhiben enormemente la función del receptor uniéndose en las proximidades estéricas del sitio de unión a ligando del receptor (bloqueando el receptor), y/o que se unen al factor de crecimiento de tal modo que impiden (bloquean) que el ligando se una al receptor. Estos anticuerpos se seleccionan usando ensayos in vitro convencionales para seleccionar anticuerpos que neutralizan la función del receptor. Se descartan anticuerpos que actúan como agonistas de ligandos imitando al ligando realizando ensayos adecuados tal como resultará evidente para los expertos en la técnica. Para determinadas células tumorales, los anticuerpos inhiben un ciclo de crecimiento autocrino (es decir, en el que una célula secreta un factor de crecimiento que entonces se une a un receptor de la misma célula). Puesto que algunos ligandos, por ejemplo TGF-D, se encuentran alojados en las membranas celulares, los anticuerpos que cumplen una función de direccionamiento se dirigen contra el ligando y/o el receptor.

El resto citotóxico de la inmunotoxina puede ser un fármaco citotóxico o una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano o vegetal, o un fragmento enzimáticamente activo de una toxina de este tipo. Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas usados son toxina diftérica, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), ricina, abrina, modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina y enomicina. En otra realización, los anticuerpos se conjugan con fármacos anticancerígenos de molécula pequeña. Se preparan conjugados del anticuerpo monoclonal y tales restos citotóxicos usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales. Ejemplos de tales reactivos son SPDP, IT, derivados bifuncionales de imidoésteres tales como un adipimidato de dimetilo HCl, ésteres activos tales como suberato de disuccinimidilo, aldehídos tales como glutaraldehído, compuestos de bis-azido tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina, derivados de bis-diazonio tales como bis-(pdiazoniobenzoil)-etilendiamina, diisocianatos tales como 2,6-diisocianato de tolileno y compuestos de bis-flúor activos tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno. La parte de lisis de una toxina puede unirse al fragmento Fab de los anticuerpos.

Pueden prepararse compuestos radiofarmacéuticos citotóxicos para tratar cáncer conjugando isótopos radiactivos con los anticuerpos. El término “resto citotóxico” tal como se usa en el presente documento pretende incluir tales isótopos.

En otra realización, se cargan liposomas con un fármaco citotóxico y se recubren los liposomas con anticuerpos que se unen específicamente a un receptor de factor de crecimiento. Puesto que hay muchos sitios de receptor, este método permite administrar grandes cantidades de fármaco al tipo celular apropiado. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden elegirse por el médico individual en vista del estado del paciente. (Véase por ejemplo Fingl et al, en The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975, cap. 1 pág. 1). Debe indicarse que el médico encargado sabrá cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la administración debido a toxicidad o disfunciones orgánicas. A la inversa, el médico encargado sabrá también ajustar el tratamiento a niveles superiores si la respuesta clínica no fuese adecuada (excluyendo toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el manejo del trastorno oncogénico de interés variará con la gravedad del estado que va a tratarse y con la vía de administración. La gravedad del estado puede evaluarse, por ejemplo, en parte, mediante métodos de evaluación de pronóstico convencionales. Además, la dosis y quizá la frecuencia de dosis también variarán según la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual.

Dependiendo de los estados específicos que están tratándose, tales agentes pueden formularse y administrarse de manera sistémica o local. Pueden encontrarse técnicas para la formulación y administración en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990). Las vías adecuadas pueden incluir administración oral, rectal, transdérmica, vaginal, transmucosa o intestinal; administración parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares, por nombrar tan sólo unas cuantas. Para inyección, los agentes de la invención pueden formularse en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hanks, disolución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica. Para tal administración transmucosa, se usan penetrantes apropiados para la barrera que va a permearse en la formulación. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica.

Habiéndose descrito por tanto la invención, se ilustra la práctica de la invención mediante los ejemplos experimentales proporcionados a continuación. El experto en la técnica se dará cuenta de que los materiales y métodos usados en los ejemplos ilustrativos pueden modificarse de diversos modos. Tales modificaciones se considera que se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de ARN a partir de tejido FPE Se extrae ARN a partir de tejido incrustado en parafina mediante el siguiente procedimiento general.

A. Desparafinización e hidratación de secciones

(1)

Se coloca una parte de una sección de aproximadamente 10 !M en un tubo de centrífuga de plástico de 1,5 ml.

(2)

Se añaden 600 !l de xileno y se agita la mezcla vigorosamente durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente (de aproximadamente 20 a 25ºC).

(3)

Se centrifuga la muestra durante aproximadamente 7 minutos a temperatura ambiente a la velocidad máxima de la centrífuga de mesa (aproximadamente 10-20.000 x g).

(4)

Se repiten las etapas 2 y 3 hasta que se haya disuelto la mayoría de la parafina. Se requieren normalmente dos o más veces dependiendo de la cantidad de parafina incluida en la parte de muestra original.

(5)

Se elimina la disolución de xileno agitando vigorosamente con un alcohol inferior, preferiblemente con etanol al 100% (aproximadamente 600 !l) durante aproximadamente 3 minutos.

(6)

Se centrifuga el tubo durante aproximadamente 7 minutos como en la etapa (3). Se decanta el sobrenadante y se desecha. El sedimento se vuelve blanco.

(7)

Se repiten las etapas 5 y 6 con disoluciones de etanol sucesivamente más diluidas: en primer lugar con etanol aproximadamente al 95%, luego con aproximadamente al 80% y finalmente con etanol aproximadamente al 70%.

(8)

Se centrifuga la muestra durante 7 minutos a temperatura ambiente como en la etapa.

(9)

Se desecha el sobrenadante y se deja que se seque el sedimento a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos.

B.

Aislamiento de ARN con fenol-cloroformo

(1)

Se añaden 400 !l de disolución de isotiocianato de guanidina que incluye sarcosina al 0,5% y 8 !l de ditiotreitol.

(2)

Se homogeneiza entonces la muestra con un homogeneizador de tejido (Ultra-Turrax, IKA-Works, Inc., Wilmington, NC) durante de aproximadamente de 2 a 3 minutos mientras se aumenta gradualmente la velocidad desde baja velocidad (velocidad 1) hasta alta velocidad (velocidad 5).

(3)

Se calienta entonces la muestra a aproximadamente 95ºC durante aproximadamente 5-20 minutos. Es preferible perforar el tapón del tubo que contiene la muestra con una aguja de calibre fino antes de calentar hasta 95ºC. Alternativamente, el tapón puede fijarse con una pinza de plástico o con película de laboratorio.

(4)

Se extrae entonces la muestra con 50 !l de acetato de sodio 2 M a pH 4,0 y 600 !l de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (10:1,93:0,036), recién preparado mezclando 18 ml de fenol con 3,6 ml de una disolución de alcohol isoamílico:cloroformo 1:49. Se agita la disolución vigorosamente durante aproximadamente 10 segundos, entonces se enfría en hielo durante aproximadamente 15 minutos.

(5)

Se centrifuga la disolución durante aproximadamente 7 minutos a velocidad máxima. Se transfiere la fase superior (acuosa) a un nuevo tubo.

(6)

Se precipita el ARN con aproximadamente 10 !l de glucógeno y con 400 !l de isopropanol durante 30 minutos a 20ºC.

(7)

Se sedimenta el ARN mediante centrifugación durante aproximadamente 7 minutos en una centrífuga de mesa a velocidad máxima; se decanta el sobrenadante y se desecha; y se lava el sedimento con aproximadamente 500 !l de etanol a de aproximadamente el 70 al 75%.

(8)

Se centrifuga la muestra de nuevo durante 7 minutos a velocidad máxima. Se decanta el sobrenadante y se seca el sedimento al aire. Se disuelve entonces el sedimento en un tampón apropiado para experimentos adicionales (por ejemplo, 50 pl de Tris cloruro 5 mM, pH 8,0).

Ejemplo 2

Transcripción inversa de ARNm y PCR

Transcripción inversa:

Se aisló ARN a partir de tejido microdiseccionado o no microdiseccionado fijado con formalina incrustado en parafina (FPE) tal como se ilustra en el ejemplo 1, o a partir de tejido fresco o congelado mediante un método de isocianato de guanidinio de una única etapa usando el kit de purificación de ARNm QuickPrepT Micro (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, N.J.) según las instrucciones del fabricante. Tras la precipitación con etanol y la centrifugación, se disolvió el sedimento de ARN en 50 !l de Tris/Cl 5 mM a pH 8,0. La transcriptasa inversa de M-MLV extenderá un cebador oligonucleotídico hibridado con un molde de ADN o ARN monocatenario en presencia de desoxinucleótidos, produciendo una hebra complementaria. Se sometió a transcripción inversa el ARN resultante con hexámeros al azar y transcriptasa inversa de M-MLV de Life Technologies. Se logró la transcripción inversa mezclando 25 !l de la disolución de ARN con 25,5 !l de “mezcla de transcripción inversa” (véase a continuación). Se colocó la reacción en un termociclador durante 8 min. a 26ºC (para la unión de los hexámeros al azar al ARN), 45 min. a 42ºC (para la reacción enzimática de transcripción inversa de M-MLV) y 5 min. a 95ºC (para la inactivación por calor de la ADNasa).

La “mezcla de transcripción inversa” consiste en 10 ul de tampón 5X (Tris-HCl 250 mM, pH 8,3, KCl 375 mM, MgCl2 15 mM), 0,5 ul de hexámeros al azar (50 D.O. disueltos en 550 ul de Tris-HCl 10 mM pH 7,5), 5 ul de dNTP 10 mM (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 5 ul de DTT 0,1 M, 1,25 ul de BSA (3 mg/ml en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5), 1,25 ul de ARN Guard

24.800 U/ml (inhibidor de ARNasa) (porcino n.º 27-0816, Amersham Pharmacia) y 2,5 ul de MMLV 200 U/ul (n.º de cat. de Life Tech 28025-02).

Las concentraciones finales de los componentes de la reacción son: Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, dNTP 1,0 mM, DTT 1,0 mM, BSA 0,00375 mg/ml, ARN Guard 0,62 U/ul y MMLV 10 U/!l.

Cuantificación por PCR de la expresión de ARNm.

Se realizó la cuantificación de ADNc de EGFR y un ADNc de un gen de mantenimiento o de control interno (por ejemplo,

�-actina) usando un método de detección en tiempo real basado en fluorescencia (sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700 o 7900 [TaqMan®], Applied Biosystems, Foster City, CA.) tal como se describe por Heid et al., (Genome Res 1996; 6:986-994); Gibson et al., (Genome Res 1996; 6:995-1001). En resumen, este método usa una sonda oligonucleotídica TaqMan® fluorogénica doblemente marcada, (EGFR-1773 (SEQ ID NO:3), Tm = 70ºC; HER2neu 2657 (SEQ ID NO:6), �-Actin-611 (SEQ ID NO:7) que se aparea específicamente dentro de los cebadores directo e inverso. La estimulación con láser dentro de los pocillos tapados que contienen la mezcla de reacción provoca la emisión de un colorante extintor en 3’ (TAMRA) hasta que la sonda se escinde mediante la actividad nucleasa 5’ a 3’ de la ADN polimerasa durante la extensión de la PCR, provocando la liberación de un colorante indicador en 5’ (6FAM). La producción de un amplicón provoca por tanto la emisión de una señal fluorescente que se detecta mediante la cámara de detección CCD (dispositivo de carga acoplada) de TaqMan®, y la cantidad de señal producida en un ciclo umbral dentro de la fase puramente exponencial de la reacción PCR refleja el número de copias de partida de la secuencia de interés. La comparación del número de copias de partida de la secuencia de interés con el número de copias de partida del gen de control interno proporciona un nivel de expresión génica relativa. El análisis de TaqMan® produce niveles que se expresan como razones entre dos mediciones absolutas (gen de interés/gen de control interno).

La mezcla de reacción PCR consistía en 0,5 !l de la reacción de transcripción inversa que contenía el ADNc preparado tal como se describió anteriormente, 600 nM de cada cebador oligonucleotídico EGFR-1753F (SEQ ID NO:1, Tm = 59ºC)

y EGFR-1823R (SEQ ID NO:2, Tm = 58ºC) o cebadores oligonucleotídicos HER2-neu 2671F (SEQ ID NO:4) y HER2neu 2699R (SEQ ID NO:5), sonda TaqMan® 200 nM (SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:6), 5 U de polimerasa AmpliTaq Gold, 200 !M de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP 400 !M, MgCl2 5,5 mM y 1 x tampón TaqMan A que contenía un colorante de referencia, hasta un volumen final inferior o igual a 25 !l (todos los reactivos de Applied Biosystems, Foster City, CA). Las condiciones de ciclación fueron 95ºC durante 10 min., seguido por 45 ciclos a 95ºC durante 15 s y 60ºC durante 1 min. Los oligonucleótidos usados para cuantificar el gen de control interno -actina fueron (�-Actin-592F (SEQ ID NO:8) y �-Actin-651R (SEQ ID NO:9).

Ejemplo 3

Determinación de la expresión génica no corregida (UGE) para EGFR

Se llevan a cabo dos pares de reacciones en paralelo. Las reacciones de “prueba” y las reacciones de “calibración”. Figura 7. La reacción de amplificación de EGFR y la reacción de amplificación del control interno de �-actina son las reacciones de prueba. Se realizan reacciones de amplificación de EGFR y �-actina separadas en el molde de ARN calibrador y se denominan reacciones de calibración. El instrumento TaqMan® proporcionará cuatro valores de umbral de ciclo (Ct) diferentes: CtEGFR y Ct -actina a partir de las reacciones de prueba y CtEGFR y Ct �-actina a partir de las reacciones de calibración. Se determinan las diferencias en los valores de Ct para las dos reacciones según la siguiente ecuación:

"Ctprueba = CtEGFR - Ct�-actina (a partir de la reacción de “prueba”)

"Ctcalibrador = CtEGFR - Ct�-actina (a partir de la reacción de “calibración”)

A continuación, la etapa implica elevar el número 2 al "Ct negativo, según las siguientes ecuaciones.

2-"Ct

prueba (a partir de la reacción de “prueba”)

2-"Ctcalibrador (a partir de la reacción de “calibración”)

Con el fin de obtener entonces una expresión génica no corregida para EGFR a partir del instrumento TaqMan®, se lleva a cabo el siguiente cálculo:

Expresión génica no corregida (UGE) para EGFR = 2-"Ctprueba / 2-"Ctcalibrador

Normalización de UGE con niveles de expresión de EGFR relativa conocidos

El cálculo de normalización supone una multiplicación de la UGE por un factor de corrección (KEGFR) específico para EGFR y un ARN calibrador particular. También puede determinarse un factor de corrección KEGFR para cualquier gen de control interno y cualquier ARN calibrador precuantificado de manera exacta. Preferiblemente, se usan el gen de control interno �-actina y el ARN calibrador precuantificado de manera exacta, ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017). Dados estos reactivos, el factor de corrección KEGFR es igual a 1,54.

Se logra la normalización usando una modificación del método de "Ct descrito por Applied Biosystems, el fabricante de TaqMan®, en el boletín de usuario n.º 2 y descrito anteriormente. Para llevar a cabo este procedimiento, se analizó la UGE de 6 tejidos de prueba FPE diferentes para determinar la expresión de EGFR usando la metodología de TaqMan® descrita anteriormente. Se usó el gen de control interno �-actina y el ARN calibrador, ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017).

Se dividió el nivel de expresión de EGFR relativa ya conocido de cada muestra AG221, AG222, AG252, pulmón adulto, PC3, AdCol entre su correspondiente UGE derivada de TaqMan® para proporcionar un factor de corrección K no promediado.

Kno promediado = Valores conocidos / UGE

A continuación, se promedian todos los valores de K para determinar un único factor de corrección KEGFR específico para EGFR, ARN total de hígado humano de Stratagene (Stratagene, n.º de cat. 735017) a partir de ARN calibrador y actina.

Por tanto, para determinar la expresión de EGFR relativa corregida en una muestra de tejido desconocido a una escala que concuerda con estudios de expresión de EGFR anteriores a TaqMan®, simplemente se multiplican los datos de expresión génica no corregida (UGE) derivados del aparato TaqMan® por el factor de corrección específico KEGFR, dado el uso del mismo gen de control interno y ARN calibrador.

Expresión de EGFR relativa corregida = UGE x KEGFR

Puede determinarse un KEGFR usando cualquier ARN calibrador precuantificado de manera exacta o gen de control interno. Pueden calibrarse fuentes futuras de ARN precuantificado de manera exacta con respecto a muestras con niveles de expresión de EGFR relativa conocidos tal como se describe en el método anterior o pueden calibrarse ahora frente a ARN calibrador calibrado previamente tal como ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017) descrito anteriormente.

Por ejemplo, si se determina un KEGFR posterior para un gen de control interno diferente y/o un ARN calibrador diferente, deben calibrarse tanto el gen de control interno como el ARN calibrador con respecto a muestras de tejido para las que los niveles de expresión de EGFR en relación con los de ese gen de control interno particular ya se han determinado. Una determinación de este tipo puede realizarse usando técnicas de RT-PCR cuantitativa, anteriores a TaqMan® convencionales bien conocidas en la técnica. Los niveles de expresión conocidos para estas muestras se dividirán entre sus correspondientes niveles de UGE para determinar una K para esa muestra. Se promedian entonces los valores de K dependiendo del número de muestras conocidas para determinar un nuevo KEGFR específico para el gen de control interno y/o ARN calibrador diferente.

Ejemplo 4

Determinación de la expresión génica no corregida (UGE) para HER2-neu

Se llevan a cabo dos pares de reacciones en paralelo. Las reacciones de “prueba” y las reacciones de “calibración”. Figura 8. La reacción de amplificación de HER2-neu y la reacción de amplificación del control interno de actina son las reacciones de prueba. Se realizan reacciones de amplificación de HER2-neu y �-actina separadas en el molde de ARN calibrador y se denominan reacciones de calibración. El instrumento TaqMan® proporcionará cuatro valores de umbral de ciclo (Ct) diferentes: CtHER2-neu y Ct -actina a partir de las reacciones de prueba y CtHER2-neu y Ct actina a partir de las reacciones de calibración. Se determinan las diferencias en los valores de Ct para las dos reacciones según la siguiente ecuación:

"Ctprueba = CtHER2-neu - Ct -actina (a partir de la reacción de “prueba”)

"Ctcalibrador = CtHER2-neu - Ct -actina (a partir de la reacción de “calibración”)

A continuación, la etapa implica elevar el número 2 al "Ct negativo, según las siguientes ecuaciones.

2-"Ct

prueba (a partir de la reacción de “prueba”)

2-"Ctcalibrador (a partir de la reacción de “calibración”)

Con el fin de obtener entonces una expresión génica no corregida para HER2-neu a partir del instrumento TaqMan®, se lleva a cabo el siguiente cálculo:

Expresión génica no corregida (UGE) para HER2-neu = 2-"Ctprueba / 2-"Ctcalibrador

Normalización de UGE con niveles de expresión de HER2-neu relativa conocidos

El cálculo de normalización supone una multiplicación de la UGE por un factor de corrección (KHER2-neu) específico para HER2-neu y un ARN calibrador particular. También puede determinarse un factor de corrección KHER2-neu para cualquier gen de control interno y cualquier ARN calibrador precuantificado de manera exacta. Preferiblemente, se usan el gen de control interno �-actina y el ARN calibrador precuantificado de manera exacta, ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017). Usando -actina y el ARN calibrador precuantificado de manera exacta, ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017), el factor de corrección KHER2-neu es igual a 12,6 x 10-3.

Se logra la normalización usando una modificación del método de "Ct descrito por Applied Biosystems, el fabricante de TaqMan®, en el boletín de usuario n.º 2 y descrito anteriormente. Para llevar a cabo este procedimiento, se analizó la UGE de 6 tejidos de prueba FPE diferentes para determinar la expresión de HER2-neu usando la metodología de TaqMan® descrita anteriormente. Se usó el gen de control interno �-actina y el ARN calibrador, ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017).

Se dividió el nivel de expresión de HER2-neu relativa ya conocido de cada muestra AG221, AG222, AG252, pulmón adulto, PC3, AdCol entre su correspondiente UGE derivada de TaqMan® para proporcionar un factor de corrección K no promediado.

Kno promediado = Valores conocidos / UGE

A continuación, se promedian todos los valores de K para determinar un único factor de corrección KEGFR específico para HER2-neu, calibrador de ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017) y �-actina.

Por tanto, para determinar la expresión de HER2-neu relativa corregida en una muestra de tejido desconocido a una escala que concuerda con estudios de expresión de HER2-neu anteriores a TaqMan®, simplemente se multiplican los datos de expresión génica no corregida (UGE) derivados del aparato TaqMan® por el factor de corrección específico KHER2-neu, dado el uso del mismo gen de control interno y ARN calibrador.

Expresión de HER2-neu relativa corregida = UGE por KHER2-neu

Puede determinarse un KHER2-neu usando cualquier ARN calibrador precuantificado de manera exacta o gen de control interno. Pueden calibrarse fuentes futuras de ARN precuantificado de manera exacta con respecto a muestras con niveles de expresión de EGFR relativa conocidos tal como se describe en el método anterior o pueden calibrarse ahora frente a ARN calibrador calibrado previamente tal como ARN total de hígado humano (Stratagene, n.º de cat. 735017) descrito anteriormente.

Por ejemplo, si se determina un KHER2-neu posterior para un gen de control interno diferente y/o un ARN calibrador diferente, deben calibrarse tanto el gen de control interno como el ARN calibrador con respecto a muestras de tejido para las que los niveles de expresión de HER2-neu en relación con los de ese gen de control interno particular ya se han determinado o publicado. Una determinación de este tipo puede realizarse usando técnicas de RT-PCR cuantitativa, anteriores a TaqMan® convencionales bien conocidas en la técnica. Los niveles de expresión conocidos para estas muestras se dividirán entre sus correspondientes niveles de UGE para determinar una K para esa muestra. Se promedian entonces los valores de K dependiendo del número de muestras conocidas para determinar un nuevo KHER2neu específico para el gen de control interno y/o ARN calibrador diferente.

Ejemplo 5

Población de pacientes y adquisición de tejidos

Pacientes

Se estudiaron ochenta y tres pacientes que padecían NSCLC que consistían en sesenta y cinco (78,3%) hombres y 18 (21,7%) mujeres, con una mediana de edad de 63,5 años (intervalo, 34-82). Treinta y nueve (47%) pacientes tenían carcinomas de células escamosas, 32 (38,6%) tenían adenocarcinoma y 12 (14,5%) tenían carcinomas de células grandes. Se clasificaron los tumores primarios histopatológicamente como bien diferenciados (G1, un paciente), moderadamente diferenciados (G2, 18 pacientes) y escasamente diferenciados (G3, 64 pacientes). Se realizó la determinación del estadio del tumor según la clasificación TNM de la Unión Internacional contra el Cáncer (“International Union Against Cancer”) (UICC): cuarenta y uno (49,4%) tenían tumores en estadio I, 16 (19,3%) tenían tumores en estadio II y 26 (31,3%) tenían tumores en estadio IIIa. Se resecaron completamente todos los tumores (categoría R0), mediante al menos una lobectomía como control de calidad. Los pacientes con tumores en estadio histopatológico IIIa recibieron radioterapia posoperatoria. La mediana del seguimiento fue de 85,9 meses (mín. 63,3; máx. 105,2 meses) y no se perdió ningún paciente durante el seguimiento.

Adquisición de tejidos.

Se obtuvo tejido para el análisis de la expresión génica inmediatamente tras la resección pulmonar antes de comenzar la linfadenectomía mediastinal y se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido. Se analizaron tejidos de las siguientes 2 ubicaciones: tejido tumoral y tejido pulmonar no implicado tomado de la mayor distancia al tumor. Se tomaron secciones congeladas de 6 !m de bloques de tejido tumoral y comenzando con la primera sección se tiñó rutinariamente cada quinta con HE y se evaluó histopatológicamente. Se agruparon secciones para su análisis a partir de zonas de un 75% estimado de células malignas. Se aisló el ARN de las muestras de tejido según los métodos del ejemplo 2.

Ejemplo 6

Análisis estadístico

Los análisis de TaqMan® producen valores que se expresan como UGE. Se usó la razón entre UGE en tejido tumoral y UGE en tejido pulmonar no maligno coincidente para determinar la expresión génica diferencial. Se sometieron a prueba las asociaciones entre las dos variables de UGE usando una prueba de Wilcox de rangos con signos. Se usó la prueba de chi-cuadrado para analizar las asociaciones entre las variables clinicopatológicas categóricas. Se usaron razones de riesgos para calcular los riesgos relativos de muerte. Estos cálculos se basaron en la estimación de Pike, con el uso del número observado y esperado de acontecimientos tal como se calcula en el estadístico de prueba de rangos logarítmicos. Pike, J R Stat Soc Series A 135:201-203; 1972. Se adaptó el método de chi-cuadrado máximo de Miller y Sigmund (Miller et al., Biometrics 38:1011-1016, 1982) y Halpern (Biometrics 38: 1017-1023, 1982) para determinar qué valor de expresión segregaba mejor los pacientes en subgrupos de pronóstico bueno y malo (en cuanto a probabilidad de supervivencia), con la prueba de rangos logarítmicos como estadístico para medir la fuerza del agrupamiento. Para determinar un valor de P que se interpretaría como una medida de la fuerza de la asociación basándose en el análisis de chi-cuadrado máximo, se usaron 1000 simulaciones de tipo remuestreo (“bootstrap”) para estimar la distribución del estadístico de chi-cuadrado máximo bajo la hipótesis de no asociación. Halpern, Biometrics 38:1017-1023, 1982. Se realizó un modelado de riesgos proporcionales de Cox de factores que eran significativos en el análisis univariante para identificar qué factores tendrían una influencia significativa sobre la supervivencia. El nivel de significación se fijó a p < 0,05.

Pudo detectarse expresión de ARNm de HER2-neu mediante RT-PCR en tiempo real cuantitativa en 83 de 83 (100%) muestras de pulmón normal y 83 de 83 (100%) muestras de tumor. La expresión de ARNm de HER2-neu corregida, expresada como la razón entre el producto de PCR de HER2-neu y �-actina, fue de 4,17 x 10-3 (intervalo de 0,28-23,86 x 10-3) en pulmón normal y de 4,35 x 10-3 (intervalo: 0,21-68,11 x 10-3) en tejido tumoral (P=0,019, prueba de Wilcoxon). El método de chi-cuadrado máximo por Miller y Siegmund (Miller et al., Biometrics 38:1011-1016, 1982) y Halpern (Biometrics 38:1017-1023, 1982) determinó un valor umbral de 1,8 para segregar pacientes en pacientes con baja y alta expresión de HER2-neu diferencial. Mediante este criterio, 29 (34,9%) pacientes tenían una alta expresión de HER2-neu diferencial y 54 (65,1%) tenían una baja expresión de HER2-neu diferencial. La figura 4 muestra asociaciones entre datos clinicopatológicos y el estado de expresión génica de HER2-neu diferencial. No hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa detectable. La figura 1 presenta un gráfico de Kaplan Meier de la probabilidad de supervivencia estimada frente al estado de expresión de ARNm de HER2-neu diferencial. No se alcanzó la mediana de la supervivencia en el grupo de baja expresión de HER2-neu diferencial en comparación con 31,1 meses (I.C. del 95%: 21,96-40,24) en el grupo de alta expresión de HER2-neu diferencial. Para determinar un valor de P, se usaron simulaciones de tipo remuestreo para estimar la distribución de un estadístico de chi-cuadrado máximo, puesto que el valor umbral de 1,8 se había elegido tras examinar los datos. El valor de P ajustado resultado fue de 0,004 (prueba de rangos logarítmicos).

Se determinó a continuación la exactitud de HER2-neu como factor de pronóstico mediante el análisis de modelo de riesgos proporcionales de Cox. En el análisis univariante de posibles factores de pronóstico, alta expresión de HER2neu diferencial así como clasificación pT (estadio de tumor), clasificación pN (estadio de ganglios linfáticos) y estadio de tumor avanzados eran factores de pronostico desfavorables significativos (figura 5). En un análisis multivariante de factores de pronóstico (figura 6), alta expresión de HER2-neu diferencial era un factor de pronostico desfavorable independiente y significativo, así como estadio de tumor y clasificación pN avanzados.

Pudo detectarse expresión de ARNm de EGFR mediante RT-PCR en tiempo real cuantitativa en 83 de 83 (100%) muestras de pulmón normal y 83 de 83 (100%) muestras de tumor. La mediana corregida de expresión de ARNm de EGFR fue de 8,17 x 10-3 (intervalo: 0,31-46,26 x 10-3 en pulmón normal y 7,22 x 10-3 (intervalo: 0,27-97,49 x 10-3) en tejido tumoral (P=n.s.). El método de chi-cuadrado máximo (Miller (1982); Halpern (1982)) determinó un valor umbral de 1,8 para segregar pacientes en pacientes con baja y alta expresión de EGFR diferencial. Mediante este criterio, 28 (33,7%) pacientes tenían un estado de alta expresión de EGFR diferencial y 55 (66,3%) tenían un estado de baja expresión de EGFR diferencial. No hubo ninguna diferencia significativa estadística detectable entre variables clinicopatológicas y el estado de expresión de ARNm de EGFR diferencial (figura 4). Podía observarse una tendencia hacia una supervivencia global inferior para el grupo de alta expresión de EGFR diferencial, pero no alcanzó significación estadística (figura 2). No se alcanzó la mediana de la supervivencia en el grupo de baja expresión de EGFR diferencial en comparación con 32,37 meses (I.C. del 95%: 8,43-56,31) en el grupo de pacientes con alta expresión de EGFR diferencial (P=0,176).

Se encontraron niveles de alta expresión (por encima de 1,8) de HER2-neu y EGFR diferencial en 14 de 83 (16,9%) pacientes. Cuarenta de 83 (48,2%) pacientes mostraron un estado de baja expresión diferencial (por debajo de 1,8) para HER2-neu y EGFR, mientras que 14 de 83 (16,9%) mostraron una alta expresión diferencial para EGFR sólo, y 15 de 83 (18,1%) pacientes presentaron una alta expresión diferencial para HER2-neu. No se alcanzó la mediana de la supervivencia en el grupo que mostró baja expresión de HER2-neu y EGFR diferencial, en comparación con 45,47 meses en el grupo de alta expresión de EGFR diferencial, 31,10 meses (I.C. del 95%: 14,77-47,43) en el grupo de alta expresión de HER2-neu diferencial y 22,03 meses (I.C. del 95%: 2,30; 41,76; P=0,003; prueba de rangos logarítmicos; figuras 3 y 5) en el grupo de alta expresión de HER2-neu y EGFR diferencial. El análisis univariante presentó alta coexpresión de HER2-neu y EGFR diferencial como un factor de pronóstico desfavorable significativo (figura 5). En un análisis multivariante de factores de pronóstico (figura 6), alta coexpresión de HER2-neu diferencial y alta coexpresión de EGFR diferencial fueron un factor de pronóstico desfavorable independiente y significativo, tal como avanzó la clasificación pN y el estadio de tumor.

Ejemplo 7

Respuesta del tumor a una quimioterapia dirigida a receptores tirosina cinasa

Se identificó inicialmente que tumores de cinco pacientes con cáncer de colon expresaban EGFR mediante inmunohistoquímica. Se trataron los pacientes con Imclone IMC-C225, dosis de carga de 400 mg/m2 seguido por 250 mg/m2 a la semana, más CPT-11 a la misma dosis y programa que había seguido previamente el paciente. Se mantuvieron las atenuaciones de la dosis de CPT-11 previas.

Usando la metodología descrita en los ejemplos 1-4, se determinó que el paciente 1 tenía un nivel de expresión de EGFR corregida de 2,08 x 10-3 y tenía una respuesta completa (RC) a una quimioterapia dirigida a receptores tirosina cinasa que comprendía CPT-11 (7-etil-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]carboxicamptotecina) / C225 (un anticuerpo monoclonal anti-EGFR eficaz en terapia anticancerígena; Mendelsohn, Endocr Relat Cancer marzo de 2001; 8(1):3-9). El paciente 2 tenía un nivel de expresión de EGFR corregida de 8,04 x 10-3 y tenía una respuesta parcial (RP) a la quimioterapia dirigida a receptores tirosina cinasa. El paciente 3 tenía un nivel de expresión de EGFR corregida de 1,47 x 10-3 y también mostraba una respuesta parcial (RP) a la quimioterapia dirigida a receptores tirosina cinasa. El paciente 4 tenía un nivel de expresión de EGFR corregida de 0,16 x 10-3 y tenía enfermedad estable (EE) sin mostrar respuesta a la quimioterapia dirigida a receptores tirosina cinasa. El paciente 5 no tenía expresión de EGFR (0,0 x 10-3) y tenía enfermedad progresiva (EP) sin mostrar respuesta a la quimioterapia dirigida a receptores tirosina cinasa. Véase la figura 9.

Lista de secuencias

<110> K. Danenberg et al.

<120> Método de determinación de la expresión génica del receptor del factor de crecimiento epidérmico y HER2-Neu

<130> 11220/120

<140> Por asignar

<141>

<160> 11

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

<210> 1

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1 tgcgtctctt gccggaat

<210> 2

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 2 ggctcaccct ccagaagctt

<210> 3

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 3 acgcattccc tgcctcggct g

<210> 4

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 4

ctgaactggt gtatgcagat tgc

23

<210> 5

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 5

ttccgagcgg ccaagtc

17

<210> 6

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 6

tgtgtacgag ccgcacatcc tcca

24

<210> 7

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 7

accaccacgg ccgagcgg

18

<210> 8

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 8

tgagcgcggc tacagctt

18

<210> 9

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 9

tccttaatgt cacgcacgat tt

22

<210> 10

<211> 197496

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 4350

<212> ADN

<213> Homo sapiens

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para determinar el nivel de expresión de EGFR en una muestra de tejido fijada incrustada en parafina, pudiéndose usar dicho método para determinar un régimen quimioterápico que comprende:

   (a)

   desparafinizar la muestra de tejido para obtener una muestra desparafinizada;

   (b)

   aislar ARNm de la muestra desparafinizada mediante calentamiento en presencia de una cantidad eficaz de un agente caotrópico hasta una temperatura en el intervalo de 75 a aproximadamente 100ºC durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 a aproximadamente 120 minutos y recuperación de dicho ARNm de la disolución caotrópica;

   (c)

   someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores oligonucleotídicos que consiste en un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 o una secuencia al menos el 80% idéntica a la misma, y un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:2 o una secuencia al menos el 80% idéntica a la misma para obtener una muestra amplificada; y

   (d)

   determinar la cantidad de ARNm de EGFR en relación con la cantidad de ARNm de un gen de control interno.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que el par de cebadores oligonucleotídicos consiste en un oligonucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 y un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:2.

3. 3.

   Método para determinar el nivel de expresión de HER2-neu en una muestra de tejido fijada incrustada en parafina, pudiéndose usar dicho método para determinar un régimen quimioterápico que comprende:

   (a)

   desparafinizar la muestra de tejido para obtener una muestra desparafinizada;

   (b)

   aislar ARNm de la muestra desparafinizada mediante calentamiento en presencia de una cantidad eficaz de un agente caotrópico hasta una temperatura en el intervalo de 75 a aproximadamente 100ºC durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 a aproximadamente 120 minutos y recuperación de dicho ARNm de la disolución caotrópica;

   (c)

   someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores oligonucleotídicos que se hibridan en condiciones rigurosas con una región del gen HER2-neu que consiste en un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:4 o una secuencia al menos el 80% idéntica a la misma, y un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:5 o una secuencia al menos el 80% idéntica a la misma para obtener una muestra amplificada; y

   (d)

   determinar la cantidad de ARNm de HER2-neu en relación con la cantidad de ARNm de un gen de control interno.

4. 4.

   Método según la reivindicación 3, en el que el par de cebadores oligonucleotídicos consiste en un oligonucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:4 y un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:5.

5. 5.

   Método según la reivindicación 1 ó 3, en el que el gen de control interno es un gen de �-actina.