CN108342464A

CN108342464A - 一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN108342464A
Application number: CN201810300644.0A
Authority: CN
Inventors: 王三
Original assignee: Good Gene Biotechnology (wuhan) Co Ltd
Current assignee: Good Gene Biotechnology (wuhan) Co Ltd
Priority date: 2018-04-04
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2018-07-31

Abstract

本发明涉及一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒及其检测方法，首先针对HER2/neu基因设计合成用于检测其表达量的上下游引物、HER2/neu cDNA特异性探针，为了有效降低因不同个体差异带来的偏差，引入了ACTB和GAPDH作为内参基因。内参基因与目的基因均会产生阈循环值(即Ct值)，通过计算内参基因与目的基因的Ct值的差值即ΔCt值，可实现对乳腺癌组织标本中的HER2基因扩增水平进行检测。本发明中所选用的内参基因在组织中的表达比较稳定，因此ΔCt值的大小表示乳腺癌组织标本中HER2基因的扩增程度。检测过程由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生，检测结果可用于由HER2基因扩增导致的乳腺癌的辅助诊断、药物治疗及预后等多个领域研究。

Description

一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中基因的分子生物学检测，尤其涉及一种一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒及其检测方法。

背景技术

HER2受体(也称c-erbB-2，HER2/neu)是分子量为185kD，具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，其编码基因定位于人染色体17q21，是表皮生长因子受体家族成员，参与细胞分裂增殖、分化及凋亡等一系列代谢调节。HER2/neu基因是一种原癌基因，1987年Slamon等首次报道HER-2/neu基因在乳腺癌细胞中过度表达与乳腺癌复发及生存率有关。HER-2/neu基因被确认为一种新的肿瘤标记物。HER2基因过度表达可导致细胞过度增值和表型恶性转化。

研究表明，HER2在20％-30％的原发性乳腺浸润性导管癌中存在基因的扩增和蛋白的过度表达。HER2阳性的乳腺癌对常规的化疗和内分泌治疗反应差，肿瘤浸润性强，无病生存期短，预后差。为此，多种阻断HER2的抗癌药物相继问世，其中，目前经FDA批准最为常用的此类药物是曲妥珠单抗，它是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于HER2的细胞外部位，适用于治疗HER2过度表达的乳腺癌。由于只有HER2蛋白过度表达和基因扩增的乳腺癌患者接受曲妥珠单抗治疗才有效，因此准确评价HER2基因和蛋白水平对治疗至关重要。

目前检测HER-2/neu基因扩增和蛋白表达的常用方法主要有以下4种：

1、免疫组织化学法(IHC)：IHC检测HER-2蛋白表达是目前最常用的方法，它采用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的曾色反应，对想要抗原进行定性、定位、定量检测的一项技术，IHC方法操作简便，价格低廉，但变异性较大，操作过程中容易受各种主、客观因素的影响，如判断标准、抗体的敏感性以及不同的实验条件等都有可能产生不同的阳性率。

2、荧光原位杂交法(FISH)：FISH检测相较IHC有着更高的准确性，但是其高昂的检测成本和复杂耗时的检测流程至今仍是制约该技术在国内普及应用的主要障碍。

3、荧光定量PCR法：目前中国专利CN106148496A、CN105112522A及CN106381338A均是基于HER2基因扩增的检测方法，该方法虽然快速，灵敏度高，但不能直接反映靶向药物的作用靶点HER2蛋白是否高表达，因而可能存在漏诊的情况。

4、HER2基因表达的mRNA可直接反映HER2蛋白的表达量，但目前一些文献及期刊论文上基于mRNA检测基因表达量的分析方法多为先提取特异组织RNA，然后将RNA逆转录成cDNA，再取一定量的逆转录产物作为下一步PCR的扩增模板，进而对目的RNA作相对定量分析，此方法虽可以很好的反映HER2蛋白的表达水平，但mRNA到PCR扩增中间经历了二步，过程相对繁琐。

发明内容

为了克服现有技术的上述不足，本发明提出了一种一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒及其检测方法，该方法设计了检测HER2 cDNA的特异性引物和探针，并结合特异性的内参基因及其引物、探针及PCR条件，一步法检测HER2/neu基因表达量，本发明的方法过程快速、简便、检测准确度和灵敏度高。

为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种用于检测HER2/neu基因表达量的HER2 cDNA特异性引物和HER2cDNA特异性探针，其中HER2 cDNA特异性上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，HER2 cDNA特异性下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，所述HER2 cDNA特异性探针序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明的第二个目的是提供一种一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒，所述试剂盒由1)PCR反应液和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒组成，其中PCR反应液由PCR缓冲液、权利要求1的用于检测HER2/neu基因表达量的HER2 cDNA特异性引物和HER2cDNA特异性探针、内参ACTB cDNA特异性上游引物、内参ACTB cDNA特异性下游引物、内参ACTB cDNA特异性探针、内参GAPDH cDNA特异性上游引物、内参GAPDH cDNA特异性下游引物、内参GAPDH cDNA特异性探针、逆转录酶和DNA聚合酶组成。

进一步地，所述内参ACTB cDNA特异性上游引物序列如SEQ ID NO：4所示、内参ACTB cDNA特异性下游引物序列如SEQ ID NO：5所示、内参ACTB cDNA特异性探针序列如SEQID NO：6所示，内参GAPDH cDNA特异性上游引物序列如SEQ ID NO：7所示，内参GAPDH cDNA特异性下游引物序列如SEQ ID NO：8所示，内参GAPDH cDNA特异性探针序列如SEQ ID NO：9所示。

进一步地，PCR反应液中HER2上下游引物终浓度为200nM-600nM，HER2探针终浓度为200nM-400nM，ACTB内参和GAPDH内参的上下游引物终浓度为200nM-600nM，ACTB内参和GAPDH内参探针终浓度为200nM-600nM。

进一步地，所述PCR缓冲液由Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0)、MgCl₂(250mM)、KCl(250mM)和dNTP(100mM)组成。

进一步地，所述逆转录酶为耐高温逆转录酶，每个反应用量为10～60U。

进一步地，所述DNA聚合酶采用热启动Taq酶，每个反应用量为0.2～2U。

进一步地，所述HER2 cDNA特异性探针、内参ACTB cDNA特异性探针、内参GAPDHcDNA特异性探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。

利用上述试剂盒一步法检测HER2/neu基因表达量的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样本RNA，并对提取的RNA进行浓度及纯度测定；

(2)将步骤(1)中已知浓度的RNA样本用TE稀释成2～20ng/μl；

(3)取PCR反应液分装到PCR管内，反应体积为25μl～50μl；

(4)向步骤(3)中分装的PCR反应液中加入2μl步骤(2)中已稀释备用的样本RNA和阴性对照品，体积不足部分加双蒸水补齐，所述阴性对照品为双蒸水；

(5)设置PCR程序，实时荧光PCR检测。

进一步地，实时荧光PCR检测的PCR扩增反应条件为：52℃，30min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，40s，捕捉荧光信号，进行45个循环。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)通过设计特异性高的引物及荧光探针，再配置成使用方便、检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR反应体系，使RNA逆转录与cDNA在同一管Mix中反应，实现了逆转录-PCR扩增一步法操作，使得本发明具有操作简单、检测速度快、检测敏感性高及特异性好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用；

(2)本发明的试剂盒在扩增待检标本时，内参基因与目的基因均会产生阈循环值(即Ct值)，通过计算内参基因与目的基因的Ct值的差值即ΔCt值，可实现对乳腺癌组织标本中的HER2基因扩增水平进行检测。本发明中所选用的内参基因在组织中的表达比较稳定，因此ΔCt值的大小表示乳腺癌组织标本中HER2基因的扩增程度，且ΔCt值越大说明HER2基因扩增水平越高。检测过程由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生，检测结果可用于由于HER2基因扩增导致的乳腺癌的辅助诊断、药物治疗及预后等多个领域研究。

附图说明

图1为两个样本中HER2基因的扩增曲线；

图2为两个样本中内参ACTB基因的扩增曲线；

图3为两个样本中内参GAPDH基因的扩增曲线。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)。

本发明提供了一种用于检测HER2/neu基因表达量的HER2 cDNA特异性引物和HER2cDNA特异性探针，HER2 cDNA特异性上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，HER2 cDNA特异性下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，所述HER2 cDNA特异性探针序列如SEQ ID NO：3所示。其中HER2 cDNA特异性探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。

本发明还提供了一种一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒，所述试剂盒由1)PCR反应液和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒组成，其中PCR反应液由PCR缓冲液、权利要求1的用于检测HER2/neu基因表达量的HER2 cDNA特异性引物和HER2 cDNA特异性探针、内参ACTB cDNA特异性上游引物、内参ACTB cDNA特异性下游引物、内参ACTB cDNA特异性探针，内参GAPDH cDNA特异性上游引物，内参GAPDH cDNA特异性下游引物，内参GAPDH cDNA特异性探针、PCR缓冲液、逆转录酶和DNA聚合酶组成。其中内参ACTB cDNA特异性上游引物序列如SEQ ID NO：4所示、内参ACTB cDNA特异性下游引物序列如SEQ ID NO：5所示、内参ACTB cDNA特异性探针序列如SEQ ID NO：6所示，内参GAPDH cDNA特异性上游引物序列如SEQ ID NO：7所示，内参GAPDH cDNA特异性下游引物序列如SEQ ID NO：8所示，内参GAPDH cDNA特异性探针序列如SEQ ID NO：9所示。所述HER2上下游引物终浓度为200nM-600nM，优选为400nM；HER2探针终浓度为200nM-400nM，优选为200nM，ACTB内参和GAPDH内参的上下游引物终浓度为200nM-600nM，优选为400nM，ACTB内参和GAPDH内参探针终浓度为200nM-400nM，优选为200nM。内参ACTB cDNA特异性探针、内参GAPDH cDNA特异性探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。PCR缓冲液由Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0)、MgCl2(8mmol/L)、KCl(250mmol/L)、甲酰胺(5％)和dNTP(25mmol/L)组成。逆转录酶为耐高温逆转录酶，每个反应用量为10～60U，优选为逆转录酶处理温度52℃，每个反应用量50U。所述DNA聚合酶采用热启动Taq酶，每个反应用量为0.2～2U，优选为采用化学修饰热启动Taq酶，每个反应用量1U。

最后，本发明提供了一种利用上述试剂盒一步法检测HER2/neu基因表达量的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样本RNA，并对提取的RNA进行浓度及纯度测定；

(2)将步骤(1)中已知浓度的RNA样本用TE稀释成2～20ng/μl；

(3)取PCR反应液分装到PCR管内，反应体积为25μl～50μl；

(5)设置PCR程序，实时荧光PCR检测。

实施例1：试剂盒的制备

1、引物、探针的合成

通过在线分析数据库Repeat Masking(http://www.girinst.org/)对Her2基因进行分析，得到HER2/neu基因的序列(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列)，将HER2/neu基因序列导入引物设计软件Primer5进行引物设计，并用人工合成的方法合成如下引物：

HER2 cDNA上游引物SEQ ID NO1：

5`-acagcggtgtgagaagtgc-3`

HER2 cDNA下游引物SEQ ID NO2：

5`-gtaactgccctcacctctcg-3`

同时，本发明在评价HER2表达量的时候，为了有效降低因不同个体差异带来的偏差，引入了2个内参基因，分别为内参ACTB和内参GAPDH，并用相同的方法合成了二者的引物：

内参ACTB cDNA上游引物SEQ ID NO4：

5`-cgagcgcggctacagctt-3`

内参ACTB cDNA下游引物SEQ ID NO5：

5`-tccttaatgtcacgcacgattt-3`

内参GAPDH cDNA上游引物SEQ ID NO7：

5`-ccacatcgctcagacaccat-3`

内参GAPDH cDNA下游引物SEQ ID NO8：

5`-ccaggcgcccaatacg-3`

用于荧光PCR扩增和监测体系的HER2 cDNA、内参ACTB cDNA、内参GAPDH cDNA探针如下：

HER2 cDNA特异性探针SEQ ID NO3：

5`-FAM-tgtgcccgagtgtgctatggtctgg-BHQ1-3`

内参ACTB cDNA特异性探针SEQ ID NO6：

5`-VIC-accaccacggccgagcgg-BHQ1-3`

内参GAPDH cDNA特异性探针SEQ ID NO9：

5`-TAMRA-aaggtgaaggtcggagtcaacgg-BHQ1-3`

探针的两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团。HER2基因和内参基因具有相同的扩增效率。

2、对照品选择

阴性对照品为双蒸水。

3、PCR反应液组成

包括含有上述特异性引物及探针的PCR反应液，还包括PCR buffer，dNTP、UNG酶、Taq酶及超纯水。

所述PCR扩增体系的总体积为12.5μL(2×Mix)，扩增体系的组分、浓度或含量如下：

其中，HER2上游引物(50μM)0.2μL，HER2下游引物(50μM)0.2μL，HER2探针(50μM)0.1μL，ACTB上游引物(50μM)0.2μL，ACTB下游引物(50μM)0.2μL，ACTB探针(50μM)0.1μL，GAPDH上游引物(50μM)0.2μL，GAPDH下游引物(50μM)0.2μL，GAPDH探针(50μM)0.1μL。

实施例2：利用实施例1的试剂盒进行HER2基因表达量检测

1、标本的采集、保存

(1)适用标本类型：石蜡包埋组织，冰冻组织。

(2)标本采集与保存：术后肿瘤组织立即冰冻并保存与-20℃或者按常规处理为石蜡包埋组织。石蜡包埋组织可长期保存于室温；新鲜组织保存在-20℃待测，保存期为6个月。

2、核酸提取

采用appliedbiosystems MagMAX^TMFFPE DNA/RNA Ultra Kit分别提取2个乳腺癌FFPE临床样本RNA，A样本临床IHC检测结果为HER2过表达，B样本检测结果为阴性，样本量大小为每个样本50um。

3、运用nanodrop2000测定上述2个样本RNA浓度及纯度，结果如下：

样本号	Nanodrop2000浓度(ng/μl)	260/280
			A	264.4	2.05
B	235.3	2.01

4、将步骤4中已知浓度的RNA样本用TE稀释成10ng/μl备用。

5、实时荧光PCR检测

从-20℃冰箱拿出已制备好的2×预混Mix(PCR反应液)，放室温溶解，等待完全溶解后轻微颠倒混匀离心，共配制4个反应Mix，每孔分装23μl Mix，然后分别加入2种10ng/μl的RNA模板，NTC孔加2μl ddH2O。反应体系配制如下：

PCR扩增反应条件为：

52℃，30min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，40s，60℃同时收集3种荧光信号，共进行45个循环。

排除PCR管底气泡，并盖紧管盖，放入仪器样品槽。设置PCR程序，荧光检测通道选择FAM，VIC/HEX，TAMRA检测通道。

6、检测结果分析

将两个内参扩增Ct值单独与HER2扩增Ct值比较分析，HER-2表达量检测结果判读标准如下：

①NTC无扩增Ct值或无S形曲线；

②ACTB、GAPDH中任何一个内参基因扩增Ct值必须≤30。

③HER-2基因相对于2个内参基因中任何一个校正分值≥7即可判定为HER-2过表达。

对于A、B两个样品的检测结果如图1、图2和图3所示，由上述扩增曲线导出Ct值并作内参基因ACTB、GAPDH与HER2 Ct值的校正分值，结果如下表：

gene	CtHER-2	CtACTB	CtGAPDH	(Ct_ACTB-Ct_HER-2)+10	(Ct_GAPDH-Ct_HER-2)+10
						A样本	23.87	22.84	24.87	8.97	11.00
B样本	26.99	22.88	23.44	5.89	6.46

由HER-2表达量检测结果判读标准可知：A样本为HER2高表达，B样本为HER2正常表达，与IHC判定结果一致。

序列表

<110> 良培基因生物科技（武汉）有限公司

<120> 一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒及其检测方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acagcggtgt gagaagtgc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtaactgccc tcacctctcg 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtgcccgag tgtgctatgg tctgg 25

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgagcgcggc tacagctt 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccttaatgt cacgcacgat tt 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accaccacgg ccgagcgg 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccacatcgct cagacaccat 20

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaggcgccc aatacg 16

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaggtgaagg tcggagtcaa cgg 23

Claims

1.一种用于检测HER2/neu基因表达量的HER2cDNA特异性引物和HER2cDNA特异性探针，其特征在于，HER2cDNA特异性上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，HER2cDNA特异性下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，所述HER2cDNA特异性探针序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由1)PCR反应液和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒组成，其中PCR反应液由PCR缓冲液、权利要求1的用于检测HER2/neu基因表达量的HER2cDNA特异性引物和HER2cDNA特异性探针、内参ACTB cDNA特异性上游引物、内参ACTB cDNA特异性下游引物、内参ACTB cDNA特异性探针、内参GAPDH cDNA特异性上游引物、内参GAPDH cDNA特异性下游引物、内参GAPDH cDNA特异性探针、逆转录酶和DNA聚合酶组成。

3.根据权利要求2所述的一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述内参ACTB cDNA特异性上游引物序列如SEQ ID NO：4所示、内参ACTB cDNA特异性下游引物序列如SEQ ID NO：5所示、内参ACTB cDNA特异性探针序列如SEQ ID NO：6所示，内参GAPDHcDNA特异性上游引物序列如SEQ ID NO：7所示，内参GAPDH cDNA特异性下游引物序列如SEQID NO：8所示，内参GAPDH cDNA特异性探针序列如SEQ ID NO：9所示。

4.根据权利要求2所述的一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒，其特征在于，PCR反应液中HER2上下游引物终浓度为200nM-600nM，HER2探针终浓度为200nM-400nM，ACTB内参和GAPDH内参的上下游引物终浓度为200nM-600nM，ACTB内参和GAPDH内参探针终浓度为200nM-600nM。

5.根据权利要求2所述的一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液由Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0)、MgCl₂(250mM)、KCl(250mM)和dNTP(100mM)组成。

6.根据权利要求2所述的一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶为耐高温逆转录酶，每个反应用量为10～60U。

7.根据权利要求2所述的一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶采用热启动Taq酶，每个反应用量为0.2～2U。

8.根据权利要求2所述的一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述HER2cDNA特异性探针、内参ACTB cDNA特异性探针、内参GAPDH cDNA特异性探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。

9.一种利用权利要求2-8所述试剂盒一步法检测HER2/neu基因表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测样本RNA，并对提取的RNA进行浓度及纯度测定；

(2)将步骤(1)中已知浓度的RNA样本用TE稀释成2～20ng/μl；

(3)取PCR反应液分装到PCR管内，反应体积为25μl～50μl；

(5)设置PCR程序，实时荧光PCR检测。

10.根据权利要求9所述的一种利用权利要求2-8所述试剂盒一步法检测HER2/neu基因表达量的方法，其特征在于，实时荧光PCR检测的PCR扩增反应条件为：52℃，30min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，40s，捕捉荧光信号，进行45个循环。