CN108998503A - 一种Oligo探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Oligo探针及其制备方法与应用。本发明通过将第一部分序列和第二部分序列混合，在带有标记的脱氧核糖核苷酸的体系中进行变性、退火，然后加入DNA聚合酶进行聚合反应，得到Oligo探针；其中，第一部分序列是共同序列1连接在特异寡核苷酸序列的3’端形成；第二部分序列是共同序列2连接在标记序列的3’端形成；特异寡核苷酸序列是与待测基因特异性结合、且去除重复序列的序列，共同序列2是3’端经过修饰的序列，共同序列1和共同序列2互补。该Oligo探针具有较高的灵敏性和特异性，可用于制备FISH探针，得到的FISH探针易于进入细胞，杂交反应快速，利用特定的杂交缓冲液，可缩短杂交时间至1‑2h。
Description
技术领域
本发明涉及供FISH技术用的核酸探针制备与标记的方法，特别涉及一种Oligo探针及其制备方法与应用。
背景技术
通过使用核酸探针，如带有某种标记的DNA或RNA探针，从而在细胞水平或染色体水平探测和显示染色体结构异常及基因表达异常，这非常的直观展现许多生命体基因层面的问题。这种可视化的技术被称为原位杂交(ISH)，而其使用的探针标记方法可大致分为“放射性同位素标记法”和“荧光素标记法”，由荧光素代替放射性同位素在标记探针上的应用，逐步发展起来的荧光原位杂交技术(FISH)具有经济、安全、快速、稳定等特点，目前，广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体亚微结构变异分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等诸多领域。其原理是用已知序列并标记了的核酸为探针，基于碱基互补配对原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测到的杂交双链核酸，根据不同的检测目的，探针可分为DNA探针和RNA探针。
利用标记好的核酸探针对特定核酸进行杂交检测的方法，其检测的效果的好坏取决于核酸探针的设计及其标记效果的优劣。随着人类基因组计划的完成，原则上我们可以设计检测任何基因的核酸探针，多种荧光素的开发成功以及与酶联免疫技术的结合使得核酸探针标记与检测结果可视化取得重大突破，该技术得到快速发展，在基础生命科学研究与疾病诊断方面均得到广泛应用。通过设计不同的核酸探针，可用于染色体数目分析、基因拷贝数分析以及基因表达量分析，使得检测微小复杂的染色体变异成为可能。近年发展起来的多色荧光原位杂交(M-FISH)和光谱核型分析(SKY)正是利用多种荧光染料标记的核酸探针对待测材料同时进行检测分析，提高了检测的通量与灵敏度。目前，核酸探针的制备与标记主要可分为化学直接合成法和以人工染色体为基础各种标记方法，前者是在合成核酸序列时将标记物直接加到探针序列上，而后者则可通过PCR法、切口平移法、末端标记法或随机引物法将标记物掺入探针序列中达到探针的制备与标记的目的。
化学法合成核酸探针，可根据需要任意掺入标记物，具有高特异性，高灵敏度，但合成一个带特定标记的探针的价格是只简单合成核酸序列的10～100倍，而检测一个基因需要成千上百个标记的探针，价格昂贵，随着探针数量及待检基因数的增加，其成本高，一般单位机构或个人难以承受；且直接带有荧光素或其他抗体等标记物的核酸探针，不能长久保存。
其他探针制备标记技术，也都各有自身的缺陷，如PCR技术和随机引物法受限于探针产量，其探针的得率低；末端平移法则受限于掺入的标记物，标记物只掺入到探针序列的有限部位，需辅以其他信号放大技术。另有PCR法制备无重复序列的高灵敏度核酸探针的方法，其反应底物中混有带标记的脱氧核苷酸，通过DNA聚合酶将带标记的脱氧核苷酸插入到核酸探针序列中，这种标记探针本身序列的方式容易影响探针的特异性且随着加入的标记脱氧核苷酸增多不利于探针的扩增，同时PCR法标记核酸探针的体系复杂，影响产物得率的因素多，每个反应都需设计特定的引物，并调试程序，还需对产物进行纯化和鉴定，制备过程繁琐。例如，专利CN100590201C说明书所公开的那样通过调整PCR法标记探针的体系，来提高标记物掺入量来达到更优的标记效果，但由于其直接标记探针序列的脱氧核苷酸，这受限于探针序列，不同的探针序列标记效果不尽相同，针对不同的探针序列，要达到比较理想的标记效果需对标记的脱氧核苷酸进行选择，保证最优。该方法严重依赖探针序列，推广到大量基因的探针制备有一定阻碍。
其次，相对合成法制作探针可对探针序列进行特定的选择，传统的核酸探针还存在重复序列的问题，探针中重复序列的存在，增加后续应用于杂交时的复杂程度，探针量之间通过重复序列结合，大大降低探针的可用量，也不利于双色甚至多色探针的应用。
目前，对大量的基因进行FISH检测，急需一种快速高效且价格低廉的探针制备与标记方法，它要能具有高特异性，能与待测基因或位点进行特异性结合，同时能兼具FISH技术的操作方便，结果直观，可视化效果好且价格适中，适用于不同基因的检测且结果稳定可靠。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高灵敏度、高特异性、价格适中、且标记不受探针序列影响，易于推广至检测任意基因的Oligo探针的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的Oligo探针。
本发明的再一目的在于提供上述Oligo探针在制备FISH探针中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种用于荧光原位杂交的试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种Oligo探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)Oligo探针序列的设计：Oligo探针的结构包括特异寡核苷酸序列、共同序列1、共同序列2和标记序列；其中，共同序列1连接在特异寡核苷酸序列的3’端，得到第一部分序列；共同序列2连接在标记序列的3’端，得到第二部分序列；特异寡核苷酸序列是与待测基因特异性结合、且去除重复序列的序列，共同序列2是3’端经过修饰的序列，共同序列1和共同序列2互补；
(2)Oligo探针的制备：将第一部分序列和第二部分序列按一定摩尔比例混合，在带有标记的脱氧核糖核苷酸的体系中进行变性、退火，然后加入DNA聚合酶进行聚合反应，得到Oligo探针。
步骤(1)中所述的共同序列1的长度优选为6～12bp。
步骤(1)中所述的共同序列2的长度优选为6～12bp。
步骤(1)中所述的标记序列是用于标记的自定义序列，是与待测基因不能完全匹配的序列。为保证荧光强度足够，以dUTP为例，所述的自定义序列中碱基A的占总标记序列碱基的比例>25％、且与待测基因不能完全匹配。
步骤(1)中所述的标记序列的长度优选为30～150bp。
步骤(1)中所述的修饰可以是氨基修饰、巯基修饰或磷酸化修饰。
步骤(2)中所述的摩尔比例优选为第一部分序列和第二部分序列的摩尔比为1:1～2；更优选摩尔比为1：1.5。
步骤(2)中所述的脱氧核糖核苷酸为dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP中的至少一种。
步骤(2)中所述的标记优选为荧光素标记或易于与荧光素反应的基团。
所述的易于与荧光素反应的基团优选为氨基。
所述的荧光素标记优选为Cy3或6-FAM。
步骤(2)中所述的体系中优选含有dATP、dCTP、dGTP、NH2-dUTP；更优选含有0.2mMdATP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、0.1mM NH2-dUTP。
步骤(2)中所述的变性的条件优选为90～100℃反应30～60秒。
步骤(2)中所述的退火的条件优选为冰浴2min后转入4℃放置10min。
步骤(2)中所述的聚合酶优选为大肠杆菌DNA聚合酶I大片段、Bst DNA聚合酶大片段或Bsu DNA聚合酶大片段。
步骤(2)中所述的聚合反应的条件优选为于25℃～65℃反应；更优选为28～37℃反应45～75min。
一种Oligo探针，通过上述制备方法得到。
所述的Oligo探针在制备FISH探针中的应用。
一种FISH探针，通过如下步骤制备得到：
①当所述的Oligo探针中的标记是荧光素时，所述的Oligo探针即为FISH探针；
②当所述的Oligo探针中的标记是易于与荧光素反应的基团时，将所述的Oligo探针与荧光素染料混合，反应，得到FISH探针。
步骤②中所述的反应的条件优选为：将所述的Oligo探针与所述的荧光素染料按摩尔比1：2～10配比，分散于pH9.6、0.2M的NaHCO3溶液中，避光反应。
所述的避光反应是在保证反应体系在液体状态下进行，在0℃以上即可进行；优选为于2～40℃避光反应2～4h；更优选为于2-8℃避光反应4h，或20～30℃避光反应2h；最优选为于24～26℃避光反应2h。
步骤②中所述的FISH探针还可进一步纯化，具体步骤如下：用异丙醇沉淀、清洗、再沉淀，得到纯化好的FISH探针。
一种用于荧光原位杂交的试剂盒，包括杂交缓冲液和上述FISH探针。
所述的杂交缓冲液的组成如下：15％～20％(v/v)碳酸乙烯酯，15～20％(w/v)表面活性剂，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，pH值为6～7。
所述的表面活性剂优选为聚乙二醇和葡聚糖硫酸钠中的一种或两种。
所述的聚乙二醇在所述的杂交缓冲液中的含量优选为15％(w/v)。
所述的葡聚糖硫酸钠在所述的杂交缓冲液中的含量优选为20％(w/v)。
所述的pH值优选为6.5。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明中第一部分序列和第二部分序列均可通过化学合成法合成，一般的核酸合成公司均可以做这样的合成，其中，第二部分的序列可以设计为同一种序列，该方案可减少序列设计复杂程度同时简化标记过程。根据不同基因的探针设计情况，制定不同的第二部分序列，而同一类的基因探针可共用第二部分的序列，标记时只需将共有的第二部分序列按比例(如摩尔比1.5:1)与探针第一部分序列混合即可。探针标记过程高度统一，过程简单，可进行集中标记，节约了人力物力。第二部分是根据探针序列第一部分的情况设计的，当待测基因序列短或可用于设计探针的非重复序列少时可适当增加第二部分标记序列的长度，来增加标记物掺入量，提高灵敏度。相较于传统的如缺口平移或者随机引物法标记探针，本发明标记过程可控，可根据需要定量探针得率，得率高，探针制备时间短。探针示意图见附图1。
本发明中的核酸探针设计是依据人类基因组计划的基因数据避开了基因组中大量的重复序列，同时避免了随机引物法标记基因探针本身具有的重复序列干扰问题，探针与靶基因杂交时不需再另外加入Cot I基因封闭靶基因的重复序列，特异性高，且杂交背景低。核酸探针的组成部分由核酸合成公司完成，探针序列的标记可根据检测目的和实验条件决定，比如掺入带有标记的ATCG(或AUCG)四种脱氧核苷酸任意一个或多个，多个可以是4个。这样将合成探针序列与标记分开可以有效控制成本，因为合成带有标记的核酸序列比单纯只合成简单核酸序列要贵很多，客户可根据自身需要选择性进行标记，同时又保证了探针的高特异性。核酸探针与靶基因特异性结合的序列部分是基于基因数据库(如NCBI)中的基因在排除重复序列后剩下的高特异性序列设计的，其与靶基因杂交具有高特异性。核酸探针序列第二部分作为显色部分不影响探针的特异性。标记时只需将对应的两部分序列混合，选择大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment)、Bst DNA聚合酶大片段或Bsu DNA聚合酶大片段，在混合有标记物底物的反应缓冲液中，常温反应一段时间即可完成核酸探针的标记，反应温度可根据所使用DNA聚合酶在25℃～65℃范围内调整，在最适条件下1h内即可标记完全。设备上，根据选择的酶只需一台恒温箱即可完成标记。该标记过程是DNA聚合酶在带有标记底物的反应体系中，将对应的脱氧核苷酸接入探针序列第一部分序列的3’端的过程，被选择的带有标记某种脱氧核苷酸替代未被标记的此种脱氧核苷酸与探针序列的第二部分互补配对接入探针序列第一部分的3’端，完成标记。探针序列的第二部分是提前设计的，可以根据需要调整序列的组成，定量控制掺入的标记脱氧核苷酸数量，保证足够的标记物被掺入，避免了一般探针标记方法掺入标记物的随意性。同时标记过程步骤简单，各探针标记过程高度统一，可进行集中处理，省时省力，提高了效率。
本发明选择标记的脱氧核苷酸底物可以是带荧光素基团的脱氧核苷酸(如Cy3-dUTP)，也可以是带其他易于与荧光素反应的基团的脱氧核苷酸(如NH2),本发明优选带氨基修饰的尿嘧啶脱氧核苷酸(NH2-dUTP)作为标记物，因标记序列是经人为设计的，其外接荧光染料足够保证信号强度，可根据需要随时接入荧光染料，分开保存探针和荧光染料，避免荧光染料标记的探针长期保存导致荧光染料发生漂白而影响探针的稳定性。其次，当探针数量有限时可以另外采取措施放大标记效果。标记好的探针电泳图见图2。
同时，探针与靶基因特异性结合的部分和探针标记部分分开这种方案对探针特异性影响低。探针标记部分序列通过人工合成，可以定量控制序列的长短及四种脱氧核苷酸的组成来定量控制标记物的多少。解决了如末端标记法标记探针出现的标记活性低的问题。化学合成一般的探针序列比直接合成带标记的核酸探针成本低，根据实际应用标记探针，避免标记探针因标记物活性降低而影响探针质量，同时又可根据需要选择标记物的种类，如荧光染料或酶连抗原抗体等。本发明通过化学合成探针序列，包括待标记的探针序列，按比例混合两种序列，核酸探针标记效率高，得率高，且产物稳定可靠。
核酸探针与靶基因杂交部分为单链，在杂交时无需对探针进行高温变性，这使得在标记物的选择上具有更多的可能，相较于需高温变性且容易退火结合成双链降低探针可利用率的双链探针，探针利用率更高。传统的探针标记技术，均是对探针序列的一种或几种核苷酸进行随机标记，且标记的核苷酸处于与靶基因结合的部位，这严重影响探针特异性，同时探针序列不同也将导致不同的标记效果，所以一般需要较长的探针序列来保证标记效果，这将影响探针的杂交效果。本发明中，与靶基因特异性结合的序列通过人工合成又与标记序列相互独立，与靶基因特异性结合不受标记脱氧核苷酸的影响，探针具有更好的特异性和灵敏性。
本发明提供的核酸探针长度在80-300bp，探针序列易于进入细胞，杂交反应快速，利用特定的杂交缓冲液，应用于FISH技术，可缩短杂交时间至1-2h，而传统的FISH技术需杂交16-30h，大大提高了检测效率。本发明提供的探针标记方法可针对不同的基因可设计不同的标记序列，使用不同荧光素进行染色，可有效降低不同染料标记的探针之间的相互干扰，可实现对多种基因的同时检测，应用于多色荧光原位杂交技术(M-FISH)。
附图说明
图1是本发明提供的Oligo探针各部分组成图示意图；该探针由与靶基因特异性结合部位和标记部位两部分组成。
图2是探针标记后电泳图；其中，泳道M为DNA Marker，泳道1为未标记的探针，泳道2为标记完全的探针。
图3是荧光显微镜拍摄系统拍摄的Cy3标记的HER2探针与293T细胞涂片的杂交结果图；其中，图a是自制的FISH杂交缓冲液混合探针杂交结果，图b是传统的杂交缓冲液混合探针杂交结果。
图4是荧光显微镜下拍摄系统拍摄的Cy3标记的HER2探针与Skbr-3细胞涂片的特异性杂交结果图。
图5是细胞滴片预处理与未预处理探针杂交荧光信号图；其中，图A是中期染色体细胞未预处理，图B是中期染色体细胞经预处理。
图6是制备探针检测肿瘤细胞与正常白细胞混合滴片的荧光信号图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
HER2又名HER2/neu，c-erbB-2，是表皮生长因子受体(EGFR)家族成员之一，研究表明30％以上的人类肿瘤中存在HER2基因的扩增，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌等。乳腺癌是威胁妇女生命健康的常见肿瘤，其中20％-30％的原发性浸润性乳腺癌有HER2基因的扩增。荧光原位杂交技术(FISH)是检测HER2基因扩增的常用方式。
(1)探针的设计
从NCBI上查找17号染色体上的HER2基因序列，去掉其中重复序列的基因序列，截断成长度为50-150bp的探针序列，每条序列的3’端增加有共同序列(5’—TGGTCGG—3’)。
探针1:5’—ggatccctga tggggagaat gtgaaaattc cagtggccat caaagtgttgTGGTCGG—3’；
探针2:5’—agggaaaaca catcccccaa agccaacaaa gaaatcttag acgtaagcccctccaccctc tcctgctagg TGGTCGG—3’；
探针3:5’—aggacaggaa ggaccccatg gctgcaggtc tgggctctgg tctctcttcattggggtttg gggagatatg actcccgcaa TGGTCGG—3’；
探针4:5’—acctagacta tttttttgga gacggagctt gctctgtcac ccaggctggagtgcagtggc gttatctcgg ctcactgcaa cctccacctc TGGTCGG—3’；
探针5:5’—ctggactcaa gcgattttca tgcctcaggc tcctgagtag ctgggattacaagcgcccgc taattttttt tttttttttg TGGTCGG—3’；
探针6:5’—agacagagtc tcgctctgtc acccaggcta gagtgaaatg gtgcggtctcagctcagcct cccaggttaa agcgattctt TGGTCGG—3’；
探针7:5’—ctccctcagt ctcctgagta gctgggatta caggcgcgag ccaccacgcccggctaattt ttgtattttt agtagagatg TGGTCGG—3’；
探针8:5’—ggatttcaccatgttggcca ggttggtgtc aaactcctga cctcatgatccgcccgcctc ggcctcccaaagtgctgggattacaggtgt gagccacgtg TGGTCGG—3’；
探针9:5’—cccggcctaa tctttgtatt tttagtagag acagggtttc accatgttgtccaggctggt actttgagcc ttcacaggct gtgggccatg TGGTCGG—3’；
探针10:5’—gctgtggttt gtgatggttg ggaggctgtg tggtgtttgg gggtgtgtggtctcccatac cctctcagcg tacccttgtc TGGTCGG—3’；
探针11:5’—cccaggaagc atacgtgatg gctggtgtgg gctccccatatgtctcccgccttctgggca tctgcctgac atccacggtg TGGTCGG—3’；
探针12:5’—cagctggtga cacagcttatgccctatggc tgcctcttag accatgtccgggaaaaccgc ggacgcctgg TGGTCGG—3’；
探针13:5’—gctcccaggacctgctgaac tggtgtatgc agattgccaa ggtatgcacctgggctcttt gcaggtctctccggagcaaa cccctatg TGGTCGG—3’；
探针14:5’—tccacaaggggctaggatgggg actcttgctg ggcatgtggc caggcccaggccctcccaga aggtctacat gggtgcttcc cattccaggg TGGTCGG—3’；
探针15:5’—gatgagctac ctggaggatg tgcggctcgt acacagggac ttggccgctcggaacgtgct ggtcaagagt cccaaccatg TGGTCGG—3’；
探针16:5’—tcaaaattac agacttcggg ctggctcggc tgctggacat tgacgagacagagtaccatg cagatggggg caaggttagg TGGTCGG—3’；
探针17:5’—tgaaggacca aggagcagag gaggctgggtggagtggtgt ctagcccatgggagaactct gagtggccac tcccacaaca TGGTCGG—3’；
探针18:5’—cacagttgga ggacttcctc ttctgccctc cccagtgccc atcaagtggatggcgctgga gtccattctccgccggcgg TGGTCGG—3’；
探针19:5’—t tcacccacca gagtgatgtg tggagttatg gtgtgtgatggggggtgttgggaggggtgg gtgaggagcc atggctggag TGGTCGG—3’；
探针20:5’—ggaggatgag agctgggatg gggagaattacggggccacc tcagcatgtgaagggaggga aggggctgcc tgtgccccac cttgcaggg tctgtgcactt cccaggatta gggaaagaccgggtagggtc tgtctcctgg TGGTCGG—3’。
设计标记序列1：5’—AAAACAAAGAATAACATCAAGAGAAACAG ACCAGCC—3’，其3’端经磷酸化修饰。
将上述序列交付苏州泓讯生物科技股份有限公司合成。
(2)探针的标记
探针的标记可通过多种DNA聚合酶在合适的条件下实现，本发明选取其中一种对标记过程进行详细的阐述，而染色过程则是基于该具体实施例所对应的。
1)将含有与靶基因特异结合序列的探针和标记序列按摩尔比1:1.5进行混合，具体为：取4μl合成的特异性探针序列(浓度150μM)和6μl 3’端磷酸化的标记序列(150μM)于1.5ml离心管中混合具有氨基修饰的尿嘧啶脱氧核苷酸的标记反应液，100℃变性5min。标记反应液的组成为：1×Bst buffer、0.2mM dATP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、0.1mM NH2-dUTP。
2)冰浴2min后转入4℃放置10min，加入Bst DNA聚合酶至终浓度为0.4U/μl。1×Bst buffer和BstDNA聚合酶可以是购自NEB，也可由本单位提供。1×Bst buffer的成分为20mM Tris-HCl、2mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、0.1％TritonX-100，25℃、pH值＝8。可根据所使用的DNA聚合酶更换最适缓冲液。
3)置于30℃反应2h或放置过夜，取1μl反应液进行核酸电泳检测，至探针标记完全。
4)加入NaCl至终浓度为0.5M，再加入等体积异丙醇，-20℃放置10min，14000rpm离心5min去掉上清。
5)加入300μl 80％异丙醇清洗2次，14000rpm离心2min，彻底除去上清，自然晾干，放于-20℃保存。
(3)探针的染色
1)将标记好的探针，溶于20μl 0.2M NaHCO3(pH9.6)溶液中，按2倍摩尔量加入荧光染料Cy3室温下避光放置2h。
2)经异丙醇沉淀，清洗和沉淀后即可得到染色好的标记探针，将染好的探针置于-20℃保存留待荧光原位杂交使用。琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。用于与标记探针反应的也可以是其它显色物质，如与氨基反应的荧光染料6-FAM。
实施例2
将上述标记好的HER2探针(Cy3标记的HER2探针)用于细胞涂片的杂交，图1为标记好的探针示意图，其在杂交缓冲的作用下进入涂片细胞内并与染色体进行特异性结合，与标记脱氧核苷酸结合的荧光素在激发光下发射出特定波长的荧光，经相应的光栅后即可看到特定的荧光信号，如图3，即为激发的探针在细胞内的特异性亮点。该实施例包括如下步骤：
(1)制备细胞涂片
往体外培养的人胚肾293T细胞(中科院上海细胞库)培养皿中加入秋水仙素至其终浓度为0.4μg/mL，37℃处理1.5h。加入25％wt胰酶溶液，37℃消化2min，加入浓度为0.075mol/L的氯化钾溶液10mL，轻轻混匀，37℃水浴30min，加入预冷的固定液(甲醇：冰乙酸＝体积比3:1)固定，将细胞滴在载玻片上，过夜干燥，-20℃保存。
(2)细胞玻片的预处理
将制备的细胞涂片置于100μg/mL的RNase A溶液(2×SSC配制)中，37℃消化1h，2×SSC清洗3次每次3min。将其置于100μg/ml胃蛋白溶液(胃蛋白酶购至Sigma，10mM HCl配制，pH2.0)中37℃消化15min。2×SSC清洗2次每次3min后转入1％甲醛溶液(1×PBS配制)中固定10min，2×SSC清洗3次每次2min。分别用70％、90％、100％乙醇溶液梯度脱水，每个梯度下2min。自然晾干。
滴加70％甲酰胺(2×SSC配制置)将细胞滴片上的细胞均覆盖住盖上盖玻片，置于75℃变性5min。然后迅速将细胞滴片置于预冷的70％、90％、100％乙醇中各2min梯度脱水，取出自然晾干。
(3)Cy3标记的HER2探针应用于细胞滴片的原位杂交
取标记并染色的HER2探针与FISH杂交缓冲液混合，使探针浓度为4ng/μL，将其滴加在细胞滴片上，并盖上盖玻片，树脂胶封片后，杂交程序为：90℃，10min；43℃，杂交2h。取出细胞滴片，置于清洗剂(50％甲酰胺/2×SSC)中，45℃清洗10min，再用2×SSC溶液清洗3次，每次2min。取出细胞滴片，自然晾干，加入复染液DAPI，盖上盖玻片，用荧光显微镜检测，在装有冷CCD摄像头的荧光显微镜下，可看到每个细胞均有2个特异性荧光点，结果如图3a。
上文所述的FISH杂交缓冲液成分为：20％(v/v)碳酸乙烯酯，15％(w/w)聚乙二醇，750mM的NaCl，75mM柠檬酸钠，pH6.5。
(4)采取Cy3标记的HER2探针按传统方法进行杂交
与步骤(3)大致相同，区别仅在于：将FISH杂交缓冲液更换为传统的杂交液，将其与Cy3标记并染色的HER2探针混合均匀，探针浓度为4ng/μL，与细胞滴片进行杂交处理，杂交程序及清洗方式同上，传统的杂交缓冲液的成分如下：45％甲酰胺，10％硫酸葡聚糖钠，0.1μg/μL胎盘DNA(human cot-1)，300mM NaCl，5mM磷酸盐缓冲液，pH7.5。使用传统的杂交缓冲液混合探针用于FISH杂交，2h后镜检荧光信号，细胞核区无信号，结果如图3b。
实施例3
将实施例2中的293T细胞系换成HER-2阳性的Skbr-3细胞系(中科院上海细胞库)，制作细胞滴片及杂交、清洗方式与实施例2相同，杂交结果如图4，结果显示HER-2阳性的Skbr-3细胞系中HER2基因拷贝数增多明显，该发明制备的探针可有效分辨HER-2阳性肿瘤细胞系。
实施例4
按实施例2中方法制备细胞中期染色体细胞滴片，将滴片分为按照实施例2中方法进行预处理和不进行预处理两种，其中不进行预处理(即实施例2中方法省略步骤(2))。将探针混合成杂交缓冲液，体系如下表：
表1
| 实施例1制备的探针 | 100ng |
| 鲑鱼精DNA(赛默飞) | 50μg |
| FISH杂交缓冲液 | 18μl |
| 探针混合液总体积 | 补ddH2O至25μl |
将探针混合液与两种滴片分别杂交，封片后，置于杂交盒内，杂交程序为：90℃，10min；43℃，2h。对照采用的是采用传统的探针标记方法得到HER-2FISH探针(购自广州市外显子生物技术有限公司，是将荧光基团结合在探针特异序列的标记方式得到的探针)，混合封闭DNA(鲑鱼精DNA)后用于两种滴片的杂交。清洗后，用荧光显微镜观察并拍摄信号。
使用实施例1制备得到的探针杂交得到的结果如图5所示，图5A是中期染色体细胞未预处理杂交结果图，图5B是中期染色体细胞经预处理后杂交的结果图。图5A和图5B的杂交效果一致，均有信号，且强度无差别，可见，本发明所制备的探针对中期染色体细胞滴片无需进行预处理。
对照组的结果如下：中期染色体细胞经预处理组的杂交结果有信号，但是，相对于实验组的图5效果而言，信号较弱；中期染色体细胞未预处理组信号更弱，或无信号。原因分析如下：传统的探针标记方式所制备的探针序列较长，以保证足够的荧光基团掺入，而最终因序列过长而不利于穿过核膜与目的片段结合，影响了探针的杂交效率；在未经预处理，尤其是未进行蛋白酶消化的细胞，传统的探针更不容易通过，这极大影响了探针的杂交效率。
实施例5
将白细胞(通过人外周血白细胞分离液试剂盒对人外周血分离得到)和HER-2阳性肿瘤细胞Skbr-3按100:1的比例混合，用于细胞滴片。实验步骤如下：
(1)将制备好的滴片置于湿盒内，65℃放置2h，再将其置于干盒内，65℃放置30min。用于滴片的载玻片经过特殊修饰，以更好的固定细胞防止细胞脱片。
载玻片的修饰过程如下：1)将普通载玻片(购至世泰)装入玻片卡槽中，超声清洗，60℃、1h(检查是否干净，适当增加超声时间)；2)转入1M盐酸中，浸泡2h；3)再经超纯水清洗干净，离心去掉水渍或烘箱烘干；4)将玻片转入50mM硅烷试剂(3-Glycidoxypropyl)TRI-METHOXYSILANE)中浸泡30min；5)将浸泡的玻片置于90％乙醇清洗1次，再用100％乙醇清洗一次，晾干或离心甩干，防止污染。置于芯片盒中，并充氮气用密封袋封存
(2)将细胞滴片置于通透液(成分如下：1×SSC、0.2wt％十二烷基硫酸钠)中，90℃，10min。1×PBS清洗三次，每次3min。
(3)把滴片依次放于37℃预热的RNA酶液(100μg/mL的RNase A溶液，2×SSC配制)和蛋白酶消化液(100μg/mL胃蛋白溶液，胃蛋白酶购至Sigma，10mM HCl配制，pH2.0)中各10min，经1×PBS清洗后，依次置于70％、90％、100％乙醇中2min，自然晾干用于杂交。
(4)配制好探针混合液(按实施例4表配制，含鲑鱼精DNA，探针浓度为4ng/μl)，共25μl，将其滴于细胞区域，盖上盖玻片不留气泡，用树脂胶封片。杂交程序：90℃，10min，43℃、2h。
(5)清洗后，用荧光显微镜检测并拍照。任意选取五个肿瘤细胞与白细胞共存的区域，统计杂交效率和准确率。
如图6所示，白细胞区域显示双信号，肿瘤细胞则信号成簇(肿瘤细胞的核区比白细胞大)。根据统计结果探针的平均杂交效率大于96％，而统计区域的肿瘤细胞均有信号且成簇，其准确达到100％。该发明制备的探针具有足够的特异性与杂交效率。
表2
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中山康源基因技术科技有限公司
<120> 一种Oligo探针及其制备方法与应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针1
<400> 1
ggatccctga tggggagaat gtgaaaattc cagtggccat caaagtgttg tggtcgg 57
<210> 2
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针2
<400> 2
agggaaaaca catcccccaa agccaacaaa gaaatcttag acgtaagccc ctccaccctc 60
tcctgctagg tggtcgg 77
<210> 3
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针3
<400> 3
aggacaggaa ggaccccatg gctgcaggtc tgggctctgg tctctcttca ttggggtttg 60
gggagatatg actcccgcaa tggtcgg 87
<210> 4
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针4
<400> 4
acctagacta tttttttgga gacggagctt gctctgtcac ccaggctgga gtgcagtggc 60
gttatctcgg ctcactgcaa cctccacctc tggtcgg 97
<210> 5
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针5
<400> 5
ctggactcaa gcgattttca tgcctcaggc tcctgagtag ctgggattac aagcgcccgc 60
taattttttt tttttttttg tggtcgg 87
<210> 6
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针6
<400> 6
agacagagtc tcgctctgtc acccaggcta gagtgaaatg gtgcggtctc agctcagcct 60
cccaggttaa agcgattctt tggtcgg 87
<210> 7
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针7
<400> 7
ctccctcagt ctcctgagta gctgggatta caggcgcgag ccaccacgcc cggctaattt 60
ttgtattttt agtagagatg tggtcgg 87
<210> 8
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针8
<400> 8
ggatttcacc atgttggcca ggttggtgtc aaactcctga cctcatgatc cgcccgcctc 60
ggcctcccaa agtgctggga ttacaggtgt gagccacgtg tggtcgg 107
<210> 9
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针9
<400> 9
cccggcctaa tctttgtatt tttagtagag acagggtttc accatgttgt ccaggctggt 60
actttgagcc ttcacaggct gtgggccatg tggtcgg 97
<210> 10
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针10
<400> 10
gctgtggttt gtgatggttg ggaggctgtg tggtgtttgg gggtgtgtgg tctcccatac 60
cctctcagcg tacccttgtc tggtcgg 87
<210> 11
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针11
<400> 11
cccaggaagc atacgtgatg gctggtgtgg gctccccata tgtctcccgc cttctgggca 60
tctgcctgac atccacggtg tggtcgg 87
<210> 12
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针12
<400> 12
cagctggtga cacagcttat gccctatggc tgcctcttag accatgtccg ggaaaaccgc 60
ggacgcctgg tggtcgg 77
<210> 13
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针13
<400> 13
gctcccagga cctgctgaac tggtgtatgc agattgccaa ggtatgcacc tgggctcttt 60
gcaggtctct ccggagcaaa cccctatgtg gtcgg 95
<210> 14
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针14
<400> 14
tccacaaggg gctaggatgg ggactcttgc tgggcatgtg gccaggccca ggccctccca 60
gaaggtctac atgggtgctt cccattccag ggtggtcgg 99
<210> 15
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针15
<400> 15
gatgagctac ctggaggatg tgcggctcgt acacagggac ttggccgctc ggaacgtgct 60
ggtcaagagt cccaaccatg tggtcgg 87
<210> 16
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针16
<400> 16
tcaaaattac agacttcggg ctggctcggc tgctggacat tgacgagaca gagtaccatg 60
cagatggggg caaggttagg tggtcgg 87
<210> 17
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针17
<400> 17
tgaaggacca aggagcagag gaggctgggt ggagtggtgt ctagcccatg ggagaactct 60
gagtggccac tcccacaaca tggtcgg 87
<210> 18
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针18
<400> 18
cacagttgga ggacttcctc ttctgccctc cccagtgccc atcaagtgga tggcgctgga 60
gtccattctc cgccggcggt ggtcgg 86
<210> 19
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针19
<400> 19
ttcacccacc agagtgatgt gtggagttat ggtgtgtgat ggggggtgtt gggaggggtg 60
ggtgaggagc catggctgga gtggtcgg 88
<210> 20
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针20
<400> 20
ggaggatgag agctgggatg gggagaatta cggggccacc tcagcatgtg aagggaggga 60
aggggctgcc tgtgccccac cttgcagggt ctgtgcactt cccaggatta gggaaagacc 120
gggtagggtc tgtctcctgg tggtcgg 147
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 标记序列
<400> 21
aaaacaaaga ataacatcaa gagaaacaga ccagcc 36
Claims (15)
1.一种Oligo探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)Oligo探针序列的设计：Oligo探针的结构包括特异寡核苷酸序列、共同序列1、共同序列2和标记序列；其中，共同序列1连接在特异寡核苷酸序列的3’端，得到第一部分序列；共同序列2连接在标记序列的3’端，得到第二部分序列；特异寡核苷酸序列是与待测基因特异性结合、且去除重复序列的序列，共同序列2是3’端经过修饰的序列，共同序列1和共同序列2互补；
(2)Oligo探针的制备：将第一部分序列和第二部分序列按一定摩尔比例混合，在带有标记的脱氧核糖核苷酸的体系中进行变性、退火，然后加入DNA聚合酶进行聚合反应，得到Oligo探针。
2.根据权利要求1所述的Oligo探针的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的共同序列1的长度为6～12bp；
步骤(1)中所述的共同序列2的长度为6～12bp；
步骤(1)中所述的标记序列的长度为30～150bp；
步骤(1)中所述的修饰为氨基修饰、巯基修饰或磷酸化修饰。
3.根据权利要求1所述的Oligo探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的摩尔比例是第一部分序列和第二部分序列的摩尔比为1:1～2。
4.根据权利要求1所述的Oligo探针的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的脱氧核糖核苷酸为dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP中的至少一种；
步骤(2)中所述的标记为荧光素标记或易于与荧光素反应的基团；
步骤(2)中所述的DNA聚合酶为大肠杆菌DNA聚合酶I大片段、Bst DNA聚合酶大片段或Bsu DNA聚合酶大片段。
5.根据权利要求4所述的Oligo探针的制备方法，其特征在于：
所述的易于与荧光素反应的基团为氨基；
所述的荧光素标记为Cy3或6-FAM。
6.根据权利要求1所述的Oligo探针的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的体系中含有dATP、dCTP、dGTP、NH2-dUTP。
7.根据权利要求1所述的Oligo探针的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的变性的条件为90～100℃反应30～60秒；
步骤(2)中所述的退火的条件为冰浴2min后转入4℃放置10min；
步骤(2)中所述的聚合反应的条件为于25℃-65℃反应。
8.一种Oligo探针，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。
9.权利要求8所述的Oligo探针在制备FISH探针中的应用。
10.一种FISH探针，其特征在于通过如下步骤制备得到：
①当权利要求8所述的Oligo探针中的标记是荧光素时，所述的Oligo探针即为FISH探针；
②当权利要求8所述的Oligo探针中的标记是易于与荧光素反应的基团时，将所述的Oligo探针与荧光素染料混合，反应，得到FISH探针。
11.根据权利要求10所述的FISH探针，其特征在于：步骤②中所述的FISH探针进一步纯化，具体步骤如下：用异丙醇沉淀、清洗、再沉淀，得到纯化好的FISH探针。
12.根据权利要求10所述的FISH探针，其特征在于：步骤②中所述的反应的条件为：将所述的Oligo探针与所述的荧光素染料按摩尔比1：2～10配比，分散于pH9.6、0.2M的NaHCO3溶液中，反应2h。
13.一种用于荧光原位杂交的试剂盒，其特征在于：包括杂交缓冲液和权利要求10～12任一项所述的FISH探针。
14.根据权利要求13所述的用于荧光原位杂交的试剂盒，其特征在于：所述的杂交缓冲液的组成如下：15％～20％(v/v)碳酸乙烯酯，15～20％(w/v)表面活性剂，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，pH值为6～7。
15.根据权利要求14所述的用于荧光原位杂交的试剂盒，其特征在于：所述的表面活性剂为聚乙二醇和葡聚糖硫酸钠中的一种或两种。
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| CN110669856A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-01-10 | 临沂大学 | 一种赫氏埃希氏菌的微滴式数字pcr快速检测方法 |
| CN117402987A (zh) * | 2023-11-14 | 2024-01-16 | 中山市康智芯源医疗科技有限公司 | 呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒（基因芯片法） |
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