CN117402987A - 呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒（基因芯片法） - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸检测试剂盒技术领域，尤其涉及呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)。盒内含有PCR扩增反应和基因芯片杂交反应所需的所有试剂和耗材，使用时先用特殊引物扩增DNA，再通过特定的基因探针和基因芯片杂交，最后对一个样本里的多种呼吸道病原微生物及耐药基因同时进行检测。本发明基于基因芯片技术并结合新型多重PCR扩增技术，提出一种检测通量和灵敏度高，鉴定准确性好，操作简单方便且成本较低，可以作为常规检测手段大量使用的新型呼吸道致病菌及耐药基因检测技术，并通过本发明的检测结果指导呼吸道疾病甚至是急重症患者的治疗方案及用药。

Description

呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)

技术领域

本发明涉及核酸检测试剂盒技术领域，尤其涉及呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)。

背景技术

现有的检测呼吸道致病菌的技术以培养法为主流，针对不同类型的病菌，通过使用不同种类的试剂盒在培养基上进行培养，可对大多数的呼吸道致病菌进行检测，也可对病菌的耐药性进行检测，且成本低廉。然而培养法的检测时间和检测通量具有非常严重的短板：常规的培养法只能逐一检测病菌或耐药性，且需要3-7天的时间，对于已经严重感染，因急重症而进入ICU的患者，根本不可能等待如此长的检测时间。同时，一些呼吸道感染病患可能携带不止一种致病菌，对数种不同的致病菌要进行结果清晰的完全检测，且可能还需要加上耐药性方面的检测，就培养法而言不仅操作方面不便(培养基逐个培养)，还需要花费相当的人力资源进行处理。

除培养法以外，PCR扩增法也越来越多被用于呼吸道致病菌和耐药基因检测。其中荧光定量PCR可将检测时间缩短至3小时，满足急重症快速检测的需要。同时，PCR法还拥有高于培养法的检测灵敏度，且单次检测成本低廉，适合常规检测使用。然而PCR法检测通量低，通常需要使用不同的引物对不同的致病菌基因和耐药基因进行扩增，因此在检测病原体对象和检测样本数量多的情境下会和培养法一样出现操作不便的情况，倘若将大量不同的引物混合进行扩增，又会因为引物之间灵敏度的不同，造成某些基因扩增程度差或无法扩增，进而造成检测灵敏度低，准确性差等问题。而当检测的样本数量较多时，还会造成检测成本的大量叠加使使用者难以承担，从而导致技术手段无法被实际运用。

相比上述两种方法，二代测序拥有极高的检测通量和灵敏度，可极准确地检测出多种呼吸道致病菌基因。但二代测序的优势多体现在野生型基因的测序方面，对于突变型基因较多的耐药基因则会出现灵敏度较低、准确性较差等问题。二代测序检测成本较高，操作难度较大，需要经过相关培训的领域内专业人员进行操作，同时耗时仍为较长(48小时)，现今仍难以作为常规检测手段和急重症快速检测手段使用，因此在使用普及程度上远不如前二者。

传统的微阵列基因芯片检测灵敏度和通量一般，虽检测结果准确性尚可，但也可能产生很高的背景信号造成结果准确性不佳。传统基因芯片的操作难度较高，操作流程较为繁复，可能需要苛刻的反应条件，并不适合在医疗中作为常规检测和快速检测的技术手段使用，多为科研实验中使用。

发明内容

针对背景技术中存在的问题，提出呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)。

本发明提出呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)，盒内含有PCR扩增反应和基因芯片杂交反应所需的所有试剂和耗材，使用方法如下：

先用特殊引物扩增DNA，再通过特定的基因探针和基因芯片杂交，最后对一个样本里的多种呼吸道病原微生物及耐药基因同时进行检测。

优选的，引物扩增时，通过对序列经过特殊设计的，可精准捕捉样品中靶DNA并与之结合、扩增的引物，按灵敏度提前进行分组，制备成缓冲液，再搭配试剂盒内含有的PCR管，使多种引物同时进行PCR扩增反应。

优选的，扩增缓冲液中含有阳性质控DNA模板，通过杂交阳性质控DNA模板的扩增产物，对PCR反应进行监测。

优选的，特定的基因探针包括可捕获致病菌基因/耐药基因的探针。

优选的，杂交时，通过添加带有cy5荧光修饰的内参，使其与基因芯片上的探针结合，基于不同荧光信号的强弱区分捕获目标基因的探针和未捕获目标基因的探针，得到杂交结果数据。

优选的，杂交后，使用清洗液对基因芯片进行清洗、晾干，扫描杂交信号并处理数据，得到检测结果。

优选的，上述技术应用于47种呼吸道感染致病菌和11种耐药基因的检测及鉴定，范围涵盖革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：

1、本发明针对特定的微生物基因和耐药基因设计扩增引物和基因探针，用引物对样本中的DNA进行扩增，再用基因芯片对扩增后的DNA进行杂交，可以同时检测出范围涵盖革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌的47种呼吸道病原微生物和11种耐药基因，是为任何现有技术所无法做到的。

2、本发明克服传统微阵列基因芯片/基因芯片检测灵敏度低、准确性不足，背景信号高、操作难度高，过程繁复等缺点，可应用于医疗方面的常规检测和快速检测，而传统微阵列基因芯片/基因芯片基本只可用于科研实验。

3、本发明检测过程耗时2-3小时，比二代测序所需的48小时更短，且灵敏度和准确性甚至优于二代测序。

4、本发明检测通量高，操作方便，只需培训使用者试剂盒的使用方法，不需要领域内专业人员也可以相对较少的人力应对大批量的样本检测。同时本发明的使用成本大大低于二代测序，在大批量样本检测的使用情境下也不易于造成成本的过高叠加，适合在常规检测中的大量使用以及在急重症治疗情境下的快速检测使用。

5、本发明对试剂和耗材按功能进行分类，并对试剂成分进行整合(如所有PCR反应所需成分，除模板DNA外全部整合成一管溶液)，使试剂盒的使用极为方便。使用试剂盒时，无需额外预备任何试剂和耗材，也无需再逐一按成分配制试剂，实现一盒完成所有反应，大大提高检测效率。

附图说明

图1为八连管中引物分布图；

图2为八连管中阳性质控DNA分布图；

图3为流感嗜血杆菌样本的荧光信号图像；

图4为粘质沙雷氏菌样本的荧光信号图像；

图5为混菌样本的荧光信号图像。

具体实施方式

实施例一

本发明提出的呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)，盒内含有PCR扩增反应和基因芯片杂交反应所需的所有试剂和耗材，具体内容见表1和表2。各组成中成分、占比和浓度皆为为配合本发明之使用，经实验优化而得。

表1.试剂盒结构及主要成分

表2.试剂盒组分中各试剂成分、占比和终浓度

接着本实施例对PCR缓冲液、基因芯片及盖玻片和杂交液进一步展开。

一、PCR缓冲液

PCR缓冲液中含有为扩增目标范围菌种和耐药基因DNA而专门设计的PCR引物，同时除标准PCR反应体系所需的组分外，相较标准反应，本发明在PCR缓冲液中除了扩增引物，额外添加1％的Triton X-100、体系终浓度为0.625mol/L的D-海藻糖(二水)和阳性质控DNA。缓冲液的组成及其成分的占比和浓度，均为使本发明性能达到理想效果而优化得到，其设计具有保证本发明效果这一特定目的。

扩增引物：PCR扩增引物被设计分为8组，命名为组A-H(如表3)，其中每条引物序列为基于靶致病菌基因和耐药基因(DNA)上特定的区域进行设计而得到，可精确捕捉相对应的模板DNA。同时，对引物进行特殊分组的原因是因为不同引物之间结合模板DNA的灵敏度不同，如果不将灵敏度相近的引物进行分组，会造成部分灵敏度相对较低的引物在高灵敏度引物的影响下不易与模板DNA结合，进而造成部分PCR扩增产物少，扩增效率低下，后续少检漏检，检测灵敏度低、准确性差等情况。因此，选择灵敏度相近的引物为一组，与其他组引物在互相隔离的独立环境下进行PCR反应，可有效解决这一问题。同时，PCR扩增引物经特殊设计，可在扩增时为产物带上cy3荧光修饰，配合后续杂交中的内参产生作用。

表3.八组引物组合

在实际使用(试剂盒包装)中，8组引物按其分组，基于上述PCR缓冲液成分，各组被制备成独立的溶液并放于八连PCR管其中一管中(八个管分别对应8个含有不同引物组的PCR缓冲液，如图1所示)。在进行PCR反应时，只需往八个管中各加入一定量的模板DNA(来自同一样本)，再将八连管放入PCR仪，便能实现单个样本的多引物同时扩增。同时不会因为反应体系中引物过多、引物灵敏度相差太大而造成PCR扩增效果不佳等问题。

Triton X-100：作为PCR反应的活性剂，具体作用为促使更多的引物与目标模板DNA结合，以提高PCR产物量的方式提升PCR反应的效率。

D-海藻糖(二水)：作为TaqHS酶的保护剂，保护本发明所含酶的活性，使酶在一定时间的冷冻运输或保存后仍可用于所需的PCR反应。

阳性质控：为8种经过特殊设计的，序列不同的单链DNA模板，具体作用为监测PCR反应是否成功。通过将阳性质控加入本发明试剂盒中的PCR缓冲液，在PCR反应进行时，引物亦会对这些阳性质控DNA进行结合并产生后续扩增反应。因此，如果PCR反应成功，产物中除了靶DNA的扩增产物外，还应带有阳性质控的扩增产物。通过在基因芯片上放置针对检测阳性质控DNA的探针，在基因芯片杂交反应时可以对PCR产物中的阳性质控产物进行检测，以观察PCR反应是否有成功进行。传统的PCR法需要在扩增后加入凝胶电泳检测的步骤，通过电泳产生的条带来监测扩增质量。本发明结合PCR扩增法和基因芯片法的优势，在基因芯片杂交反应时便对扩增质量进行监测，无需额外再用凝胶电泳，省去了器材和人力成本，同时提升了整体的操作效率。8种阳性质控分别命名为Interncontrltemp 1-8(表4所示)，按序号1-8对应引物组A1-H1，分别加入各引物组所在PCR缓冲液中，放于八连管内(如图2所示)。

表4.八种PCR阳性质控DNA

二、基因芯片及盖玻片

基于上述检测范围，本发明针对每种致病菌和耐药基因包含至少一种可以检出该致病菌或耐药基因的基因探针(即可捕获致病菌基因/耐药基因的探针)，应用于47种呼吸道感染致病菌和11种耐药基因的检测及鉴定，范围涵盖革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌。所有探针(或称探针库)序列基于靶致病菌基因和耐药基因上特定的区域设计而得，可准确与对应基因配对。探针被定植于低荧光背景的显微玻片上，形成基因芯片。在使用时，搭配本发明内含的盖玻片，将盖片盖于基因芯片上，在二者中间夹层加入混合了扩增产物的杂交液，便可在后续步骤中进行杂交反应。

三、杂交液

杂交液主要由杂交缓冲液和内参组成。使用时，将PCR扩增得到的产物DNA与杂交液混合，然后将杂交液加入到基因芯片和盖玻片中，便能用来进行后续的杂交反应。

杂交缓冲液：成分及配比如表2所示。其中甲酰胺的作用为降低扩增产物与探针结合所需的温度(降至37℃)；柠檬酸钠缓冲液可在其他成分加入溶液时保护溶液pH不产生过大的变化；十二烷基硫酸钠、PEG35K和Triton X-100作为活性剂，提高了产物与探针的结合效率，同时PEG35K因具有较大的粘稠度，可保证杂交时溶液在基因芯片表面张力不至过大，具有较好的流动性。基于上述成分，本发明的基因芯片杂交反应无需苛刻的环境要求，只需在37℃恒温中规律转动45分钟即可完成杂交，得到清晰、准确的结果。

内参：内参为经过特殊设计的，5’端带有cy5荧光染料修饰的一段DNA短序列，在扩增产物DNA(扩增时由引物带上cy3荧光修饰)与基因芯片探针DNA进行杂交时，内参同时与探针进行杂交，使成功捕获与未成功捕获目标基因的探针之间呈现不同的荧光信号强度(前者会带有强烈的cy3荧光信号，否则只有cy5荧光信号)，产生明显的对比结果，以利数据分析，具体内参信息见表5。

名称	内参序列	浓度	备注
				杂交内参	ACGTCGTGGCGACCAGTGC	0.1ng/ul	带染料修饰5’cy5

表5.杂交内参信息

上述的呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)使用方法如下：先用特殊引物扩增DNA，再通过特定的基因探针和基因芯片杂交，最后对一个样本里的多种呼吸道病原微生物及耐药基因同时进行检测。其中涉及的基因芯片以及基因探针的结构、制备方法等技术特征，已由本发明的申请人在过往单独申请了专利,申请号分别为CN201110129845、CN201810939564和CN201810941697。引物扩增时，通过对序列经过特殊设计的，可精准捕捉样品中靶DNA并与之结合、扩增的引物，按灵敏度提前进行分组，制备成缓冲液，再搭配试剂盒内含有的PCR八连管，可使多种不同的引物在互为独立的环境下同时进行PCR扩增反应。杂交时，通过添加带有cy5荧光修饰的内参(扩增的DNA产物在PCR时被标记有cy3荧光，内参与DNA产物可同时与探针结合)，使其与基因芯片上的探针结合，基于不同荧光信号的强弱区分捕获目标基因的探针和未捕获目标基因的探针，得到可用于分析的杂交结果数据。杂交后，使用清洗液对基因芯片进行清洗、晾干，扫描杂交信号并处理数据，得到检测结果。在实际使用中，所有探针都会与内参进行杂交，因此在扫描中会呈现一定的绿色荧光信号(cy5)；同时，样本中所含有的靶DNA其扩增产物会和特定的探针进行杂交，使这些探针在扫描中还会呈现明显的红色信号(cy3)。分析软件通过特定的计算程序，基于内参的信号值计算出背景值，再将结合了靶DNA的探针的阳性信号值(即cy3荧光信号)与背景值作对比，便能得出有哪些探针结合了靶DNA，从而得出明显、清晰的检测结果。

在本实施例中，使用本发明对检测范围内致病菌的DNA样本进行检测及鉴定，所选择样本分别为提取自流感嗜血杆菌和提取自粘质沙雷氏菌标准菌株的DNA(菌浓度＝10^5个菌)，分别对流感嗜血杆菌和粘质沙雷氏菌的DNA进行检测，检测流程为PCR扩增、基因芯片杂交、扫描并分析杂交信号。

实施例二

本实施例在实施例一的基础上，本实施例中使用本发明对流感嗜血杆菌样本和粘质沙雷氏菌样本进行检测和鉴定，步骤如下：

S1、取出试剂盒中的八连管，一排八连管对应一个检测样本，八个管分别装有8组预制好的含有不同引物组的PCR缓冲液。

S2、将提取的待检测样本的DNA于每个PCR缓冲液反应管中加入5μL，短暂离心收集管壁残液至底部。

S3、将反应管放入PCR仪，设置如下反应程序，进行扩增反应：95℃5min预变性；95℃15sec，53℃1min30 sec，72℃20sec，5个循环；94℃15sec，55℃35sec，72℃20sec 30个循环。

S4、扩增后，将来自同一个样本DNA的8组PCR扩增产物各取5μL混合在一个EB管中进行基因芯片杂交反应，往EB管中加入121μL试剂盒杂交液，混匀。

S5、将EB管放置100℃5分钟，然后取出并放置冰水浴5分钟。

S6、使用试剂盒中的盖玻片将基因芯片盖好，然后将冰水浴后的样品沿着盖玻片与基因芯片边缘缝隙全部加入，然后放入杂交盒内。

S8、将杂交盒放入杂交仪中杂交。杂交完成后，取出基因芯片。将试剂盒的1000X清洗液用纯化水稀释成1X的清洗液(1个基因芯片清洗盒需要150ml的1X清洗液能将基因芯片清洗干净)，然后将杂交好的基因芯片放入清洗盒，盖上盒盖上下涮洗3次，最后倒入清洗液将基因芯片浸泡。

S9、用基因芯片扫描仪扫描清洗好的基因芯片，得到带有荧光信号的图像，如图3和图4所示，并分析其结果。实验结果如表6和表7所示。

表6.流感嗜血杆菌样本提取DNA检测结果

表7.粘质沙雷氏菌样本提取DNA检测结果

根据表6和表7可知，提取自流感嗜血杆菌和粘质沙雷氏菌的DNA，经试剂盒进行检测实验后，在基因芯片上都显示出了相符合的结果，并显示出耐药基因结果。证明试剂盒可检出致病菌单菌DNA及所含有的耐药基因。

实施例三

在实施例一的基础上，本实施例中使用本发明对检测范围内致病菌的DNA样本进行检测及鉴定，所选择样本为提取自混菌样本的DNA(菌浓度＝10^7个菌)，混菌样本为使用嗜肺军团菌、化脓链球菌、产酸克雷伯菌和白色念珠菌的标准菌株混合制备而来，检测流程为PCR扩增、基因芯片杂交、扫描并分析杂交信号。其中PCR扩增流程，杂交流程均与实施例二相同。最后用基因芯片扫描仪扫描清洗好的基因芯片，得到带有荧光信号的图像，如图5所示，并分析其结果。实验结果如表8所示。

表8.混菌样本提取DNA检测结果

根据表8可知，提取自流感嗜血杆菌和粘质沙雷氏菌的DNA，经试剂盒进行检测实验后，在基因芯片上都显示出了相符合的结果，并显示出耐药基因结果。证明试剂盒可检出致病菌混菌样本DNA及所含有的耐药基因。

实施例四

在实施例一的基础上，本实施例中使用本发明对临床DNA样本进行检测及鉴定，所选择样本为提取自呼吸道感染疾病患者痰液的致病菌DNA，检测流程为PCR扩增、基因芯片杂交、扫描并分析杂交信号。PCR扩增流程、杂交流程均与实施例二相同。实验结果如表9所示。

表9.呼吸道感染疾病患者痰液样本致病菌DNA检测结果

根据表9可知，提取自呼吸道感染疾病患者痰液样本的致病菌DNA，经试剂盒进行检测实验后，在基因芯片上显示出了相应的结果，并显示出耐药基因结果。证明试剂盒可检出呼吸道感染疾病患者痰液样本中含有的致病菌DNA，及其所含有的耐药基因。

以上应用为对本发明进行阐述的具体个例，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明，如其中应用例四所使用样本为呼吸道感染疾病患者的痰液样本，除此以外，本发明也可用于检测有呼吸道感染症状患者的痰液或肺泡灌洗液样品，或呼吸道感染疾病患者的肺泡灌洗液样品。

上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于此，在所属技术领域的技术人员所具备的知识范围内，在不脱离本发明宗旨的前提下还可以作出各种变化。

Claims (8)

1.呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)，其特征在于，盒内含有PCR扩增反应和基因芯片杂交反应所需的所有试剂和耗材，上述的所有试剂和耗材按功能进行分类，且试剂成分通过整合、优化得到；再通过与基因芯片杂交体系结合，为基因芯片杂交构建稳定且易于使用者操作的反应条件；

试剂盒的使用方法如下：结合上述试剂和耗材，先用特殊引物扩增DNA，再通过特定的基因探针和基因芯片杂交，最后对一个样本里的多种呼吸道病原微生物及耐药基因同时进行检测。

2.根据权利要求1所述的呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)，其特征在于，试剂包括A部分和B部分；A部分包括杂交试剂和杂交耗材；B部分包括PCR试剂；杂交试剂包括杂交液和1000X清洗液；杂交耗材包括基因芯片及盖片；PCR试剂包括PCR缓冲液，其中：

杂交液包括甲酰胺、柠檬酸钠缓冲液、十二烷基硫酸钠(SDS)、PEG35K、TritonX-100、内参和纯化水；

1000X清洗液包括半胱胺盐酸盐和纯化水；

PCR缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH₄)SO₄、MgSO₄、Triton X-100、D-海藻糖(二水)、dNTP、Taq HS酶、PCR扩增引物、阳性质控和灭菌水。

3.根据权利要求2所述的呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)，其特征在于，引物扩增时，通过对序列经过特殊设计，可精准捕捉样品中靶DNA并与之结合、扩增的引物，按灵敏度提前进行分组，制备成缓冲液，再搭配试剂盒内含有的PCR管，使多种引物同时进行PCR扩增反应。

4.根据权利要求2所述的呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)，其特征在于，通过杂交阳性质控DNA模板的扩增产物，对PCR反应进行监测。

5.根据权利要求1所述的呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)，其特征在于，特定的基因探针包括可捕获致病菌基因/耐药基因的探针。

6.根据权利要求1所述的呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)，其特征在于，杂交时，通过添加带有cy5荧光修饰的内参，使其与基因芯片上的探针结合，基于不同荧光信号的强弱区分捕获目标基因的探针和未捕获目标基因的探针，得到杂交结果数据。

7.根据权利要求1所述的呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)，其特征在于，杂交后，使用清洗液对基因芯片进行清洗、晾干，扫描杂交信号并处理数据，得到检测结果。

8.根据权利要求1-7任一项所述的呼吸道病原微生物及耐药基因核酸检测试剂盒(基因芯片法)，其特征在于，上述技术应用于47种呼吸道感染致病菌和11种耐药基因的检测及鉴定，范围涵盖革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌。