CN110643722A - 一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种耐药位点的检测方法，特别涉及一种多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的方法及其试剂盒。该发明所提供的用于多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的专用引物，是选取与二联用药(头孢曲松和阿奇霉素)耐药相关基因作为检测的靶基因，包括penA、ponA、porB、mtrR和23S rRNA。基于高分辨率熔解曲线分析技术，通过PCR产物的高分辨率熔解实时监控DNA解链过程，根据熔解曲线的特征变化来分析上述基因的突变情况，从而为判定淋病奈瑟菌的耐药状况提供依据。

Description

一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种耐药位点的检测方法，特别涉及一种多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的方法及其试剂盒。
背景技术
淋病是由淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)引起的全球第二常见的细菌性性传播感染(Sexually transmitted infection，STI)，全世界每年的新发病率高达8700万例。目前尚未有针对淋病奈瑟菌的有效疫苗，有效的抗菌治疗仍是治疗和控制淋病的主要手段。广谱头孢菌素类(Extended-spectrum cephalosporins，ESCs)被认为是目前用于淋病经验治疗单药的最后一种选择。随着头孢菌素类抗生素的广泛应用，淋病奈瑟菌对头孢菌素类的耐药现象也开始慢慢出现，在全球报道各地相继报道了对头孢菌素类抗生素低敏和耐药的淋病奈瑟菌分离株。因此，世界卫生组织推荐采用头孢曲松(第三代头孢菌素类抗生素)联合阿奇霉素作为淋球菌感染时的一线治疗方案。不幸的是，近年来不断有对头孢曲松和阿奇霉素高度耐药的淋球菌菌株被报导，严重地威胁着当前推荐的治疗方案。
加强淋病奈瑟菌耐药性的监测是控制和预测耐药趋势的必要手段，以确保当前推荐治疗方案的有效性。常规的耐药检测手段主要是基于细菌的分离培养法，通过纯培养获得分离株，观察分离株在相应的抗生素浓度下的生长情况从而对淋球菌的耐药性进行评价。该方法特异性强，准确性高，但需要经历繁琐费时的培养过程，缺乏时效性。而全基因组测序技术(Whole-genome sequencing，WGS)，通过获得细菌的全基因组序列信息，进而分析携带的耐药情况，已成功应用于淋病奈瑟菌的分子流行病学筛查和耐药性监测。全基因组测序技术的优势是显而易见的，它可以提供更全面的耐药信息，追踪不同耐药株亲缘关系与进化关系，分析特定人群、地区的耐药株分布与变异。但是成本高昂、需要专业的人员进行数据分析，并且一次可处理的样本有限。幸运的是在过去几十年年里，在研究淋病奈瑟菌的分子耐药机制方面取得了巨大进展，使得建立分子筛查方法以检测特定的耐药基因成为可能。一系列核酸扩增方法(Nucleic acid amplification testing，NAAT)凭借耗时短、操作简便、自动化等优点快速建立起来，取代培养法逐渐成为检测淋病奈瑟菌耐药性的首选。然而，这些方法需要使用昂贵的荧光标记引物或探针，大大地增加了这些方法在应用中的成本。
高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting，HRM)是近年来兴起的一种新型的结合饱和荧光染料、未标记探针和实时荧光定量PCR的检测基因突变与基因分型的分子诊断技术。HRM在实时荧光定量PCR的基础之上，在体系中加入饱和荧光染料，利用高精密度的仪器，通过PCR产物的高分辨率熔解实时监控DNA解链过程，根据熔解曲线的特征变化来分析DNA序列的微小差异。由于HRM具有快速、准确、高通量、特异性强、灵敏度高、成本低廉和实现真正的闭管操作等优点，因此广泛应用于序列分析、基因分型、突变位点扫描、单核苷酸多态性分析以及临床检测等领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强和灵敏度高的用于多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的专用引物。
本发明所提供的用于多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的专用引物，是选取与二联用药(头孢曲松和阿奇霉素)耐药相关基因作为检测的靶基因，包括penA、ponA、porB、mtrR和23S rRNA。
首先从GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下载各淋病奈瑟菌经过完整注释作为参考序列的代表株基因序列，将参考序列与NCBI的nr数据库进行核酸序列BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下载比对得到的结果，获取更多检测靶基因序列。使用Beacon Designer 8.0软件在耐药位点两侧设计特异性的扩增引物，使用NCBI在线的引物工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/)验证引物的特异性。用oligocalc(http://biotools.nubic.norwestern.edu/oligocalc.html)和UMELT在线软件(https://www.dna.utah.edu/umelt/umelt.html)预测扩增产物的熔解温度(Melting temperature，Tm)。针对每个检测位点设计6组引物对，并筛选出能准确区分野生型和突变型的最佳引物对。另外在某些引物中加入了非特异性的GC尾，使得扩增产物之间的Tm值不重叠，从而能够同时检测和分析不同的熔解曲线。最后，选择能准确区分野生型和突变型的最佳引物对，形成最终多重的HRM分析体系。
多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的专用引物，所述引物为11个靶点的特征性引物组，一套引物组由两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物。共有11套引物组，分别针对11个检测靶点实现多重检测反应，专用引物如序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22所示。
其中，11个检测靶点中，
检测靶点porB-120&121所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；
检测靶点penA-G545S所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示；
检测靶点opa所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；
检测靶点porA所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示；
检测靶点penA-345Del所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示；
检测靶点23S rRNA-2611所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示；
检测靶点mtrR-G45D所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14所示；
检测靶点mtrR-H105Y所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16所示；
检测靶点23S rRNA-2059所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18所示；
检测靶点ponA-L421P所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20所示；
检测靶点penA-nmA501所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.22所示。
具体的，本发明所述的引物的序列见表1。
表1引物序列信息
Figure BDA0002196631710000041
本发明所述的11个检测靶点中，作用如下：
(i)penA-D345del和penA-G545S用于识别淋病奈瑟菌的mosaic型别；
(ii)penA-nmA501用于区分非mosaic型别时A501T和A501V位点的突变，或者作为鉴定淋病奈瑟菌的mosaic型别和非mosaic型别的靶点；
(iii)靶标porB-120&121用于扩增含有porB1b基因突变位点(G120K/D/R/N和A121N/D/G)和porB1a基因；
(iv)mtrR-G45D和mtrR-H105Y两靶标用以确定外排泵MtrCDE的表达情况；
(v)ponA基因421位氨基酸的变化(L421P)可通过ponA-L421P靶标加以区分；
(vi)为了检测对阿奇霉素的高度或中度耐药的耐药位点，分别选择23S rRNA-2059或23S rRNA-2611作为靶点；
opa和porA两靶标作为淋病奈瑟菌种属的鉴定和确认。
本发明的第二个目的是提供本发明专用引物在检测淋病奈瑟菌耐药位点中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种含有本发明专用引物的试剂盒。
本发明所述的试剂盒，除了含有多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的专用引物，还包括采样管、粗提试剂Lysis buffer、反应组分EvaGreen Master Mix(扩增酶、扩增buffer、dNTP和EvaGreen荧光染料)、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为各检测靶点的野生型阳性样本，所述阴性对照为ddH2O。
本发明的第四个目的是提供试剂盒在检测淋病奈瑟菌耐药位点中的应用。
本发明的第五个目的是提供专用引物在检测淋病奈瑟菌耐药位点的方法。
本发明所述检测方法，包括以下步骤：
1)使用试剂盒方法或裂解法完成样本基因组DNA的提取；
2)以待测样本的基因组DNA为模板，在上述专用引物组的引导下配制HRM扩增反应体系，进行特异性扩增；
3)在PCR过程中，在饱和染料的作用下，对PCR扩增子进行加热，通过实时监测升温过程中荧光强度的变化，将检测结果进行数据整合及图像绘制，生成PCR产物熔解曲线，根据熔解曲线的不同来判断PCR产物中DNA序列的差异。
具体的，本发明所提供的多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的方法，包括以下步骤：
1、使用试剂盒方法或裂解法完成样本基因组DNA的提取；
2、以待测样本的基因组DNA为模板，在上述专用引物组的引导下配制HRM扩增反应体系，进行特异性扩增；
3、DNA熔解曲线的变化取决于扩增子序列的特异性，其序列长度和GC含量与DNA熔解曲线的特征表现密切相关，一个碱基的细微变化也会引起DNA双链解链温度的变化。因此，DNA分子间的差异可以通过不同DNA分子的熔解曲线的变化来区分。在PCR过程中，由于目标序列的序列特异性，会造成不同PCR产物的碱基含量差异，根据DNA本身的性质，在饱和染料的作用下，对PCR扩增子进行加热，通过实时监测升温过程中荧光强度的变化，将检测结果进行数据整合及图像绘制，生成PCR产物熔解曲线，我们根据熔解曲线的不同来判断PCR产物中DNA序列的差异。
本发明的目的还在于提供试剂盒在多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的中的应用，包括以下步骤：
1)使用试剂盒提供的样本采集管收集病人分泌物或者尿液样本；
2)对于尿液样本，8,000rpm离心10min后，弃上清，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysis buffer；对于分泌物的拭子样本，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysisbuffer，搅拌，将拭子浸泡在Lysis buffer中5min；
3)将样本采集管置于金属浴或水浴锅中，95℃加热10min，室温静置，完成样本基因组DNA的提取；
4)以上述步骤获得样本基因组DNA为模板，在3个的引物组，Assay1-Assay 3中实现头孢曲松和阿奇霉素耐药相关位点的检测，
其中20μl的反应体系包括：10μL的EvaGreen Master Mix，Assay中各引物的最佳扩增浓度(表2)，样本基因组DNA 2μl，ddH2O补足至20μl，每次检测反应均同时引物阳性对照和阴性对照反应管；
5)在QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System进行扩增反应和HRM分析，扩增反应的条件为：95℃孵育10分，接着95℃退火15秒，60℃延伸1分钟，共进行30个循环扩增反应结束后，60℃孵育1分钟，随后以0.025℃/s到95℃的速率缓慢升温，并连续收集荧光信号；
6)反应结束后使用QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR software v1.0进行分析，软件会自动生成扩增子对应的熔解曲线和Tm值，通过与野生型的阳性对照进行对比，判断结果，若待测样本的耐药位点与野生型对照样本相同则熔解曲线形状无变化，若待测样本与野生型对照样本不同会形成突变，熔解曲线形状也会相应发生改变。
本发明的方法，能够快速地检测与WHO推荐的二联治疗方案(头孢曲松和阿奇霉素联合)耐药相关的位点。与现有检测淋病奈瑟菌耐药位点的其它技术和同类技术相比，本发明技术方案有如下优点：首先，与传统的PCR或其他分子检测技术相比，HRM技术是通过实时监控熔解曲线变化而进行PCR产物分析的高通量基因筛查技术，不受检测靶标突变位置及突变种类的限制，无需合成昂贵的序列特异性探针，大大降低检测成本，反应结束后直接通过高分辨率熔解曲线即可快速灵敏地分析实验结果，获得耐药位点的突变信息；其次，本发明进行HRM分析实验采用饱和染料EvaGreen，由于饱和染料EvaGreen不会抑制PCR反应，可以在反应开始前直接加入PCR反应体系中参与PCR过程，反应结束后也无需转入其他分析装置或开盖加入染料而直接进行HRM分析，真正实现了闭管操作，避免了开盖可能引入的污染，造成假阳性结果，提高了实验结果的准确率和可信度；最后，分析过程中的升降温不会对DNA结构造成破坏性损伤，后续的降温可使DNA复性，复性后的DNA可以直接用于后续研究(如测序验证结果)，大大节省了时间及人力物力，避免了不必要的浪费。
对于说明书中出现的名词，进行解释：
Lysis buffer：样本裂解液
EvaGreen Master Mix：带有EvaGreen染料的反应体系混合液
ddH2O：双蒸水
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System：ABI公司的QuantStudio 6实时定量PCR系统
HRM：high-resolution melting，高分辨率熔解曲线
附图说明
图1、Assay1的结果示意图
图2、Assay2的结果示意图
图3、Assay3的结果示意图。
具体实施方式
实施例是基于本发明的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。此处所描述的具体实施方式和操作过程仅用于解释本发明，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面就医院临床筛查淋病奈瑟菌耐药位点实施例的实施方式和具体操作过程阐述如下。
实施例1、多重检测淋病奈瑟菌耐药位点方法的建立
1、选取48株耐药位点信息明确的淋病奈瑟菌分离株，进行多重检测方法的建立；
2、使用商业化试剂盒方法提取菌株基因组DNA；
3、以耐药位点信息明确的淋病奈瑟菌分离株的基因组DNA为模板，在上述专用引物组的引导下配制HRM扩增反应体系，体系为20μl，包括：10μL的EvaGreen Master Mix，Assay中各引物的最佳扩增浓度(表1)，样本基因组DNA 2μl，ddH2O补足至20μl。
4、在QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System进行扩增反应和HRM分析。扩增反应的条件为：95℃孵育10分，接着95℃退火15秒，60℃延伸1分钟，共进行30个循环扩增反应结束后，60℃孵育1分钟，随后以0.025℃/s到95℃的速率缓慢升温，并连续收集荧光信号；
5、DNA熔解曲线的变化取决于扩增子序列的特异性，其序列长度和GC含量与DNA熔解曲线的特征表现密切相关，一个碱基的细微变化也会引起DNA双链解链温度的变化。因此，DNA分子间的差异可以通过不同DNA分子的熔解曲线的变化来区分。在PCR过程中，由于目标序列的序列特异性，会造成不同PCR产物的碱基含量差异，根据DNA本身的性质，在饱和染料的作用下，对PCR扩增子进行加热，通过实时监测升温过程中荧光强度的变化，将检测结果进行数据整合及图像绘制，生成PCR产物熔解曲线，我们根据熔解曲线的不同来判断PCR产物中DNA序列的差异。
6、HRM分析结果表明，引物组内的所有引物工作性能良好，能够准确区分耐药位点的突变型和野生型。多重HRM分析结果显示，该方法不仅能够识别在临床样本中鉴定出淋病奈瑟菌，还能特异、准确地识别与头孢曲松和阿奇霉素耐药相关位点不同核苷酸变异。在优化后的最佳条件下，所有靶点均得到了高效、特异的扩增。每孔中多种靶点组合产生的多种扩增子，在HRM分析时不会相互干扰，每个扩增子对应的溶解曲线充分分离，能够很好的区分和鉴定耐药位点的突变信息(表2)。
表2多重检测淋病奈瑟菌耐药位点检测方法的结果
a NA,无扩增子产生.
实施例2、多重检测淋病奈瑟菌耐药位点方法与全基因组测序的比较
1、选取218株经全基因组测序获得全基因组信息的淋病奈瑟菌分离株，进行多重检测方法的比较；
2、以218淋病奈瑟菌分离株的基因组DNA为模板，在上述专用引物组的引导下配制HRM扩增反应体系，体系为20μl，包括：10μL的EvaGreen Master Mix，Assay中各引物的最佳扩增浓度(表1)，样本基因组DNA 2μl，ddH2O补足至20μl。
3、在QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System进行扩增反应和HRM分析。扩增反应的条件为：95℃孵育10分，接着95℃退火15秒，60℃延伸1分钟，共进行30个循环扩增反应结束后，60℃孵育1分钟，随后以0.025℃/s到95℃的速率缓慢升温，并连续收集荧光信号；
4、结果显示，多重检测淋病奈瑟菌耐药位点方法和全基因组测序方法在与头孢曲松和阿奇霉素耐药相关位点的结果非常一致。两种方法比较的阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、特异性和灵敏度见表3。总的来说，检测淋病奈瑟菌耐药位点方法的灵敏度、特异性、PPV和NPV分别为98.5％(95％置信区间：97.9-98.9)、99.2％(95％置信区间：98.9-99.4)、98.5％(95％置信区间：97.9-98.9)和99.2％(95％置信区间：98.9-99.4)。
表3|多重检测淋病奈瑟菌耐药位点方法和全基因组测序方法在与头孢曲松和阿奇霉素耐药相关位点检测的比较
Figure BDA0002196631710000111
Figure BDA0002196631710000121
a TP,真阳性；FP,假阳性；FN,假阴性；TN,真阴性.b CI,置信区间；PPV,阳性预测值；NPV,阴性预测值.c NA,无测量值.
实施例3、多重检测淋病奈瑟菌耐药位点检测试剂盒的应用
1)使用本发明试剂盒提供的样本采集管收集病人分泌物或者尿液样本。
2)对于尿液样本，8,000rpm离心10min后，弃上清，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysis buffer；对于分泌物的拭子样本，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysisbuffer，搅拌，将拭子浸泡在Lysis buffer中5min。
3)将样本采集管置于金属浴或水浴锅中，95℃加热10min，室温静置，完成样本基因组DNA的提取。(以上步骤可用其他核酸提取试剂盒或方法完成基因组DNA的提取)
4)以上述步骤获得样本基因组DNA为模板，在3个Assay的引物组(Assay1-Assay3)中实现头孢曲松和阿奇霉素耐药相关位点的检测。反应体系为20μl，包括：10μL的EvaGreen Master Mix，Assay中各引物的最佳扩增浓度(表1)，样本基因组DNA 2μl，ddH2O补足至20μl。每次检测反应均同时引物阳性对照和阴性对照反应管。
5)在QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System进行扩增反应和HRM分析。扩增反应的条件为：95℃孵育10分，接着95℃退火15秒，60℃延伸1分钟，共进行30个循环扩增反应结束后，60℃孵育1分钟，随后以0.025℃/s到95℃的速率缓慢升温，并连续收集荧光信号。
6)反应结束后使用QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR software v1.0进行分析，软件会自动生成扩增子对应的熔解曲线和Tm值。通过与野生型的阳性对照进行对比，判断结果。若待测样本的耐药位点与野生型对照样本相同则熔解曲线形状无变化，若待测样本与野生型对照样本不同会形成突变，熔解曲线形状也会相应发生改变(图1-3)。
序列表
<110> 中国医学科学院病原生物学研究所
<120> 一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法及试剂盒
<130>
<160> 4
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> porB-120&121
<400> 1
GAACAGCCCCCTGAAAAACAC
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> porB-120&121
<400> 2
CCGGATTCCCAAGCATTGAC
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-G545S
<400> 1
GTGTGATTGTGGCGGTAAC
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-G545S
<400> 2
GACCGGACCTGTCACTAC
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> opa
<400> 1
AGGGAGAGCGGGGAAACC
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> opa
<400> 2
CAGCAGGCGTTGGTGGAA
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> porA
<400> 1
TAATTGGAGACTGATTGGGTGT
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> porA
<400> 2
CGCATATCGGCTTCCTTTTGTA
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-345Del
<400> 1
TCGGCTACCGTACAAGATAC
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-345Del
<400> 2
GGTACCGACGTTGGAAGA
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 23S rRNA-2611
<400> 1
CGTCGTGAGACAGTTTGG
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 23S rRNA-2611
<400> 2
CGGTCCTCTCGTACTAGG
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> mtrR-G45D
<400> 1
CCGGCGGCGGACGAAATCGCCCAAGCCG
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> mtrR-G45D
<400> 2
CGGCGGCCGCTTTTTGAAATGCCAATAGAGCG
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> mtrR-H105Y
<400> 1
GCACTTTTTCGAGCGGCTG
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> mtrR-H105Y
<400> 2
AACAGGATGTTGTGGAATTTGTAG
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 23S rRNA-2059
<400> 1
ACTCAGCGAAGTTGAAGTGGT
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 23S rRNA-2059
<400> 2
TACAGTAAAGGTTCACGGGGTC
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> ponA-L421P
<400> 1
TTGGGCGGTGGTTCAAGAG
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> ponA-L421P
<400> 2
TGCATCCAGCGAAACCAAAG
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-nmA501
<400> 1
CCGGCGGCGGGTTTCGATGTCGGCGCTAAA
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-nmA501
<400> 2
CGGCGGCCGCTAGCGGCCATTGACCAGTTT

Claims (10)

1.一种用于多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的专用引物，其特征在于，选取与二联用药(头孢曲松和阿奇霉素)耐药相关基因作为检测的靶基因，包括penA、ponA、porB、mtrR和23SrRNA。
2.根据权利要求1所述的检测专用引物，其特征在于，专用引物为11个检测靶点的特征性引物组，每一套引物组由两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物。
3.根据权利要求2所述的检测专用引物，其特征在于，专用引物如序列表中SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.22所示。
4.根据权利要求2所述的检测专用引物，其特征在于，11个检测靶点中，
检测靶点porB-120&121所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；
检测靶点penA-G545S所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示；
检测靶点opa所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；
检测靶点porA所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示；
检测靶点penA-345Del所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示；
检测靶点23S rRNA-2611所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示；
检测靶点mtrR-G45D所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14所示；
检测靶点mtrR-H105Y所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16所示；
检测靶点23S rRNA-2059所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18所示；
检测靶点ponA-L421P所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20所示；
检测靶点penA-nmA501所针对的引物为序列表中SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.22所示。
5.根据权利要求2所述的检测专用引物，其特征在于，11个检测靶点中，
(i)penA-D345del和penA-G545S用于识别淋病奈瑟菌的mosaic型别；(ii)penA-nmA501用于区分非mosaic型别时A501T和A501V位点的突变，或者作为鉴定淋病奈瑟菌的mosaic型别和非mosaic型别的靶点；(iii)靶标porB-120&121用于扩增含有porB1b基因突变位点(G120K/D/R/N和A121N/D/G)和porB1a基因；(iv)mtrR-G45D和mtrR-H105Y两靶标用以确定外排泵MtrCDE的表达情况；(v)ponA基因421位氨基酸的变化(L421P)可通过ponA-L421P靶标加以区分；(vi)为了检测对阿奇霉素的高度或中度耐药的耐药位点，分别选择23S rRNA-2059或23S rRNA-2611作为靶点；选取opa和porA两靶标作为淋病奈瑟菌种属的鉴定和确认。
6.权利要求1所述的检测专用引物的应用，为检测淋病奈瑟菌耐药位点。
7.含有权利要求1所述的检测专用引物的试剂盒。
8.权利要求7所述的试剂盒在检测淋病奈瑟菌耐药位点中的应用。
9.权利要求1所述的检测专用引物在检测淋病奈瑟菌耐药位点的方法，包括以下步骤：
1)使用试剂盒方法或裂解法完成样本基因组DNA的提取；
2)以待测样本的基因组DNA为模板，在上述专用引物组的引导下配制HRM扩增反应体系，进行特异性扩增；
3)在PCR过程中，在饱和染料的作用下，对PCR扩增子进行加热，通过实时监测升温过程中荧光强度的变化，将检测结果进行数据整合及图像绘制，生成PCR产物熔解曲线，根据熔解曲线的不同来判断PCR产物中DNA序列的差异。
10.权利要求7所述试剂盒在检测淋病奈瑟菌耐药位点的方法，包括以下步骤：
1)使用试剂盒提供的样本采集管收集病人分泌物或者尿液样本；
2)对于尿液样本，8,000rpm离心10min后，弃上清，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysis buffer；对于分泌物的拭子样本，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysis buffer，搅拌，将拭子浸泡在Lysis buffer中5min；
3)将样本采集管置于金属浴或水浴锅中，95℃加热10min，室温静置，完成样本基因组DNA的提取；
4)以上述步骤获得样本基因组DNA为模板，在3个的引物组，Assay1-Assay 3中实现头孢曲松和阿奇霉素耐药相关位点的检测，
其中20μl的反应体系包括：10μL的EvaGreen Master Mix，Assay中各引物的最佳扩增浓度(表2)，样本基因组DNA 2μl，ddH2O补足至20μl，每次检测反应均同时引物阳性对照和阴性对照反应管；
5)在QuantStudio 6Flex Real-Time PCR System进行扩增反应和HRM分析，扩增反应的条件为：95℃孵育10分，接着95℃退火15秒，60℃延伸1分钟，共进行30个循环扩增反应结束后，60℃孵育1分钟，随后以0.025℃/s到95℃的速率缓慢升温，并连续收集荧光信号；
6)反应结束后使用QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR software v1.0进行分析，软件会自动生成扩增子对应的熔解曲线和Tm值，通过与野生型的阳性对照进行对比，判断结果，若待测样本的耐药位点与野生型对照样本相同则熔解曲线形状无变化，若待测样本与野生型对照样本不同会形成突变，熔解曲线形状也会相应发生改变。
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