CN111394438A - 一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测检测19个淋病奈瑟菌耐药位点突变的方法。该方法利用多重PCR‑质谱法检测19个淋病奈瑟菌耐药位点突变。本发明的检测方法，包括以下步骤：1)针对不同耐药位点的引物设计；2)多重PCR扩增反应；3)虾碱性磷酸酶处理；4)单碱基延伸反应；5)树脂脱盐纯化；6)质谱检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种多重耐药位点的检测方法，特别涉及一种多重PCR-质谱检测淋病奈瑟菌耐药位点的方法。
背景技术
淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)是一种严重影响公共卫生的性传播病原体，全球新发感染率高达8700万例。高发病率不但加重了全球健康经济成本，更导致了严重耐药问题。伴随着淋球菌的耐药性发展和蔓延迅速，过去广泛推荐使用的抗生素(磺胺类药物、青霉素、早期头孢菌素、四环素、大环内酯和喹诺酮类药物)相继退出淋病推荐一线推荐用药。目前世界卫生组织推荐的一线经验性用药为头孢菌素联合阿奇霉素，而广谱头孢菌素类(Extended-spectrum cephalosporins，ESCs)在多个国家被认为是目前用于淋球菌感染单抗生素治疗的最后一种选择。不幸的是，近年来不断有多地报告了头孢菌素和奇耐霉素双耐药株，最近更是在英国和澳大利亚发现了超级耐药株，在阿奇霉素高耐的同时也对头孢菌素耐药，不断增长的耐药性可能会导致淋病进入一个无法治疗的时代。
淋球菌感染的治疗面临着耐药现状严重，而细菌还在不断获得新的耐药机制的困境。我们必须对其耐药性及时检测和监控，建立合适的治疗方案才能使我们对淋病的控制更加强有力。常规的淋球菌耐药性检的测方法分为培养法和非培养法，培养法测淋球菌MIC(最低抑菌浓度)是淋球菌耐药性诊断的“金标准”，特异性强，准确性高，也是唯一可以获得纯培养的分离株的方法。但这种方法需要经历繁琐费时的培养过程，缺乏时效性，且不适用于大量样本的情况。核酸扩增方法(Nucleic acid amplification tests，NAATs)具有耗时短，自动化等优点，通过检测特定耐药相关突变位点，可实现快速检测淋球菌耐药性。但是此类方法均受到方法通量的限制，且检测位点有限，无法运用于大规模样本的耐药相关位点的监测和获得全面的耐药信息。目前WGS(Whole Genome Sequencing)也成功的运用到淋球菌耐药检测中，可及时发现新的耐药相关基因以及突变，且对耐药突变位点的预测具有指导意义。但成本与技术限制了WGS在一些资源有限的地区的广泛运用，同样不适用于大规模样本的监测。因此有必要开发一种具有高通量，低成本和全面检测淋球菌耐药相关位点的多重检测方法，以进行有效的筛选。在临床治疗中，可通过一次快速的检测获得全面的耐药信息，从而选择最佳治疗方案。在而公共卫生层面，该方法一个工作人员可在8h内同时检测大量份样本，适用于大规模的淋球菌耐药监测，可及时监测不同地区不同人群中的耐药分布情况。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测淋球菌耐药相关位点突变的方法，该方法用于非诊断目的。该方法利用多重PCR-质谱法检测19个淋病奈瑟菌耐药位点突变。
本发明所提供的用于多重检测淋病奈瑟菌耐药位点的专用引物，是选取与五类抗生素(头孢菌素类、大环内酯类、喹诺酮类、大观霉素、青霉素类)耐药相关基因作为检测的靶基因，包括rpsE、penA、gyrA、parC、ponA、porB、mtrR、16S rRNA和23S rRNA。
本发明所述的19个淋病奈瑟菌耐药位点突变，包括：
1)16S rRNA C1192U
2)rpsE T24P
3)23S rRNA C2611T
4)23S rRNA A2059G
5)gyrA D95G/A
6)gyrA S91F
7)parC D86N
8)parC S88P
9)penA G542S
10)penA G545S
11)penA A501T/V
12)penA P551S/L
13)penA A311V
14)penA D345-insertion
15)ponA L421P
16)mtrR-G45D
17)mtrR-deletion A
18)porB-A121DN(G)
19)porB G120D(KNR)
本发明所述的19个检测靶点，其作用如下：
1)16S rRNA C1192U和rpsE T24P用于检测大观霉素耐药性；
2)23S rRNA C2611T和23S rRNA A2059G用于检测大环内酯类抗生素耐药性；
3)gyrA D95G/A、gyrA S91F、parC D86N和parC S88P用于检测喹诺酮类抗生素耐药性；
4)penA G542S、penA G545S、penA A501T/V、penA P551S/L和penA A311V用于检测头孢菌素耐药性；
5)penA D345-insertion、ponA L421P用于检测青霉素类抗生素耐药性；
6)mtrR-G45D和mtrR-deletion A两靶标用以确定外排泵MtrCDE的表达情况，与多种抗生素耐药性相关；
7)靶标porB-A121DN(G)和porB G120D(KNR)用于确定主要外膜蛋白表达情况，与多种抗生素耐药性相关；
8)penA-D345del和penA-G545S用于识别淋病奈瑟菌的mosaic penA型别；
9)penA A311V用于识别包含A311V突变的mosaic penA型别；
10)opa和porA两靶标作为淋病奈瑟菌种属的鉴定和确认；
本发明所述的检测方法，包括以下步骤：
1)引物设计：针对每一种拟检测耐药位点，首先从GenBank数据库中下载各淋病奈瑟菌经过完整注释作为参考序列的代表株9个耐药基因序列，包括rpsE、penA、gyrA、parC、ponA、porB、mtrR、16S rRNA和23S rRNA，将参考序列提交到NCBI的进行核酸序列BLAST，选择nr数据库，下载比对得到的结果，得到19个检测淋病奈瑟菌耐药位点突变所在的靶基因序列，针对每个靶基因中的待测耐药位点的特异性扩增引物，为了避免扩增引物的质量出现在结果窗口，须在每条扩增引物的5’端加上通用序列ACGTTGGATG等10个碱基的增加质量，在扩增区中的耐药位点所在区域设计一条单碱基延伸探针，使该探针结合到靶基因上后，在3’末端只允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，其中，19个耐药位点的扩增引物和延伸探针序列见表1；
2)多重PCR扩增反应：将UNG酶、dNuTPs混合物、DNA聚合酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中混匀，先使用UNG酶进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，预变性，随后作PCR扩增，获得待测样本中靶基因扩增产物；
3)虾碱性磷酸酶反应：多重PCR反应结束后，加入SAP混合液，使用SAP消化去除反应体系剩余的dNTP，预防多余的底物影响下一步单碱基延伸反应结果；
4)单碱基延伸反应：加入针对耐药位点设计的延伸探针，结合至扩增出来的靶基因进行单碱基延伸反应，底物为经过修饰的双脱氧三磷酸核苷，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应，通过分子量差异可判断延伸碱基，作分子量标记，以判断耐药位点基因型；
5)树脂脱盐：采用阳离子交换树脂吸附体系中的盐离子，纯化延伸反应产物；
6)质谱检测：纯化后产物采用全自动点样装置点到芯片，进行分子量检测，根据分子量差异确定待测靶基因上耐药位点的基因型。
其中，步骤(1)引物设计中，针对待检测耐药位点分别设计一对扩增引物和一条延伸探针。扩增引物和延伸探针序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.62，详见表1。
优选的，添加人类的opa基因作为样品种属鉴定参照，引物序列为SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64，延伸探针序列为SEQ ID NO.65。
优选的，添加人类的porA基因作为样品种属鉴定参照，引物序列为SEQ ID NO.66和SEQ ID NO.67，延伸探针序列为SEQ ID NO.68。
优选的，在每次反应中加入阴性对照，所述阴性对照为无核酸酶蒸馏水。
其中，步骤(2)PCR反应体系见表2-1，反应流程见2-2。
其中，步骤(3)虾碱性磷酸酶反应体系见表3-1，反应流程见3-2。
其中，步骤(4)碱基延伸反应体系见表4-1，反应流程见4-2。
其中，步骤(6)质谱检测：产物纯化后使用专用设备转移到芯片上，与芯片基质进行共结晶，结晶后的芯片放入质谱仪的真空管内，芯片在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF mass spectrometry)系统真空管中受到瞬时的强激光激发，使核酸分子解吸附并产生单电荷离子，这些离子在真空小管中飞行达到检测器，离子质量大小与飞行时间成正比，可检测分子质量数取决于飞行管长度。检测结果会以可视化的图形呈现到服务器上，即以离子峰的强度为纵坐标、离子质量为横坐标形成分析图谱，根据特异性探针延伸反应前后的分子质量差异来判断样本中特定耐药位点延伸的碱基，以判断有无突变，软件自动处理报告每个耐药位点的检测结果和可信程度。
最优选的，本发明的检测方法，包括以下步骤：
1)引物设计：首先从GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下载各淋病奈瑟菌经过完整注释作为参考序列的代表株9个耐药基因序列，包括rpsE、penA、gyrA、parC、ponA、porB、mtrR、16S rRNA和23S rRNA。将参考序列与NCBI的nr数据库进行核酸序列BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下载比对得到的结果，获取更多比对的检测耐药靶基因序列。根据已选定19个目标基因的耐药位点，利用Agena公司的Assay Design 4.0软件设计针对每个待测耐药位点的特异性扩增引物，为了避免扩增引物的质量出现在结果窗口，须在每条扩增引物的5’端加上通用序列ACGTTGGATG等10个碱基的增加质量。在扩增区中的耐药位点所在区域设计一条单碱基延伸探针，使该探针结合到靶基因上后，在3’末端只允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，通过分子量的差异可以判断延伸的碱基，以此判断耐药位点基因型。其中，19个耐药位点的扩增引物和延伸探针序列见表1；
表1、核苷酸序列
2)多重PCR扩增反应:反应使用384孔板，按照下表配制反应体系，总反应体系5μl。将UNG酶、dNuTPs混合物、DNA聚合酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中，先是用UNG酶进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后进行PCR扩增(45个循环)，获得待测样本中靶基因扩增产物，反应体系见表2-1与反应流程表2-2，完成后于4℃低温保存。
表2-1
表2-2
3)虾碱性磷酸酶(Shrimp alkaline phosphatase，SAP)处理：对目标片段多重PCR扩增后，使用SAP消化掉多于的底物，防止未消耗完的底物干扰下一步单碱基延伸反应。按下表配制反应体系，之后用连续分液器转移至上一步的反应板中，每孔转移2μl。反应体系见表3-1与反应流程表3-2，完成后于4℃低温保存。
表3-1
表3-2
4)单碱基延伸(iPLEX)反应：加入设计好的延伸探针进行单碱基延伸反应，使用经修饰的双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)作为反应底物，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应，即在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，通过分子量差异判断延伸的碱基，以此判断耐药位点基因型。按下表配制反应体系，之后用连续分液器转移至上一步的反应板中，每孔转移2μl，反应体系见表4-1与反应流程见表4-2，完成后于4℃低温保存。
表4-1
表4-2
5)树脂脱盐：采用阳离子交换树脂吸附体系中的盐离子，纯化延伸反应产物。加16微升无核酸酶水至于摇床上，80rpm摇4min，2000rpm离心5min。
6)质谱检测：产物纯化后使用专用设备转移到芯片上，与芯片基质进行共结晶，结晶后的芯片放入质谱仪的真空管内，芯片在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDITOF mass spectrometry)系统真空管中受到瞬时的强激光激发，使核酸分子解吸附并产生单电荷离子，这些离子在真空小管中飞行达到检测器，离子质量大小与飞行时间成正比，可检测分子质量数取决于飞行管长度。检测结果会以可视化的图形呈现到服务器上，即以离子峰的强度为纵坐标、离子质量为横坐标形成分析图谱，根据特异性探针延伸反应前后的分子质量差异来判断样本中特定耐药位点延伸的碱基，以判断有无突变，软件自动处理报告每个耐药位点的检测结果和可信程度。利用TyperAnalyzer软件自动分析和报告结果，导出数据。
本发明的检测方法，能够检测位于19个耐药位点的24种突变，且与其他微生物无交叉反应。这24个已报道的重要耐药相关突变位点，覆盖目前大部分用于淋病治疗的抗生素的耐药突变位点并且可筛选mosaic penA。
本发明的方法是一种的淋球菌耐药相关位点高通量多重检测方法，在可以高通量多重(24重)检测的基础上同时可以进行mosaic penA的筛查，很好的应对淋球菌的多重耐药的问题。且操作简单，一个工作人员在一个工作日内运用384芯片可以同时检测大量样本。该方法具有较高灵敏度和特异性，可准确鉴定样本中低丰度的目标序列。同时检测速度快，有很好的可扩展性，实验操作简便易行。在适用于大规模的淋球菌耐药监测的同时更加具有在临床医学上使用和推广的价值。
本发明的另一个目的在于提供一种试剂盒，用于临床样本的检测。
本发明的试剂盒，包括一种或多种表1所示的引物组。
优选的，本发明的试剂盒，包括以下引物组：两个检测靶基因的正向、反向扩增引物序列和对应的延伸探针序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.62；以opa基因为淋病奈瑟菌种属鉴定靶标的扩增引物SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64，延伸探针序列SEQ ID NO.65；以porA基因为淋病奈瑟菌种属鉴定靶标的扩增引物序列SEQ ID NO.66和SEQ ID NO.67，延伸探针序列SEQ ID NO.68。
根据需要，本发明的试剂盒中还可以包括有利于实验室操作的试剂如：溶剂，缓冲溶剂，辅助材料等。
本发明的试剂盒，可以包括以上组分制备而成的试剂，试剂的配制方法均为常规技术，只需要将各种原材料在常温下混合均匀即可，无需特殊设备和条件。
本发明的试剂盒，可以将不同试剂分别盛装，再一同包装在同一包装盒内，使用时根据说明书中描述的方法进行操作。
本发明的另一个目的在于提供上述试剂盒在用于检测淋病奈瑟菌耐药位点的应用。
该试剂盒用于检测19个淋病奈瑟菌的耐药位点，包括：16S rRNA C1192，23S rRNAC2611T，23S rRNA A2059G，gyrA D95/A，gyrA S91F，parC D86N，parC S88，mtrR deletion-A，mtrR G45D，penA D345-insertion,penA G542S，penA G545S，penA A501T/V，penAP551S/L，ponA L421P，porB A121(DN)/G，porB G120D/(KNR)，rpsE T24P和penA A311V。
对于文中出现的技术名词，作出进一步的解释：
Template DNA：DNA模板
SAP Buffer：虾碱性磷酸酶缓冲液
shrimp alkaline phosphatase：虾碱性磷酸酶
iPLEX Pro buffer：单碱基延伸反应缓冲液
Terminator mix：终止反应混合物
延伸探针Mix：延伸探针混合物
Total volume：总体积
MALDI TOF mass spectrometry：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱
ddNTP：双脱氧三磷酸核苷
PCR Buffer：PCR缓冲液
dNuTPs：dATP、dCTP、dGTP和dUTP共4种脱氧核苷酸混合物
扩增引物Mix：多重PCR扩增的引物混合物
DNA polymerase enzyme：DNA聚合酶
uracil-DNA glycosylase：尿嘧啶DNA糖基化酶，也称UNG酶
附图说明
图1：淋球菌耐药位点检测质谱图
具体实施方式
本发明包括同时检测19个淋病奈瑟菌耐药位点。此处所描述的具体实施方式仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1、检测方法
本发明实施方式提供的高灵敏度检测和/或鉴定淋病奈瑟菌耐药位点的方法，待检测的19个淋病奈瑟菌耐药位点包括：16S rRNA C1192，23S rRNA C2611T，23S rRNAA2059G，gyrA D95/A，gyrA S91F，parC D86N，parC S88，mtrR deletion-A，mtrR G45D，penAD345-insertion,penA G542S，penA G545S，penA A501T/V，penA P551S/L，ponA L421P，porB A121(DN)/G，porB G120D/(KNR)，rpsE T24P和penA A311V。
本发明实施包括如下步骤：
1)引物设计：首先从GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下载各淋病奈瑟菌经过完整注释作为参考序列的代表株耐药基因序列，将参考序列与NCBI的nr数据库进行核酸序列BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下载比对得到的结果，获取更多检测耐药靶基因序列。根据已选定目标基因的耐药位点，利用Agena公司的Assay Design 4.0软件设计针对每个待测耐药位点的特异性扩增引物，在每条扩增引物的5’端加上10个碱基的通用序列ACGTTGGATG，在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，在探针的3’末端，延伸探针在特定的核苷酸位点延伸一个经设计确定后的碱基后会终止反应，作为该基因型特异性序列标记，其中，19个耐药位点的扩增引物和延伸探针序列见表1；
2)多重PCR扩增反应:反应使用384孔板，按照下表配制反应体系，总反应体系5μl。将dNuTPs混合物、UNG酶、DNA聚合酶酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中，先使用UNG酶进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后作45个循环PCR扩增，获得待测样本中靶基因扩增产物，反应体系见表2-1与反应流程表2-2，完成后于4℃低温保存。
表2-1
表2-2
3)虾碱性磷酸酶(Shrimp alkaline phosphatase，SAP)处理：对目标片段多重PCR扩增后，使用SAP消化掉多于的底物，防止未消耗完的底物干扰下一步单碱基延伸反应。按下表配制反应体系，之后用连续分液器转移至上一步的反应板中，每孔转移2μl。反应体系见表3-1与反应流程表3-2，完成后于4℃低温保存。
表3-1
表3-2
4)单碱基延伸(iPLEX)反应：加入设计好的延伸探针进行单碱基延伸反应，使用经修饰的双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)作为反应底物，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应，即在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，通过分子量差异判断延伸的碱基，以此判断耐药位点基因型。按下表配制反应体系，之后用连续分液器转移至上一步的反应板中，每孔转移2μl，反应体系见表4-1与反应流程见表4-2，完成后于4℃低温保存。
表4-1
表4-2
5)树脂脱盐：采用阳离子交换树脂吸附体系中的盐离子，纯化延伸反应产物。加16微升水至于摇床上，摇50分钟，2000rpm离心5min。；
6)质谱检测：纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测，将纯化后产物与芯片基质共结晶，芯片在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF mass spectrometry)系统真空管中受到瞬时的强激光激发，伴随着基质晶体的升华，核酸分子解吸附转变为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场下获得动能，在真空小管中飞行到达检测器。检测结果会以可视化的图形呈现到服务器上，即以离子峰的强度为纵坐标、离子质量为横坐标形成分析图谱，根据特异性探针延伸反应前后的分子质量差异来判断样本中耐药位点所延伸的特定碱基，以判断有无突变。利用TyperAnalyzer软件自动分析和报告结果，导出数据。
实施例2、试剂盒
本发明提供的试剂盒用于检测19个淋病奈瑟菌耐药位点中的应用，包括以下步骤：
1.核酸提取：使用核酸提取试剂盒提取测试换着的分泌物或者尿液样本。
2.多重PCR反应:配合专用的扩增反应体系，经过一轮的多重PCR，实现对多条目的基因扩增。先用45℃反应2分钟，此步目的是发挥UNG酶作用，进行dUTP的消化，然后94℃ 4分钟灭活UNG，(同时这一步也达到预变性的效果)，随后开始多重PCR扩增。反应条件为95℃变性30秒，56.5℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行45个循环；最终72℃延补充伸5分钟，完成后于4℃低温保存。在PCR过程中引入尿嘧啶N糖基化酶(UNG酶)技术，在首次PCR反应体系中，采用以dUTP替代常规PCR的dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG酶处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG酶在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR反应及产物，彻底排除了PCR扩增产物污染引起的假阳性问题。通过第一轮PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
3.虾碱性磷酸酶(SAP)处理：多重PCR反应结束后，使用虾碱性磷酸酶(Shrimpalkaline phosphatase，SAP)消化去除反应体系剩余的dNTP，预防干扰下一步碱基延伸反应。反应条件设置为37℃孵育40分钟，SAP发挥作用去除剩余dNTPs；然后用85℃ 5分钟使SAP酶失活，完成后于4℃低温保存。
4.碱基延伸反应：加入设计好的延伸探针进行单碱基延伸反应，使用经修饰的双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)作为反应底物，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应。即在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记。设置整个单碱基延伸反应为400个短阶梯程序，包含两个循环嵌合，开始为94℃变性30秒，随后在94℃ 5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共40个循环，其中在每个循环内部插入退火和延伸5个小循环；最终72℃补充延伸5分钟。
5.树脂脱盐：脱盐纯化延伸反应产物，80rpm翻转40分钟。
6.质谱检测：将纯化后产物与芯片基质共结晶，芯片在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF mass spectrometry)系统真空管中受到瞬时的强激光激发，伴随着基质晶体的升华，核酸分子解吸附转变为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场下获得动能，在真空小管中飞行到达检测器。检测结果会以可视化的图形呈现到服务器上，即以离子峰的强度为纵坐标、离子质量为横坐标形成分析图谱，根据特异性探针延伸反应前后的分子质量差异来判断样本中的微生物，软件自动处理报告每种微生物的检测结果和可信程度。
试验例1：检测效果实验
本发明所涉及的淋病奈瑟菌多重耐药位点检测方法的检测效果从灵敏度和准确性两个方面进行评估。
1.灵敏度：随机挑选三株淋病奈瑟菌分离株，使用实时定量荧光PCR(Real TimeQuantitative Polymerase Chain Reaction)对三株分离株进行定量，根据每个分离株定量结果分别稀释成5个梯度(100拷贝/μL,50拷贝/μL,10拷贝/μL,5拷贝/μL,and 1拷贝/μL)。所有稀释样本均使用本发明涉及的淋病奈瑟菌多重耐药位点检测方法进行检测，结果表明种属鉴定参照基因porA与opa以及18的检测位点的灵敏度为5拷贝/μL，包括16S rRNAC1192U、RpsE T24P、23S rRNA C2611T、23S rRNA A2059G、GyrA D95G/A、GyrA S91F、ParCD86N、ParC S88P、PenA G542S、PenA G545S、PenA A501T/V、PenA P551L/S、PenA A311V、PenA D345-insertion、PonA L421P、MtrR G45D、MtrR deletion A、PorB G120D(KNR)，PorBA121DN(G)位点灵敏度为50拷贝/μL。
2.准确性：针对本发明所涉及的淋病奈瑟菌多重耐药位点检测方法所检测的位于19个耐药位点的24种突变，每种突变型选择两株预先经过全基因组测序的明确耐药位点突变的分离株样本进行准确性测试。结果表明该检测方法可以准确检测位于19个耐药位点的24种突变。
本发明的检测方法，能够准确检测相关耐药位点突变，且与其他微生物无交叉反应。检限为5拷贝/μL(PorB A121DN(G)位点灵敏度为50拷贝/μL)，灵敏度高。
试验例2：
本发明的检测方法，与现有检测淋病奈瑟菌耐药位点的其它技术和同类技术相比，本发明技术方案有如下优点：首先，由于采用了高灵敏度的MALDI-TOF质谱方法对扩增产物进行鉴定，通过合理选择设计位点、适当添加修饰碱基，可以将延伸探针的质量加以区分，均匀分布于检测范围之内，从而达到多重检测的目的，远高于常用的荧光定量PCR方法；其次，该平台可使用384芯片，如使用单孔反应进行检测，运行一次即可同时分析2快芯片，超过760份样本中的耐药位点信息，全部实验时间不多于8个小时；最后，研究人员可以根据实际情况自行调整检测试剂，操作简单，不需要专业人士协助。本发明的这些优势，非常适合对于对耐药情况复杂的淋病奈瑟菌进行快速耐药位点筛查(详见表5)。
表5.不同检测方法对比
序列表
<110> 中国医学科学院病原生物学研究所
<120> 一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法
<130>
<160> 4
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 16S rRNA-C1192U
<400> 1
ACGTTGGATGTGTGAAGCCCTGGTCATAAG
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 16S rRNA-C1192U
<400> 2
ACGTTGGATGTGGGCACTCTAATGAGACTG
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 16S rRNA-C1192U
<400> 3
GGGCCATGAGGACTTGAC
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> rpsE-T24P
<400> 1
ACGTTGGATGGATTGAAAAGATGGTCGCAG
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> rpsE-T24P
<400> 2
ACGTTGGATGCAACAACAGTTAGCGCAGAG
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> rpsE-T24P
<400> 3
AGATGGTCGCAGTTAACCGTGTA
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 23S rRNA-A2059G
<400> 1
ACGTTGGATGTCCCACCTATCCTACACAAG
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 23S rRNA-A2059G
<400> 2
ACGTTGGATGAAGATGCAATCTACCCGCTG
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 23S rRNA-A2059G
<400> 3
AGTAAAGGTTCACGGGGTCT
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 23S rRNA-C2611T
<400> 1
ACGTTGGATGGCTGGGTTTAAAACGTCGTG
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 23S rRNA-C2611T
<400> 2
ACGTTGGATGTCCTCTCGTACTAGGAGCAG
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 23S rRNA-C2611T
<400> 3
TCGTGAGACAGTTTGGTC
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> parC-D86N
<400> 1
ACGTTGGATGGTCGGCGAGATTTTGGGTAA
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> parC-D86N
<400> 2
ACGTTGGATGGGTAAAATCCTGAGCCATGC
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> parC-D86N
<400> 3
ACCATCCGCACGGC
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> parC-S88P
<400> 1
ACGTTGGATGGGTAAAATCCTGAGCCATGC
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> parC-S88P
<400> 2
ACGTTGGATGGTCGGCGAGATTTTGGGTAA
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> parC-S88P
<400> 3
ATCGCCTCATAGGCGG
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> gyrA-D95G/A
<400> 1
ACGTTGGATGCGAAATTTTGCGCCATACGG
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> gyrA-D95G/A
<400> 2
ACGTTGGATGGCGACGTCATCGGTAAATAC
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> gyrA-D95G/A
<400> 3
CATACGGACGATGGTG
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> gyrA-S91F
<400> 1
ACGTTGGATGGCGACGTCATCGGTAAATAC
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> gyrA-S91F
<400> 2
ACGTTGGATGCGAAATTTTGCGCCATACGG
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> gyrA-S91F
<400> 3
ATACCACCCCCACGGCGATT
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-G545S
<400> 1
ACGTTGGATGTTTTTTGAAGGGCGGCCCTG
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-G545S
<400> 2
ACGTTGGATGGATTGTGGCGGTAACCATTG
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-G545S
<400> 3
TGCCACTACACCGC
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-A501T/V
<400> 1
ACGTTGGATGTTCGACGTCGGCGCAAAAAC
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-A501T/V
<400> 2
ACGTTGGATGAAACGCCCAAGATGTTCAGG
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-A501T/V
<400> 3
AGACCGTTAACCAACTTACGC
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-A501T/V
<400> 4
TCGGCGCAAAAACCGGTACG
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-G542S
<400> 1
ACGTTGGATGTTTTTTGAAGGGCGGCCCTG
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-G542S
<400> 2
ACGTTGGATGGATTGTGGCGGTAACCATTG
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-G542S
<400> 3
GAGCCGACTGCAAAC
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-P551L/S
<400> 1
ACGTTGGATGTTCGACGTCGGCGCAAAAAC
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-P551L/S
<400> 2
ACGTTGGATGAAACGCCCAAGATGTTCAGG
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-P551L/S
<400> 3
GACATAGGTGTAGTGGCAGGG
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-P551L/S
<400> 4
GCCCATAATTTTTTTGAAGGGC
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-A311V
<400> 1
ACGTTGGATGAACCGACATGATCGAACCTG
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-A311V
<400> 2
ACGTTGGATGGGATCCACTTTGCCTGAATC
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-A311V
<400> 3
GTGATCGAACCTGGTTCTG
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-D345ins
<400> 1
ACGTTGGATGATAAAATCGGACCGTCTCCC
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-D345ins
<400> 2
ACGTTGGATGGCCTTACAAAATCGGTTCGG
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-D345ins
<400> 3
ACGTTGGATGACGATTTCTGCATAATGCCG
<210> 45
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-D345ins
<400> 4
ACGTTGGATGTTTTGCATAATGCCGCGCAC
<210> 46
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-D345ins
<400> 5
ACCGTCTCCCGTGCGCGA
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> penA-D345ins
<400> 6
TTCGGCTACCGTACAAGA
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> ponA-L421P
<400> 1
ACGTTGGATGTCCGTGTCAAAAACAACGGC
<210> 49
<211> 33
<212> DNA
<213> ponA-L421P
<400> 2
ACGTTGGATGTGCATCCAGCGAAACCAAAG
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> ponA-L421P
<400> 3
TCAAGAGCCGTTGC
<210> 51
<211> 33
<212> DNA
<213> mtrR-G45D
<400> 1
ACGTTGGATGATGTCGTCGCAGATACGTTG
<210> 52
<211> 33
<212> DNA
<213> mtrR-G45D
<400> 2
ACGTTGGATGACCTCGCTCAACGAAATCGC
<210> 53
<211> 33
<212> DNA
<213> mtrR-G45D
<400> 3
GCCAATAGAGCGCG
<210> 54
<211> 33
<212> DNA
<213> mtrR-delA
<400> 1
ACGTTGGATGATACATACACGATTGCACGG
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> mtrR-delA
<400> 2
ACGTTGGATGTTTCGTTTCGGGTCGGTTTG
<210> 56
<211> 33
<212> DNA
<213> mtrR-delA
<400> 3
CACGATTGCACGGATAAAA
<210> 57
<211> 33
<212> DNA
<213> porB-A121DN/(G)
<400> 1
ACGTTGGATGCCGGTAAATTTGCCGGATTC
<210> 58
<211> 33
<212> DNA
<213> porB-A121DN/(G)
<400> 2
ACGTTGGATGCCTGAACAGCCCCCTGAAAA
<210> 59
<211> 33
<212> DNA
<213> porB-A121DN/(G)
<400> 3
CCGGATTCCCAAGCATTGACGTTG
<210> 60
<211> 33
<212> DNA
<213> porB-G120D/(KNR)
<400> 2
ACGTTGGATGCCTGAACAGCCCCCTGAAAA
<210> 61
<211> 33
<212> DNA
<213> porB-G120D/(KNR)
<400> 2
ACGTTGGATGCCGGTAAATTTGCCGGATTC
<210> 62
<211> 33
<212> DNA
<213> porB-G120D/(KNR)1
<400> 2
CAGCCCCCTGAAAAACACCG
<210> 63
<211> 33
<212> DNA
<213> opa
<400> 1
ACGTTGGATGTCAGCGTAGCCGTCGTTATC
<210> 64
<211> 33
<212> DNA
<213> opa
<400> 2
ACGTTGGATGCACGCATTTTGACGGCAAAG
<210> 65
<211> 33
<212> DNA
<213> opa
<400> 3
GGGCGGAGCAAATCAAAGGC
<210> 66
<212> DNA
<213> porA
<400> 1
ACGTTGGATGGACAATACGAGGGCGGTAAG
<210> 67
<211> 33
<212> DNA
<213> porA
<400> 2
ACGTTGGATGGTTTGCCCGATGTTTTTAGC
<210> 68
<211> 33
<212> DNA
<213> porA
<400> 3
GTAAGTTTTTTTCGCATATCGGCTTC
Claims (10)
1.一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法，该方法用于非诊断目的，其特征在于，包括以下步骤：
1)引物设计：针对每一种拟检测耐药位点，首先从GenBank数据库中下载各淋病奈瑟菌经过完整注释作为参考序列的代表株9个耐药基因序列，包括rpsE、penA、gyrA、parC、ponA、porB、mtrR、16S rRNA和23S rRNA，将参考序列提交到NCBI的进行核酸序列BLAST，选择nr数据库，下载比对得到的结果，得到19个检测淋病奈瑟菌耐药位点突变所在的靶基因序列，针对每个靶基因中的待测耐药位点的特异性扩增引物，为了避免扩增引物的质量出现在结果窗口，须在每条扩增引物的5’端加上通用序列ACGTTGGATG等10个碱基的增加质量，在扩增区中的耐药位点所在区域设计一条单碱基延伸探针，使该探针结合到靶基因上后，在3’末端只允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，其中，19个耐药位点的扩增引物和延伸探针序列见表1；
2)多重PCR扩增反应：将UNG酶、dNuTPs混合物、DNA聚合酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中混匀，先使用UNG酶进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，预变性，随后作PCR扩增，获得待测样本中靶基因扩增产物；
3)虾碱性磷酸酶反应：多重PCR反应结束后，加入SAP混合液，使用SAP消化去除反应体系剩余的dNTP，预防多余的底物影响下一步单碱基延伸反应结果；
4)单碱基延伸反应：加入针对耐药位点设计的延伸探针，结合至扩增出来的靶基因进行单碱基延伸反应，底物为经过修饰的双脱氧三磷酸核苷，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应，通过分子量差异可判断延伸碱基，作分子量标记，以判断耐药位点基因型；
5)树脂脱盐：采用阳离子交换树脂吸附体系中的盐离子，纯化延伸反应产物；
6)质谱检测：纯化后产物采用全自动点样装置点到芯片，进行分子量检测，根据分子量差异确定待测靶基因上耐药位点的基因型。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)引物设计中，19个淋病奈瑟菌耐药位点突变，包括：
1)16S rRNA C1192U
2)rpsE T24P
3)23S rRNA C2611T
4)23S rRNA A2059G
5)gyrA D95G/A
6)gyrA S91F
7)parC D86N
8)parC S88P
9)penA G542S
10)penA G545S
11)penA A501T/V
12)penA P551S/L
13)penA A311V
14)penA D345-insertion
15)ponA L421P
16)mtrR-G45D
17)mtrR-deletion A
18)porB-A121DN(G)
19)porB G120D(KNR)。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，针对待检测耐药位点分别设计一对扩增引物和一条延伸探针，扩增引物和延伸探针序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.62。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，添加人类的opa基因作为样品种属鉴定参照，引物序列为SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64，延伸探针序列为SEQ ID NO.65。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，添加人类的porA基因作为样品种属鉴定参照，引物序列为SEQ ID NO.66和SEQ ID NO.67，延伸探针序列为SEQ ID NO.68。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
其中，在步骤(2)-步骤(4)的反应中加入阴性对照，所述阴性对照为无核酸酶蒸馏水；
其中，步骤(2)PCR反应体系见表2-1，反应流程见2-2；
其中，步骤(3)虾碱性磷酸酶反应体系见表3-1，反应流程见3-2；
其中，步骤(4)碱基延伸反应体系见表4-1，反应流程见4-2；
其中，步骤(6)质谱检测：产物纯化后使用专用设备转移到芯片上，与芯片基质进行共结晶，结晶后的芯片放入质谱仪的真空管内，芯片在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统真空管中受到瞬时的强激光激发，使核酸分子解吸附并产生单电荷离子，这些离子在真空小管中飞行达到检测器，离子质量大小与飞行时间成正比，可检测分子质量数取决于飞行管长度，检测结果会以可视化的图形呈现到服务器上，即以离子峰的强度为纵坐标、离子质量为横坐标形成分析图谱，根据特异性探针延伸反应前后的分子质量差异来判断样本中特定耐药位点延伸的碱基，以判断有无突变，软件自动处理报告每个耐药位点的检测结果和可信程度。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)引物设计：首先从GenBank数据库中下载各淋病奈瑟菌经过完整注释作为参考序列的代表株9个耐药基因序列，包括rpsE、penA、gyrA、parC、ponA、porB、mtrR、16S rRNA和23SrRNA，将参考序列与NCBI的nr数据库进行核酸序列BLAST，下载比对得到的结果，获取更多比对的检测耐药靶基因序列，根据已选定19个目标基因的耐药位点，利用Agena公司的Assay Design 4.0软件设计针对每个待测耐药位点的特异性扩增引物，为了避免扩增引物的质量出现在结果窗口，须在每条扩增引物的5’端加上通用序列ACGTTGGATG等10个碱基的增加质量，在扩增区中的耐药位点所在区域设计一条单碱基延伸探针，使该探针结合到靶基因上后，在3’末端只允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，通过分子量的差异可以判断延伸的碱基，以此判断耐药位点基因型，其中，19个耐药位点的扩增引物和延伸探针序列如下所示：
2)多重PCR扩增反应:反应使用384孔板，按照下表配制反应体系，总反应体系5μl，将UNG酶、dNuTPs混合物、DNA聚合酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中，先是用UNG酶进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后进行PCR扩增(45个循环)，获得待测样本中靶基因扩增产物，反应组分与反应流程如下所示，完成后于4℃低温保存，
3)虾碱性磷酸酶处理：对目标片段多重PCR扩增后，使用SAP消化掉多于的底物，防止未消耗完的底物干扰下一步单碱基延伸反应，按下表配制反应体系，之后用连续分液器转移至上一步的反应板中，每孔转移2μl，反应组分与反应流程如下所示，完成后于4℃低温保存，
4)单碱基延伸反应：加入设计好的延伸探针进行单碱基延伸反应，使用经修饰的双脱氧三磷酸核苷作为反应底物，使得延伸探针在特定的单核苷酸位点处延伸一个碱基后终止反应，即在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，通过分子量差异判断延伸的碱基，以此判断耐药位点基因型，按下表配制反应体系，之后用连续分液器转移至上一步的反应板中，每孔转移2μl，反应组分与反应流程如下所示，完成后于4℃低温保存，
5)树脂脱盐：采用阳离子交换树脂吸附体系中的盐离子，纯化延伸反应产物，加16微升无核酸酶水至于摇床上，80rpm摇4min，2000rpm离心5min，
6)质谱检测：产物纯化后使用专用设备转移到芯片上，与芯片基质进行共结晶，结晶后的芯片放入质谱仪的真空管内，芯片在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统真空管中受到瞬时的强激光激发，使核酸分子解吸附并产生单电荷离子，这些离子在真空小管中飞行达到检测器，离子质量大小与飞行时间成正比，可检测分子质量数取决于飞行管长度，检测结果会以可视化的图形呈现到服务器上，即以离子峰的强度为纵坐标、离子质量为横坐标形成分析图谱，根据特异性探针延伸反应前后的分子质量差异来判断样本中特定耐药位点延伸的碱基，以判断有无突变，软件自动处理报告每个耐药位点的检测结果和可信程度，利用TyperAnalyzer软件自动分析和报告结果，导出数据。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括一种或多种表1所示的引物组。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒，包括以下引物组：两个检测靶基因的正向、反向扩增引物序列和对应的延伸探针序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.62；以opa基因为淋病奈瑟菌种属鉴定靶标的扩增引物SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64，延伸探针序列SEQ ID NO.65；以porA基因为淋病奈瑟菌种属鉴定靶标的扩增引物序列SEQ ID NO.66和SEQ ID NO.67，延伸探针序列SEQ ID NO.68。
10.权利要求8或9所述的试剂盒在检测淋病奈瑟菌耐药位点突变中的应用。
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