CN113046449A - 快速检测耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌gyrA突变体的方法及试剂盒 - Google Patents

快速检测耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌gyrA突变体的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了提供快速检测耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌gyrA突变体的方法及试剂盒。本发明提供了一种核酸分子组合物，由6种DNA分子组成；6种DNA分子均为单链DNA分子，分别如序列表的序列2至序列表的序列7所示。本发明还保护所述核酸分子组合物在鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌中的应用。本发明检测耐氟喹诺酮药物耻垢分枝杆菌gyrA突变体基因点突变的方法，快速、灵敏度高、特异性强、可用于大批量样品筛选。

Description

快速检测耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌gyrA突变体的方 法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及快速检测耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌gyrA突变体的方法及试剂盒。
背景技术
肺结核(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的影响人类生命健康的重大疾病之一，随着耐药结核的出现使得结核病的治疗更加困难。氟喹诺酮类药物是治疗耐药结核的药物之一，2021年WHO重新修订pre-XDR-TB以及XDR-TB(广泛耐药结核)定义，由于氟喹诺酮类耐药与治疗转归相关，所以目前XDR-TB的定义依然具有存在的价值。
耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.smegmatis)与结核分枝杆菌同属于分枝杆菌科分支杆属，是一种非致病性分枝杆菌。耻垢分枝杆菌很多基因与结核分枝杆菌高度同源，其生长速度快且无致病性，使得耻垢分枝杆菌成为研究结核分枝杆菌首选的模式菌株。
耻垢分枝杆菌对氟喹诺酮类耐药的主要机制之一是靶位突变，而靶位突变主要发生在gyr蛋白中的氟喹诺酮耐药决定区(QRDR)，主要涉及的突变为Ala91、Ser92、Asp95。
发明内容
本发明的目的是提供快速检测耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌gyrA突变体的方法及试剂盒。
本发明提供了一种核酸分子组合物，由6种DNA分子组成；6种DNA分子均为单链DNA分子，分别如序列表的序列2至序列表的序列7所示。所述核酸分子组合物的用途为鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌。
上游引物为序列表的序列2所示的单链DNA分子；
下游引物为序列表的序列3所示的单链DNA分子；
错配下游引物SNPA91V为序列表的序列4所示的单链DNA分子；
错配下游引物SNPS92P为序列表的序列5所示的单链DNA分子；
错配下游引物SNPD95G为序列表的序列6所示的单链DNA分子；
错配下游引物SNPD95Y为序列表的序列7所示的单链DNA分子。
所述核酸分子组合物由4个包装组合组成。
第一个包装组合由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPA91V组成。上游引物、下游引物和错配下游引物SNPA91V的摩尔配比为：8:2:12。
第二个包装组合由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPS92P组成。上游引物、下游引物和错配下游引物SNPS92P的摩尔配比为：8:2:12；
第三个包装组合由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95G组成。上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95G的摩尔配比为：8:1:12；
第四个包装组合由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95Y组成。上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95Y的摩尔配比为：8:1:12。
本发明还保护所述核酸分子组合物在鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌中的应用。
本发明还保护所述核酸分子组合物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌。
本发明还提供了一种试剂盒，包括所述核酸分子组合物；所述试剂盒的功能为鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌。所述试剂盒还可包括保护剂。具体的，所述保护剂可为甘油。所述试剂盒还可包括DNA聚合酶，例如TaqDNA聚合酶。所述试剂盒还可包括PCR Buffer。所述试剂盒还可包括MgCl2。所述试剂盒还可包括dNTPMixture。所述试剂盒具体还包括记载于下述“鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌的方法”的载体。
本发明还保护所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌中的应用。
本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌的方法，包括如下步骤：
将供试耻垢分枝杆菌或其基因组DNA作为模板，分别进行四个体系的PCR扩增；
第一个体系中采用的引物由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPA91V组成；
第二个体系中采用的引物由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPS92P组成；
第三个体系中采用的引物由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95G组成；
第四个体系中采用的引物由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95Y组成；
上游引物为序列表的序列2所示的单链DNA分子；下游引物为序列表的序列3所示的单链DNA分子；错配下游引物SNPA91V为序列表的序列4所示的单链DNA分子；错配下游引物SNPS92P为序列表的序列5所示的单链DNA分子；错配下游引物SNPD95G为序列表的序列6所示的单链DNA分子；错配下游引物SNPD95Y为序列表的序列7所示的单链DNA分子。
PCR扩增的反应体系中加入甘油作为保护剂。
甘油在反应体系中的浓度优选为7.5％(体积百分含量)。
第一个体系中，上游引物、下游引物和错配下游引物SNPA91V的摩尔配比为：8:2:12；
第二个体系中，上游引物、下游引物和错配下游引物SNPS92P的摩尔配比为：8:2:12；
第三个体系中，上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95G的摩尔配比为：8:1:12；
第四个体系中，上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95Y的摩尔配比为：8:1:12。
第一个体系中，上游引物的工作浓度为2μM，下游引物的工作浓度为0.5μM，错配下游引物SNPA91V的工作浓度为3μM。
第一个体系具体如表1所示。
第二个体系中，上游引物的工作浓度为2μM，下游引物的工作浓度为0.5μM，错配下游引物SNPS92P的工作浓度为3μM。
第二个体系具体如表2所示。
第三个体系中，上游引物的工作浓度为2μM，下游引物的工作浓度为0.25μM，错配下游引物SNPD95G的工作浓度为3μM。
第三个体系具体如表3所示。
第四个体系中，上游引物的工作浓度为2μM，下游引物的工作浓度为0.25μM，错配下游引物SNPD95Y的工作浓度为3μM。
第四个体系具体如表4所示。
第一个体系的PCR扩增的反应程序：98℃3min；98℃30s、55℃40s、72℃30s，30个循环；72℃5min；16℃2min；
第二个体系的PCR扩增的反应程序：98℃3min；98℃30s、65℃40s、72℃30s，30个循环；72℃5min；16℃2min；
第三个体系的PCR扩增的反应程序：98℃3min；98℃30s、58℃40s、66℃30s，30个循环；72℃5min；16℃2min；
第四个体系的PCR扩增的反应程序：98℃3min；98℃30s、62℃40s、72℃30s，30个循环；72℃5min；16℃2min。
耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌具体可为A91V突变型耻垢分枝杆菌或S92P突变型耻垢分枝杆菌或D95G突变型耻垢分枝杆菌或D95Y突变型耻垢分枝杆菌。
A91V突变型耻垢分枝杆菌是将耻垢分枝杆菌(野生型耻垢分枝杆菌)基因组DNA中序列表的序列1所示的gryA基因的第272位核苷酸由C突变为T，得到的突变菌。
S92P突变型耻垢分枝杆菌是将耻垢分枝杆菌(野生型耻垢分枝杆菌)基因组DNA中序列表的序列1所示的gryA基因的第274位核苷酸由T突变为C，得到的突变菌。
D95G突变型耻垢分枝杆菌是将耻垢分枝杆菌(野生型耻垢分枝杆菌)基因组DNA中序列表的序列1所示的gryA基因的第284位核苷酸由A突变为G，得到的突变菌。
D95Y突变型耻垢分枝杆菌是将耻垢分枝杆菌(野生型耻垢分枝杆菌)基因组DNA中序列表的序列1所示的gryA基因的第283位核苷酸由G突变为T，得到的突变菌。
野生型耻垢分枝杆菌为具有序列表的序列1所示的gryA基因的耻垢分枝杆菌。
野生型耻垢分枝杆菌具体可为耻垢分枝杆菌mc2155。
MAMA-PCR，全称为错配扩增突变分析PCR法(Mismatch amplification mutationassay-PCR,MAMA-PCR)。具有无需特殊仪器且简单快捷的优点。
为了快速提高大量野生型基因背景下低丰度已知点突变基因的检测灵敏度，本发明提供了一种检测耐氟喹诺酮药物耻垢分枝杆菌gyrA突变体的分子生物学方法、核酸分子组合物和试剂盒，本发明将错配PCR和多重PCR相结合，主要包括引物设计、PCR扩增、突变判读三个步骤。本发明检测耐氟喹诺酮药物耻垢分枝杆菌gyrA突变体基因点突变的试剂盒和配套方法，快速、灵敏度高、特异性强、可用于大批量样品筛选。
附图说明
图1为实施例3的结果电泳图。
图2为实施例4的结果电泳图。
图3为实施例5的结果电泳图。
图4为实施例6的结果电泳图。
图5为实施例7的结果电泳图。
图6为实施例8的步骤一的结果电泳图。
图7为实施例8的步骤二的结果电泳图。
图8为实施例8的步骤四的结果电泳图。
图9为实施例8的步骤五的结果电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例3至实施例8中，模板溶液可为菌落、菌液、菌体悬浮液(即用无菌水悬浮菌体得到的悬浮液)、菌体悬浮液的煮沸液或菌体基因组DNA。
实施例1、方法的建立过程
本发明的方法针对gryA蛋白的氟喹诺酮耐药决定区(QRDR)的3个突变氨基酸(Ala91、Ser92、Asp95)，从DNA层面来说针对gryA基因的4个突变位点。
设计上游引物、下游引物和错配下游引物。上游引物和下游引物为通用引物，其靶序列覆盖4个突变位点。上游引物和下游引物可以实现以野生型基因为模板的扩增(大小为369bp)，也可以实现以相应突变型基因为模板的扩增(大小为369bp)。针对不同的突变位点设计不同的错配下游引物；错配下游引物的3’末端的第一个碱基对应于突变位点，与野生型反向互补；错配下游引物的3’末端的第二个碱基为引入的错配碱基，来增强3’端的错配效应，使得Taq DNA聚合酶无法进行延伸过程；从而，上游引物和错配下游引物可以实现以野生型基因为模板的扩增，不能实现以相应突变型基因为模板的扩增。
上游引物(序列2)：5’-AGCGCAGCTACATCGACTAC-3’；
下游引物(序列3)：5’-CCTCGTCGATTTCACGCAAC-3’。
用MAMA-PCR检测已知突变的耻垢分枝杆菌gyrA突变体，确定最佳的PCR反应条件(主要是退火温度和延伸温度、3条引物的浓度比例，保护剂的体积比)；MAMA-PCR反应均设立已知野生型耻垢分枝杆菌作为阴性对照且设立已知突变型耻垢分枝杆菌作为阳性对照，只有当二者扩增显示预期条带才能认为结果判断有效。
根据琼脂糖凝胶电泳分析结果判断是否突变：若显示2条特异性条带，则在此突位点未发生目标突变；若仅显示1条特异性条带，则在此位点发生了目标突变。
实施例2、制备各个突变型耻垢分枝杆菌
野生型耻垢分枝杆菌携带的gryA基因如序列表的序列1所示。野生型耻垢分枝杆菌记载于如下文献(即文献中的M.smegmatis wild-type strain mc2155)：Mycobacteriumfluoroquinolone resistance protein B,a novel small GTPase,is involved in theregulation of DNA gyrase and drug resistance；2370-2381Nucleic Acids Research,2013,Vol.41,No.4。
以野生型耻垢分枝杆菌为出发菌，通过引入单点突变，改造得到A91V突变型耻垢分枝杆菌。与野生型耻垢分枝杆菌相比，A91V突变型耻垢分枝杆菌的差异仅在于：gryA基因的第272位核苷酸由C突变为了T。
以野生型耻垢分枝杆菌为出发菌，通过引入单点突变，改造得到S92P突变型耻垢分枝杆菌。与野生型耻垢分枝杆菌相比，S92P突变型耻垢分枝杆菌的差异仅在于：gryA基因的第274位核苷酸由T突变为了C。
以野生型耻垢分枝杆菌为出发菌，通过引入单点突变，改造得到D95G突变型耻垢分枝杆菌。与野生型耻垢分枝杆菌相比，D95G突变型耻垢分枝杆菌的差异仅在于：gryA基因的第284位核苷酸由A突变为了G。
以野生型耻垢分枝杆菌为出发菌，通过引入单点突变，改造得到D95Y突变型耻垢分枝杆菌。与野生型耻垢分枝杆菌相比，D95Y突变型耻垢分枝杆菌的差异仅在于：gryA基因的第283位核苷酸由G突变为了T。
实施例3、检测gyrA基因A91V突变体
采用引物组Ⅰ进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。
引物组Ⅰ由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPA91V组成。
错配下游引物SNPA91V(序列4)：5’-CAGGGTGTCGTAGATCGAAG-3’。
PCR扩增的反应体系(20μl)见表1。即，上游引物的工作浓度为2μM，下游引物的工作浓度为0.5μM，错配下游引物SNPA91V的工作浓度为3μM。
表1
组分 加入量
TaKaRa Taq(5U/μl) 0.25μl
10x PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>free) 2μl
25mM MgCl<sub>2</sub> 1.2μl
2.5mM dNTPMixture 1.6μl
50％甘油 3μl
100μM上游引物 0.4μl
50μM下游引物 0.2μl
100μM错配下游引物R<sub>SNPA91V</sub> 0.6μl
模板溶液 0.5μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至20μl
PCR扩增的反应程序：98℃3min；98℃30s、55℃40s、72℃30s，30个循环；72℃5min；16℃2min。
模板溶液分别采用：野生型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液或A91V突变型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液。
电泳图见图1(均设置2个重复泳道)。野生型耻垢分枝杆菌显示两条特征性条带(一条为369bp，另一条为215bp)，A91V突变型耻垢分枝杆菌显示一条特征性条带(369bp)。
实施例4、本发明方法对gyrA基因S92P突变体检测
采用引物组Ⅱ进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。
引物组Ⅱ由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPS92P组成。
错配下游引物SNPS92P(序列5)：5’-GACCAGGGTGTCGTAGATCCA-3’。
PCR扩增的反应体系(20μl)见表2。即，上游引物的工作浓度为2μM，下游引物的工作浓度为0.5μM，错配下游引物SNPS92P的工作浓度为3μM。
表2
组分 加入量
TaKaRa Taq(5U/μl) 0.25μl
10x PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>free) 2μl
25mM MgCl<sub>2</sub> 1.2μl
2.5mM dNTPMixture 1.6μl
50％甘油 3μl
100μM上游引物 0.4μl
50μM下游引物 0.2μl
100μM错配下游引物<sub>SNPS92P</sub> 0.6μl
模板溶液 0.5μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至20μl
PCR扩增的反应程序：98℃3min；98℃30s、65℃40s、72℃30s，30个循环；72℃5min；16℃2min。
模板溶液分别采用：野生型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液或S92P突变型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液。
电泳图见图2(均设置2个重复泳道)。野生型耻垢分枝杆菌显示两条特征性条带(一条为369bp，另一条为218bp)，S92P突变型耻垢分枝杆菌显示一条特征性条带(369bp)。
实施例5、本发明方法对gyrA基因D95G突变体检测
采用引物组Ⅲ进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。
引物组Ⅲ由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95G组成。
错配下游引物SNPD95G(序列6)：5’-CCATGCGGACCAGGGTAT-3’。
PCR扩增的反应体系(20μl)见表3。即，上游引物的工作浓度为2μM，下游引物的工作浓度为0.25μM，错配下游引物SNPD95G的工作浓度为3μM。
表3
Figure BDA0002963090170000071
Figure BDA0002963090170000081
PCR扩增的反应程序：98℃3min；98℃30s、58℃40s、66℃30s，30个循环；72℃5min；16℃2min。
模板溶液分别采用：野生型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液或D95G突变型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液。
电泳图见图3(均设置2个重复泳道)。野生型耻垢分枝杆菌显示两条特征性条带(一条为369bp，另一条为225bp)，D95G突变型耻垢分枝杆菌显示一条特征性条带(369bp)。
实施例6、本发明方法对gyrA基因D95Y突变体检测
采用引物组Ⅳ进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。
引物组Ⅳ由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95Y组成。
错配下游引物SNPD95Y(序列7)：5’-CCATGCGGACCAGGGTGAC-3’。
PCR扩增的反应体系(20μl)见表4。即，上游引物的工作浓度为2μM，下游引物的工作浓度为0.25μM，错配下游引物SNPD95Y的工作浓度为3μM。
表4
组分 加入量
TaKaRa Taq(5U/μl) 0.25μl
10x PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>free) 2μl
25mM MgCl<sub>2</sub> 1.2μl
2.5mM dNTPMixture 1.6μl
50％甘油 3μl
100μM上游引物 0.4μl
50μM下游引物 0.1μl
100μM错配下游引物<sub>SNPD95Y</sub> 0.6μl
模板溶液 0.5μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至20μl
PCR扩增的反应程序：98℃3min；98℃30s、62℃40s、72℃30s，30个循环；72℃5min；16℃2min。
模板溶液分别采用：野生型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液或D95Y突变型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液。
电泳图见图4(均设置2个重复泳道)。野生型耻垢分枝杆菌显示两条特征性条带(一条为369bp，另一条为225bp)，D95Y突变型耻垢分枝杆菌显示一条特征性条带(369bp)。
实施例7、对gyrA基因A91V突变体批量筛选
将序列表的序列8所示的单链DNA分子电转至表达重组酶gp60 gp61的耻垢分枝杆菌中，然后在环丙沙星抗性平板上进行筛选。挑取32个转化子，分别作为供试菌。表达重组酶gp60 gp61的耻垢分枝杆菌记载于如下文献：Efficient point mutagenesis inmycobacteria using single-stranded DNA recombineering:characterization ofantimycobacterial drug targets；Molecular Microbiology(2008)67(5),1094–1107。表达重组酶gp60 gp61的耻垢分枝杆菌即文献中的“M.tuberculosis strains carryingpJV76amber(gp60/gp61)”。
模板溶液为：供试菌的菌体悬浮液。
模板溶液分别采用：野生型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液(阴性对照，用WT或-表示)或A91V突变型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液(阳性对照，用A91V或+表示)。
方法同实施例3。
结果见图5。部分转化子电转成功，部分转化子电转失败。将结果进行测序验证，与图5的结果一致。
实施例8、部分参数的优化数据
发明人在建立方法的过程中，对多个参数进行了优化，例如错配碱基、退火温度、延伸温度、3种引物的浓度比例、保护剂(甘油)的浓度等。示例性的，本实施例列出部分优化数据。
一、延伸温度的优化
模板溶液采用：野生型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液。
基本同实施例5，差异仅在于采用不同的延伸温度。
延伸温度分别采用：64℃、66℃、68℃、70℃、72℃。
延伸温度为68℃时，条带亮度最低(即扩增效果最差)，其他温度下条带亮度都很高。
进行多次重复试验，延伸温度为66℃结果最稳定。
某次电泳图见图6(均设置2个重复泳道)。
二、错配碱基的优化
模板溶液分别采用：野生型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液或D95G突变型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液。
基本同实施例5，差异仅在于用不同的引物代替错配下游引物SNPD95G。
分别采用如下引物：
非错配下游引物SNPD95G：5’-CCATGCGGACCAGGGTGT-3’。
错配下游引物SNPD95G-1：5’-CCATGCGGACCAGGGTCT-3’。
错配下游引物SNPD95G-2：5’-CCATGCGGACCAGGGTTT-3’。
错配下游引物SNPD95G(序列6)：5’-CCATGCGGACCAGGGTAT-3’。
电泳图见图7。图7中，均设置两个重复泳道；WT DNA代表以野生型耻垢分枝杆菌为模板，D95G DNA代表以D95G突变型耻垢分枝杆菌为模板；D95G R代表采用非错配下游引物SNPD95G；DNP R代表采用错配下游引物，C#C中为错配下游引物SNPD95G-1，C#A中为错配下游引物SNPD95G，C#T中为错配下游引物SNPD95G-2。
结果表明：C#T错配强度大于C#A，C#C出现不正确的特异性条带，三者比较优选C#A，即采用错配下游引物SNPD95G效果最佳。
三、错配下游引物浓度的优化
模板溶液采用：野生型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液。
基本同实施例5。
反应体系中各引物等浓度混合，其他各成分浓度保持不变，根据扩增结果对多重PCR反应体系和反应条件进行调整。多重PCR初试结果发现长片段可以正常扩增，但短片段没有条带，于是降低下游引物R浓度，增加错配下游引物SNPD95G浓度，在不同的退火温度下扩增。发现退火温度为58℃时，上游引物F：下游引物R:错配下游引物摩尔比等于20：5：28，会出现短片段，但短片段相比较长片段条带亮度依然不是很亮。继续降低下游引物R浓度，增加错配下游引物SNPD95G浓度，在上游引物F：下游引物R:错配下游引物摩尔比等于8：1：12时，会出现短片段。
四、退火温度的优化
模板溶液采用：D95G突变型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液。
基本同实施例5，差异仅在于采用不同的退火温度。
退火温度分别采用：55℃、58℃、60℃。
电泳图见图8。图8中，均设置两个重复泳道；D95G R代表采用非错配下游引物SNPD95G；DNP R代表采用错配下游引物SNPD95G。
退火温度58℃最优。
五、保护剂浓度的优化
模板溶液分别采用：野生型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液或D95G突变型耻垢分枝杆菌的菌体悬浮液。
保护剂，即甘油。
基本同实施例5，差异仅在于采用不同的甘油浓度。
结果见图9。图9中，均设置两个重复泳道；WT DNA代表以野生型耻垢分枝杆菌为模板，D95G DNA代表以D95G突变型耻垢分枝杆菌为模板；D95G R代表采用非错配下游引物SNPD95G；DNP R代表采用错配下游引物SNPD95G。
甘油浓度为7.5％(体积比)效果最好。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 快速检测耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌gyrA突变体的方法及试剂盒
<130> GNCYX210854
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2529
<212> DNA
<213> Mycobacteriumsmegmatis
<400> 1
atgactgata cgacgctgcc gccggaaggc gaggcgcacg accggatcga accggtcgac 60
atccagcagg agatgcagcg cagctacatc gactacgcca tgagcgtgat cgtgggccgc 120
gcgctgcccg aggtgcgcga cggtctcaag cccgtgcacc gccgcgtgct gtacgcgatg 180
tacgactcgg gcttccgtcc ggatcgcagc cacgccaaat ccgcgcgctc cgttgccgag 240
acgatgggta actaccatcc gcacggcgac gcctcgatct acgacaccct ggtccgcatg 300
gcccagccgt ggtcgttgcg ctacccgctg gtggacggcc agggcaactt cggctcgccg 360
ggtaacgatc cgccagcggc catgcgttac accgaagcgc gactcactcc gttggcgatg 420
gagatgttgc gtgaaatcga cgaggagaca gtcgatttca tcccgaacta cgacggacgg 480
gtgcaggagc ccacggttct gccgagccgg ttccccaacc tgttggccaa cggttcgggc 540
ggtatcgccg tgggcatggc caccaacatc ccgccgcaca acctcggcga gctcgcggag 600
gccgtgtact ggtgcctgga gaattacgag gccgacgagg aagccacctg cgaggccgtg 660
atggagcggg tcaagggacc cgacttcccc acgtccggcc tgatcgtggg cacccagggt 720
atcgaggaca cgtacaagac cggccgcggg tcgatcaaga tgcgtggcgt cgtcgagatc 780
gaggaggaca gccggggacg gaccagcatc gtcatcaccg agctgcccta ccaggtcaac 840
cacgacaact tcatcacctc gatcgccgag caggtgcgcg acggcaagct cgcgggcatc 900
tcaaacatcg aggaccagtc cagtgaccgt gtgggcctgc gaattgtcgt ggagctcaag 960
cgcgatgcgg tcgccaaggt ggtgctgaac aacctctaca agcacaccca gctgcagacc 1020
agcttcggcg ccaacatgct gtcgatcgtc gacggtgtgc cgcgcacgct gcgcctggac 1080
cagctgatcc gcctgtacgt cgaccaccaa ctcgatgtca tcgtgcggcg cacccggtac 1140
cggctgcgca aggccaacga acgggcccac atcctgcgtg gtctggtcaa ggcactcgat 1200
gccctcgacg aggtcatcgc gttgatccgg gcgtcgcaga ccgtcgacat cgcgcgtgcc 1260
ggcctgatcg agctgctcga catcgacgac atccaggccc aggcgatcct cgacatgcag 1320
ctgcgcaggc tcgcagccct cgagcggcag aagatcgtcg acgacctcgc caagatcgag 1380
gccgagatcg ccgacctcga ggacatcctc gccaagcccg agcggcagcg cgggatcgtg 1440
cgtgacgagc tcaaggagat cgtcgacaag cacggcgacg cgcgtcggac ccgcatcgtg 1500
cccgccgacg gcgaggtcag cgacgaggat ctcatcgccc gcgaagacgt ggtggtcacc 1560
atcaccgaga ccggctacgc caaacgcacc aagaccgacc tgtaccgcag ccagaaacgc 1620
ggcggcaaag gtgtgcaggg tgccggcctc aagcaggacg acatggtcaa ccacttcttc 1680
gtctgctcga cgcacgactg gatcctgttc ttcaccacac agggtcgcgt gtaccgggcg 1740
aaggcgtacg agttgcccga ggcgtcccgc accgcgcgtg gccagcacgt cgcgaacctc 1800
ctggccttcc agcccgagga gcgcatcgcg caggtcatcc agatcaagag ctacgaggat 1860
gcgccctacc tggtgctcgc gacccgcaat ggtctggtga agaagtccaa gctgtccgac 1920
ttcgactcca accgctccgg cggcatcgtc gcgatcaacc tgcgggaagg cgacgaactg 1980
gtcggtgcgg tgctgtgctc ggcagaggac gacctgctcc tggtgagtgc caacggccag 2040
tcgatccgct tctcggcgac cgacgaggcg ctgcggccca tgggtcgcgc cacctccggt 2100
gtgcagggca tgcggttcaa cgaggacgac cgcctgctgt cgctcaacgt cgtccggccc 2160
gatacgtatc tgctggtcgc gacatcgggt ggctacgcca agcgcacctc gatcgacgag 2220
tactcggtgc agggccgcgg cggcaagggc atcctgacga tccagtacga ccgcaaacgt 2280
ggcagtctgg tcggagcgtt gatcgtcgac gacgacaccg agctgtacgc gatcacgtcc 2340
acaggtggtg tcatccgcac tgccgcacgt caggtccgca aggctggtcg ccagaccaag 2400
ggcgttcgct tgatgaacct ggccgagggc gacacactga ttgccatcgc ccgcaacgcg 2460
gacgaggacg aggcggccga gtcgatcagc gaatccgacg cggacaccgc cgagtcaccc 2520
gaggcgtga 2529
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcgcagcta catcgactac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctcgtcgat ttcacgcaac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagggtgtcg tagatcgaag 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaccagggtg tcgtagatcc a 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccatgcggac cagggtat 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccatgcggac cagggtgac 19
<210> 8
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctgggccat gcggaccagg gtgtcgtaga tcgagacgtc gccgtgcgga tggtagttac 60
ccatcgtctc g 71

Claims (9)

1.核酸分子组合物，由6种DNA分子组成；6种DNA分子均为单链DNA分子，分别如序列表的序列2至序列表的序列7所示。
2.权利要求1所述核酸分子组合物在鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌中的应用。
3.权利要求1所述核酸分子组合物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌。
4.一种试剂盒，包括权利要求1所述核酸分子组合物；所述试剂盒的功能为鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌。
5.权利要求4所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌中的应用。
6.一种鉴定或辅助鉴定耐氟喹诺酮类药物的耻垢分枝杆菌的方法，包括如下步骤：
将供试耻垢分枝杆菌或其基因组DNA作为模板，分别进行四个体系的PCR扩增；
第一个体系中采用的引物由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPA91V组成；
第二个体系中采用的引物由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPS92P组成；
第三个体系中采用的引物由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95G组成；
第四个体系中采用的引物由上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95Y组成；
上游引物为序列表的序列2所示的单链DNA分子；下游引物为序列表的序列3所示的单链DNA分子；错配下游引物SNPA91V为序列表的序列4所示的单链DNA分子；错配下游引物SNPS92P为序列表的序列5所示的单链DNA分子；错配下游引物SNPD95G为序列表的序列6所示的单链DNA分子；错配下游引物SNPD95Y为序列表的序列7所示的单链DNA分子。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：PCR扩增的反应体系中加入甘油作为保护剂。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：
第一个体系中，上游引物、下游引物和错配下游引物SNPA91V的摩尔配比为：8:2:12；
第二个体系中，上游引物、下游引物和错配下游引物SNPS92P的摩尔配比为：8:2:12；
第三个体系中，上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95G的摩尔配比为：8:1:12；
第四个体系中，上游引物、下游引物和错配下游引物SNPD95Y的摩尔配比为：8:1:12。
9.如权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于：
第一个体系的PCR扩增的反应程序：98℃3min；98℃30s、55℃40s、72℃30s，30个循环；72℃5min；16℃2min；
第二个体系的PCR扩增的反应程序：98℃3min；98℃30s、65℃40s、72℃30s，30个循环；72℃5min；16℃2min；
第三个体系的PCR扩增的反应程序：98℃3min；98℃30s、58℃40s、66℃30s，30个循环；72℃5min；16℃2min；
第四个体系的PCR扩增的反应程序：98℃3min；98℃30s、62℃40s、72℃30s，30个循环；72℃5min；16℃2min。
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