CN116377092A - 一种单管巢式qPCR检测布鲁氏杆菌的试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单管巢式qPCR检测布鲁氏杆菌的试剂，所述引物组合包括外围引物、内围引物、探针；外围引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，内围引物核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，探针序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8所示；发明检测试剂具有检测灵敏度高、特异性强、重复性良好，对仪器设备要求不高、操作简便、所需时间短等优点，具有较大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于单管巢式荧光定量PCR检测布鲁氏杆菌的试剂。
背景技术
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌侵入机体引起的人兽共患的传染病。布鲁氏菌宿主范围极广，对人、家畜、野生动物以及海洋动物均具有很强的感染性、致病性；根据主要宿主不同可主要分为猪布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、地中海布鲁氏菌、新生布鲁氏菌、鲸鱼布鲁氏菌、鳍足布鲁氏菌、小布鲁氏菌、猪布鲁氏菌和其他没有命名的菌株；其中猪布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌四个种可以以人作为宿主。布鲁氏菌主要通过皮肤黏膜、消化道、呼吸道三大途径感染人类。布鲁氏菌感染人后一般可潜伏1-3周，临床上通常在感染3个月内发生波浪热、多汗并且伴随头痛、肌肉酸痛等，通常伴随肝肿和脾肿，此外男性患者可能出现睾丸炎或附睾炎，女性则可能出现流产，严重威胁着人类生命健康，并且若早期未得到有效的治疗可能会导致严重残疾。
我国布鲁氏菌病病例主要集中在北方地区，南方地区则以散发病例为主，2018年布鲁氏菌病发病数为37947例，2019年布鲁氏菌病发病数为44036例，2020年布鲁氏菌病发病数为47245例，2021年布鲁氏菌病发病数为69757例。近几年布鲁氏菌病发病数呈现出逐步上升趋势，2021年报道发病数达到十年来最高，目前人类布鲁氏菌病仍是我国重大公共卫生问题之一。
临床上最常用的布鲁氏菌病检测方法包括常规微生物检测、血清学检测、分子检测。常规微生物检测，该鉴定方法检测灵敏度低，细菌培养周期长、危险、人力投资大、不敏感，判断时主观性大。血清学检测尽管操作简单，但容易与其他病原体发生交叉反应，出现假阳性。分子检测方法包括普通PCR、巢式PCR、荧光定量PCR、RAPD-PCR、PCR-RFLP、AMOS PCR等。这些分子检测方法过程快速、简单。在这些分子检测方法中，巢式PCR相较于其他分子检测方法特异性更强，且高度灵敏；普通PCR与巢式PCR检测人血中布鲁氏菌核酸方法比较发现，巢式PCR更适合检测人血中布鲁氏菌核酸。PCR 是最敏感和最特异的检测方法，但需要几个程序来评估扩增产物。为了最大限度地降低产品残留的风险，需要一个快速、简单且步骤最少的程序，而荧光定量PCR方法通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量，检测速度快、时效性强、灵敏度高且操作简单。
单管巢式荧光定量PCR将巢式PCR与荧光定量PCR优势相结合，同时具有高特异性、高敏感性等特点，相较于两步巢式PCR，不仅能减少开盖次数降低污染风险，并且检测时间短、时效性强、操作简单，能够在很大程度上弥补其他方法的不足，用以早期快速诊断检测。
发明内容
针对现有检测布鲁氏菌的不足，本发明提供了一种单管巢式荧光定量PCR检测布鲁氏杆菌的试剂，本发明针对布鲁氏菌bcsp31基因设计特异性引物和探针，此外根据GAPDH基因设计引物探针，作为内标基因，将巢式PCR与荧光定量PCR相结合，本发明检测试剂具有检测灵敏度高、特异性强、重复性良好，对仪器设备要求不高、操作简便、所需时间短等优点，具有较大的应用价值。
本发明特异性引物根据布鲁氏菌bcsp31基因设计，外围引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，内围引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
所述探针为针对布鲁氏菌bcsp31基因的SEQ ID NO:5和针对GAPDH的SEQ ID NO:8，探针分别标记了不同的荧光基团和猝灭基团，针对布鲁氏菌bcsp31基因的探针为FAM标记，针对GAPDH基因的为Cy5标记。
针对GAPDH设计引物序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
本发明布鲁氏杆菌检测试剂中还包括用于巢式PCR与荧光定量PCR的所需常规试剂。
上述单管巢式qPCR引物组合检测布鲁氏杆菌的方法如下：
1、从医院收集阳性全血样本（细菌培养或一代测序验证的阳性病原体），运输过程保持4℃左右，-80℃条件下保藏；
2、全血样品DNA提取，用Axyen Axypreo血液基因组DNA小量提取试剂盒提取；
3、以步骤2中DNA为模板，采用布鲁氏菌靶向的特异性引物和探针，进行单管巢式荧光定量PCR检测，以GAPDH基因为内参，根据Ct值进行结果判定；其中反应程序为95℃预变性30s；95℃变性5s，68℃退火并延伸30s，10个循环；95℃变性5s，58℃退火并延伸40s，40个循环；在第二轮每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。
检测阳性结果判读包括如下内容：（1）内参（GAPDH基因）Ct值≤36，阴性对照组、无模板对照组无Ct值；如不符合须再次进行单管巢式荧光定量PCR检测，或重新提取核酸进行单管巢式荧光定量PCR检测；（2）病原体Ct值≤36.0，若Ct值＞36.0，需要增加单巢式荧光定量PCR第一轮循环数；（3）扩增曲线呈标准“S”型且无异常波动。
本发明相比现有技术具有如下优势：
近年来，许多普通的多重PCR和RT-qPCR检测已常规应用于设备齐全的实验室，用于诊断布鲁氏菌。本发明的单管巢式荧光定量PCR将巢式PCR与荧光定量PCR相结合，具有高特异性、高敏感性等特点，能够检测极其微量的DNA，相较于两步巢式PCR，不仅能减少开盖次数降低污染风险，并且检测时间短、时效性强、重现性好且操作简单，能够在很大程度上弥补其他方法的不足，为临床检测布鲁氏菌复制情况及评价药物疗效提供便捷有效的方法。
附图说明
图1为单管巢式荧光定量PCR外围退火温度筛选结果；
图2为单管巢式荧光定量PCR外围退火温度筛选结果；
图3为单管巢式荧光定量PCR引物浓度优化结果；
图4为布鲁氏菌单管巢式qPCR特异性实验结果；
图5为布鲁氏菌单管巢式qPCR灵敏度实验结果；
图6为布鲁氏菌单管巢式qPCR标准曲线；
图7为布鲁氏菌普通荧光定量PCR灵敏度实验结果；
图8为单管巢式qPCR与普通qPCR检测灵敏度对比结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1：引物设计和探针的设计
1、在NCBI (National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)网站中下载病原体基因参考序列如下：布鲁氏菌bcsp31基因共30条，基因序列号：MH045846.1、MH045845.1、MH045844.1、MH045843.1、MH045842.1、MH045841.1、MW070210.1、MK881176.1、MK881175.1、MK881174.1、MK881173.1、MN170894.2、MN170893.2、MW343458.1、MK240101.1、MK240100.1、MK240099.1、MK240098.1、MK240097.1、KT592382.1、KT592381.1、MN954953.1、MN954952.1、MN954951.1、MN954950.1、HQ132292.1、HQ132291.1、MT680895.1、M20404.1、HM030804.1；
2、使用Mega 7软件对核苷酸序列进行对齐，使用Primer Select软件设计引物与探针，并需要满足以下条件：
a、Tm值：一般探针Tm值较引物Tm高8-10℃，其中探针Tm值一般为60℃以上；外围引物Tm一般高于内围引物Tm10℃；
b、GC含量：一般不低于40%；
c、不产生引物二聚体，发夹结构软件评估结果为OK；
d、扩增片段大小一般小于200bp；
3、引物与探针BLAST评估：初步设计完成的引物探针核苷酸序列，再次使用NCBI网站中的BLAST检索功能，进行比对，选择特异性高的引物、探针序列；
靶向布鲁氏菌病原体及内参GAPDH基因的特异性引物和探针的核苷酸序列如SEQID NO:1 -SEQ ID NO:8所示，见下表：
实施例2：单管巢式荧光定量PCR方法的建立
1、质粒的构建
（1）利用Axyen Axypreo血液基因组DNA小量提取试剂盒，提取布鲁氏菌阳性患者全血样本中的总DNA，使用布鲁氏菌特异性引物：Bru-bcsp31-WF，Bru-bcsp31-WR进行PCR扩增；扩增体系如下：Taq酶10μL、ddH2O 6μL、Bru-bcsp31-WF 1μL、Bru-bcsp31-WR 1μL、模板2μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火并延伸30s，72℃延伸3min，40个循环；
（2）将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后切下260bp大小的布鲁氏菌bcsp31目的基因条带，并利用DNA产物纯化试剂盒（天根生化科技有限公司）进行DNA胶回收；
（3）利用TA克隆试剂盒（TaKaRa），将胶回收的产物和pMD19T进行连接，连接体系为pMD19T载体1μL、胶回收产物4μL、solution1 5μL；反应体系置于16℃连接8h，并转化至DH5α感受态细胞中；将菌液涂布于含氨苄抗性的平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测后，将与预期条带大小一致的PCR产物送昆明硕擎生物科技有限公司测序确认；成功构建pMD-19-bcsp31阳性质粒；
（4）利用质粒DNA提取试剂盒进行质粒DNA提取，通过紫外分光光度计进行浓度测定，根据各个长度和浓度计算出胶回收产物的拷贝数；
拷贝数结果如下表所示：
将阳性质粒按10倍稀释法梯度稀释，共设置六个浓度106、105、104、103、102、101、100 copies/μL。
2、退火温度优化
以步骤1合成的浓度103copies/μL质粒为模板，对反应条件外围退火温度优化，采用62℃、66℃、68℃、70℃进行试验；反应体系体系如下：
使用艾科瑞生物公司Pro Taq HS预混型探针法qPCR试剂盒进行单管巢式荧光定量PCR检测，使用博日FQD-96a实时荧光定量PCR仪进行检测，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，分别采用62、66、68、70℃退火并延伸30s，10个循环；95℃变性5s，58℃退火并延伸40s，40个循环；在第二轮每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号，检测结果如图1、2所示，62℃和70℃没有扩增曲线，最终确定68℃作为退火温度。
3、引物浓度优化
设置外围上下游引物终浓度240nmol/L、280 nmol/L、320 nmol/L、360 nmol/L、400 nmol/L、440 nmol/L、480 nmol/L、520 nmol/L、560 nmol/L；
以浓度103copies/μL的质粒为模板，使用艾科瑞生物公司Pro Taq HS预混型探针法qPCR试剂盒进行单管巢式荧光定量PCR检测；
使用博日FQD-96a实时荧光定量PCR仪进行检测，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，68℃退火并延伸30s，10个循环；95℃变性5s，58℃退火并延伸40s，40个循环；在第二轮每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。
检测结果如图3，通过比较Ct值的平均值和Ct值标准偏差最小，以及试验组的扩增曲线等综合指数，发现最佳外围引物浓度为400 nmol/L。
实施例3：单管巢式荧光定量PCR特异性、灵敏度、重复性评价
1、单管巢式荧光定量PCR特异性评价
扩增反应程序为：反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，68℃退火并延伸30s，10个循环；95℃变性5s，58℃退火并延伸40s，40个循环；在第二轮每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。以浓度102 copies/μL量级的质粒标准品作为阳性模板，使用艾科瑞生物公司Pro Taq HS预混型探针法qPCR试剂盒进行单管巢式qPCR检测，同时检测大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等6种常见病原体，结果如图4所示，从以上结果可以看出仅标准品为阳性，说明单管巢式qPCR检测特异性良好。
2、单管巢式荧光定量PCR灵敏度评价
用单管巢式qPCR的方法对梯度106、105、104、103、102、101、100 copies/μL的质粒为模板进行检测，确定单管巢式qPCR检测方法能检测到的最低质粒浓度，使用博日FQD-96a实时荧光定量PCR仪进行检测，扩增反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，68℃退火并延伸30s，10个循环；95℃变性5s，58℃退火并延伸40s，40个循环；在第二轮每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。结果如图5所示，从图中可以看出检测限达到1 copies/μL；图6为单管巢式荧光定量PCR标准曲线，Y=-3.46X+28.9，R2=0.998，线性关系良好。
同时采用普通荧光定量PCR对梯度106、105、104、103、102、101、100 copies/μL的质粒进行检测，确定普通荧光定量PCR方法能够检测到的最低质粒浓度；普通定量PCR扩增体系如下，扩增反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火并延伸40s，40个循环；每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号；
结果如图7所示，普通荧光定量PCR的检测下下限为104copies/μL；图8表示单管巢式荧光定量PCR与普通荧光定量PCR检测灵敏度的比较，从图中可以看出，单管巢式荧光定量PCR相比于普通荧光定量PCR检测灵敏度提高了1000倍。
3、单管巢式荧光定量PCR重复性评价
为了验证单管巢式qPCR检测方法的重复性，用103copies/μL、104copies/μL、105copies/μL量级的质粒作为模板进行实验，分别进行组内和组间重复性实验；以布鲁氏菌病原体的特异性引物和探针对质粒模板进行检测，批内重复：同一时间重复进行三次，观察记录其Ct值；批间重复：每周一进行重复性检测，连续进行三周，观察记录其Ct值。扩增反应条件如前所述一致，重复性检测结果下表：
实施例4：单管巢式荧光定量PCR临床样本的检测
（1）样本来源
从医院收集21例布鲁氏菌疑似患者全血样本，在运输过程中储存在4℃，保存在-80℃直至分析；
（2）采用Axyen Axypreo血液基因组DNA试剂盒提取DNA，具体操作步骤如下：
a、样品分装：分装200 μL菌液至新的EP管中，利用移液器加200μL Buffer AP1至EP管中，漩涡震荡10s，瞬离；
b、再加100 μL Buffer AP2，漩涡震荡10s，13400g离心10min；
c、吸取b中上清全部加入至吸附柱中， 13400g离心1min；
d、弃滤液，加入700μL Buffer W1A，室温放置两分钟后，13400g离心30s；
e、弃滤液，加800μL Buffer W2，13400g离心1min；
f、重复加入500 μL Buffer W2，13400g离心1min；弃滤液，空转13400g离心1min；
g、将吸附柱置于新的1.5mL离心管中，在膜中央加入75μL已65℃预热好的BufferTE，室温静置1min，13400g离心1min洗脱基因组DNA；
（3）单管巢式qPCR检测
使用博日FQD-96a实时荧光定量PCR仪进行检测，扩增反应程序为：反应程序95℃预变性30s；95℃变性5s，68℃退火并延伸30s，10个循环；95℃变性5s，58℃退火并延伸40s，40个循环；在第二轮每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号；同时采用常规细菌培养法检测作为对照，结果见下表：
| 样品编号 | 单管巢氏qPCR Ct值 | 细菌培养结果 |
| GGJ | 23.14 | 阳性 |
| FHJ | 23.57 | 阳性 |
| LZH | 23.81 | 阳性 |
| LYC | 23.47 | 阳性 |
| LCH | 23.52 | 阳性 |
| DQX | 22.59 | 阳性 |
| SGX | 23.86 | 阳性 |
| YJL | 23.63 | 阳性 |
| WBF | 23.12 | 阳性 |
| ZDK | 23.52 | 阳性 |
| WBH | 23.69 | 阳性 |
| ZDH | 22.97 | 阳性 |
| GGH | 23.8 | 阳性 |
| CFS | 23.46 | 阳性 |
| GFS | 23.55 | 阳性 |
| ZFB | 24.57 | 阳性 |
| LSH | 23.22 | 阳性 |
| NLM | 23.54 | 阳性 |
| ZF | 36.18 | 阴性 |
| DC | 34.09 | 阴性 |
| LZF | 35.24 | 阴性 |
由上表可知，通过本发明单管巢式荧光定量PCR检测方法对布鲁氏菌感染的临床样本具有很好的检出率。21例样品中，18例样品经细菌培养确定为阳性病原体，另外3例样品细菌培养并未检出。而我们建立的单管巢式荧光定量PCR检测为阳性，其CT值均大于34；结果表明单管巢式荧光定量PCR可以检测出细菌培养或一代测序检测不到的布鲁氏菌，适合用于布鲁氏菌载量低的临床样本检测，对布鲁氏菌诊断具有良好的应用价值。
Claims (2)
1.一种单管巢式qPCR引物组合在制备布鲁氏杆菌检测试剂中的应用，所述引物组合包括外围引物、内围引物、探针；
外围引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，内围引物核苷酸序列如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示，探针序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：采用引物组合进行单管巢式荧光定量PCR检测。
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| CN202211238333.9A CN116377092A (zh) | 2022-10-11 | 2022-10-11 | 一种单管巢式qPCR检测布鲁氏杆菌的试剂 |
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2022
- 2022-10-11 CN CN202211238333.9A patent/CN116377092A/zh active Pending
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