CN111378771B - 一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物及其试剂、试剂盒和应用 - Google Patents
一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物及其试剂、试剂盒和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111378771B CN111378771B CN202010223352.9A CN202010223352A CN111378771B CN 111378771 B CN111378771 B CN 111378771B CN 202010223352 A CN202010223352 A CN 202010223352A CN 111378771 B CN111378771 B CN 111378771B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- helicobacter pylori
- probe
- acid composition
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物及其试剂、试剂盒和应用,涉及生物技术领域。具体地,该核酸组合物包括核酸组合物1~4中的至少一个组合,核酸组合1~4分别用于检测幽门螺杆菌毒力基因vacA s1型、vacA m1型、cagA以及babA2,该核酸组合物能够快速、高效的检测幽门螺杆菌毒力基因,具有检测灵敏度高,检测特异性好的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物及其试剂、试剂盒和应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.Pylori),是一种微需氧的革兰氏阴性螺旋杆菌,1994年被世界卫生组织列为与胃癌发生相关的I类致癌因子。研究显示幽门螺杆菌感染与胃部炎症、胃黏膜萎缩、肠化、异型增生以及胃癌等的发生发展具有密切相关。
全球约一半以上的人口感染H.Pylori,其中约20%的感染者继发消化性疾病。研究显示,H.Pylori的发病机制与细菌本身的载量和产生的多种毒力因子的基因多态性以及宿主的生活环境和生活方式相关。
目前幽门螺杆菌毒力基因检测较多的有vac A,vag A,Oip A,Dup A,目前最常用的检测方法为real-time PCR法,虽然有将多个毒力基因同时检测的方法,但是该方法同时依赖于实时荧光定量PCR仪和质谱分析仪。
而研究显示毒力基因与胃癌的发生发展并不是单独某个基因的作用,而如何选择相关的毒力基因,以及怎样快速、准确的进行分析是本领域技术人员需解决的棘手问题。
鉴于此,提出本申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物及其试剂、试剂盒和应用。
本发明提供一种技术方案:
第一方面,本发明实施例提供了一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物,其包括核酸组合物1~4中的至少一个组合,核酸组合1~4分别用于检测幽门螺杆菌毒力基因vacA s1型、vacA m1型、cagA以及babA2;
核酸组合1包括上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.1~2所示的引物对1;
核酸组合2包括上游引物的序列为SEQ ID No.5和/或6,下游引物的序列如SEQ ID No.7所示的引物对2;
核酸组合3包括上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.10~11所示的引物对3;
核酸组合4包括上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.13~14所示的引物对4。
第二方面,本发明实施例提供了一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的试剂或试剂盒,其包括如前述实施例所述的用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物。
第三方面,本发明实施例提供了如前述实施例所述的用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物在幽门螺杆菌的毒力基因检测和/或分析中的应用,所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。
第四方面,本发明实施例提供了如前述实施例所述的用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物在制备用于检测和/或诊断幽门螺杆菌相关疾病的产品中的应用。
本发明提供的核酸组合物的有益效果是:
本发明实施例提供的一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物,其包括核酸组合物1~4中的至少一个组合,核酸组合1~4分别用于检测幽门螺杆菌毒力基因vacAs1型、vacA m1型、cagA以及babA2,该核酸组合物能够快速、高效的检测幽门螺杆菌毒力基因,具有检测灵敏度高,检测特异性好的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明验证例1中幽门螺杆菌毒力基因vacA s1的退火温度图;
图2为本发明验证例1中幽门螺杆菌毒力基因vacA m1的退火温度图;
图3为本发明验证例1中幽门螺杆菌毒力基因cagA的退火温度图;
图4为本发明验证例1中幽门螺杆菌毒力基因babA2的退火温度图;
图5为本发明验证例2中毒力基因最佳引物探针浓度下扩增曲线;
图6为本发明验证例4中幽门螺杆菌毒力基因vacA s1的最低检测线检测结果图;
图7为本发明验证例4中幽门螺杆菌毒力基因vacA m1的最低检测线检测结果图;
图8为本发明验证例4中幽门螺杆菌毒力基因cagA的最低检测线检测结果图;
图9为本发明验证例4中幽门螺杆菌毒力基因babA2的最低检测线检测结果图;
图10为本发明验证例6中幽门螺杆菌毒力基因vacA s1的ROC曲线图;
图11为本发明验证例6中幽门螺杆菌毒力基因vacA m1的ROC曲线图;
图12为本发明验证例6中幽门螺杆菌毒力基因cagA的ROC曲线图;
图13为本发明验证例6中幽门螺杆菌毒力基因babA2的ROC曲线图;
图14为本发明验证例7中幽门螺杆菌毒力基因特异性检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
下面对本申请提供的一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物及其试剂、试剂盒和应用进行具体说明。
本发明实施例提供的一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物,其包括核酸组合物1~4中的至少一个组合,核酸组合1~4分别用于检测幽门螺杆菌毒力基因vacAs1型、vacA m1型、cagA以及babA2。
毒力基因与胃癌的发生发展并不是单独某个基因的作用。bab A有2个等位基因babA1,babA2,通常只有babA2可以正常表达。而bab A黏附素的表达会增强cag-PAI依赖的幽门螺杆菌的致病性并且加重炎症反应。同时,三阳性的(cagA、vacA、babA)幽门螺杆菌在胃里有更大的定植密度。同时检测vacAs1型、vacA m1型、cagA以及babA2对于检测和/或分析与幽门螺杆菌相关疾病的发生具有重要意义。
具体地,核酸组合1包括上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.1~2所示的引物对1。
核酸组合2包括上游引物的序列为SEQ ID No.5和/或6,下游引物的序列如SEQ IDNo.7所示的引物对2。需要说明的是,选择SEQ ID No.5和6中的任意序列作为引物对2的上游引物,或同时采用该2条序列作为上游引物的技术方案均属于本发明的保护范围内。
核酸组合3包括上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.10~11所示的引物对3。
核酸组合4包括上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.13~14所示的引物对4。
优选地,所述核酸组合物包括所述引物对1~所述引物对4。采用引物对1~4能够在同一反应体系中,同时检测出vacA s1,vacA m1,cagA以及babA2等毒力基因,解决了现有产品只能在一管中检测一种毒力基因的问题。
在可选实施方式中,所述核酸组合物还包括用于检测幽门螺杆菌毒力基因vacAs1型、vacA m1型、cagA以及babA2中至少1个基因的探针。
在可选实施方式中,所述核酸组合1包括序列如SEQ ID No.3和/或4所示的探针1。
具体地,探针1包括探针1a(序列如SEQ ID No.3所示)和/或探针1b(序列如SE QID No.4所示),优选地,核酸组合1包括探针1a和探针1b。核酸组合1是用于检测毒力基因vac S1型的组合,而vac S1型具有2种亚型,探针1a用于检测vac S1a亚型,探针1b用于检测vac S1b亚型。
在可选实施方式中,所述核酸组合2包括序列如SEQ ID No.8和/或9所示的探针2。
具体地,探针2包括探针2a(序列如SEQ ID No.8所示)和/或探针2b(序列如SEQ IDNo.9所示),是发明人通过研究多种菌株序列的多态性,筛选的能够高效检测毒力基因vacM1型的探针。优选地,探针2包括探针2a和探针2b,同时采用该2种探针能够避免或减少菌株因序列多态性而导致的漏检。
在可选实施方式中,所述核酸组合3包括序列如SEQ ID No.12所示的探针3。
在可选实施方式中,所述核酸组合4包括序列如SEQ ID No.15和/或16所示的探针4。
具体地,探针4包括探针4a(序列如SEQ ID No.15所示)和/或探针4b(序列如SE QID No.16所示),是发明人通过研究多种菌株序列的多态性,筛选的能够高效检测毒力基因babA2型的探针。优选地,探针4包括探针4a和探针4b,同时采用该2种探针能够避免或减少菌株因序列多态性而导致的漏检。
在可选实施方式中,所述探针1~4的5′端均标记有荧光报告基团,3′端均标记有荧光淬灭基团。
在可选实施方式中,荧光报告基团选自:FAM、HEX、Quasar 705、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED640中的任意基团。荧光淬灭基团选自:BHQ2、BHQ1、Dabcyl、Tamra和BHQ3中的任意基团。
本发明实施例还提供了一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的试剂或试剂盒,其包括如前述任一实施方式所述的用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物。
在可选实施方式中,所述试剂或试剂盒还包括以下任意一种或多种试剂的组合:阳性对照品、阴性对照品、PCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs、热启动DNA聚合酶和UNG酶。
本发明实施例还提供了如前述任一实施方式所述的用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物在幽门螺杆菌的毒力基因检测和/或分析中的应用,所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。
在可选实施方式中,所述毒力基因检测和/或分析包括采用所述核酸组合物对待测样品的DNA进行PCR扩增。
优选地,在进行PCR扩增时,所述核酸组合物1中引物对1和探针1的摩尔比为2:(0.5~1.5);需要说明的是,引物对1和探针1的摩尔比是指引物对1中的上游引物和/或下游引物与探针1的摩尔比,下同。
优选地,在进行PCR扩增时,所述核酸组合物2中引物对2和探针2的摩尔比为3:(1.5~2.5);
优选地,在进行PCR扩增时,所述核酸组合物3中引物对3和探针3的摩尔比为2:(0.5~1.5);
优选地,在进行PCR扩增时,所述核酸组合物4中引物对4和探针4的摩尔比为3:(1.5~2.5)。
优选地,在进行PCR扩增时,引物对1的浓度为700~900nM、探针1的浓度为300~500nM。需要说明的是,引物对1的浓度为700~900nM指引物对1中上游引物和下游引物的浓度均为700~900nM。在一些实施例中,探针1包括2条序列,探针1a(序列如SEQ ID No.3所示)和探针1b(序列如SEQ ID No.4所示),在该种情况下,探针1的浓度为300~500nM是指探针1a和探针1b的浓度均为300~500nM,下同。
优选地,在进行PCR扩增时,引物对2的浓度为500~700nM、探针2的浓度为300~500nM;
优选地,在进行PCR扩增时,引物对3的浓度为700~900nM、探针3的浓度为300~500nM;
优选地,在进行PCR扩增时,引物对4的浓度为500~700nM、探针4的浓度为300~500nM。
此外,本发明实施例还提供了如前述任一实施方式所述的用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物在制备用于检测和/或诊断幽门螺杆菌相关疾病的产品中的应用。
需要说明的是,在该应用中,用于检测和/或诊断幽门螺杆菌相关疾病的方法包括前述实施方式所述的采用所述核酸组合物对待测样本进行PCR扩增,PCR扩增的条件同前述所述方式所述,如引物对1~4以及探针1~4的摩尔比和浓度,在此不再赘述。
在可选实施方式中,所述幽门螺杆菌相关疾病选自:胃部炎症、胃黏膜萎缩、胃黏膜肠化、胃黏膜异型增生和胃癌。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步解释。
实施例1
本实施例提供一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的试剂盒,其包括:阳性对照品、阴性对照品、PCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs、热启动DNA聚合酶、UNG酶以及核酸组合物。
其中,核酸组合物包括核酸组合1~4,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其具体序列如表1所示。
表1 核酸组合1~4的序列信息
阳性对照品是分别包括所有目的基因靶点(4种毒力基因:vacA s1型、vacA m1型、cagA以及babA2)的质粒混合物。
阴性对照品为无核酸酶超纯水。
实施例2
采用本实施例提供实施例1提供的试剂盒,以检测或分析幽门螺杆菌毒力基因,具体包括以下步骤。
(1)制备待检测样本:
采用核酸提取试剂盒提取待测样本中的DNA,在本实施例中,核酸提取试剂盒选自江苏硕世生物科技股份有限公司核酸提取试剂盒,待测样本为幽门螺杆菌患者胃组织标本,需要说明的是,在其它实施例中,也可以采用其他公司的核酸提取试剂盒,以及其他如人体其他组织、健康人组织、血液、动物或大自然中选则的样本进行DNA的提取,以待进行幽门螺杆菌的检测。
(2)配置PCR反应混合液:
PCR反应体系如表2所示。
表2 PCR反应体系
成分 | 体积 |
PCR反应缓冲液(5×) | 5μL |
Taq DNA聚合酶(2U/μL) | 0.2μL |
引物及探针混合液 | 8μL |
dUTP(10mM) | 0.0625μL |
dTTP(10mM) | 0.0625μL |
dATP(10mM) | 0.125μL |
dGTP(10mM) | 0.125μL |
dCTP(10mM) | 0.125μL |
UNG酶(2U/μL) | 0.1μL |
无酶水 | 1.2μL |
MgCl2(15mmol) | 5μL |
核酸样本 | 5μL |
反应总体积 | 25μL |
备注:其中,引物对1的上下游引物浓度均为800nM、探针1a和探针1b的浓度均为400nM;引物对2的上下游引物浓度均为600nM、探针2a和探针2b的浓度均为400nM;引物对3的上下游引物浓度均为800nM、探针3的浓度为400nM;引物对4的上下游引物浓度均为600nM、探针1a和探针1b的浓度均为400nM;
PCR反应条件如表3所示。
表3 PCR反应条件
验证例1
验证实施例2提供的检测方法中的退火温度。
采用实施例1中的试剂盒,按照实施例2提供的检测方法,分别在45℃~55℃,进行PCR扩增,比较不同退火温度下的退火效率,结果如附图1~4所示。
由附图1~4可知,当PCR的退火温度为45℃~51℃时,引物的扩增效率均比较好,阴性对照没有荧光信号,综合考虑,将其最适退火温度设定为51℃。
验证例2
验证实施例2的检测方法中的引物对与探针的最佳浓度配比。
采用实施例1中的试剂盒,按照实施例2提供的检测方法,分别将引物对与探针在不同浓度下(引物对1~4以及探针1~4的浓度分别设置为100nM、200nM、400nM、600n M、800nM以及1200nM,具体参照表4~表7所示),进行PCR扩增,比较不同浓度配比下的扩增结果,结果如表4、表5、表6以及表7所示。
表4 引物对1和探针1的扩增结果
表5 引物对2和探针2的扩增结果
表6 引物对3和探针3的扩增结果
表7 引物对4和探针4的扩增结果
由表5~表7可知,毒力基因vacA s1、vacA m1、cagA、babA2反应体系中,最佳引物探针(1~4)浓度为分别为800nM和400nM、600nM和400nM、800nM和400nM、600n M和400nM时(参照附图5),Ct值小且曲线呈现光滑的S型。
验证例3
验证实施例2提供的检测方法的准确度。
取弱阳性样本(Ct值在30~33间),采用实施例2提供的检测方法进行实时荧光定量P CR扩增实验,批内重复至少10个样本,至少重复3次实验。
实验结果如表8所示。
表8 实验结果
由表8可知,幽门螺杆菌毒力基因vacA s1、vacA m1、cagA和babA2基因同一样本复孔Ct值的变异系数(CV%)小于5.0%。变异系数无异常,精密度良好,实验的准确度高。
验证例4
验证实施例2提供的检测方法的最低检测限度。
在正常胃组织中加入不同CFU,1×105CFU、1×104CFU、1×103CFU、1×102C FU、1×101CFU、2×104CFU、2×103CFU、2×102CFU、2×101CFU的幽门螺杆菌菌液作为模拟样本,采用病毒核酸DNA提取试剂盒提取幽门螺杆菌基因组,按照实施例2中的方法对核酸样本进行实时荧光定量PCR分析,PCR扩增结果如附图6、图7、图8以及图9所示。
由附图6~9可知,毒力基因vacA s1、vacA m1、cagA、babA2的最低检测线分别为200CFU、200CFU、200CFU以及100CFU。
验证例5
验证实施例2提供的检测方法的检测灵敏度。
在正常胃组织中加入100CFU、200CFU的幽门螺杆菌作为模拟样本,采用病毒核酸DNA提取试剂盒提取幽门螺杆菌基因组,按照实施例2中的检测方法对核酸样本进行实时荧光定量PCR分析,PCR扩增结果如表9所示。
表9 实验结果
由表9所示,vacA s1、vacA m1、cagA以及babA2的最低检测线分别为200CFU、200CFU、200CFU以及100CFU。最低检测限的Ct值小于35,重复20次实验检出率为100%,故实施例1提供的用于检测幽门螺杆菌毒力基因vacA s1、vacA m1、cagA、babA2核酸组合具有很高的灵敏性。
验证例6
验证实施例2提供的检测方法的ROC曲线。
样本制备
样本1:选取正常人胃组织样本10例,采用试剂盒提取模板DNA;
样本2:在正常20例人胃组织样本中加入2×104CFU的幽门螺杆菌菌液,试剂盒提取模板DNA;
样本3:在正常20例人胃组织样本中加入2×103CFU的幽门螺杆菌菌液,试剂盒提取模板DNA;
样本4:在正常20例人胃组织样本中加入2×102CFU的幽门螺杆菌菌液,试剂盒提取模板DNA;
样本5:在正常20例人胃组织样本中加入1×102CFU的幽门螺杆菌菌液,试剂盒提取模板DNA;
样本6:在正常20例人胃组织样本中加入5×101CFU的幽门螺杆菌菌液,试剂盒提取模板DNA;
样本7:大肠杆菌菌株,粪链球菌菌株,嗜酸乳杆菌共10例,试剂盒提取模板DNA。
按照实施例2中的检测方法进行实时荧光定量PCR检测,分析数据。然后将实时荧光定量分析所得Ct值带入SPSS软件,制备ROC曲线,阴性对照无实时荧光定量PCR扩增曲线。SPSS软件分析各样本Ct值的结果如表10以及附图10、附图11、附图12以及附图13所示。
表10 ROC曲线结果
/>
备注:a.Under the nonparametric assumption(假设在非参数性的情况下);
b.Null hypothesis:true area=0.5(b.虚无假设:真区域=0.5)。
由表10和附图10~13可知,幽门螺杆菌毒力基因vacAs1、vacA m1、cagA以及babA2 ROC曲线分析结果中,AUC(area under ROC)分别为:0.986、0.988、0.987以及0.984,尤登指数(正确指数)最大值分别为0.94,0.95,0.9以及0.9,最大youden指数对应的Ct值分别为36.2、36.24、36.3以及36.08即为阳性判定临界值。
验证例7
验证实施例2提供的检测方法的特异性。
以上海硕世磁珠法病毒核酸提取试剂盒中洗脱液为空白对照,以正常胃组织基因组DN A为阴性对照,以幽门螺杆菌菌株的核酸为阳性对照,与大肠杆菌、梭杆菌、乙链球菌、金黄色葡萄球菌、胃内常见菌体嗜酸乳杆菌菌株的核酸一起用实施例1的核酸组合物,按照实施例2中的检测方法进行实时定量荧光PCR分析后的扩增曲线和Ct值,检测结果如表11和附图14所示。
表11 检测结果
由表11可知,空白对照和大肠杆菌、梭杆菌、乙链球菌、金黄色葡萄球菌、胃内常见菌体嗜酸乳杆菌均无特异性扩增和Ct值。请参照附图14,阳性对照样品的毒力基因有特异扩增曲线,且Ct值在18~35之间,胃内杂菌和其他菌体对测定无干扰,该核酸组合对幽门螺杆菌毒力基因检测的特异性良好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆博利达医学科技有限公司
<120> 一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物及其试剂、试剂盒和应用
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acaccgcaaa atcaatcgcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccccaacaat ggctggaatg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcatcacacc gcaacaaagt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcgccatacc gcaagagagt 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atcaattatt tggtccgagg c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atcaactatc tggtccgagg c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gctgttaatc ttcatgagcg gt 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gatagcgcga ctgggtttta 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gacagcgcga ccggatttta 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cagcaaggta acgcaagcaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cactgaaatc gcctgttgcc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgacaatctc aatcaagcgg 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaaatcccta atactaaatc c 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gtaaaagccg tcgtcttcag c 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggagaaaaaa catgaaaaaa ca 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggggagaaaa catgaaaaaa ca 22
Claims (9)
1.一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物,其特征在于,其包括核酸组合物1~4的组合,核酸组合1~4分别用于检测幽门螺杆菌毒力基因vacA s1型、vacA m1型、cagA以及babA2;
核酸组合1包括上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.1~2所示的引物对1,以及包括序列如SEQ ID No.3和/或4所示的探针1;
核酸组合2包括上游引物的序列为SEQ ID No.5和/或6,下游引物的序列如SEQ IDNo.7所示的引物对2,以及包括序列如SEQ ID No.8和/或9所示的探针2;
核酸组合3包括上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.10~11所示的引物对3,以及包括序列如SEQ ID No.12所示的探针3;
核酸组合4包括上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.13~14所示的引物对4,以及包括序列如SEQ ID No.15和/或16所示的探针4。
2.根据权利要求1所述的用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物,其特征在于,探针1~探针4的5′端均标记有荧光报告基团,3′端均标记有荧光淬灭基团。
3.一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的试剂或试剂盒,其特征在于,其包括如权利要求1~2任一项所述的用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物。
4.根据权利要求3所述的用于检测幽门螺杆菌毒力基因的试剂或试剂盒,其特征在于,所述试剂或试剂盒还包括以下任意一种或多种试剂的组合:
阳性对照品、阴性对照品、PCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs、热启动DNA聚合酶和UNG酶。
5.如权利要求1~2任一项所述的用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物在幽门螺杆菌的毒力基因检测和/或分析中的应用,其特征在于,所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述毒力基因检测和/或分析包括采用所述核酸组合物对待测样品的DNA进行PCR扩增;
在进行PCR扩增时,所述核酸组合物1中引物对1和探针1的摩尔比为2:(0.5~1.5);
在进行PCR扩增时,所述核酸组合物2中引物对2和探针2的摩尔比为3:(1.5~2.5);
在进行PCR扩增时,所述核酸组合物3中引物对3和探针3的摩尔比为2:(0.5~1.5);
在进行PCR扩增时,所述核酸组合物4中引物对4和探针4的摩尔比为3:(1.5~2.5)。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,在进行PCR扩增时,引物对1的浓度为700~900nM、探针1的浓度为300~500nM;
在进行PCR扩增时,引物对2的浓度为500~700nM、探针2的浓度为300~500nM;
在进行PCR扩增时,引物对3的浓度为700~900nM、探针3的浓度为300~500nM;
在进行PCR扩增时,引物对4的浓度为500~700nM、探针4的浓度为300~500nM。
8.如权利要求1~2任一项所述的用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物在制备用于检测和/或诊断幽门螺杆菌相关疾病的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述幽门螺杆菌相关疾病选自:胃部炎症、胃黏膜萎缩、胃黏膜肠化、胃黏膜异型增生和胃癌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010223352.9A CN111378771B (zh) | 2020-03-26 | 2020-03-26 | 一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物及其试剂、试剂盒和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010223352.9A CN111378771B (zh) | 2020-03-26 | 2020-03-26 | 一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物及其试剂、试剂盒和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111378771A CN111378771A (zh) | 2020-07-07 |
CN111378771B true CN111378771B (zh) | 2023-07-28 |
Family
ID=71217505
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010223352.9A Active CN111378771B (zh) | 2020-03-26 | 2020-03-26 | 一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物及其试剂、试剂盒和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111378771B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112877408A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-06-01 | 南开大学 | 一种使用环介导等温扩增法检测幽门螺杆菌毒力基因类型的方法及试剂盒 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999024607A2 (en) * | 1997-11-06 | 1999-05-20 | Innogenetics N.V. | DETECTION AND TYPING OF THE iceA GENE OF $i(HELICOBACTER PYLORI) |
CN105463124A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-04-06 | 华东医院 | 幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系及其试剂盒和应用 |
CN107557436A (zh) * | 2017-10-09 | 2018-01-09 | 重庆博利达医学科技有限公司 | 一种用于检测幽门螺杆菌的核酸组合及其应用和试剂盒 |
-
2020
- 2020-03-26 CN CN202010223352.9A patent/CN111378771B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999024607A2 (en) * | 1997-11-06 | 1999-05-20 | Innogenetics N.V. | DETECTION AND TYPING OF THE iceA GENE OF $i(HELICOBACTER PYLORI) |
CN105463124A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-04-06 | 华东医院 | 幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系及其试剂盒和应用 |
CN107557436A (zh) * | 2017-10-09 | 2018-01-09 | 重庆博利达医学科技有限公司 | 一种用于检测幽门螺杆菌的核酸组合及其应用和试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111378771A (zh) | 2020-07-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6574703B2 (ja) | 糞便サンプル中のヘリコバクターピロリdnaを検出するための方法 | |
CN110607379A (zh) | 同时检测多种细菌及支原体的多重pcr检测方法及其应用 | |
US20130065232A1 (en) | Assays and kits for serotyping pseudomonas aeruginosa and oligonucleotide sequences useful in such methods and kits | |
CN111004862B (zh) | 用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用 | |
US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
KR20130128334A (ko) | 마이코플라즈마 오염 유무 확인을 위한 프라이머 세트, TaqMan 프로브 및 이를 이용한 Real―Time PCR 시험 방법 | |
JP2001512035A (ja) | Candida種を検出するための核酸プローブ | |
CN111378771B (zh) | 一种用于检测幽门螺杆菌毒力基因的核酸组合物及其试剂、试剂盒和应用 | |
CN106282176A (zh) | 一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物组合及其应用 | |
KR102388060B1 (ko) | 결핵균 및 베이징 계통 결핵균의 감별을 위한 조성물 및 이를 이용한 결핵균 검출 방법 | |
CN110684854A (zh) | 用于检测幽门螺杆菌耐药突变位点的引物和探针组及应用 | |
KR101425149B1 (ko) | 원-튜브 네스티드 실시간 피시알을 이용한 개선된 결핵균 진단방법 | |
KR102246953B1 (ko) | 에드와드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 동정 방법 | |
CN111334592A (zh) | 一种用于检测幽门螺杆菌耐药基因的核酸组合物及其试剂盒和应用 | |
CN107699639B (zh) | 一种鉴别牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌的引物及方法 | |
CN111004855A (zh) | 一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合和试剂盒 | |
KR102027157B1 (ko) | 장관병원성 대장균 (Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)과 장관조직 침입성 대장균 (Enteroinvasive Escherichia coli, EIEC) screening이 가능한 검출용 primer 및 PNA probe와 이를 이용한 대장균 Real-time multiplex PCR 검출 방법 | |
CN116694786B (zh) | 一种用于检测幽门螺旋杆菌耐药突变基因的引物探针组合 | |
KR102557450B1 (ko) | CRISPR-Cas 기반의 살모넬라균 검출용 조성물 및 이를 이용한 살모넬라균 검출방법 | |
CN117363767B (zh) | 一种用于靶基因实时荧光pcr检测的探针组合、引物组、试剂盒及其应用 | |
CN108085401B (zh) | 检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂 | |
CN116377092A (zh) | 一种单管巢式qPCR检测布鲁氏杆菌的试剂 | |
CN117701746A (zh) | 一种幽门螺杆菌分型核酸检测引物组及其应用 | |
CN117286264A (zh) | 一种用于同时检测幽门螺杆菌及其耐药基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 | |
CN116497133A (zh) | 用于检测或辅助检测幽门螺杆菌的引物探针组合物以及试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |