CN107699639B

CN107699639B - 一种鉴别牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌的引物及方法

Info

Publication number: CN107699639B
Application number: CN201711178085.2A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 范晴; 谢志勤; 黄莉; 熊文婕; 黄娇玲; 张艳芳; 曾婷婷; 谢丽基
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2037-11-23
Also published as: CN107699639A

Abstract

本发明提供了一种可同时检测牛轮状病毒(BRV)和产肠毒大肠杆菌(ETEC)的可视化多重荧光LAMP检测方法。本发明在LAMP方法中引入了两个荧光基团，通过反应产物颜色直接判断结果，例如红色即为牛轮轮状病毒(BRV)引起的牛腹泻，绿色即为产肠毒大肠杆菌(ETEC)引起的牛腹泻。本发明提供的检测方法通过一个反应管中的一次LAMP反应，即可同时鉴别检测两个病毒。本发明设计的引物序列灵敏度高，每个反应最低能检测到100个拷贝混合模板；特异性好，能高效扩增目的基因；临床检测效果好。本发明提供的检测方法，方便、快速、无需使用昂贵仪器、成本低，能够实现现场检测病原。

Description

一种鉴别牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌的引物及方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种可同时检测牛轮状病毒(BRV)和产肠毒大肠杆菌(ETEC)的可视化多重荧光LAMP检测方法。

背景技术

犊牛腹泻症是养牛业的一种常见病，在犊牛出生一个月内其发生率和死亡率最高，给养牛业造成巨大的经济损失。牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)和产肠毒大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli,ETEC)是引起犊牛腹泻症的主要病原。牛轮状病毒感染所引起的腹泻多发生在1月龄以内的犊牛，引起疾病的严重程度差别很大，包括无症状感染、温和的自限性腹泻以及伴有严重脱水的重度腹泻。据报道将近一半的新生犊牛腹泻与轮状病毒感染有关。据资料显示,轮状病毒引起犊牛腹泻的发病率为60％～80％,死亡率为0～50％。产肠毒大肠杆菌能产生肠毒素，导致宿主分泌型腹泻症。已经鉴定出几种类型的肠毒素：不耐热型(LTⅠ，LTⅡ)和耐热型(STa，STb)，导致新生犊牛腹泻症。因为肠毒素不具有免疫原性，所以在犊牛中控制ETEC主要是诱导抗体抑制菌毛蛋白。犊牛的F4(LTⅠ),F5(STa)抗原是最常见的两种抗原，可作为诊断和制备疫苗之用。通常1-7日龄犊牛容易感染BRV，期间感染引起的肠细胞损伤更利于ETEC的附着和感染，表现为严重腹泻，腹部扩张，脱水，休克，发病快，死亡率高。只根据临床症状，很难区分ETEC和BRV，且这两种细菌和病毒经常混合感染，临床上很容易误诊，所以常常因为不能得到及时正确的诊断和有效的治疗，而造成很大的经济损失。因此急需开发ETEC和BRV的快速检测相关产品和方法，对犊牛腹泻症的防治提供技术保障。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种可同时检测牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌的方法，所述方法包括：进行环介导等温扩增反应，其中，用于检测牛轮状病毒的引物序列中的至少一条序列和用于检测产肠毒大肠杆菌的引物序列中的至少一条序列，分别用不同颜色的荧光基团进行标记。

具体的，所述方法不包括专利法第二十五条所述的疾病的诊断和治疗方法。

具体的，所述方法包括下述1)‐8)中的至少一种：

1)所述荧光基团标记在环介导等温扩增反应中的内引物FIP的5’端；

2)用于检测牛轮状病毒的引物序列根据牛轮状病毒的VP6基因序列设计；

3)用于检测产肠毒大肠杆菌的引物序列根据产肠毒大肠杆菌的LTⅠ和/或STa基因序列设计；

4)所述环介导等温扩增反应，参与所述反应的引物共3套：一套为根据牛轮状病毒的VP6基因序列设计的外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；另一套为根据产肠毒大肠杆菌的LTⅠ基因序列设计的外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；还有一套为根据产肠毒大肠杆菌的STa基因序列设计的外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；

5)所述环介导等温扩增反应，其中所述反应的反应体系包括：1μL模板，10×缓冲液2.5μL,10U AMV反转录酶，15U Bst DNA聚合酶，内引物各40pmol,外引物各5pmol；

所述10×缓冲液的成分为：pH 8.8的200Mm Tris–HCl，100mM KCl，80mMMgSO₄，100mM(NH₄)₂SO₄，1％Tween 20，8M betain，14mM dNTPs，其中1％为体积百分数；

6)所述环介导等温扩增反应，其中所述反应的反应时间包括90分钟；

7)所述环介导等温扩增反应，其中所述反应的反应温度包括62℃；

8)在所述环介导等温扩增反应反应完成后，还包括终止反应，所述终止反应包括80℃放置5分钟。

具体的，所述环介导等温扩增反应，参与所述反应的引物包括下述1)‐12)中的至少一种：

1)序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

3)序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

4)序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

5)序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

6)序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

7)序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

8)序列表中SEQ ID №：8所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：8所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：8所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

9)序列表中SEQ ID №：9所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：9所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：9所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

10)序列表中SEQ ID №：10所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：10所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：10所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

11)序列表中SEQ ID №：11所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：11所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：11所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

12)序列表中SEQ ID №：12所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：12所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：12所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。

所述相同功能具体为可用于检测牛轮状病毒BRV和/或产肠毒大肠杆菌ETEC。

具体的，所述序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列、SEQ ID №：7所示核苷酸序列、和/或SEQ ID №：11所示核苷酸序列的5’端标记有荧光基团。

具体的，所述序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列的5’端标记有FITC荧光基团、SEQ ID №：7所示核苷酸序列的5’端标记有CY5.5荧光基团、和/或SEQ ID №：11所示核苷酸序列的5’端标记有CY5.5荧光基团。

本发明的另一个目的是提供一种引物组合物，所述引物组合物包括下述1)‐12)中的至少一种：

本发明的还一个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明任一所述的引物组合物。

本发明的再一个目的是提供本发明任一所述方法、本发明任一所述引物组合物、本发明所述试剂盒的应用。

所述应用包括在下述1)‐6)中的至少一种中的应用：

1)鉴别牛轮状病毒和/或产肠毒大肠杆菌；

2)制备用于鉴别牛轮状病毒和/或产肠毒大肠杆菌的试剂盒或相关产品；

3)检测待测病原微生物是否为牛轮状病毒和/或产肠毒大肠杆菌；

4)制备用于检测待测病原微生物是否为牛轮状病毒和/或产肠毒大肠杆菌的试剂盒或相关产品；

5)检测待测样本中是否含有牛轮状病毒和/或产肠毒大肠杆菌；

6)制备用于检测待测样本中是否含有牛轮状病毒和/或产肠毒大肠杆菌的试剂盒或相关产品。

所述任一应用不包括专利法第二十五条所述的疾病的诊断和治疗方法。

本发明在LAMP方法中引入了两个荧光基团，通过反应产物颜色直接判断结果，例如红色即为牛轮轮状病毒(BRV)引起的牛腹泻，绿色即为产肠毒大肠杆菌(ETEC)引起的牛腹泻。

本发明提供的检测方法通过一个反应管中的一次LAMP反应，即可同时鉴别检测两个病毒。

本发明设计的引物序列灵敏度高，每个反应最低能检测到100个拷贝混合模板；特异性好，能高效扩增目的基因；临床检测效果好。

本发明提供的检测方法，方便、快速、无需使用昂贵仪器、成本低，能够实现现场方便、快速、准确的检测病原。

本发明的有益效果还包括：

1继承了传统LAMP的优点：反应条件要求低，只需一台水浴锅，反应时间短，全程90分钟；灵敏度高，多条引物同进扩增，扩增效率高。

2有效抑制假阳性：由于荧光基团镶嵌在内引物FIP上，扩增过程中比普通引物更需要消耗能量，引物与模板DNA分子碰撞要求高，可以有效抑制假阳性。

3结果准确：

近几年来，LAMP与其方便快速的优势受到广泛学者的关注，但也由于其自身技术上的局限，多重LAMP方法一直未有较大的进展。与PCR产物特异性目的条带不同，LAMP产物电泳呈梯状条带，LAMP检测无论是单重还是多重，其颜色变化和沉淀物，阳性结果都是一样，不能确定具体到底是由哪一种阳性反应所引起的结果，因此进行多重区分比较困难。本研究采取的是一种新的技术路线，通过添加荧光基团，用不同颜色的荧光基团显示扩增结果，能准确判断病原。

本研究使用了2种新型荧光基团，CY5.5和FITC,这2种荧光基团的激发光和吸收光均不同，因此可呈现不同的颜色，FITC吸收波为520nm，呈黄绿色，CY5.5吸收波为670nm，呈大红色。不同的荧光基团，仅能在特定的通道下观察到，即在520通道下只能观察到FITC，不能观察到CY5.5。比加染料肉眼观察颜色变化，仅凭沉淀物观察等方式更准确，是第一次实现了真正意义上的多重LAMP鉴别检测。

附图说明

图1为多重荧光LAMP特异性实验结果图，其中，A：520荧光通道图(BRV-FITC标记),B：670荧光通道图(MB-CY5.5)，C：双通道图；1：BRV 014，2：ETEC-1，3：BRV014+ETEC-1，4-11分别为：FMDV，VSV，BTV，PPRV，BVDV，MB，IBRV，阴性对照。

图2为多重荧光LAMP敏感性实时浊度图，其中，1～8：10⁷～10⁰拷贝/μl(BRV反转录RNA，PMD-18T-LTⅠ和PMD-18T-STa混合质粒)，9：阴性对照。

图3为多重荧光RT-LAMP敏感性实验结果图，其中，1～8：10⁷～10⁰拷贝/μl(BRV反转录RNA，PMD-18T-LTⅠ和PMD-18T-STa混合质粒)，9：阴性对照。

图4为多重荧光LAMP干扰性试验结果图，其中，1：BRV(10⁸copies/μL)+LTⅠ(10⁴copies/μL)，2：BRV(10⁴copies/μL)+STa(10⁸copies/μL)，3：BRV(10⁷copies/μL)+LTⅠ(10³copies/μL)，4：BRV(10⁴copies/μL)+STa(10⁷copies/μL)，5：BRV(10⁶copies/μL)+STa(10²copies/μL)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、可视化多重荧光LAMP检测牛轮状病毒(BRV)和产肠毒大肠杆菌(ETEC)

(一)引物设计

下载Genebank上已登录的BRV的VP6基因和ETEC的LTⅠ,STa基因序列，利用MEGA5.0进行保守性和同源性分析，选取保守性好的区域，用primer5.0软件设计3套LAMP特异性引物。每套包括4条引物：外引物F3和B3，内引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2)，每条内引物的5’端标记荧光基团：BRV-FIP标记FITC荧光，在520nm波长下呈黄绿色，ETEC-LTⅠ-FIP，ETEC-STa-FIP标记CY5.5荧光，在694nm波长下呈大红色。引物均由大连宝生物公司合成。引物的具体核苷酸序列如表1所示。

表1

(二)模板制备

取250μL细胞培养物，细菌培养物或病料处理液参照全式金easy purevirus DNA/RNA试剂盒说明书，提取样品总RNA/DNA，用全世金Transcriptfirst-strand cDNAsynthesis试剂盒将RNA反转录成cDNA和抽提好的DNA模板置-20℃保存，备用。

(三)反应体系

通过矩阵法优化引物的最佳配比，本实施例选取的最佳的反应体系为：1μL模板，10×buffer 2.5μL(成分为200Mm Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，80mM MgSO₄，100mM(NH₄)₂SO₄，1％Tween 20，8M betaine，and 14mM dNTPs),10UAMV反转录酶，15U of Bst DNA聚合酶，内引物各40pmol(BRV-FIP，BRV-BIP，ETEC-LTⅠ-FIP,ETEC-LTⅠ-BIP,ETEC-STa-FIP,ETEC-STa-BIP),外引物各5pmol(BRV-F3，BRV-B3，ETEC-LTⅠ-F3,ETEC-LTⅠ-B3,ETEC-STa-F3,ETEC-STa-B3)。

(四)反应过程

将步骤(三)反应体系的各组份混合均匀，置恒温仪62℃反应90分钟，80℃作用5min终止反应。

(五)结果检测

电泳：由于LAMP反应产物是长度不等的DNA片断的混合物，呈现大量梯状条带，Marker对这些片断的指示无意义，考虑成本原因，二荧光LAMP电泳时不需要使用Marker。

电泳结果通过荧光检测仪的520荧光通道、670荧光通道或520/670双通道检测结果。

若临床检测中只需要检测阳性不合格样品不需要区分这两种病原，可以使用加染料后，凭肉眼观察颜色变化的方法判断结果。染料我们推荐使用钙黄绿素为指示剂，将300μM氯化锰与25μM钙黄绿素按1：10混匀为荧光染料工作液，每个反应管取1μL荧光染料工作液加入反应试剂一起反应，避免开盖污染。

实施例2、方法的验证实验

(一)特异性实验

1)菌株与毒株

3株产肠毒大肠杆菌(ETEC)，8株牛轮状病毒(BRV)广西分离株，3株牛支原体广西分离株由广西兽医研究所分离获得，2株牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)，3株牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，2株牛轮状病毒(BRV)参考毒株购自中国兽药监察所，口蹄疫(FMDV)灭活疫苗A型、O型、Asia 1型购自兰州兽医研究所，口蹄疫灭活病毒O型、A型、Asia 1型，水泡性口炎(VSV)灭活病毒新泽西型(NJ型)和印第安型(IND型)，蓝舌病(BTV)灭活病毒(4型，8型，9型，15型，17型，18型)，小反刍兽疫(PPRV)灭活病毒由云南出入境惠赠。

2)采用实施例1已经建立好的多重荧光LAMP方法分别以ETEC，BRV，FMDV(A、O和Asina 1型)，VSV(NJ型，IND型)，BTV(4型，8型，9型，15型，17型，18型)，PPRV，BVDV的cDNA，以及MB，IBRV的DNA为模板，用多重荧光LAMP检测，验证其特异性。

3)实验结果

用实施例1建立的多重荧光LAMP方法对表2的毒株和菌株进行扩增，仅ETEC和BRV有扩增，而FMDV，VSV，BVDV，MB，IBRV，PPRV，BTV检测结果均为阴性，检测结果见表2和图1。表2中，GVRI为广西兽医研究所，YNCIQ为云南出入境检疫检测局；CVCC为中国兽药监察所。

表2

(二)敏感性实验

1)标准品的制备

将BRV外引物(BRV-B3，BRV-F3)PCR扩增产物克隆到pGM-T载体(天根，北京)，制备pGM-T-BRV重组质粒，参照T7体外转录试剂盒(Fermentas)说明书将pGM-T-BRV体外转录为RNA。将ETEC外引物(ETEC-LTⅠ-F3,ETEC-LTⅠ-B3,ETEC-STa-F3,ETEC-STa-B3)PCR扩增产物克隆到PMD-18T载体，制备PMD-18T-LTⅠ和PMD-18T-STa重组质粒，用试剂盒提取阳性重组菌的质粒。经NanoDrop 2000核酸测定仪测定质粒和反转录RNA的浓度，根据根据阿弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数，-70℃保存备用。拷贝数(copies/μL)＝质粒浓度(g/μL)×10^-9×6.02×10²³/660×2692(质粒总长度)。

将计算好拷贝数的BRV反转录RNA，PMD-18T-LTⅠ和PMD-18T-STa重组质粒作10倍速梯度稀释，终浓度为1×10⁸～1拷贝/μL，共8个梯度，再将三种重组质粒等体积混合，制备成标准品，用多重荧光LAMP检测，验证其敏感性。

2)将上述制备好的混合质粒标准品作为模板，利用实施例1优化好的多重荧光LAMP反应体系进行敏感性实验。

3)实验结果

实时浊度仪结果见图2。将多重荧光LAMP产物进行2％琼脂糖电泳，结果如图3所示，特异性目的条带亮度随模板拷贝数梯度的降低而下降。由图2和图3所示结果评估，多重LAMP检测体系的灵敏度可达100拷贝/μL，该方法灵敏度高。

(三)干扰性实验

将上述制备的BRV反转录RNA，PMD-18T-LTⅠ和PMD-18T-STa标准样品按不同浓度进行组合，制备不同浓度模拟混合感染样品：样品1：BRV(10⁸copies/μL)+LTⅠ(10⁴copies/μL)，样品2：BRV(10⁴copies/μL)+STa(10⁸copies/μL)，样品3：BRV(10⁷copies/μL)+LTⅠ(10³copies/μL)，样品4：BRV(10⁴copies/μL)+STa(10⁷copies/μL)，样品5：BRV(10⁶copies/μL)+STa(10²copies/μL)，用实施例1优化好的多重荧光LAMP检测方法检测，确定高浓度模板是否会抑制低浓度模板的扩增。

检测结果见图4，对不同浓度模拟混合感染样品的检测发现，当一个模板浓度高而另一个模板浓度较低时，多重荧光LAMP仍然可同时检测到两个模板，不影响彼此扩增效率，干扰性小。

(四)临床样品的检测

2016年至2017年间，在广西各地牛场采集56份粪便拭子，样品均采自1月龄以下腹泻犊牛。粪便拭子用PBS洗脱，进行核酸抽提，制备cDNA或DNA模板，应用实施例1已建立好的多重荧光LAMP方法进行检测，同时参照文献用BRV荧光PCR和ETEC常规PCR进行检测，评估多重荧光LAMP的临床检测效果。

检测结果见表3。牛轮状病毒阳性样品8份，感染率为14.3％；产肠毒大肠杆菌阳性样品32份的感染率为57.1％；牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌混合感染样品5份，混合感染率为8.9％；与荧光定量PCR检测方法相比，检测BRV的敏感性和特异性分别为100％(8/8)、100％(43/43)，检测ETEC的敏感性和特异性分别为100％(32/32)、100％(19/19)。结果表明多重荧光LAMP临床检测效果好。

表3

本研究设计了两套引物，优化引物组合及反应条件，成功建立了在同一反应管里鉴别诊断牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌的多重荧光LAMP检测方法。该特异性好，能高效扩增目的基因，而对其它病原核酸无反应；敏感性好，每个反应最低能检测到100个混合模板拷贝。综上所述，本发明所建立的BRV和ETEC多重荧光LAMP方法是一种快速，简便，成本低的诊断方法，适用于犊牛大规模的流行病学调查。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 一种鉴别牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌的引物及方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatcagtact tgccgacg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catttgacaa gcatgcttct 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctggtccaac tggtatcgcg aaacaatgct agcaagtgtg 40

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttccaccagg tatgaattgg actcactgta aatacacgct gc 42

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtgctgact ctagaccccc a 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtattccac ctaacgcaga aac 23

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtttgtgtt cctctcgcgt cgttccggag gtcttatgcc 40

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaagtgctca cttagcagga cagtcgaagt gctcacttag caggacagtc 50

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgctcgtatt gactggtctg gt 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccaccatta gacggagcgc 20

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcaccaccag acccatttcc ggataccata tgactttgcg cg 42

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggctgaata cactcacact tctgagtcat ttaactattc agcccagc 48

Claims

1.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括：

1)序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID№：2所示核苷酸序列；

3)序列表中SEQ ID№：3所示核苷酸序列；

4)序列表中SEQ ID№：4所示核苷酸序列；

5)序列表中SEQ ID№：5所示核苷酸序列；

6)序列表中SEQ ID№：6所示核苷酸序列；

7)序列表中SEQ ID№：7所示核苷酸序列；

8)序列表中SEQ ID№：8所示核苷酸序列；

9)序列表中SEQ ID№：9所示核苷酸序列；

10)序列表中SEQ ID№：10所示核苷酸序列；

11)序列表中SEQ ID№：11所示核苷酸序列；

12)序列表中SEQ ID№：12所示核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述序列表中SEQ ID№：3所示核苷酸序列、SEQ ID№：7所示核苷酸序列、SEQ ID№：11所示核苷酸序列的5’端标记有荧光基团。

3.根据权利要求1或2任一所述的引物组合物，其特征在于，所述序列表中SEQ ID№：3所示核苷酸序列的5’端标记有FITC荧光基团、SEQ ID№：7所示核苷酸序列的5’端标记有CY5.5荧光基团、SEQ ID№：11所示核苷酸序列的5’端标记有CY5.5荧光基团。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一所述的引物组合物。