CN108913790B

CN108913790B - 一种检测贝氏柯克斯体的重组酶聚合酶恒温扩增方法、专用引物和探针及应用

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Publication number: CN108913790B
Application number: CN201710850526.2A
Authority: CN
Inventors: 李越希; 齐永; 尹琼; 邵银秀; 王长军; 李素琴; 陈红霞; 李佳萌; 沈万鹏; 饶继先; 曹勇平; 徐亭亭; 操敏
Original assignee: Individual
Current assignee: Eastern Theater Disease Prevention And Control Center Of Pla
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2037-09-20
Also published as: CN108913790A

Abstract

本发明提供了用于检测贝氏柯克斯体的RPA检测方法，其专用引物、探针及其在贝氏柯克斯体检测中的用途。所述检测方法、其专用引物和探针及基于贝氏柯克斯体23S rRNA基因保守序列设计，具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列。本发明首次将新型恒温扩增技术RPA应用于贝氏柯克斯体的检测中，该方法模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合，包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，对DNA模板进行扩增，可在25‑43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。本发明具有高灵敏度、高特异性，且对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理、适合现场检测等优点，适于推广应用。

Description

一种检测贝氏柯克斯体的重组酶聚合酶恒温扩增方法、专用引物和探针及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及贝氏柯克斯体的分子生物学及其检测方法和用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增技术（RPA技术）快速检测贝氏柯克斯体的方法、其专用引物和探针及其用途。

背景技术

贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii，Cb），俗称Q热立克次体，为Q热的病原体，是一类严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，贝氏柯克斯体对外界环境抵抗力强、存活时间长，人类和动物普遍易感，且可通过气溶胶广泛传播，是高致死性的病原体之一。贝氏柯克斯体可引发人类急、慢性Q热，主要通过呼吸道进入体内引起人和动物感染，仅吸入少量贝氏柯克斯体就可致病，感染的家畜牛、羊为主要传染源，猫、狗等宠物和啮齿动物鼠及节肢动物蜱、螨等均可传播该病。第二次世界大战期间该病曾多次暴发流行，目前Q热已成为世界上分布最广的人兽共患病之一。

Q热临床表现为发热、头痛、肌肉酸痛，无特异性，与其他呼吸道感染难以区分，误诊和漏诊情况严重。目前，对贝氏柯克斯体的检测方法主要包括平板分离培养法、血清学技术、荧光定量PCR法。但是，这些方法存在成本较高、需要特定设备、耗时且需对样品进行复杂处理等缺陷，导致它们的实际应用范围严重受限。建立一种简单、快速、适合现场应用的贝氏柯克斯体的检测方法有重要意义。

近年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，其中英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶恒温扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）被誉为是可替代PCR的核酸检测技术，其是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，可在25 - 43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一组用于快速检测贝氏柯克斯体的特异性引物和探针，以及一种能快速、简便、特异的检测贝氏柯克斯体的检测方法。

因此本发明的第一个目的是提供用于检测贝氏柯克斯体的引物，包括正向引物和反向引物，共两条。所述引物是根据贝氏柯克斯体的保守基因23S rRNA（GeneBank：NR_076084）设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了贝氏柯克斯体23S rRNA基因的保守区：第2347位到第3388位核苷酸序列，此区域含有1042个碱基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

优选的引物长度为30bp以上。

所述引物包括正向引物cbF399和反向引物cbR564，共两条，分别具有如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列，分别为贝氏柯克斯体的保守基因23S rRNA（GeneBank：NR_076084）的第2745到2774位核苷酸序列和第2881到2910位核苷酸序列，其中反向引物5’端标记生物素（Biotin）。正向引物和反向引物扩增完成后获得的双链DNA将标记有生物素。

一种用于检测贝氏柯克斯体的RPA专用引物，是根据贝氏柯克斯体23S rRNA基因（GeneBank：NR_076084）保守序列设计的，所述贝氏柯克斯体23S rRNA基因保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.1：

AATTAACCGTTGTAGTTACGTAAATAAACTTGGCTATATGCTGGAAACTCCGAGTATCCTCCAGTACTCATCTCAACTAAAATTGAGGTAGTAAAAATCTGCGAGGTGCGGACAATCAGCAGGAAAGACTAATCTTTTTGATTAGAATCCTCAGAGACTAATACGCCGAGCGTACTTAGAAAAAATCCATTCTAAGTGTGATGATAGAGTCCGATCTCTATAGCGATATAGAGGGTTTTCAAAAGAAACCTGTTAATCATTATCCCATGATTAACATAACGTCAATAAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGGTAAAAAATTGCCCCGCTAAACTGTAAAGTTTAGTGATAAAGTCAGCTCATATCGGGGGAACCCTCCTGCTTTTTAGCAAAGGGCAATCCCGAGGGAAGTCTTAAATGACCCCGTAACGACTGATCCGAAAGGTGAGGCACGCATTTGTGTGCAATACGCTGACTTCTTGCCCTTGGGTTTATACTCAAGAAGTAAGTGACTATGGAGAATTTATTTATGTATTTACATTTAGAGCCATGGTATGTAAGTGGTTTAACAGAAGGAGAAGGGTGTTTTTCGATATCATTTAACTTCAGAAAAAAGTTAAAAATTGGTATTGAAACAAGACCATCTTTTTCCATCACGTTAAATCAAAGAGATTTACCTCTCTTAAAAGAGATACATTCGTTTTTTGAATGTGGAGCAATTAGATTTTCACGAGGGGATCGTACGTATAAATATGAAGTCCGTTCCGTAAAAGATCTTGTGAAGCGAATAATTCCACACTTCGATAACTATCCTCTTAGAGGAGGTAAACAAAAAGATTTTCGATATTTTTCTGAAATCTGTAAAAAAATACATACCAATTTTCATTTAAATAAACAACATTTAATTGAAATAATAAAAATGGCTTATCTGATGAATCCATCAGGTAAACGTAGGCATGAAATAAATGATCTCCTAAGGTTGCTTGGTGAGAAAATGGTATAGTCTACTCCCTATGGAAACATAGGAAAGAGTGA。

所述引物中的正向引物具有SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有SEQID NO.3所示的寡核苷酸序列，且5’端标记生物素Biotin。

SEQ ID NO.2： 5’ AAGGGCAATCCCGAGGGAAGTCTTAAATGA 3’

SEQ ID NO.3： 5’ CATACCATGGCTCTAAATGTAAATACATAA 3’。

一种用于检测贝氏柯克斯体的RPA探针，是根据贝氏柯克斯体23S rRNA基因（GeneBank：NR_076084）保守序列设计的，所述贝氏柯克斯体23S rRNA基因保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该探针为贝氏柯克斯体的保守基因23S rRNA（GeneBank：NR_076084）的第2754到2799位核苷酸序列，具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素，3’端添加延伸阻断基团，在第30-31位碱基之间增加一个四氢呋喃（THF）。

SEQ ID NO.4：

5’ CCCGAGGGAAGTCTTAAATGACCCCGTAACACTGATCCGAAAGGT 3’。

所述探针由荧光素、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团几部分组成。

所述的荧光素为羧基荧光素FAM或FITC等其他荧光素，所述的延伸阻断基团为磷酸基团或其他阻断基团。

一种用于检测贝氏柯克斯体的RPA方法，包括使用引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和探针SEQ ID NO.4。

所述用于贝氏柯克斯体快速检测的RPA检测方法中用于50μL的RPA反应体系的试剂，所述的正向引物的浓度为10μmol/L，反向引物的浓度为5μmol/L，所述的探针的浓度为5μmol/L，镁离子浓度为280μmol/L，模板加样量为1μL；将2.1μL正向引物、2.1μL反向引物、0.6μL探针、1μL样品、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中，然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上；将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃ 扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增，检测时加样量为5μL，试纸条显色时间控制在3 - 5min。

本发明的第二个目的是提供用于检测贝氏柯克斯体的探针。所述探针是根据贝氏柯克斯体的保守基因23S rRNA设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了贝氏柯克斯体23S rRNA基因的保守区，此区域含有1042个碱基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述探针由荧光素（如羧基荧光素FAM）、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（如磷酸基团）几部分组成。

所述探针的长度为所述探针的长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp。

优选地，所述探针具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），在第30-31位碱基之间增加一个四氢呋喃（THF）。所述探针与扩增后的标记有生物素的DNA退火，RPA系统中的nfo酶将在THF部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得FAM和Biotin双标记的扩增产物。

本发明的第三个目的是提供了用于贝氏柯克斯体快速检测的RPA检测方法，所述方法采用上述的RPA引物和探针进行扩增，并结合侧向层析核酸检测试纸条，进行可视化判断。

本发明所述的用于贝氏柯克斯体快速检测的RPA检测方法，包括以下步骤：

（1）以待测样品基因组DNA为模板，在所述引物组和探针的标记下进行RPA反应；

（2）结果判断：用上述侧向层析核酸检测试纸条对RPA产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。

本发明所述用于贝氏柯克斯体快速检测的RPA检测方法，具体步骤如下：

（1）扩增试剂准备和加样：将10μmol/L正向引物2.1μL、5μmol/L反向引物2.1μL、5μmol/L探针0.6μL、1μL样品、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中。然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。

（2）扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃ 扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。

（3）结果判断：取5μL的RPA扩增产物用PBST稀释至100μL，用上述胶体金横向流动试纸条对回收后的RPA产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。

本发明用于贝氏柯克斯体快速检测的RPA检测方法，对贝氏柯克斯体的特异性保守靶序列，即贝氏柯克斯体23S rRNA的保守序列进行检测，该序列可作为贝氏柯克斯体的标志基因之一。

本发明用于贝氏柯克斯体快速检测的RPA检测方法，节约了了贝氏柯克斯体的检测时间，检测可在37℃ 下20min内完成扩增，整个检测过程可在1小时内完成，与常规PCR和实时荧光定量PCR需要数小时相比极大地缩短了检测时间。

本发明用于贝氏柯克斯体快速检测的RPA检测方法，降低了反应温度，RPA只需要恒温37℃ 即可完成实验，该温度远远低于荧光定量PCR的60 - 95℃ 以及LAMP的63℃ 。

本发明的用于贝氏柯克斯体快速检测的RPA检测方法，更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要的东西可冻干保存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，且样品不需要进行复杂反应。

本发明用于贝氏柯克斯体快速检测的RPA检测方法，灵敏性高，特异性强。可用于现场或床旁检测，具有广阔的应用前景。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明：

图1显示RPA检测体系最优引物组合筛选中不同引物组合的检测结果，每组组合均设置一组阴性对照，试验结果如图所示，NC代表阴性对照；（A）1-6组及其各组的阴性对照；（B）7-12组及其各组的阴性对照；（C）13-16、阳性对照及其各组的阴性对照。

图2为确定检测贝氏柯克斯体RPA检测方法的最佳反向引物和探针组合浓度。设定反向引物的浓度梯度为10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L，探针的浓度为5μmol/L、2.5μmol/L，将三种浓度的反向引物分别与两种浓度的探针进行组合，组合成6组组合，组合编号见表3，每组组合均设置一组阴性对照，试验结果如图所示，样品顺序：1- 6，上为1- 6号的阴性对照，下为1- 6号样品。

图3为确定检测贝氏柯克斯体RPA检测方法的最佳加样量。设定加样量为1μL、2μL、5μL，且分别为每一组样品设置了一个阴性对照，试验结果如图所示，NC代表阴性对照。

图4为确定检测贝氏柯克斯体RPA检测方法的最佳扩增时间。设定扩增时间为10min、15min、20min，且分别为每一组扩增时间的样品设置了一个阴性对照，试验结果如图所示，NC代表阴性对照。

图5为检测贝氏柯克斯体 RPA方法的灵敏度，将合成的阳性质粒进行定量，并以十倍倍比稀释的方式稀释出浓度为10⁴-10⁰copies/μL的质粒DNA作为模板进行试验，试验条件为上述的最佳试验条件，试验结果如图所示，NC代表阴性对照。

图6为检测贝氏柯克斯体 RPA方法的的特异性，分别用立氏立克次体、恙虫东方体、黑龙江立克次体斑点热、西伯利亚立克次体斑疹热、金黄色葡萄球菌、猪链球菌的基因组DNA和人全血DNA作为模板进行试验，试验结果如图所示。

图7为检测贝氏柯克斯体基因组DNA的RPA方法的灵敏度，试验结果如图所示，样品顺序：阴性对照NC，1-5号样品；1未定量出，2-5分别含6.7 copies/μL、51.4 copies/μL、1001.8 copies/μL、14525.5 copies/μL的检测贝氏柯克斯体基因组DNA，1-5的样品由荧光定量PCR法定量。

具体实施方式

下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook 等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用RPA引物和探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，qPCR引物和探针上海生工生物技术有限公司合成，所有序列测定工作均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1、贝氏柯克斯体引物和探针的设计及筛选

（1）引物和探针的设计

发明人通过文件检索，分析确定本发明使用贝氏柯克斯体的23S rRNA基因中的特异性序列为目标基因。从NCBI数据库中获得已知的模板基因序列，即SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，并由南京金斯瑞生物科技有限公司对上述序列进行合成，作为阳性质粒，在后续引物探针筛选、反应体系的优化等过程中作为模板使用。根据RPA引物及探针设计原则，设计8条引物及1条探针，如表1所示。

表1引物及探针

（2）引物筛选

人工合成含有贝氏柯克斯体的23S rRNA基因的SEQ ID NO.1所示的序列的阳性质粒，以此质粒为模板，将引物与探针进行全面组合成16组引物组合，组合编号如表2所示。16组引物组合分别进行在37℃ 条件下进行RPA扩增，以侧向层析核酸检测试纸条检测线显出情况为指标，筛选出在37℃ 条件下，扩增效率最高的引物探针组合，用于后续RPA检测的评价和应用。

筛选用的50μL的RPA反应体系如下：将10μmol/L正向引物2.1μL、10μmol/L反向引物2.1μL、5μmol/L探针0.6μL、3.3×10¹⁰copies/μL模板1μL、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp® nfo反应管中。然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，考虑到RPA反应灵敏度较高，易出现假阳性的情况，发明者为每一组引物探针组合均设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。发明者还设置了一组阳性对照，阳性对照由TwistAmp® RPA nfo试剂盒内提供，同时还为阳性对照设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃ 扩增20min，在反正第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。结果判断：取5μL的RPA扩增产物用PBST稀释至100μL，再用上述胶体金横向流动试纸条对RPA产物进行检测。每个反应设置一个复孔。

表2引物探针组合编号

编号	组合	编号	组合
				1	Cbf310+Cbr484	9	Cbf370+Cbr484
2	Cbf310+Cbr507	10	Cbf370+Cbr507
				3	Cbf310+Cbr533	11	Cbf370+Cbr533
4	Cbf310+Cbr564	12	Cbf370+Cbr564
				5	Cbf340+Cbr484	13	Cbf399+Cbr484
6	Cbf340+Cbr507	14	Cbf399+Cbr507
				7	Cbf340+Cbr533	15	Cbf399+Cbr533
8	Cbf340+Cbr564	16	Cbf399+Cbr564

16组引物组合的胶体金检测结果见图1。图1分A、B、C，是检测时间为5min时16组探针探针组合、阳性对照及其相对应的阴性对照的胶体金横向流动试纸条的检测线和质控线的显示情况。

本发明确定的引物组合包括：正向引物Cbf399和反向引物Cbr564，共两条，分别具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列。

（3）探针的确定

表1列出的cbprobe408探针为本发明优选，探针由荧光素（如羧基荧光素FAM）、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（如磷酸基团）几部分组成。探针的长度为45 - 60bp，其中5’端至少30bp，3’端至少15bp。

探针具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），在第30-31位碱基之间增加一个四氢呋喃（THF）。所述探针与扩增后的标记有生物素的DNA退火，RPA系统中的nfo酶将在THF部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得FAM和Biotin双标记的扩增产物。

实施例2：RPA反应体系、扩增和检测条件的优化

在引物筛选的过程中，胶体金横向流动试纸条在检测是仍存在假阳性的情况，因此需对RPA反应体系、扩增和检测条件进行优化

（1）引物探针浓度

设定反向引物的浓度梯度为10 μmol/L、5 μmol/L、2.5 μmol/L，探针的浓度为5 μmol/L、2.5 μmol/L，将三种浓度的反向引物分别与两种浓度的探针进行组合，组合成6组组合，每组组合均设置一组阴性对照。分别进行在37℃ 条件下进行RPA扩增，扩增完毕使用PCR产物回收试剂盒对产物进行回收，以胶体金横向流动试纸条检测线显出情况为指标。筛选出扩增效果最好，且不出现假阳性的组合。

表3 反向引物浓度和探针浓度组合编号

编号	组合	编号	组合
				1	10μM Cbr564 + 5μM cbprobe408	4	10μM Cbr564 + 2.5μM cbprobe408
2	5μM Cbr564 + 5μM cbprobe408	5	5μM Cbr564 + 2.5μM cbprobe408
				3	2.5μM Cbr564+ 5μM cbprobe408	6	2.5μM Cbr564 + 2.5μM cbprobe408

通过对胶体金横向流动试纸条检测结果分析，本发明确定的反向引物的浓度为5μmol/L、探针的浓度为5 μmol/L。

（2）加样量

调整反应体系：将10μmol/L正向引物2.1μL、5μmol/L反向引物2.1μL、5 μmol/L探针0.6μL、1×10⁴copies/μL模板1μL、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp® nfo反应管中。然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃ 扩增20min，在反正第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。扩增完毕使用PCR产物回收试剂盒对产物进行回收，再用上述胶体金横向流动试纸条对RPA产物进行检测。检测时设定加样量为1μL、2μL、5μL，每一组均设置了一组阴性对照。

通过对胶体金横向流动试纸条检测结果分析，1μL、2μL、5μL的加样量均未出现假阳性的情况，但1μL和2μL的加样量样品检测线条带较浅，考虑到后续灵敏度试验，本发明确定的加样量为5μL。

（3）扩增时间

50μL的RPA反应体系如下：将10 μmol/L正向引物2.1μL、5 μmol/L反向引物2.1μL、5 μmol/L探针0.6μL、1×10⁴copies/μL模板1μL、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp® nfo反应管中。然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增10min，15min，20min，均在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。发明者为每一组分别设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。结果判断：取5μL的RPA扩增产物用PBST稀释至100μL，再用上述胶体金横向流动试纸条对RPA产物进行检测。

通过对胶体金横向流动试纸条检测结果分析，10min和15min的扩增时间样品检测线条带较浅，考虑到后续灵敏度试验，本发明确定的扩增时间为20min。

综上，通过RPA反应体系、扩增和检测条件进行优化，本发现确定在使用10μM浓度的正向引物、5μM浓度的反向引物和5μM浓度的探针扩增20min，加样量为5μL，试纸条显色时间控制在3 - 5min时，检测效果最好。

实施例3：RPA检测的灵敏度评价

将cb阳性质粒按10倍比稀释成10⁴到1个/μL等一系列不同浓度，各取1μL分别加入实施例2所确定的反应体系，利用筛选出的引物组合，采用实施例2确定的扩增和检测条件对上述不同拷贝数的模板进行RPA检测，观察RPA检测的灵敏度。

结果，从10个/μL拷贝数开始以上样品均呈阳性，说明本发明RPA检测方法的灵敏度达到10个拷贝/μL。

实施例4：RPA检测的特异性评价

特异性评价以立氏立克次体、恙虫东病方体、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、猪链球菌的基因组DNA和人全血DNA为对照，以确定本发明RPA检测方法的特异性。

分别以贝氏柯克斯体、立氏立克次体、恙虫东方体、黑龙江立克次体斑点、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、猪链球菌基因组DNA和人全血DNA为模板，采用如下反应体系：将10μmol/L正向引物2.1μL、5μmol/L反向引物2.1μL、5μmol/L探针0.6μL、1μL样品、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中。然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃ 扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀。结果判断：取5μL的RPA扩增产物用PBST稀释至100μL，用上述胶体金横向流动试纸条对回收后的RPA产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。

结果见图6：立氏立克次体、恙虫东方体、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、猪链球菌的基因组DNA和人全血DNA样品检测线均为出现条带，呈阴性，只有贝氏柯克斯体样品检测线出现清晰条带，呈阳性，说明本发明RPA检测方法对贝氏柯克斯体有很强的特异性。

实施例5：RPA检测贝氏柯克斯体基因组DNA的灵敏度评价

本发明采用荧光定量PCR对不同稀释浓度的贝氏柯克斯体基因组DNA进行定量，各取1μL作为模板分别加入实施例2所确定的反应体系，利用筛选出的引物组合，采用实施例2确定的扩增和检测条件对上述不同拷贝数的模板进行RPA检测，观察RPA检测贝氏柯克斯体基因组DNA的灵敏度，同时将不同浓度的贝氏柯克斯体基因组DNA分别进行荧光定量PCR确定基因组拷贝数。

所用荧光定量PCR方法参考张晶波等[1]方法：

（1）荧光定量PCR的引物探针

引物Fp 5’-CGGCTGAATTTAAGCGATTTATTTTT-3’

引物Rp 5’-CGTAACCACACACGCATCTCA-3’

探针TaqMan MGB-probe 5’-CGGAACCCATTGCAA -3’

（2）荧光定量PCR反应体系

采用25μL反应体系：每个反应中含12.5μL通用PCR反应混合物TaqMan UniversalPCR Master Mix；5μL引物和探针混合物（100μL混合物中含50μM引物Fp和Rp各3μL，50μM探针2μL，去离子水92μL），5.5μL去离子水，2μLDNA模板。反应条件为50℃ 2min，95℃ 10min，后进行40次循环，循环参数为95℃ 15s，60℃ 1min；

（3）荧光定量PCR标准曲线的建立

稀释的贝氏柯克斯体标准质粒，使其拷贝数分别为10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹和1 copies/μL，将其分别加到反应体系中做荧光定量PCR。同时定量贝氏柯克斯体基因组DNA。定量出5个浓度的贝氏柯克斯体基因组DNA拷贝数分别为：未定量出， 6.7 copies/μL、51.4 copies/μL、1001.8 copies/μL、14525.5 copies/μL。

结果本发明RPA检测方法检测贝氏柯克斯体基因组DNA的检测限为6.7拷贝数/μL，与已有的荧光定量PCR的检测方法的检测限一致，说明本发明方法具有良好的灵敏度。

序列表

<110> 李佳萌

<120> 一种检测贝氏柯克斯体的重组酶聚合酶恒温扩增方法、专用引物和探针及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1042

<212> DNA

<213> 贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1042)

<400> 1

aattaaccgt tgtagttacg taaataaact tggctatatg ctggaaactc cgagtatcct 60

ccagtactca tctcaactaa aattgaggta gtaaaaatct gcgaggtgcg gacaatcagc 120

aggaaagact aatctttttg attagaatcc tcagagacta atacgccgag cgtacttaga 180

aaaaatccat tctaagtgtg atgatagagt ccgatctcta tagcgatata gagggttttc 240

aaaagaaacc tgttaatcat tatcccatga ttaacataac gtcaataaac ggtcctaagg 300

tagcgaaatt ccttgtcggg taaaaaattg ccccgctaaa ctgtaaagtt tagtgataaa 360

gtcagctcat atcgggggaa ccctcctgct ttttagcaaa gggcaatccc gagggaagtc 420

ttaaatgacc ccgtaacgac tgatccgaaa ggtgaggcac gcatttgtgt gcaatacgct 480

gacttcttgc ccttgggttt atactcaaga agtaagtgac tatggagaat ttatttatgt 540

atttacattt agagccatgg tatgtaagtg gtttaacaga aggagaaggg tgtttttcga 600

tatcatttaa cttcagaaaa aagttaaaaa ttggtattga aacaagacca tctttttcca 660

tcacgttaaa tcaaagagat ttacctctct taaaagagat acattcgttt tttgaatgtg 720

gagcaattag attttcacga ggggatcgta cgtataaata tgaagtccgt tccgtaaaag 780

atcttgtgaa gcgaataatt ccacacttcg ataactatcc tcttagagga ggtaaacaaa 840

aagattttcg atatttttct gaaatctgta aaaaaataca taccaatttt catttaaata 900

aacaacattt aattgaaata ataaaaatgg cttatctgat gaatccatca ggtaaacgta 960

ggcatgaaat aaatgatctc ctaaggttgc ttggtgagaa aatggtatag tctactccct 1020

atggaaacat aggaaagagt ga 1042

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<400> 2

aagggcaatc ccgagggaag tcttaaatga 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 5’端标记生物素

<400> 3

cataccatgg ctctaaatgt aaatacataa 30

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223> 5’端标记荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），在第30-31位碱基之间插入一个四氢呋喃（THF）

<300>

<301> 张晶波，温博海，陈梅玲，邱玲，牛东升，李丽莉

<302> 检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR

<303> 中国人兽共患病杂志

<304> 2015,21(8)

<305> 35-1284/R

<306> 652-655

<400> 4

cccgagggaa gtcttaaatg accccgtaac actgatccga aaggt 45

Claims

1. 一种用于检测贝氏柯克斯体的RPA专用引物和探针，是根据贝氏柯克斯体特异性保守序列设计的，所述贝氏柯克斯体特异性保守序列如SEQ ID NO.1所示，

SEQ ID NO.1：

AATTAACCGTTGTAGTTACGTAAATAAACTTGGCTATATGCTGGAAACTCCGAGTATCCTCCAGTACTCATCTCAACTAAAATTGAGGTAGTAAAAATCTGCGAGGTGCGGACAATCAGCAGGAAAGACTAATCTTTTTGATTAGAATCCTCAGAGACTAATACGCCGAGCGTACTTAGAAAAAATCCATTCTAAGTGTGATGATAGAGTCCGATCTCTATAGCGATATAGAGGGTTTTCAAAAGAAACCTGTTAATCATTATCCCATGATTAACATAACGTCAATAAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGGTAAAAAATTGCCCCGCTAAACTGTAAAGTTTAGTGATAAAGTCAGCTCATATCGGGGGAACCCTCCTGCTTTTTAGCAAAGGGCAATCCCGAGGGAAGTCTTAAATGACCCCGTAACGACTGATCCGAAAGGTGAGGCACGCATTTGTGTGCAATACGCTGACTTCTTGCCCTTGGGTTTATACTCAAGAAGTAAGTGACTATGGAGAATTTATTTATGTATTTACATTTAGAGCCATGGTATGTAAGTGGTTTAACAGAAGGAGAAGGGTGTTTTTCGATATCATTTAACTTCAGAAAAAAGTTAAAAATTGGTATTGAAACAAGACCATCTTTTTCCATCACGTTAAATCAAAGAGATTTACCTCTCTTAAAAGAGATACATTCGTTTTTTGAATGTGGAGCAATTAGATTTTCACGAGGGGATCGTACGTATAAATATGAAGTCCGTTCCGTAAAAGATCTTGTGAAGCGAATAATTCCACACTTCGATAACTATCCTCTTAGAGGAGGTAAACAAAAAGATTTTCGATATTTTTCTGAAATCTGTAAAAAAATACATACCAATTTTCATTTAAATAAACAACATTTAATTGAAATAATAAAAATGGCTTATCTGATGAATCCATCAGGTAAACGTAGGCATGAAATAAATGATCTCCTAAGGTTGCTTGGTGAGAAAATGGTATAGTCTACTCCCTATGGAAACATAGGAAAGAGTGA，

所述引物中的正向引物的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且反向引物5’端标记生物素，

SEQ ID NO. 2： 5’ AAGGGCAATCCCGAGGGAAGTCTTAAATGA 3’，

SEQ ID NO. 3： 5’ CATACCATGGCTCTAAATGTAAATACATAA 3’，

所述探针的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，且5’端标记荧光素，3’端添加延伸阻断基团，在第30-31位碱基之间增加一个四氢呋喃；

SEQ ID NO. 4：

5’CCCGAGGGAAGTCTTAAATGACCCCGTAACACTGATCCGAAAGGT 3’。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述的荧光素为羧基荧光素FAM或FITC，所述的延伸阻断基团为磷酸基团。

3.权利要求1-2中任一项所述的引物和探针在制备贝氏柯克斯体RPA检测试剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述检测试剂包括用于50μL的RPA反应体系的试剂，所述的正向引物的浓度为10μmol/L，反向引物的浓度为5μmol/L，所述的探针的浓度为5μmol/L，镁离子浓度为280μmol/L，模板加样量为1μL；所述RPA反应为将2.1μL正向引物、2.1μL反向引物、0.6μL探针、1μL样品、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中，然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上；将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃ 扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增，检测时加样量为5μL，试纸条显色时间控制在3 - 5min。