CN110438260A

CN110438260A - 一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒

Info

Publication number: CN110438260A
Application number: CN201910689509.4A
Authority: CN
Inventors: 王衡; 宋雪梅; 张桂红; 杨奎亮; 卢刚; 李中圣
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-07-29
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2019-11-12
Anticipated expiration: 2039-07-29
Also published as: CN110438260B

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒，其含有一种用于检测非洲猪瘟的引物组，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，上游引物标记Biotin，下游引物标记FITC。本发明通过组织裂解液直接获取病毒DNA，无需核酸抽提步骤；通过高效核酸扩增酶减少PCR反应时间；对引物进行标记，通过核酸试纸条显色方法替代核酸琼脂糖电泳显色方法。本发明建立了适合临床使用的高效、快检非洲猪瘟病毒的方法，并且与传统的琼脂糖凝胶电泳方法相比，无需任何仪器设备,操作简单，具有更高的灵敏性。

Description

一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，更具体地，涉及一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus，ASFV)引起的一种烈性、热性、高度致死性传染病。该病毒属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，可通过节肢动物进行传播，被世界动物卫生组织列为A类动物传染病，被我国列为一类动物传染病。自2018年8月，我国首次出现以来，已经累计出现疫情120余例。截止至2019年5月12日，我国仅有澳门、台湾未出现发病病例。该病已对我国生猪产业赞成巨大经济损失，采取科学的手段对其防控迫在眉睫。目前针对该病没有有效的疫苗，因此采取系统的生物安全手段加强防控十分重要，同时对猪只进行常规监测和检测亦，及时精确淘汰发病猪只亦可减少经济损失。目前主要采用分子生物方法和免疫方法对该病毒核酸及蛋白进行检测。由于在受到临床样本保存条件、运输条件和单克隆抗体特异性的制约，免疫学检测方法的灵敏性受到大大的影响。常用的分子生物方法主要有荧光定量PCR检测方法、常规PCR检测方法及核酸等温扩增检测方法。其中荧光定量PCR方法一次性投入高，单次检测成本高；等温扩增方法易污染，需配合DNA抽提步骤，耗时久；而常规PCR方法存在结果展示步骤繁琐的缺点。

因此目前缺乏一种适合屠宰场、生猪养殖场等非专业临床检测实验室使用的快速、便捷的非洲猪瘟病毒检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测非洲猪瘟的引物组。

本发明的第二个目的是提供所述引物组在制备非洲猪瘟检测试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种检测非洲猪瘟的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种用于检测非洲猪瘟的引物组，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述的上游引物标记Biotin，下游引物标记FITC。

所述引物组在制备非洲猪瘟检测试剂盒中的应用。

优选地，所述的试剂盒含有任一所述的引物组。

优选地，所述的试剂盒为核酸试纸条试剂盒。

优选地，所述的试剂盒还含有PCR扩增试剂。

优选地，所述PCR扩增试剂为2×PCR Buffer、2mM dNTPs、1U/μL的Marathon DNA聚合酶和超纯水。

优选地，PCR扩增的体系为：2×PCR Buffer 25μL，2mM dNTPs 10μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，1U/μL Marathon DNA聚合酶1μL，模板2μL，补超纯水至50μL。

优选地，PCR扩增的程序为：94℃预变性2分钟；98℃变性10秒，60～63℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环。

优选地，退火温度为60℃或63℃。

最优选地，一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒，包括以下组分：PCR扩增引物、PCR扩增试剂、试纸条；

其中，PCR扩增引物的浓度为10μM，PCR扩增上游引物序列为5′-GTCTCCCCGCGTCATCATTCA-3′(SEQ ID NO：1)，引物5′标记Biotin；PCR扩增下游引物序列为5′-CATGCAGAAAACCTACCTACTT-3′(SEQ ID NO：2)，引物5′标记FITC；

PCR扩增试剂为：2×PCR Buffer、2mM dNTPs、Marathon DNA聚合酶(1U/μL)和超纯水；

试纸条为：普通型一次性核酸检测试纸条，货号JY0001S。

其使用方法包括以下步骤：

1、模板提取

(1)组织

肌肉或内脏样品：首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等，每份组织用手术剪取0.05g或3mm见方的组织块于离心管内，加入180μL组织裂解液1，漩涡混合均匀后于95℃加热2分钟后，再加入20μL组织裂解液2，漩涡混合均匀。12000rpm瞬时离心，吸取2μL上清液。

(2)血清或血液

漩涡震荡后吸取2μL。

(3)呼吸道分泌物或排泄物

棉拭子沾取呼吸道分泌物或排泄物，置于装有超纯水的EP管，漩涡震荡，12000rpm瞬时离心，吸取2μL。

2、PCR反应

按照如下体系配制PCR反应液：

反应程序为：94℃预变性2分钟；98℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环。

3、结果判读

PCR反应结束后，打开PCR反应管，将试纸条的结合垫端插入PCR反应管，液面不得超过结合垫最上端，待判读区全部浸润(约需30～60秒)，将试纸平放1分钟，等待红色条带出现。根据试纸条显色情况直接读取检测结果：每个测试样品至少出现一条质控线，有或无检测线。仅在质控区C出现一条红线，表明样品中无非洲猪瘟病毒，或其拷贝数低于试剂盒最低检测限。检测区T和质控区C均出现红线，表示样品中存在非洲猪瘟病毒。无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。10分钟内观察结果，10分钟后判读无效。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过组织裂解液直接获取病毒DNA，无需核酸抽提步骤；通过高效核酸扩增酶减少PCR反应时间；对引物进行标记，通过核酸试纸条显色方法替代核酸琼脂糖电泳显色方法。本发明建立了适合临床使用的高效、快检非洲猪瘟病毒的方法，并且与传统的琼脂糖凝胶电泳方法相比，无需任何仪器设备,操作简单，具有更高的灵敏性。

附图说明

图1为不同引物及退火温度(50、53、58、60、63、65和68℃)的PCR扩增情况(M：DL2000)。

图2不同Taq酶添加1、2、3和4μL全血的PCR扩增情况(M：DL2000plus)。

图3为不同Taq酶添加1、2、3和4μL肌肉组织裂解液的PCR扩增情况(M：DL2000plus)。

图4为浓度为10μM引物添加体积为0.1、0.25、0.5、0.6和0.8μL的PCR扩增情况(M：DL2000plus)。

图5为不同PCR变性时间对试纸条检测的影响；A：10秒；B：20秒；C：30秒。

图6为不同PCR循环数对试纸条检测的影响；A：30个循环；B：33个循环。

图7为本试剂盒的具体检测流程。

图8为非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒的灵敏度及特异性试验情况；(其中阴性1～3的扩增初始模板分别为健康猪外周血、健康猪肌肉组织裂解液和超纯水)

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

试剂和仪器

dNTP、Marathon DNA聚合酶、组织裂解液1、组织裂解液2、核酸试纸条均为北京宝盈同汇生物技术有限公司产品；DL 2000 DNA Marker、-Blunt ZeroCloning Vector、Trans-T1感受态购自北京全式金生物技术有限公司；AxyPrep PCR清洁试剂盒、AxyPrep Easy-96质粒DNA小量试剂盒均购自爱思进生物技术(杭州)有限公司。NanoDrop2000超微量分光光度计购自Thermo Fisher Scientific公司；PCR仪购自杭州柏恒科技有限公司。

实施例1引物的设计与合成

一、实验方法

分析非洲猪瘟病毒不同亚型的保守区，并设计特异性扩增引物。通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST功能，对其特异性进行初步鉴定。

分别使用引物对1～5对确定感染非洲猪瘟病毒的血液样本进行扩增，引物序列如表1所示。

表1：

引物引物5′端标记Biotin，引物5′端标记FITC，修饰引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

选取经北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的“非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒”测试为非洲猪瘟病毒阳性的血液样本，按照PCR反应体系：25μL2×PCR Buffer，10μL 2mM dNTPs，0.5μL ASFV PCR扩增上游引物，0.5μL ASFVPCR扩增下游引物，1μL MarathonDNA聚合酶，全血作为PCR扩增反应模板的添加量为2μL，用超纯水补足PCR反应体积至50μL。

反应程序为：94℃预变性2分钟；98℃变性10秒，50～68℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；反应结束后4℃保存。

二、实验结果

根据扩增效果，最终确定引物对5为最佳引物组合(图1)，使用引物对5(图1，泳道5)可以扩增所有的非洲猪瘟亚型的B263R和B66L基因部分序列，该引物对在退火温度为50～63℃的条件下均可进行特异性扩增，PCR最佳退火温度可达到60℃和63℃，且PCR扩增产物浓度均较高，无非特异性扩增产物。

扩增目的片段为386bp(SEQ ID NO：3)，PCR产物经回收、连接后进行测序，重组质粒测序结果与目的片段序列完全一致。

实施例2质粒标准阳性模板的制备

1、PCR产物的纯化回收及克隆鉴定

将鉴定正确的PCR产物(SEQ ID NO：3)用AxyPrep PCR清洁试剂盒纯化回收目的片段。将目的片段连接于-Blunt Zero Cloning Vector，转化Trans-T1感受态细胞，在含Amp 100μg/μL的LB固体培养基中进行培养后，挑取阳性菌落进行单克隆培养，提取质粒进行PCR鉴定，并将阳性质粒送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

2、重组质粒浓度测定与标准样品的制备

将含有非洲猪瘟病毒B263R和B66L基因部分片段(SEQ ID NO：3)构建于pEASY-T5Zero载体上，制成重组克隆菌，测序证实为目的序列后，提取重组质粒，用于后续扩增实验。用紫外分光光度计测量重组质粒OD260、OD280及OD260/OD280值，并重复3次，确定质粒DNA浓度和纯度，计算拷贝数并稀释至1×10⁸拷贝/μL，–20℃保存备用。

拷贝数＝质粒浓度×6.02×10²³/(660×质粒总长度)。

将已定值的重组质粒稀释至1×10⁵拷贝/μL，再10倍系列稀释，获得1×10¹拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10⁵拷贝/μL稀释液为后续扩增模板，保存备用。

实施例3检测体系的建立

一、Taq酶及扩增模板最适添加体积的确定

1、实验方法

比较不同Taq酶添加1μL、2μL、3μL和4μL全血或组织裂解液的扩增情况，确定最适的Taq酶。其中2×Omega PCR Mix(BT0013)(北京，北京宝盈同汇生物技术有限公司)按照如下体系配制PCR反应液：

Omega DNA Polymerase(BT0014)(北京，北京宝盈同汇生物技术有限公司)按照如下体系配制PCR反应液：

Marathon DNA聚合酶(BT0016)(北京，北京宝盈同汇生物技术有限公司)按照如下体系配制PCR反应液：

2、实验结果

为缩短检测时间，在不提取基因组的前提下确保最高的PCR扩增得率，比较了不同Taq酶添加1μL、2μL、3μL和4μL全血或组织裂解液的扩增情况。

试验结果显示，以全血为PCR扩增反应的模板，模板添加体积相同的条件下，Marathon DNA聚合酶表现最佳，不同添加体积均显示了相同的产物亮度(图2)；以组织裂解液为PCR扩增反应的模板，仅有MarathonDNA聚合酶可稳定扩增，且组织裂解液模板量为1μL和2μL的扩增产物明显高于组织裂解液模板量为3μL和4μL的扩增产物(图3)。

结合Marathon DNA聚合酶对不同体积全血和肌肉组织裂解液的扩增情况，确定Marathon DNA聚合酶为后续PCR扩增使用的Taq酶，且全血、血清或组织裂解液等模板的添加体积为每50μL PCR反应体系添加2μL。

二、PCR扩增引物最适添加体积的确定

1、实验方法

使用Marathon DNA聚合酶，以1×10⁵拷贝/μL质粒标准阳性模板稀释液作为模板(质粒标准阳性模板来自本专利实施例2)，比较浓度为10μM上、下游引物添加量分别为0.1、0.25、0.5、0.6和0.8μL的扩增情况，确定最适的引物添加量。

其中Marathon DNA聚合酶按照如下体系配制PCR反应液：

2、实验结果

使用Marathon DNA聚合酶，以1×10⁵拷贝/μL质粒标准阳性模板稀释液作为模板，比较浓度为10μM上、下游引物添加量分别为0.1、0.25、0.5、0.6和0.8μL的扩增情况，确定最适的引物添加量。试验结果显示，浓度为10μM上、下游引物各添加0.1μL时无明显扩增条带，各添加0.25μL时仅有微弱的扩增条带，各添加0.5μL时有明显的扩增条带，但产物量明显少于各添加0.6μL和各添加0.8μL的扩增产物量(图4)。

同等扩增条件，以未感染非洲猪瘟病毒的健康猪的全血、组织裂解液，及超纯水作为阴性对照进行扩增，试纸条的检测结果浓度为10μM上游引物和下游引物各添加0.5μL的扩增产物显示为阴性，而浓度为10μM上游引物和下游引物各添加0.6和0.8μL扩增产物试纸条的检测结果均呈现弱阳性，因此提高引物虽然有助于增加扩增产物的得率，但也容易引发因引物二聚体造成试纸条检测结果的假阳性，最终确定的10μM上、下游引物的最适添加体积均为0.5μL。

三、PCR反应变性时间的确定

1、实验方法

使用Marathon DNA聚合酶，以1×10⁰～拷贝/μL质粒标准阳性模板稀释液作为模板，比较PCR扩增变性时间长度为10～30秒，试纸条的检测情况。

按照如下体系配制PCR反应液：

反应程序为：94℃预变性2分钟；98℃变性10～30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，33个循环；反应结束后4℃保存。比较使用Marathon DNA聚合酶，PCR扩增变性时间从10～30秒时，试纸条检测情况的差异。

2、实验结果

使用Marathon DNA聚合酶，比较PCR扩增变性时间长度为10～30秒，试纸条的检测情况。试纸条检测结果显示，缩短反应程序中98℃的变性时间对检测结果并没有影响，不影响结果的判读，3个不同的98℃的变性时间最低检测水平均为1×10¹拷贝/μL，且阴性对照不显示T线(图5)，据此，确定最适PCR反应程序中98℃的为10秒。

四、PCR反应扩增循环数的确定

1、实验方法

使用Marathon DNA聚合酶，以实施例2制备的质粒标准阳性模板为PCR模板，比较PCR扩增循环数为30个和33个时，试纸条的检测情况。

按照如下体系配制PCR反应液：

反应程序为：94℃预变性2分钟；98℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30或33个循环；反应结束后4℃保存。以实施例3制备的质粒标准阳性模板为PCR模板，比较使用Marathon DNA聚合酶，PCR扩增循环数为30个和33个时，试纸条检测情况的差异。

2、实验结果

试纸条检测结果显示，PCR扩增模板起始拷贝数为1×10¹拷贝/μL和1×10²拷贝/μL情况下，PCR反应循环数为30个时试纸条T线的显色时间与33个循环一致，仅T线的显色程度比33个循环的稍浅，但不影响结果的判读，最低检测水平均为1×10¹拷贝/μL，且阴性对照不显示T线(图6)，据此，确定最适PCR反应程序的循环数为30个。

实施例4一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒

一、组成

PCR扩增引物、PCR扩增试剂、试纸条；

其中，PCR扩增引物的浓度为10μM，PCR扩增上游引物序列为5′-GTCTCCCCGCGTCATCATTCA-3′(SEQ ID NO：1)，引物标记Biotin；PCR扩增下游引物序列为5′-CATGCAGAAAACCTACCTACTT-3′(SEQ ID NO：2)，标记FITC；

试纸条为：普通型一次性核酸检测试纸条，货号JY0001S。

二、使用方法

1、模板提取

(1)组织

肌肉或内脏样品：首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等。每份组织用手术剪取0.05g或3mm见方的组织块于离心管内，加入180μL组织裂解液1，漩涡混合均匀后于95℃加热2分钟后，再加入20μL组织裂解液2，漩涡混合均匀。12000rpm瞬时离心，吸取2μL上清液。

(2)血清或血液

漩涡震荡后吸取2μL。

(3)呼吸道分泌物或排泄物

棉拭子沾取呼吸道分泌物或排泄物，置于装有超纯水的EP管，漩涡震荡，12000rpm离心2min，吸取2μL。

2、PCR反应

按照如下体系配制PCR反应液：

3、结果判读

本试剂盒的具体检测流程如图7所示。

实施例5敏感性试验

一、实验方法

选取实施例2制备的质粒标准阳性模板中拷贝数为1×10¹拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10⁵拷贝/μL的重组质粒做为PCR扩增的模板，进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)为25μL 2×PCR Buffer，10μL2mM dNTPs，0.5μL ASFV PCR扩增上游引物，0.5μL ASFV PCR扩增下游引物，1μLMarathon DNA聚合酶，2μL阳性对照质粒，并用超纯水补足体积至50μL。反应程序为：94℃预变性2分钟；98℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环；反应结束后4℃保存。

二、实验结果

选取实施例2制备的质粒标准阳性模板中拷贝数为1×10¹拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10⁵拷贝/μL的重组质粒做为模板，利用本产品进行PCR扩增和检测，检测结果显示，获得产品的检测下限为1×10¹拷贝/μL(图8)。在初始模板为1×10³～1×10⁹拷贝/μL的情况下，试纸条显色速度很快，从试纸条插入PCR反应管，至条带显色不超过3分钟。当初始模板拷贝数为1×10¹～1×10²拷贝/μL的情况下，阳性样品的T线显色时间与高拷贝数一致，仅条带略浅，整个检测过程也仅需3分钟即可完成。

实施例6特异性试验

一、实验方法

用建立的PCR结合核酸试纸条试验体系检测50份健康猪血液及50份健康猪脾脏组织，确定方法的特异性。

二、实验结果

同时以50份健康猪的全血，50份健康猪脾脏裂解液，及3份超纯水作为阴性对照的情况下，试纸条的检测结果均显示为阴性。

实施例7重复性试验

一、实验方法

选取实施例施例2制备的质粒标准阳性模板中拷贝数为1×10¹拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10⁵拷贝/μL的重组质粒做为PCR扩增的模板，利用本产品进行PCR扩增和检测，每个标准品重复3次，进行PCR扩增，同时PCR产物进行核酸试纸条的检测。

二、实验结果

以未感染非洲猪瘟病毒的健康猪的全血、组织裂解液，及超纯水作为阴性对照，选取施例2制备的质粒标准阳性模板中拷贝数为1×10¹拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10⁵拷贝/μL的重组质粒做为PCR扩增的模板，进行5次批内和批间平行试验，每个梯度重复10次，本产品检测均成功检测初始模板低至1×10¹拷贝/μL的PCR扩增产物，且保证阴性对照无假阳性，批内和批间平行试验结果完全一致，检测结果稳定可靠。

实施例8临床样品检测

一、实验方法

对100头临床症状疑似感染非洲猪瘟的病猪血液和肌肉样品，进行PCR扩增，并以核酸试纸条检测扩增产物。同一样品使用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的“非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒”进行检测，对比两种方法的检测结果。

二、实验结果

对100份疑似非洲猪瘟感染临床样品，采用本产品直接检测，共检测出阳性样品24份。同时采用“北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒”复检结果，发现本产品与荧光定量PCR检测结果相符，并且与传统的琼脂糖凝胶电泳方法相比，无需任何仪器设备,操作简单，具有更高的灵敏性。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtctccccgc gtcatcattc a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catgcagaaa acctacctac t 21

<210> 3

<211> 383

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtctccccgc gtcatcattc atttaaaaaa atttgcagct ttgttggaac acatccctac 60

tccatatccc atacgtgaaa taaagcctcc attagaagac tcaaaagtat ccgcaaaatt 120

tatggtcagt ccgggaaaaa aagtacgcat taatgttttt cttaaaggta agataaatat 180

tttaggctgc aacacaaagg aatccgcgga gaccatttat acgtttttga aagatcttat 240

cagcgtacat tggcaagaaa ttttgtgcgt gttaccggta cccgattaaa gaatgttttc 300

attaataagg taatcgacta tgctaaaaag aataacaaga aaaatacctt gaagaactat 360

accaaagtag gtaggttttc tgc 383

Claims

1.一种用于检测非洲猪瘟的引物组，其特征在于，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的上游引物标记Biotin，下游引物标记FITC。

3.权利要求1所述引物组在制备非洲猪瘟检测试剂盒中的应用。

4.一种检测非洲猪瘟的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1或2任一所述的引物组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为核酸试纸条试剂盒。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有PCR扩增试剂。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂为2×PCR Buffer、2mMdNTPs、1U/μL的Marathon DNA聚合酶和超纯水。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，PCR扩增的体系为：2×PCR Buffer 25μL，2mM dNTPs 10μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，1U/μL Marathon DNA聚合酶1μL，模板2μL，补超纯水至50μL。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，PCR扩增的程序为：94℃预变性2分钟；98℃变性10秒，60～63℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环。