CN111363852A - 一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，所述试剂盒由20支PCR反应管、300μl PCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μl Taq酶(5U/μl)组成，其中PCR反应混合物包含引物序列Primer:F 5’‑CTGGCATAGGACGGAGTA‑3’，R 5’‑CGCAACATTCGCATCTAC‑3，所述试剂盒的有益效果为引物序列高度保守，可以检测不同来源，突变的非洲猪瘟病毒，可以更好的应对非洲猪瘟病毒突变。

Description

一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪痘病毒(African swine fevervirus,ASFV)感染引起的，巧猪、豪猪、野猪及家养猪易感，猪一旦感染后，主要临床症状表现为高热、食欲废绝、皮肤发绀，剖检后会发现淋巴结、肾、胃肠黏膜等出血，毒力强的毒株感染猪后，造成的病死率可高达100％，虽然无该病毒感染人的报道，但发生该病后对养猪业带来极大的危害，动物产品的销售、贸易等均受到严重限制，因此世界动物卫生组织将其列为法定上报的动物疫病，在我国动物病原微生物名录中，也被列为一类动物疾病。
ASFV二十面体对称，病毒粒子直径200nm，结构呈同心球状，最中央区域为核质体，其直径约80nm，由病毒基因组、完成基因早期转录所必需的酶以及一些DNA结合蛋白组成，如p150、p37、p34、p14以及p14.5、p10，核质体外围是一些蛋白组成的核衣壳，壳粒是其基本结构单位，共有1982-2172个。
1921年，ASF最早在肯尼亚出现，随后的几十年里该病发生于撒哈拉沙漠周边一些国家，1957年非洲大陆外的葡萄牙国家首次爆发该病，葡萄牙的这次ASF发生后很快就被控制和消灭掉，到了1960年，里斯本附近地区又爆发了ASF，从该病爆发开始到1995年，ASFV在伊比利亚半岛(西班牙和葡萄牙)的许多地区蔓延，上世纪70年代末到80年代中后期，ASFV迅速扩散到世界其他的地方，其中影响较大的是另外一些欧洲国家(如意大利、法国、荷兰、比利时等)和美洲的一些国家，多米尼加共和国和巴西尤其严重。通过追根溯源发现，给健康猪饲喂污染ASFV的机场和港口的泔水，是造成ASFV从疫区国家传播到无疫病国家的主要原因。一旦猪群感染，发病猪及猪肉制品立马成为新的病毒传染源。西班牙ASFV的流行病学资料显示，控制措施如果能落实到位，ASF还是可以清除的，然而在意大利的撒丁岛和非洲大陆，特别是非洲东南部地区，该病毒仍持续存在。上世纪90年代到本世纪初，ASF的流行病学和分布情况发生了改变，开始进入其他的一些地区，包括一些西非国家；1996年科特迪瓦发生ASF，1997年尼日利亚和多哥发生ASF，1999年加纳发生ASF，2003年布基纳法索发生ASF，2010年乍得发生ASF等；在西非发生的同时，马达加斯加和毛里求斯这样的岛屿国家也出现了ASF的流行；2007年，格鲁吉亚首次发生了ASF，随后向西北方向流行，再次进入欧洲大陆。到目前为止，ASF己在非洲、美洲、欧洲及欧亚大陆交界处等许多国家流行，2018年8月3日，中国确诊首例非洲猪瘟疫情，2018年之前，中国没有非洲猪瘟。分子流行病学研究表明：传入中国的非洲猪瘟病毒属基因Ⅱ型，与格鲁吉亚、俄罗斯、波兰公布的毒株全基因组序列同源性为99.95％左右，通常非洲猪瘟跨国境传入的途径主要有四类：一是生猪及其产品国际贸易和走私，二是国际旅客携带的猪肉及其产品，三是国际运输工具上的餐厨剩余物，四是野猪迁徙。中国已查明疫源的68起家猪疫情，传播途径主要有三种：一是生猪及其产品跨区域调运，占全部疫情约19％；二是餐厨剩余物喂猪，占全部疫情约34％；三是人员与车辆带毒传播，这是当前疫情扩散的最主要方式，占全部疫情约46％。
PCR检测具有检测特异性高、灵敏度强、操作简单、可大批量检测等特点，用于检测各种组织、体液中病原微生物的核酸，与其它试验相比，此方法更加快速、敏感，且不需要分离培养病原微生物，并能进行大批量的流行病学调查，Steiger等首先根据AS FV DNA保守区序列设计一对PCR引物，用建立的PCR检测细胞培养和感染组织中的ASFV核酸，虽然该对引物检测时灵敏高，但在血液样品检测时，可能会检出假阳性，并伴有非特异性条带产生，本发明的目的在于提供一种PCR检测方法，具有高度的特异性和能适应ASFV变异的性能。
发明内容
本发明的目的在于提供适宜ASFV变异的PCR诊断试剂盒，其具有高度保守的引物序列，可以更好的应对ASFV的变异以及具有高度的特异性。
本发明的制备和使用过程如下：
1.从NCBI上获得非洲猪瘟序列，通过NCBI Blast功能，获得保守序列，比对结果见图1；
2.使用Primer Premier 6.0针对保守序列设计引物，设计的引物序列为：Primer:F 5’-CTGGCATAGGACGGAGTA-3’，R 5’-CGCAACATTCGCATCTAC-3，扩增区域94354-94632，长度279bp；
3.样品处理
选择多只疑似非洲猪瘟的猪，采集每只病猪的的淋巴结、肾、胃、肠等若干份，-20℃冰箱中保存，并做好记录，称取每份样品10g，剪碎后加入5ml PBS缓冲液(pH值为7.4)，用组织匀浆机低温研磨，反复冻融2次，再次研磨，放入低温离心机以5000r/min离心10min，上清液转移至另一支灭菌离心管内-20℃保存，用于DNA的提取；
4.样品DNA模板提取
将组织匀浆液转移至1.5ml离心管中，煮沸裂解10min，然后以10000r/min低温离心10min，将上清液移入另一支干净离心管内，-20℃保存，备用；
5.试剂盒组成
20支PCR反应管、300μl PCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μl Taq酶(5U/μl)；
6.PCR扩增
取步骤四样品5μl，加入15μl PCR反应混合物、1U Taq酶，PCR反应程序：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min，样品出现预定大小的荧光带即为阳性。
本发明的有益效果是：
获得了非洲猪瘟病毒检测试剂盒，所述试剂盒的引物序列高度保守，可以检测不同来源，突变的非洲猪瘟病毒，可以更好的应对非洲猪瘟病毒突变。
附图说明
图1序列对比图
图2特异性检验结果图
图3不同种类非洲猪瘟病毒检测
图4敏感性检验结果图
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
本实施例涉及的材料和试剂见表1，实验仪器见表2；
表1实验材料和试剂
Figure BDA0002458856520000031
Figure BDA0002458856520000041
表2实验仪器设备
AB104-N电子分析天平 梅特勒-托利多上海有限公司
PTC-200型PCR仪 美国MJResearch公司
DYY-6D型核酸电泳仪 北京市六一仪器厂
GelDoc凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司
Sigma3K-15高速冷冻离心机 德国Sigma公司
MilliQIntegral超纯水仪 美国Milipore公司
1.从NCBI上获得非洲猪瘟序列(序列号：U18466.2)，通过NCBI Blast功能，获得保守序列，比对结果见图1；
2.使用Primer Premier 6.0针对保守序列设计引物，设计的引物序列为：Primer:F5’-CTGGCATAGGACGGAGTA-3’，R 5’-CGCAACATTCGCATCTAC-3，扩增区域94354-94632，长度279bp；
3.样品处理
选择多只疑似非洲猪瘟的猪，采集每只病猪的的淋巴结、肾、胃、肠等若干份，-20℃冰箱中保存，并做好记录，称取每份样品10g，剪碎后加入5ml PBS缓冲液(pH值为7.4)，用组织匀浆机低温研磨，反复冻融2次，再次研磨，放入低温离心机以5000r/min离心10min，上清液转移至另一支灭菌离心管内-20℃保存，用于DNA的提取；
4.样品DNA模板提取
将组织匀浆液转移至1.5ml离心管中，煮沸裂解10min，然后以10000r/min低温离心10min，将上清液移入另一支干净离心管内，-20℃保存，备用；
5.试剂盒组成
20支PCR反应管、300μl PCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μl Taq酶(5U/μl)；
6.PCR扩增
取步骤四样品5μl，加入15μl PCR反应混合物、1U Taq酶，PCR反应程序：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min，样品出现预定大小的荧光带即为阳性。
实验一试剂盒特异性检验
1.病料的收集和处理
选择多只疑似非洲猪瘟的猪，采集每只病猪的的淋巴结、肾、胃、肠等若干份，-20℃冰箱中保存，并做好记录，称取每份样品10g，剪碎后加入2ml PBS缓冲液(pH值为7.4)，用组织匀浆机低温研磨，反复冻融2次，再次研磨，放入低温离心机以5000r/min离心10min，上清液转移至另一支灭菌离心管内-20℃保存，用于DNA的提取；
2.基因组DNA的提取
将组织匀浆液转移至1.5ml离心管中，煮沸裂解10min，然后以10000r/min低温离心10min，将上清液移入另一支干净离心管内，-20℃保存，备用；
3.用本试剂盒对步骤二的DNA样品，以及猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PrV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRS)、猪乙型脑炎病毒(Japaneseenceph alitis virus,JEV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus infection,PPI)的cDNA为模板，用设计的引物PCR扩增，观察结果，结果见图2。
根据实验结果可以看出，本试剂盒在猪瘟病毒样品中可以扩增出特异条带，在PrV、PCV2、PRRS、JEV、PPI cDNA为模板的PCR体系中未扩增出特异条带，说明本试剂盒特异性良好。
实验二：应对非洲猪瘟病毒变异能力检测
从NCBI上查找相差比较大的不同区域，不同时间段非洲猪瘟病毒序列(MN641876.1、MH910496.1、MN336500.2、M77121.1、NC044956.1、AY261365.1、NC044942.1、LR536725.1)，人工合成相关的4Kb的DNA序列，插入pGEM-T载体，瞬时转染大肠杆菌DH5а，挑选克隆测序，测序正确的菌株，扩大培养，用本试剂盒PCR检测，实验结果见图3。
实验三：试剂盒敏感性检验
将初始浓度为400ng/μl的标准模板ASFV DNA分别按1：10、1：30、1：50、1：70、1：90、1：100稀释，从每个稀释度各取2μl模板用ASFV PCR试剂盒进行检验，观察结果，实验结果见图4。
结果显示1％稀释的ASFV DNA模板也能用本试剂盒检测出来。
从实验结果可以看出，均出现了目的条带，说明本试剂盒能够很好的检测不同类型的非洲猪瘟病毒，具有很好的抗病毒变异功能。
实验三：与其他方法的比较
收集猪血液95份，用本试剂盒与HA、ELISA方法分别检测样品，观察结果，实验结果见表3。
表3不同检测方法非洲猪瘟病毒检出率
方法 阳性检出个数 阳性检出率(％)
PCR 23 24.2
ELISA 14 14.7
HA 17 17.9

Claims (2)

1.一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒检测试剂盒包括：20支PCR反应管、300μl PCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μl Taq酶(5U/μl)，其中PCR反应混合物包含引物序列：Primer:F 5’-CTGGCATAGGACGGAGTA-3’，R 5’-CGCAACATTCGCATCTAC-3；
2.一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒检测试剂盒的制备和使用过程如下：
1)从NCBI上获得非洲猪瘟序列，通过NCBI Blast功能，获得保守序列；
2)使用Primer Premier 6.0针对保守序列设计引物，设计的引物序列为：Primer:F5’-CTGGCATAGGACGGAGTA-3’，R 5’-CGCAACATTCGCATCTAC-3，扩增区域94354-94632，长度279bp；
3)样品处理
选择多只疑似非洲猪瘟的猪，采集每只病猪的的淋巴结、肾、胃、肠等若干份，-20℃冰箱中保存，并做好记录，称取每份样品10g，剪碎后加入5ml PBS缓冲液(pH值为7.4)，用组织匀浆机低温研磨，反复冻融2次，再次研磨，放入低温离心机以5000r/min离心10min，上清液转移至另一支灭菌离心管内-20℃保存，用于DNA的提取；
4)样品DNA模板提取
将组织匀浆液转移至1.5ml离心管中，煮沸裂解10min，然后以10000r/min低温离心10min，将上清液移入另一支干净离心管内，-20℃保存，备用；
5)试剂盒组成
20支PCR反应管、300μl PCR反应混合物、2.0g琼脂糖、100μl溴化乙锭10μg/μl、0.25％溴酚蓝点样缓冲液100μl、5μl Taq酶(5U/μl)；
6)PCR扩增
取步骤四样品5μl，加入15μl PCR反应混合物、1U Taq酶，PCR反应程序：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min，样品出现预定大小的荧光带即为阳性。
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