CN107586887B

CN107586887B - 一种猪圆环病毒2型与3型pcr鉴别诊断试剂盒及其检测方法

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Publication number: CN107586887B
Application number: CN201711044872.8A
Authority: CN
Inventors: 吴旭锦; 朱小甫
Original assignee: Xianyang Vocational Technical College
Current assignee: Xianyang Vocational Technical College
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2037-10-31
Also published as: CN107586887A

Abstract

本发明提供了一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；裂解液的成分为DNAiso Reagent；扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、PCV2‑F上游引物、PCV2‑R下游引物、PCV3‑F上游引物、PCV3‑R下游引物和rTaq DNA聚合酶；阴性对照为灭菌三蒸水；阳性对照为PCV2和PCV3阳性质粒混合物。该猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，能彻底解决PCV2、PCV3引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场快速检测。

Description

一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是一种重要的猪病病原，PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾炎综合征(PDNS)、怀孕母猪繁殖障碍和新生仔猪A2型先天性震颤(CT)。1991年Clark首次报道了加拿大猪群中存在PMWS，随后世界许多国家和地区均报道了该病的发生和流行，对养猪业造成了巨大的经济损失。迄今为止，各国学者针对PCV2建立了多种检测方法，对调查PCV2的感染流行情况起到了重要作用。

病毒的分离需要采集病死猪的组织，研磨、冻融、离心后取上清接种于细胞，如无PCV污染的PK-15、猪睾丸细胞(ST)或Dulac细胞等。由于病毒在培养细胞上不出现细胞病变，在病料接种3d后，可通过间接免疫荧光试验(IFA)、免疫组织化学染色法(IHC)、PCR等确认病毒。但病毒分离所需时间较长，不宜作为疾病的快速诊断方法。

免疫荧光试验包括直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验，这两种方法均可对用细胞分离的PCV病毒进行鉴定，也可对病理组织冰冻切片细胞内有无PCV进行检查和定位。免疫荧光试验操作简单，耗时少，适合作为快速诊断的试验方法。

免疫组化技术是应用标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，可对组织或细胞表面的抗原进行定性、定量和定位。常用的技术有：酶免疫组化(用辣根过氧化物酶标记)、免疫金组化(用胶体金颗粒标记)和免疫电镜技术(用铁蛋白、胶体金、过氧化物酶标记)等。

随着分子生物学技术的兴起与发展，PCR技术以其快速、敏感、易于操作等优点在动物疫病诊断中得到了广泛应用。参照GenBank已发表的猪圆环病毒2型的基因序列，设计一对PCV2特异引物，如果能从患病猪的病料中扩增PCV2特异的基因组片段，就可以证明存在PCV-2的感染。

2016年，Palinski等首次鉴定并命名猪圆环病毒3型(PCV3)。同年3月，在中国辽宁、江西、重庆的3个猪场检测出了PCV3病原。研究认为，PCV3是一种与母猪皮炎肾病综合征和繁殖障碍相关的病原，但目前尚未清楚其起源，是否早已存在于猪体中只是未被发现，还是通过跨物种传播或通过PCV间的重组而形成，仍有待进一步探究。自2016年以来，我国部分省(市)相继出现以母猪流产和死亡、断奶仔猪呼吸衰竭和死亡为临床特征的PCV3感染报道。国内有研究从广西腹泻病死仔猪的病料样品中检测出PCV3，表明PCV3不但引起母猪皮炎肾病综合征与繁殖障碍，还能引起仔猪腹泻。由于PCV3是新发猪群病毒病，目前未见快速检测PCV3病原的公开报道。由于PCV2和PCV3引起猪群发病的症状类似，因此，发明一种快速鉴别PCV2或PCV3感染的诊断试剂盒，为临床快速确诊相应疾病，具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法，该猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制PCV2和PCV3感染提供有力的技术手段。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

(一)一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水PCR Buffer、dNTP、PCV2-F上游引物、PCV2-R下游引物、PCV3-F上游引物、PCV3-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为PCV2和PCV3阳性质粒混合物。

优选的，所述PCV2-F上游引物的序列为：5’-AGCAAACTTTTAATAAAGTGAAG-3’；

所述PCV2-R下游引物的序列为：5’-ATTTATTTCATATGGAAATTC-3’；

所述PCV3-F上游引物的序列为：5’-GCGGGAATTGCAGTTGTATTTC-3’；

所述PCV3-R下游引物的序列为：5’-GCCGTGGCTAGGGGGCTGCCCA-3’。

优选的，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1PCV2-F上游引物、25μmol·L^-1PCV2-R下游引物、25μmol·L^-1PCV3-F上游引物、25μmol·L^-1PCV3-R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为15.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰1.0︰1.0︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为PCV2和PCV3阳性质粒混合物，20个反应共计40.0μL，装成1管。

(二)一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：

步骤1，DNA提取

子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管(EP管)，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；

子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；

步骤2，PCR扩增反应

子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述待检样品DNA提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应40s、58℃反应40s、72℃反应60s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得待检样品PCR扩增产物；

子步骤2.2，阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述阴性对照样品提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应40s、58℃反应40s、72℃反应60s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物；

子步骤2.3，阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入PCV2和PCV3阳性质粒混合物，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应40s、58℃反应40s、72℃反应60s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物；

步骤3，电泳检测

通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物和阳性对照样品PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断。

优选的，子步骤1.1中，所述待检样品为组织病料样品、血清样品或全血样品。

进一步优选的，所述组织病料样品为肺脏、肝脏或脾脏。

优选的，步骤2中，所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、PCV2-F上游引物、PCV2-R下游引物、PCV3-F上游引物、PCV3-R下游引物和rTaq DNA聚合酶。

进一步优选的，

所述PCV2-F上游引物的序列为：5’-AGCAAACTTTTAATAAAGTGAAG-3’；所述PCV2-R下游引物的序列为：5’-ATTTATTTCATATGGAAATTC-3’；所述PCV3-F上游引物的序列为：5’-GCGGGAATTGCAGTTGTATTTC-3’；所述PCV3-R下游引物的序列为：5’-GCCGTGGCTAGGGGGCTGCCCA-3’。

优选的，步骤2中，所述多个循环为35个循环。

优选的，步骤3中，所述判断的标准为：阴性对照不出条带，阳性对照出740bp、426bp两个条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现740bp单条带，即为单一PCV2感染；待检样品PCR扩增产物出现426bp单条带，即为单一PCV3感染；待检样品PCR扩增产物出现740bp和426bp两个条带，即为PCV2和PCV3二重混合感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒采用二重PCR扩增，两种病变相似且同为DNA病毒的病毒一次检测，检测总时间控制在2.5小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本发明能彻底解决PCV2、PCV3引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场快速检测，亦适用于流行病学调查。

本发明的提供了两对针对PCV2和PCV3的特异性引物，PCV2-F/PCV2-R为PCV2特异性扩增引物组，PCV3-F/PCV3-R为PCV3特异性扩增引物组，利用其制成的二重试剂盒能快速、特异的检测出PCV2和PCV3中的单一病毒以及二者的混合病毒，PCV2出现740bp一个条带，PCV3出现426bp一个条带，PCV2、PCV3两种病毒混合样品出现740bp、426bp两个条带。

本发明的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒能检测的极限为1.0×10^-5pg·μL^-1，表明本发明的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒在检测PCV2、PCV3时具有很高的灵敏度。常规的猪圆环病毒3型PCR检测试剂盒的灵敏度为最低能检测到0.1597ng·μL^-1，本发明的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的灵敏度约为常规的猪圆环病毒3型PCR检测试剂盒的灵敏度6.26×10⁶倍。本发明的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒既能缩短诊断时间、节约诊断试剂，又能降低使用成本。

本发明提供的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒在6个月内检测结果一致，表明本发明猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒具有很高的稳定性。田间试验证明本发明所得的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒实用性和适用性良好。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

图1为本发明猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法特异性试验电泳图；

图中M为DL2000DNA分子质量标准，1为PCV2、PCV3混合病毒，2为PCV3病毒，3为PCV2病毒，4为猪伪狂犬病病毒，5为细小病毒，6为猪瘟病毒，7为蓝耳病毒，8为流行性腹泻病毒；

图2为本发明猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法灵敏度试验电泳图；

图中M为DL2000DNA分子质量标准，1～9分别为PCV2、PCV3混合病毒DNA梯度稀释，浓度范围为10×10^-1pg·μL^-1～10×10^-9pg·μL^-1；

图3为本发明猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒对部分临床样品电泳检测结果；

图中M为DL2000DNA分子质量标准，1为阴性对照，2为阳性对照，3-15为部分组织病料和血清的电泳检测结果；

图4为常规的猪圆环病毒3型PCR检测试剂盒对部分临床样品电泳检测结果；

图中M为DL2000DNA分子质量标准，1-13为部分组织病料和血清电泳检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

实施例1

一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照，具体如下：

1)裂解液：成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；

2)扩增反应混合液：由灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1PCV2-F上游引物、25μmol·L^-1PCV2-R下游引物、25μmol·L^-1PCV3-F上游引物、25μmol·L^-1PCV3-R下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为15.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰1.0︰1.0︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；其中引物的设计与制备如下：

参考GenBank上公布的PCV2、PCV3病毒基因组序列，经过综合分析比对，针对以上两种病毒基因设计了4条引物，引物的序列如下：

PCV2-F：5’-AGCAAACTTTTAATAAAGTGAAG-3’；

PCV2-R：5’-ATTTATTTCATATGGAAATTC-3’；

PCV3-F：5’-GCGGGAATTGCAGTTGTATTTC-3’；

PCV3-R：5’-GCCGTGGCTAGGGGGCTGCCCA-3’；

上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；

3)阴性对照：为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；

4)阳性对照：为PCV2和PCV3阳性质粒混合物，20个反应共计40.0μL，装成1管。

本发明的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒中裂解液为常温保存，扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照保存条件为-20℃。

上述猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：

步骤1，DNA提取

子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取100μL待检样品置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL8mmol·L^-1NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；

子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取100μL灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L^-1NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；

步骤2，PCR扩增反应

子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入待检样品DNA提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，58℃反应40s，72℃反应60s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得待检样品PCR扩增产物；

子步骤2.2，阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入阴性对照样品提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，58℃反应40s，72℃反应60s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物；

子步骤2.3，阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入PCV2和PCV3阳性质粒混合物2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，58℃反应40s，72℃反应60s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物；

步骤3，电泳检测

通过经10g·L^-1琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物和阳性对照样品PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断；判断标准为：阴性对照不出条带，阳性对照出740bp、426bp两个条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现740bp单条带，即为单一PCV2感染；待检样品PCR扩增产物出现426bp单条带，即为单一PCV3感染；待检样品PCR扩增产物出现740bp和426bp两个条带，即为PCV2和PCV3二重混合感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。

采用实施例1所得的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及检测方法分别对组织病料样品、血清样品和全血样品进行检测，具体检测方法如下：

对实施例1所得的一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法的特异性、稳定性、灵敏性进行试验，并通过田间试验对本发明所得猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的实用性和适用性进行验证，具体如下：

(1)异性试验

采用实施例1所得的一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法提取PCV2、PCV3、猪伪狂犬病病毒与猪细小病毒等DNA病毒的DNA作为模板，同时将PCV2、PCV3两种病毒混合作为1个样品提取DNA作为模板，用试剂盒的扩增混合液进行二重PCR，扩增完毕后电泳观察。按照RNAiso Reagent试剂说明提取猪瘟病毒、蓝耳病毒与流行性腹泻病毒总RNA，反转录获得第一链cDNA，用本发明所得的诊断试剂盒扩增混合液进行二重PCR，扩增完毕后电泳观察，试验结果如图1所示。

由图1可知，PCV2出现740bp一个条带，PCV3出现426bp一个条带，PCV2、PCV3两种病毒混合样品出现740bp、426bp两个条带，猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、蓝耳病毒和流行性腹泻病毒均没有出现条带。

回收各阳性样本的条带，纯化后连接pMD18-T载体，转化DH5ɑ感受态细胞，取PCR鉴定为阳性得菌液，提取质粒进行测序，将测得的序列与所用毒株基因序列进行比较，发现序列完全一致。结果证实本发明所得猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法具有很高的特异性，能准确扩增PCV2、PCV3基因片段，并能直观鉴别诊断PCV2、PCV3的感染情况。

(2)灵敏度试验

采用实施例1所得的一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法提取PCV2、PCV3样本DNA，紫外分光光度计测定浓度后稀释调整各病毒DNA浓度为10pg·μL^-1，混合两种病毒DNA作为模板，按照10倍浓度梯度稀释至10^-9，用试剂盒提供的扩增混合液进行二重PCR，扩增完毕后电泳观察，试验结果如图2所示。

由图2可知，本发明的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒能检测的极限为1.0×10^-5pg·μL^-1，表明本发明的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法有很高的灵敏度。

(3)稳定性试验

将实施例1所得的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒保存在-20℃，每月1次用PCV2、PCV3及对照进行检测试验，连续检测6个月，检测试剂盒存放的稳定性。

结果显示，6个月内猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测结果完全一致，说明猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒有良好的稳定性。

(4)田间试验

采集了2016-2017年间猪场出现母猪有繁殖障碍现象、皮炎肾炎综合征表现以及仔猪腹泻现象的组织病料和血清共62份，采用实施例1所得的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法对其病毒感染情况进行检测诊断，具体如下：

实施例2

1、组织病料样品的处理

取疑似病例组织病料如肺脏、肝脏或脾脏3～5g，剪碎成糊状，加5倍无菌PBS缓冲液，用组织研磨器充分研磨，收集悬液，4℃、12000r/min离心10min，吸取上清液，备用；

2、DNA提取

2.1组织病料样品DNA提取：吸取100μL所得上清液置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L^-1NaOH溶解，得组织病料DNA提取液；

2.2阴性对照样品提取：吸取100μL灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L^-1NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；

3、PCR扩增反应

3.1组织病料样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入组织病料DNA提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，58℃反应40s，72℃反应60s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得组织病料样品PCR扩增产物；

3.2阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入阴性对照样品提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，58℃反应40s，72℃反应60s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物；

3.3阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入PCV2和PCV3阳性质粒混合物2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，58℃反应40s，72℃反应60s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物；

4、电泳检测

将所得的组织病料样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物通过10g·L^-1琼脂糖凝胶电泳进行检查诊断，具体如下：

4.1称取1.0g琼脂糖，加入100mL 1×TAE缓冲液中，微波炉中加热融化，加入5μL(100mg/mL)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为5mm，待冷却凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液淹没胶面，得琼脂糖缓冲溶液；

4.2分别取5μL组织病料样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物和琼脂糖缓冲液混匀，加入加样孔中，同时加5μL DL2000DNA分子量标准；

4.3电压80V～100V，或电流40mA～50mA，电泳30min；

4.4取出凝胶，置入紫外分析仪中观察，或置入凝胶成像系统中观察照相；

4.5以DL2000DNA分子质量标准作为参照，阴性对照不出条带，阳性对照出740bp、426bp两个条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现740bp单条带，即为单一PCV2感染；待检样品PCR扩增产物出现426bp单条带，即为单一PCV3感染；待检样品PCR扩增产物出现740bp和426bp两个条带，即为PCV2和PCV3二重混合感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。

实施例3

1、血清样品的处理

对疑似病例猪只进行前腔静脉采血，自然凝固，待血清析出后分离出血清，备用；

2、DNA提取、PCR扩增反应和电泳检测

具体检测方法同实施例2，区别在于将实施例2中的组织病料样品替换为血清样品。

实施例4

1、全血样品的处理

注射器中加入肝素钠抗凝剂，对疑似病例猪只进行前腔静脉采血，混匀后即得抗凝血，备用；

2、DNA提取、PCR扩增反应和电泳检测

具体检测方法同实施例2，区别在于将实施例2中的组织病料样品替换为全血样品。

电泳检测结果发现62份临床样品中存在单一的PCV2感染、单一PCV3感染和PCV2、PCV3混合感染现象。其中，临床样品中共有阳性样品34份，阳性率54.8％；单一的PCV2阳性11份，阳性率17.7％；单一PCV3阳性9份，阳性率14.5％；PCV2和PCV3双阳性14份，阳性率22.6％。图3为部分组织病料和血清检测结果。

由图3可知，7/8/12/14为PCV2、PCV3病毒混合感染阳性结果；3/15为PCV2病毒阳性结果；4/5/10为PCV3病毒阳性结果；6/9/11/13为阴性结果。田间试验证明本发明所得的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒实用性和适用性良好。

对比实施例1

采用常规的猪圆环病毒3型PCR检测试剂盒及检测方法对上述采集的2016-2017年间猪场出现母猪有繁殖障碍现象、皮炎肾炎综合征表现以及仔猪腹泻现象的组织病料和血清共62份进行检测，结果表明，猪圆环病毒3型PCR检测试剂盒仅检测出3份阳性PCV3，其阳性率为4.8％，图4为部分组织病料和血清电泳检测结果。

由图4可知，5/6为PCV3弱阳性结果；1/2/3/4/7/8/9/10/11/12/13为阴性结果。

综上所述，在对同样的62份猪场出现母猪有繁殖障碍现象、皮炎肾炎综合征表现以及仔猪腹泻现象的组织病料和血清进行检测时，本发明所得的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒检测出单一PCV3阳性9份、阳性率14.5％，而常规的猪圆环病毒3型PCR检测试剂盒仅检测出3份阳性PCV3、阳性率为4.8％，由此可知，本发明所得的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检出率远远优于常规的猪圆环病毒3型PCR检测试剂盒的检出率，且避免了常规的猪圆环病毒3型PCR检测试剂盒中假阴性结果的出现，其实用性和适用性良好。此外，本发明所得的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒不仅能检测出单一的PCV2、单一的PCV3，还能检测出PCV2和PCV3的混合病毒，检测范围更广。

虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、PCV2-F上游引物、PCV2-R下游引物、PCV3-F上游引物、PCV3-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为PCV2和PCV3阳性质粒混合物；

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1PCV2-F上游引物、25μmol·L^-1PCV2-R下游引物、25μmol·L^-1PCV3-F上游引物、25μmol·L^-1PCV3-R下游引物和5U/μLrTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为15.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰1.0︰1.0︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为PCV2和PCV3阳性质粒混合物，20个反应共计40.0μL，装成1管。