CN108315490B - 猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒rt-pcr诊断试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT‑PCR诊断试剂盒及其检测方法，包括：反转录混合液：SADSCoV‑1R下游引物、PDCoV‑1R下游引物、AMV反转录酶和酶抑制剂；一扩混合液：SADSCoV‑1F上游引物、SADSCoV‑1R下游引物、PDCoV‑1F上游引物、PDCoV‑1R下游引物和DNA聚合酶；二扩混合液：SADSCoV‑2F上游引物、SADSCoV‑2R下游引物、PDCoV‑2F上游引物、PDCoV‑2R下游引物和DNA聚合酶；阴、阳性对照。该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高，能快速确诊并区分SADS‑CoV与PDCoV感染，其检测方法易于操作、方便快捷。
Description
技术领域
本发明涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断技术领域，具体涉及猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒及其检测方法。
背景技术
2016年10月，在广东省清远市某猪场开始爆发一种引起急性腹泻和呕吐为特征的传染病，随后蔓延至周围150公里范围的3个猪场。截止2017年5月，该病共导致4个猪场24693头仔猪死亡，死亡率达64％。病原检测发现，常见引起腹泻、呕吐的流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒均为阴性，提示这一疫情是一种新的疫病，并将这一新病命名为猪急性腹泻综合征(Swine acute diarrhea syndrome，SADS)。周鹏等通过高通量测序技术，最终确认病原为猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)。
猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是尼多目、冠状病毒科、冠状病毒亚科德尔塔冠状病毒属成员。该病毒于2012年在中国香港首次报道，约10％的猪粪便样品呈PDCoV阳性，美国于2014年2月在腹泻仔猪和母猪的粪便中首次检测到PDCoV，感染猪的临床症状类似于猪流行性腹泻病毒感染，主要表现为仔猪、母猪水样腹泻和仔猪死亡。国内陈建飞等成功分离到国内首株PDCoV并将其命名为NH株。
由于SADS与德尔塔冠状病毒感染为新发猪群传染病，且临床症状相似，急需要开发一种快速鉴别诊断试剂盒，为临床快速确诊SADS和德尔塔冠状病毒感染提供技术手段。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，能快速确诊并区分SADS-CoV与PDCoV感染，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，节省检测成本。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
(一)一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒，包括：反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照；所述反转录混合液包含灭菌水、dNTP、AMV Buffer、SADSCoV-1R下游引物、PDCoV-1R下游引物、AMV反转录酶和HPR IRNA酶抑制剂；所述一扩混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、SADSCoV-1F上游引物、SADSCoV-1R下游引物、PDCoV-1F上游引物、PDCoV-1R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述二扩混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、SADSCoV-2F上游引物、SADSCoV-2R下游引物、PDCoV-2F上游引物、PDCoV-2R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为SADSCoV M基因阳性质粒和PDCoV S基因阳性质粒混合溶液。
优选的，所述反转录混合液包含：DEPC处理的灭菌水、2.5m mol·L-1dNTP、5×AMVBuffer、25μmol·L-1SADSCoV-1R下游引物、25μmol·L-1PDCoV-1R下游引物、5U/μL AMV反转录酶和40U/μL HPR I RNA酶抑制剂；每个反应体积比为9︰4︰4︰1︰1︰0.5︰0.5，共计20μL，50个反应共计1000μL，装成1管；
优选的，所述一扩混合液包含：灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1SADSCoV-1F上游引物、25μmol·L-1SADSCoV-1R下游引物、25μmol·L-1PDCoV-1F上游引物、25μmol·L-1PDCoV-1R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为16︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管。
优选的，所述二扩混合液包含：灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1SADSCoV-2F上游引物、25μmol·L-1SADSCoV-2R下游引物、25μmol·L-1PDCoV-2F上游引物、25μmol·L-1PDCoV-2R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为16︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管。
优选的，所述SADSCoV-1F上游引物的序列为：5’-ATGACTGATT-CTAACAACAC-3’；所述SADSCoV-1R下游引物的序列为：5’-TTAGACTAAATGCAGCAA-3’。
优选的，所述SADSCoV-2F上游引物的序列为：5’-TCTTCTCCTTCAGCATTCT-3’；所述SADSCoV-2R下游引物的序列为：5’-TGCAGGCTGCACACCAGTA-3’。
优选的，所述PDCoV-1F上游引物的序列为：5’-TTCTTACATAAACCCACGAG-3’；所述PDCoV-1R下游引物的序列为：5’-GCCTGAAGTAAGGCTTAGTG-3’。
优选的，所述PDCoV-2F上游引物的序列为：5’-AGCATGTATCTCCTACCTA-3’；所述PDCoV-2R下游引物的序列为：5’-AACTACTGACTTATCACAAT-3’。
(二)一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：
步骤1，RNA提取与反转录
采用TRIzol Reagent试剂法提取待检样品RNA，得待检样品RNA；取反转录混合液，加入所述待检样品RNA，在42℃条件下水浴反转录90min，得待检样品反转录产物，取出置于-20℃保存，备用；
步骤2，PCR扩增
子步骤2.1，取一扩混合液，加入所述待检样品反转录产物，混合均匀后进行PCR扩增，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性5min、94℃反应45s、52℃反应50s、72℃反应50s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min，得待检样品一扩产物；
子步骤2.2，取二扩混合液，加入所述待检样品一扩产物，混合均匀后进行PCR扩增，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性5min、94℃反应30s、54℃反应30s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min，得待检样品二扩产物；
步骤3，采用步骤1和步骤2的方法分别对阴性对照和阳性对照处理，得阴性对照样品二扩产物和阳性对照样品二扩产物；
步骤4，电泳检测
通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品二扩产物、阴性对照样品二扩产物和阳性对照样品二扩产物进行电泳检测，并进行判断。
优选的，所述反转录混合液包含灭菌水、dNTP、AMV Buffer、SADSCoV-1R下游引物、PDCoV-1R下游引物、AMV反转录酶和HPR I RNA酶抑制剂；所述一扩混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、SADSCoV-1F上游引物、SADSCoV-1R下游引物、PDCoV-1F上游引物、PDCoV-1R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述二扩混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、SADSCoV-2F上游引物、SADSCoV-2R下游引物、PDCoV-2F上游引物、PDCoV-2R下游引物和rTaqDNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为SADSCoV M基因阳性质粒和PDCoVS基因阳性质粒混合溶液。
优选的，所述SADSCoV-1F上游引物的序列为：5’-ATGACTGATT-CTAACAACAC-3’；所述SADSCoV-1R下游引物的序列为：5’-TTAGACTAAATGCAGCAA-3’；所述SADSCoV-2F上游引物的序列为：5’-TCTTCTCCTTCAGCATTCT-3’；所述SADSCoV-2R下游引物的序列为：5’-TGCAGGCTGCACACCAGTA-3’；所述PDCoV-1F上游引物的序列为：5’-TTCTTACATAAACCCACGAG-3’；所述PDCoV-1R下游引物的序列为：5’-GCCTGAAGTAAGGCTTAGTG-3’；所述PDCoV-2F上游引物的序列为：5’-AGCATGTATCTCCTACCTA-3’；所述PDCoV-2R下游引物的序列为：5’-AACTACTGACTTATCACAAT-3’。
优选的，步骤3中，所述判断的标准为：阴性对照样品二扩产物不出条带，阳性对照阴性对照样品二扩产物出260bp、489bp两个条带，说明对照成立；待检样品二扩产物中出现单一260bp条带，即为猪急性腹泻综合征冠状病毒感染；待检样品二扩产物中出现单一样489bp条带，即为德尔塔冠状病毒感染；待检样品二扩产物中出现260bp、489bp两个条带，即为猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒；待检样品二扩产物中无条带出现，即为阴性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明将反转录步骤和第一次PCR扩增分开进行，目的是保证反应充分有效，采用套式PCR扩增，且目的片段较小，保证了反应的高灵敏度，试剂盒的检测极限可达5.02×10- 4ng·μL-1。检测总时间控制在4小时左右，并能直接区分SADS-CoV与PDCoV单一感染和混合感染，达到了快速检测的目的。本发明试剂盒的稳定性高，试剂盒在在6个月内检测结果一致；田间试验证明试剂盒的实用性和适用性良好。其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本发明诊断SADS-CoV与PDCoV感染快速特异，适用于各实验室、动物疫病预防控制中心以及条件具备的大中型养殖场等大面积快速检测普查。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为本发明猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒及其检测方法的特异性试验电泳图；
图中M为DL2000DNA分子质量标准，1为SADS-CoV阳性样本和PDCoV阳性样本混合物、2为SADS-CoV阳性样本、3为PDCoV阳性样本、4为猪瘟病毒(CSFV)、5为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、6为猪流行性腹泻病毒(PEDV)、7为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、8为轮状病毒(RotV)；
图2为本发明猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒及其检测方法的灵敏度试验电泳图；
图中M为DL2000DNA分子质量标准，1～9为SADS-CoV阳性样本和PDCoV阳性样本混合物cDNA梯度稀释，浓度范围为502×10-1ng·μL-1～502×10-11ng·μL-1；
图3为本发明猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒及其检测方法的对部分临床样品检测结果；
图中M为DL2000DNA分子质量标准，N为阴性对照，P为阳性对照，1～9为部分组织病料和血清。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
实施例1
一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR(反转录-复合套式聚合酶链式反应)诊断试剂盒，包括：反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照；具体如下：
1)反转录混合液：DEPC处理的灭菌水、2.5m mol·L-1dNTP、5×AMV Buffer、25μmol·L-1SADSCoV-1R下游引物、25μmol·L-1PDCoV-1R下游引物、5U/μL AMV反转录酶和40U/μL HPR I RNA酶抑制剂；每个反应体积比为9︰4︰4︰1︰1︰0.5︰0.5，共计20μL，50个反应共计1000μL，装成1管；
2)一扩混合液：灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L-1dNTP、25μmol·L- 1SADSCoV-1F上游引物、25μmol·L-1SADSCoV-1R下游引物、25μmol·L-1PDCoV-1F上游引物、25μmol·L-1PDCoV-1R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为16︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管。
3)二扩混合液：灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L-1dNTP、25μmol·L- 1SADSCoV-2F上游引物、25μmol·L-1SADSCoV-2R下游引物、25μmol·L-1PDCoV-2F上游引物、25μmol·L-1PDCoV-2R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为16︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管。
4)阴性对照为灭菌三蒸水。
5)阳性对照为SADSCoV M基因阳性质粒和PDCoV S基因阳性质粒混合溶液。
其中，引物的设计参考GenBank上公布的SADS-CoV全基因组序列，针对M基因设计了4条引物，序列如下：
SADSCoV-1F上游引物的序列为：5’-ATGACTGATT-CTAACAACAC-3’；
SADSCoV-1R下游引物的序列为：5’-TTAGACTAAATGCAGCAA-3’；
ADSCoV-2F上游引物的序列为：5’-TCTTCTCCTTCAGCATTCT-3’；
SADSCoV-2R下游引物的序列为：5’-TGCAGGCTGCACACCAGTA-3’；
PDCoV-1F上游引物的序列为：5’-TTCTTACATAAACCCACGAG-3’；
PDCoV-1R下游引物的序列为：5’-GCCTGAAGTAAGGCTTAGTG-3’；
PDCoV-2F上游引物的序列为：5’-AGCATGTATCTCCTACCTA-3’；
PDCoV-2R下游引物的序列为：5’-AACTACTGACTTATCACAAT-3’。
上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒的保存条件为-20℃。
上述猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，RNA提取与反转录
采用TRIzol Reagent试剂法提取待检样品RNA，得待检样品RNA；取反转录混合液，加入待检样品RNA，在42℃条件下水浴反转录90min，得待检样品反转录产物，取出置于-20℃保存，备用；
步骤2，PCR扩增
子步骤2.1，取一扩混合液，加入待检样品反转录产物，混合均匀后进行PCR扩增，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性5min、94℃反应45s、52℃反应50s、72℃反应50s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min，得待检样品一扩产物；
子步骤2.2，取二扩混合液，加入待检样品一扩产物，混合均匀后进行PCR扩增，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性5min、94℃反应30s、54℃反应30s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min，得待检样品二扩产物；
步骤3，采用步骤1和步骤2的方法分别对阴性对照和阳性对照处理，得阴性对照样品二扩产物和阳性对照样品二扩产物；
步骤3，电泳检测
通过琼脂糖凝胶电泳分别对待检样品二扩产物、阴性对照样品二扩产物和阳性对照样品二扩产物进行电泳检测，具体电泳检测方法如下：
子步骤3.1，称取1.0g琼脂糖，加入100mL 1×TAE缓冲液中，微波炉中加热融化，加入5μL(100mg/mL)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为5mm，待冷却凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液淹没胶面，得琼脂糖缓冲溶液。
子步骤3.2，分别取5μL待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物和琼脂糖缓冲液混匀，加入加样孔中，同时加5μL DL2000DNA分子量标准。
子步骤3.3，电压80V～100V，或电流40mA～50mA，电泳30min。
子步骤3.4，取出凝胶，置入紫外分析仪中观察，或置入凝胶成像系统中观察照相。
电泳检测结果的判断的标准为：阴性对照样品二扩产物不出条带，阳性对照阴性对照样品二扩产物出260bp、489bp两个条带，说明对照成立；待检样品二扩产物中出现单一260bp条带，即为猪急性腹泻综合征冠状病毒感染；待检样品二扩产物中出现单一样489bp条带，即为德尔塔冠状病毒感染；待检样品二扩产物中出现260bp、489bp两个条带，即为猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒；待检样品二扩产物中无条带出现，即为阴性。
对实施例1所得的猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒及其检测方法的特异性、稳定性、灵敏性进行试验，并通过田间试验对本发明所得猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒的实用性和适用性进行验证，具体如下：
1)特异性试验
使用本发明的诊断试剂盒，提取SADS-CoV阳性样本和PDCoV阳性样本混合物、SADS-CoV阳性样本、PDCoV阳性样本、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(RotV)总RNA，按试剂盒操作方法进行反转录-复合套式PCR，扩增完毕后电泳观察，试验结果如图1所示。
由图1可知，SADS-CoV阳性样本和PDCoV阳性样本混合物出现260bp、489bp两个条带，SADS-CoV阳性样本出现260bp一个条带，PDCoV阳性样本出现489bp一个条带，CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV和RotV均没有出现条带。结果证实本试剂盒及检测方法具有很高的特异性，能准确扩增SADS-CoV与PDCoV基因片段。
2)灵敏度试验
使用本发明提供的诊断试剂盒，提取SADS-CoV阳性样本和PDCoV阳性样本混合物总RNA，用试剂盒提供的反转录混合液反转录后得到cDNA，紫外分光光度计测定浓度为502ng·μL-1，按照10倍浓度梯度稀释至10-9，用试剂盒提供的一扩混合液和二扩混合液进行复合套式PCR，扩增完毕后电泳观察，试验结果如图2所示。
由图2可知，本发明的试剂盒能检测的极限为5.02×10-4ng·μL-1。
3)稳定性试验
本发明提供的诊断试剂盒保存条件为-20℃，每月1次用SADS-CoV阳性样本和PDCoV阳性样本混合物及对照进行检测试验，连续检测6个月，检测试剂盒存放的稳定性。结果显示，6个月内试剂盒检测结果完全一致，说明试剂盒有良好的稳定性。
4)田间试验
采集了临床腹泻猪群肠道组织病料、病猪血清、全血样品48份，用本发明的试剂盒及检测方法进行诊断，具体如下：
实施例2
1、组织病料样品的处理与RNA提取
1.1取疑似猪急性腹泻综合征肠道组织病料3～5g，剪碎成糊状，加5倍无菌PBS，用组织研磨器充分研磨，收集悬液，在4℃、12 000r/min条件下离心15min，取上清液250μL加入到无菌无RNA酶的EP管，同时做试剂盒中提供的阴性对照、阳性对照，分别加入750μLTRIzol Reagent，颠倒混匀后于4℃静置5min。
1.2加入200μL预冷的氯仿(4℃保存)，充分振荡至乳化均匀，4℃静置15min。
1.3于4℃、12 000r/min离心15min，取出EP管，轻轻吸取上层水相约450μL转移入另一EP管。
1.4加入等体积的冰冷异丙醇(-20℃保存)，颠倒混匀后置-20℃过夜，充分沉淀核酸。
1.5于4℃、12 000r/min离心10min，取出EP管，弃去上清液，加入1mL冰冷的75％乙醇(-20℃保存)，颠倒数次洗涤核酸。
1.6于4℃、12 000r/min离心5min，取出EP管，弃去上清液，倒置EP管干燥核酸，分别得组织病料样品RNA提取液、阴性对照样品RNA提取液和阳性对照样品RNA提取液。
2、反转录与PCR扩增
2.1吸取反转录混合液20μL，分别得组织病料样品RNA提取液、阴性对照样品RNA提取液和阳性对照样品RNA提取液，反复吹打离心管管底核酸，充分溶解后瞬间离心，置于42℃水浴反转录90min，取出备用；
2.2吸取一扩混合液23μL，加入反转录产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min、94℃反应45s、52℃反应50s、72℃反应50s共进行35个循环，最后72℃延伸10min；
2.3吸取二扩混合液23μL，加入一扩产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min、94℃反应30s、54℃反应30s、72℃反应40s共进行35个循环，最后72℃延伸10min；即得组织病料样品二扩产物、阴性对照样品二扩产物和阳性对照样品二扩产物。
3、电泳检测
具体电泳检测方法及判断标准同实施例1。
实施例3
1、血清样品的处理与RNA提取
1.1取分离得到待检猪血清250μL加入到无菌无RNA酶的EP管，同时做试剂盒中提供的阴性对照、阳性对照，给以上各管中加入750μL TRIzol Reagent，颠倒混匀后于4℃静置5min。
1.2加入200μL预冷的氯仿(4℃保存)，充分振荡至乳化均匀，4℃静置15min。
1.3于4℃、12 000r/min离心15min，取出EP管，轻轻吸取上层水相约450μL转移入另一EP管。
1.4加入等体积的冰冷异丙醇(-20℃保存)，颠倒混匀后置-20℃过夜，充分沉淀核酸。
1.5于4℃、12 000r/min离心10min，取出EP管，弃去上清液，加入1mL冰冷的75％乙醇(-20℃保存)，颠倒数次洗涤核酸。
1.6于4℃、12 000r/min离心5min，取出EP管，弃去上清液，倒置EP管干燥核酸，分别得血清样品RNA提取液、阴性对照样品RNA提取液和阳性对照样品RNA提取液。
2、反转录与PCR扩增
2.1吸取反转录混合液20μL，分别得血清样品RNA提取液、阴性对照样品RNA提取液和阳性对照样品RNA提取液，反复吹打离心管管底核酸，充分溶解后瞬间离心，置于42℃水浴反转录90min，取出备用；
2.2吸取一扩混合液23μL，加入反转录产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min、94℃反应45s、52℃反应50s、72℃反应50s共进行35个循环，最后72℃延伸10min；
2.3吸取二扩混合液23μL，加入一扩产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min、94℃反应30s、54℃反应30s、72℃反应40s共进行35个循环，最后72℃延伸10min；即得血清样品二扩产物、阴性对照样品二扩产物和阳性对照样品二扩产物。
3、电泳检测
具体电泳检测方法及判断标准同实施例1。
实施例4
1、全血样品的处理与RNA提取
1.1取待检猪全血250μL加入到无菌无RNA酶的EP管，同时做试剂盒中提供的阴、阳性对照，给以上各管中加入750μL TRIzol Reagent，颠倒混匀后于4℃静置5min。
1.2加入200μL预冷的氯仿(4℃保存)，充分振荡至乳化均匀，4℃静置15min。
1.3于4℃、12 000r/min离心15min，取出EP管，轻轻吸取上层水相约450μL转移入另一EP管。
1.4加入等体积的冰冷异丙醇(-20℃保存)，颠倒混匀后置-20℃过夜，充分沉淀核酸。
1.5于4℃、12 000r/min离心10min，取出EP管，弃去上清液，加入1mL冰冷的75％乙醇(-20℃保存)，颠倒数次洗涤核酸。
1.6于4℃、12 000r/min离心5min，取出EP管，弃去上清液，倒置EP管干燥核酸，分别得全血样品RNA提取液、阴性对照样品RNA提取液和阳性对照样品RNA提取液。
2、反转录与PCR扩增
2.1吸取反转录混合液20μL，分别得全血样品RNA提取液、阴性对照样品RNA提取液和阳性对照样品RNA提取液，反复吹打离心管管底核酸，充分溶解后瞬间离心，置于42℃水浴反转录90min，取出备用；
2.2吸取一扩混合液23μL，加入反转录产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min、94℃反应45s、52℃反应50s、72℃反应50s共进行35个循环，最后72℃延伸10min；
2.3吸取二扩混合液23μL，加入一扩产物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min、94℃反应30s、54℃反应30s、72℃反应40s共进行35个循环，最后72℃延伸10min；即得全血样品二扩产物、阴性对照样品二扩产物和阳性对照样品二扩产物。
3、电泳检测
具体电泳检测方法及判断标准同实施例1。
实施例2-4的结果电泳检测结果表明，临床腹泻猪群肠道组织病料、病猪血清、全血样品48份中阳性率为14.6％(7/48)。其中，图3为本发明的猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒部分临床试验结果。
由图3可知，2、3、4、7、9为检测阴性结果，1为PDCoV单一感染阳性结果，5、6为SADS-CoV和PDCoV混合感染结果，8为SADS-CoV单一感染阳性结果，田间试验证明本发明所得的猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒实用性和适用性良好。
虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括：反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照；
所述反转录混合液包含灭菌水、dNTP、AMV Buffer、SADSCoV-1R下游引物、PDCoV-1R下游引物、AMV反转录酶和HPR I RNA酶抑制剂；
所述SADSCoV-1R下游引物的序列为：ttagactaaatgcagcaa；
所述PDCoV-1R下游引物的序列为：gcctgaagtaaggcttagtg；
所述一扩混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、SADSCoV-1F上游引物、SADSCoV-1R下游引物、PDCoV-1F上游引物、PDCoV-1R下游引物和rTaq DNA聚合酶；
所述SADSCoV-1F上游引物的序列为：atgactgattctaacaacac；
所述PDCoV-1F上游引物的序列为：ttcttacataaacccacgag；
所述二扩混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、SADSCoV-2F上游引物、SADSCoV-2R下游引物、PDCoV-2F上游引物、PDCoV-2R下游引物和rTaq DNA聚合酶；
所述SADSCoV-2F上游引物的序列为：tcttctccttcagcattct；
所述SADSCoV-2R下游引物的序列为：tgcaggctgcacaccagta；
所述PDCoV-2F上游引物的序列为：agcatgtatctcctaccta；
所述PDCoV-2R下游引物的序列为：aactactgacttatcacaat；
所述阴性对照为灭菌三蒸水；
所述阳性对照为SADSCoV M基因阳性质粒和PDCoV S基因阳性质粒混合溶液。
2.根据权利要求1所述的猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于，
所述反转录混合液包含：DEPC处理的灭菌水、2.5m mol·L-1dNTP、5×AMV Buffer、25μmol·L-1 SADSCoV-1R下游引物、25μmol·L-1 PDCoV-1R下游引物、5U/μL AMV反转录酶和40U/μL HPR I RNA酶抑制剂；每个反应体积比为9︰4︰4︰1︰1︰0.5︰0.5，共计20μL，50个反应共计1000μL，装成1管；
所述一扩混合液包含：灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L-1dNTP、25μmol·L-1SADSCoV-1F上游引物、25μmol·L-1 SADSCoV-1R下游引物、25μmol·L-1 PDCoV-1F上游引物、25μmol·L-1 PDCoV-1R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为16︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管；
所述二扩混合液包含：灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5m mol·L-1dNTP、25μmol·L-1SADSCoV-2F上游引物、25μmol·L-1 SADSCoV-2R下游引物、25μmol·L-1 PDCoV-2F上游引物、25μmol·L-1 PDCoV-2R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为16︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107586887A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-01-16 | 咸阳职业技术学院 | 一种猪圆环病毒2型与3型pcr鉴别诊断试剂盒及其检测方法 |
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| CA3161295A1 (en) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | Zoetis Services Llc | Novel vaccine compositions for porcine epidemic diarrhea virus and porcine deltacoronavirus |
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Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| "Evaluation of two singleplex reverse transcription-Insulatedisothermal PCR tests and a duplex real-time RT-PCR test for thedetection of porcine epidemic diarrhea virus and porcinedeltacoronavirus";Jianqiang Zhang等;《Journal of Virological Methods》;20160406;第234卷;第34-42页 * |
| "基于单链置换的环介导间接PCR鉴别PEDV、TGEV方法的建立及应用";郑鸣等;《中国农业科学》;20180117;第50卷(第24期);第4790-4798页 * |
| "猪德尔塔冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及应用";郑丽等;《中国兽医科学》;20170320;第47卷(第3期);第334-340页 * |
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