CN111440895A

CN111440895A - SADS-CoV和PDCoV的双重实时荧光定量PCR检测及专用引物和探针

Info

Publication number: CN111440895A
Application number: CN202010039957.2A
Authority: CN
Inventors: 徐丽媛; 陈君彦; 王艳杰; 王秀明; 刘建奇; 刘东霞; 刘亭岐; 李静; 郝鹏; 黄海碧; 关平原; 张贵刚; 范秀丽; 刘国英; 魏学峰
Original assignee: Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2020-01-15
Publication date: 2020-07-24

Abstract

本发明公开了一种SADS‑CoV和PDCoV双重实时荧光定量PCR检测及引物和探针，并基于该引物和探针提供用于同时鉴别检测SADS‑CoV和PDCoV的试剂盒，属于生物检测技术领域。利用该试剂盒的检测操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，不仅可以用于对SADS‑CoV和PDCoV进行定性鉴别检测，还可以实现准确定量，能在疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗中应用。

Description

SADS-CoV和PDCoV的双重实时荧光定量PCR检测及专用引物和探针

技术领域

本发明属于生物检测技术领域中的兽医动物病原检测，具体涉及一种用于SADS-CoV和PDCoV的双重实时荧光定量PCR检测方法、检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针。

背景技术

冠状病毒对人和家畜的危害严重。2019年3月马静云等在国外杂志《Nature》报道了在华南某猪场发生急性腹泻疾病暴发的病例中分离鉴定出1个新的冠状病毒，即猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)。该病毒引起的的临床症状与其他已知的猪肠道冠状病毒引起的临诊症状非常相似，可严重感染各种年龄的猪且造成急性呕吐和腹泻，新生仔猪体重迅速减轻导致急性死亡，而感染的母猪只有轻度腹泻，大多数母猪在两天内恢复。随着规模化、集约化养猪业的持续发展，猪SADS-CoV已经或可能给养殖业带来潜在的重大经济损失。

猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)又称为猪德尔塔冠状病毒，为单股正链RNA病毒，与猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因组结构相似。2012年中国香港对该病毒进行了首次报道，2014年2月，美国学者在腹泻仔猪和母猪的粪便中检测到PDCoV，加拿大、韩国、泰国和我国大陆也先后从腹泻猪的样本中检测到PDCoV。感染猪的临床症状类似于SADS-CoV感染，表现为仔猪、母猪水样腹泻和仔猪死亡。随着PDCoV在全球范围内的不断流行和演化，以及新发病原SADS-CoV的出现，它们相似的临床症状给猪腹泻病的鉴别诊断和防控带来了新的挑战。

文献CN108315490A公开了一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR 诊断试剂盒及其检测方法，其采用套式PCR扩增，分为反转录步骤、第一次PCR扩增和第二次PCR扩增，并且针对每种病毒分别使用了不同的两对PCR扩增引物，因此其反应体系较为复杂，操作繁琐；并且其提供的试剂盒的检测极限仅为5.02×10^-4ng·μL^-1，相当于10⁵copies/μL，因此检测灵敏度也较低，不能够满足对猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒进行快速和高灵敏度鉴别检测的需要。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种用于对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测及鉴别的引物和TaqMan探针组，包含：

用于检测SADS-CoV的上游引物(SADS-CoV-F)和下游引物(SADS-CoV-R)，其中所述上游引物(SADS-CoV-F)的核苷酸序列如SED ID NO：3所示，所述下游引物(SADS-CoV-R) 的核苷酸序列如SED ID NO：4所示；

用于对SADS-CoV进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(SADS-CoV-P)，所述TaqMan探针(SADS-CoV-P)的核苷酸序列如SED ID NO：5所示；

用于检测PDCoV的上游引物(PDCoV-F)和下游引物(PDCoV-R)，其中所述上游引物(PDCoV-F)的核苷酸序列如SED ID NO：6所示，所述下游引物(PDCoV-R)的核苷酸序列如SEDID NO：7所示；

用于对PDCoV进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(PDCoV-P)，所述TaqMan探针(PDCoV-P)的核苷酸序列如SED ID NO：8所示；

所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且所述TaqMan探针的3’端已经磷酸化处理。

上述TaqMan探针(SADS-CoV-P)的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有TAMRA荧光淬灭基团；所述TaqMan探针(PDCoV-P)的5’端标记有ROX荧光报告基团，3’端标记有BHQ2荧光淬灭基团。

本发明另一方面提供一种用于对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测及鉴别的试剂盒，包括上述的引物和TaqMan探针组；

使用所述试剂盒时的25μL实时荧光定量PCR检测体系中所述引物和TaqMan探针的用量优选为：SADS-CoV-F(10μM)1μL，SADS-CoV-R(10μM)1μL，SVV-P(10μM)1μL，PDCoV-F(10μM)0.75μL，PDCoV-R(10μM)0.75μL，PDCoV-P(10μM)0.5μL。

上述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为SADS-CoV和PDCoV基因组RNA，各阳性对照品为单一包装或混合包装，所述阴性对照品为不含SADS-CoV和PDCoV的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)；使用所述试剂盒对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品。

上述试剂盒中还包括标准品：SADS-CoV标准品和PDCoV标准品；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR 检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。

上述的引物和TaqMan探针组或上述的试剂盒在对SADS-CoV和PDCoV进行非疾病诊断目的的检测中的应用也属于本发明的内容。

上述的检测应用为用实时荧光定量PCR技术对SADS-CoV和PDCoV进行非疾病诊断目的的定性、定量检测方法，包括以下步骤：

1)建立标准曲线：将SADS-CoV标准品和PDCoV标准品等浓度混合，按照10倍梯度将混合液中各标准品浓度稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、 1×10¹copies/μL；以不同浓度的标准品混合液作为模板，在上述的引物和TaqMan探针组的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制各自标准曲线；

2)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在上述的引物和TaqMan探针组的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测；

3)用得到的CT值或荧光信号的变化实现对SADS-CoV和PDCoV的定性检测，再根据荧光信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含SADS-CoV和PDCoV的拷贝数，实现定量检测。

上述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR检测体系包括：模板2μL，实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL(购于TakaRa公司)，SADS-CoV-F(10μM)1μL，SADS-CoV-R(10μM)1μL，SADS-CoV-P(10μM)1μL，PDCoV-F(10μM)0.75μL，PDCoV-R(10μM)0.75μL，PDCoV-P(10μM)0.5μL，RNA-free H₂O 4.5μL；所述步骤1)和步骤2)中的双重实时荧光定量PCR检测条件为：反转录52℃15min， 95℃2min；PCR扩增95℃15s，52℃30s，45个循环。

上述步骤3)中的判定方法为：

若待测样品只在SADS-CoV-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道中出现标准的 S型曲线，且10＜CT值≤38，则结果判定为SADS-CoV病毒阳性；若待测样品只在PDCoV-P 的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道中出现标准的S型曲线，且10＜CT值≤38，则结果判定为PDCoV病毒阳性；若待测样品在SADS-CoV-P和PDCoV-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道中均出现标准的S型曲线，且10＜CT值≤38，则结果判定为SADS-CoV和PDCoV病毒阳性；若待测样品在38＜CT值≤40范围出现标准的S型曲线，则结果判定为可疑，需复检；若待测样品CT值＞40范围出现或不出现曲线，则结果判定为阴性；

优选地，使用FAM荧光报告基团标记所述TaqMan探针(SADS-CoV-P)的5’端，使用ROX荧光报告基团标记所述TaqMan探针(PDCoV-P)的5’端时，若待测样品只在FAM通道中出现标准的S型曲线，且10＜CT值≤38，则结果判定为SADS-CoV病毒阳性；若待测样品只在ROX通道中出现标准的S型曲线，且10＜CT值≤38，则结果判定为PDCoV病毒阳性；若待测样品在FAM和ROX两个通道中均出现标准的S型曲线，且10＜CT值≤38，则结果判定为SADS-CoV和PDCoV病毒阳性。

上述待测样品包括用于疫苗生产的原料、疫苗半成品及成品。

基于以上技术方案提供的用于鉴别检测SADS-CoV和PDCoV的双重实时荧光定量PCR 检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针能同时对SADS-CoV和PDCoV实施快速鉴别和定量检测，可用于疫苗生产过程中原料毒株的筛选、质量监控和合理化配苗(如评估配制疫苗抗原的准确含量，为疫苗抗原含量提供数据基础)，确保接种疫苗的安全性和合理性，对SADS-CoV和PDCoV疫苗的生产具有指导作用。还可以为临床病原主要流行情况的调查提供有力依据。本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，可以同时实现对SADS-CoV和PDCoV的定性检测和准确定量，将在样本中SADS-CoV和PDCoV的准确检测及在疫苗生产(非诊断目的的应用)中发挥重要作用，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明用于对SADS-CoV与PDCoV双重实时荧光定量PCR检测优选组和对照组目的基因标准品的扩增曲线；

图2为本发明用于对SADS-CoV和PDCoV双重实时荧光定量PCR检测目的基因标准品的标准曲线；

图3为SADS-CoV和PDCoV双重实时荧光定量PCR检测方法的特异性检测结果；

图4为SADS-CoV和PDCoV双重实时荧光定量PCR检测方法的敏感性扩增曲线检测结果；

图5为SADS-CoV和PDCoV双重实时荧光定量PCR检测方法的敏感性标准曲线检测结果；

图6为SADS-CoV和PDCoV双重实时荧光定量PCR检测方法的重复性扩增曲线检测结果；

图7为SADS-CoV和PDCoV双重实时荧光定量PCR检测方法的重复性标准曲线检测结果。

具体实施方式

本发明旨在提出一种对SADS-CoV和PDCoV能同时进行鉴别及定量检测的技术。针对两种病毒的同时鉴别与检测，生物基因组是直接反应生物基本信息的一个最客观的指标，不同的病毒所含有的基因组信息不同，通过基因组信息可将不同的病毒分类至不同的族群，利用基因组碱基互补配对的原则，可实现特异位点基因序列的大量扩增，从而通过一定的方法使得肉眼可见，实现对不同病毒的鉴别区分以及定量检测。

实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的，该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术是一种对病毒基因组进行检测的相对定量技术，与普通PCR技术相比，增加了一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确的优点，可以利用多种荧光基团实现多种基因的检测，并可利用中间的寡核苷酸探针实现相似性较高基因的鉴别。

本发明基于以上基本原理设计了两对特异性引物和两条寡核苷酸探针，利用碱基互补配对的原理，建立了一种特异性检测SADS-CoV和PDCoV的双重实时荧光定量PCR检测方法，并基于设计得到的特异性引物和探针提供一种能同时检测和鉴别SADS-CoV和PDCoV的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒。

通过以下具体实施方式详细说明本发明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《MolecμLar Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.， MolecμLar Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积 (W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物和探针均由生工生物工程(北京)股份有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

实施例1、设计引物和TaqMan探针

从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)分别检索获得SADS-CoV 与PDCoV基因组的多个标准参考序列，用DNA Star软件进行比对后，根据引物、TaqMan 探针设计原则，在充分考虑两种病毒保守区的差异的基础上，最终确定：使用SADS-CoV的 M基因、PDCoV的N基因特异性保守区域序列来设计同时检测SADS-CoV与PDCoV的双重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针。

用Primer Express 6.0软件设计，分别基于SADS-CoV的M基因和PDCoV的N基因特异性保守区域序列设计了多组引物和探针，以同时能对SADS-CoV和PDCoV进行检测，并具有较高的灵敏度为目标，选择其中的两组(以下组1和组2)进行验证比较，以获得同时能对SADS-CoV和PDCoV进行检测的优选组引物和探针。

组1参照SADS-CoV的M基因(选择Genbank中登录号分别为MF769444、MF370205、MF094688、EF203064、MH615810、MG742313的序列)，经比对获得该M基因的特异性保守区序列，确定一段为SADS-CoV检测靶标，靶标序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；参照PDCoV的N基因(选择Genbank中登录号为JQ065042、KT021234、KP757892、KP757890、KJ569769、KM820765、KJ584358、MH708125的序列)，经比对获得该N基因的特异性保守区序列，确定一段作为PDCoV检测靶标，靶标序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。依据组1确定的靶标序列分别设计引物和探针，具体序列如下：

组1(优选组)：

SADS-CoV-F(上游引物)：5’-CGCCATTGCTGTCATTTCAGT-3’(SEQ ID NO：3)；

SADS-CoV-R(下游引物)：5’-CAGTCACAAATTGCGGTAAGTGT-3’(SEQ ID NO：4)；

SADS-CoV-P(TaqMan荧光探针)： 5’-FAM-TCCTACTCGATACCTATGCCAGTGGCACC-TAMRA-3’(SEQ ID NO：5)；

SADS-CoV-P的报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。

PDCoV-F(上游引物)：5’-CACTCGTGTTACTTGGGTTA-3’(SEQ ID NO：6)；

PDCoV-R(下游引物)：5’-GGATTGTTGGGGTTGCGTTT-3’(SEQ ID NO：7)；

PDCoV-P(TaqMan荧光探针)：5’-ROX-GACACTTCTATTAAACCTCATGTTGCC-BHQ2 -3’(SEQ ID NO：8)；

PDCoV-P的报告荧光基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2。

为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端已经磷酸化处理。

组2的引物和探针分别参照SADS-CoV的M基因(Genbank中登录号MF769444、MG775253、MF094688、MH615810、MF370205、MG742313，靶标序列如序列表中SEQ ID NO：9所示)和PDCoV的N基因(Genbank中登录号为JQ065042、KT021234、KP757892、 KP757890、KJ569769、KM820765、KJ584358、MH708125，靶标序列如序列表中SEQ ID NO： 10所示)序列设计而成，具体序列如下：

组2(对照组)：

SADS-CoV-MF(上游引物)：5’-GAGTTCCGACAGGTAAAGG-3’(SEQ ID NO：11)；

SADS-CoV-MR(下游引物)：5’-AAGGAGCATCTGCGTGAG-3’(SEQ ID NO：12)；

SADS-CoV-MP(TaqMan荧光探针)： 5’-FAM-TGGTTATTGGGTTGAACAAAAACGCTG-TAMRA-3’(SEQ ID NO：13)。

SADS-CoV-MP的报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。

PDCoV-NF(上游引物)：5’-CTTATTCTGCTTTGGCTGCTC-3’(SEQ ID NO：14)；

PDCoV-NR(下游引物)：5’-TTGGCCCAGGATATGAAGGT-3’(SEQ ID NO：15)；

PDCoV-NP(TaqMan荧光探针)： 5’-ROX-CCTAGTGGTGACCATTTGGACCGCAGT-BHQ2-3’(SEQ ID NO：16)。

PDCoV-NP的报告荧光基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2。

为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端已经磷酸化处理。

分别使用上述组1和组2的引物和探针组对SADS-CoV和PDCoV的梯度浓度(1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL)目的基因标准品(以下详述) 进行双重实时PCR检测，结果如图1所示，可见组1(优选组)的引物和探针对SADS-CoV和PDCoV均可检测至1×10²copies/μL，而组2(对照组)的引物和探针对SADS-CoV和PDCoV仅能检测至1×10³copies/μL；并且相对于组2的引物和探针，组1的引物和探针对SADS-CoV和PDCoV检测的相对荧光强度较高，因此确定组1作为本发明的优选引物和探针组，用于以下实施例中。

实施例2、SADS-CoV和PDCoV的双重实时荧光定量PCR检测

2.1、提取基因组RNA

使用AxyprepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN公司)对金宇保灵生物药品有限公司兽用疫苗国家工程实验室提供的SADS-CoV和PDCoV细胞培养物(用于获得标准品和阳性对照)以及待测样品提取基因组RNA，具体方法包括以下步骤：

(1)AXYGEN试剂盒准备：按试剂盒说明书，预先配置含1％冰乙酸的异丙醇和在试剂Buffer W1A和Buffer W2中添加指定浓度的无水乙醇。

(2)在1.5mL离心管中加入200μL的待测样品，并加入200μL Buffer V-L，漩涡震荡混匀后，静置5min。

(3)在步骤(2)的1.5mL样品及试剂混合离心管中加75μL Buffer V-N，漩涡震荡混匀， 12000g离心5min。

(4)将步骤(3)离心管中上清转移至2mL离心管(试剂盒内提供)中，加300μL异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均匀。

(5)将制备管置于2mL离心管中(试剂盒内提供)中，取步骤(4)的混合液移入制备管中，6000g离心1min。

(6)弃滤液，将制备管置回至2mL离心管中，加500μL Buffer W1A，室温静置1min。12000g离心1min。

(7)弃滤液，将制备管置回至2mL离心管中，加800μL Buffer W2，12000g离心1min。

(8)将制备管置回到2mL离心管中，12000g离心1min。

(9)将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加40μL无酶水，室温静置1min。12000g离心1min洗脱RNA。

从待测样品中提取的RNA作为检测样；从SADS-CoV和PDCoV细胞培养物中提取的RNA作为阳性对照样；按照下述方法将从SADS-CoV和PDCoVRNA中制备获得标准品。

2.2、双重实时荧光定量PCR标准曲线的建立

2.2.1、PCR扩增靶标序列

使用实施例1中组1的两对特异性引物，分别对步骤2.1提取的SADS-CoV和PDCoV基因组RNA进行PCR(定量PCR仪，型号CFX96，购自美国伯乐)扩增，分别得到SADS-CoV 和PDCoV基因的目的片段，25μL的PCR反应体系如下表1所示，PCR反应条件为：反转录 50℃15min；94℃2min；PCR扩增94℃30s，52℃30s，72℃30s，30个循环；终延伸72℃2min。

表1：PCR扩增体系

试剂名称	体积(μL)
		2×1 Step Buffer(Dye Plus)	12.5
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix	1.0
		SADS-CoV-F/PDCoV-F(10μM)	0.8
SADS-CoV-R/PDCoV-R(10μM)	0.8
		RNA模板	2.0
RNA-free H<sub>2</sub>O	7.9

2.2.2、标准品制备

将纯化回收的SADS-CoV和PDCoV基因的目的片段分别克隆至pCR-4TOPO载体(购自Invitrogen公司)和pMD19-T载体(购自TakaRa公司)中，构建成重组质粒，并筛选阳性重组质粒送生工生物工程(北京)股份有限公司测序，验证质粒构建是否成功。测序结果表明获得了序列正确的分别携带SADS-CoV和PDCoV目的基因的2个重组质粒，分别命名为

4-TOPO-SADS-CoV和pMD19-T-PDCoV重组质粒，提取质粒DNA得到标准品，分别命名为SADS-CoV标准品和PDCoV标准品。

2.2.3、标准曲线的建立

将上述SADS-CoV标准品和PDCoV标准品分别用Nanodrop测定浓度，并计算各标准品的拷贝数；将两种标准品等浓度混合，按照10倍梯度将标准品混合液稀释至1×10⁸、1×10⁷、 1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL的梯度浓度作为标准样品，每个标准样品做3个重复，以不同浓度的标准样品作为模板，在实施例1中组1的引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测。其中实时荧光定量PCR的反应体系(25μL)如下表2所示：

表2：双重实时荧光定量PCR的反应体系

双重实时荧光定量PCR的反应条件为：反转录条件：52℃15min，95℃2min；PCR扩增条件：95℃15s，52℃30s，45个循环。SADS-CoV标准品和PDCoV标准品的双重实时荧光定量PCR扩增曲线如图1(左图)所示，可见，标准品扩增曲线为平滑的“S”形曲线(阳性)，其中八组带○线条从左向右对应的是SADS-CoV标准品，其浓度分别为：1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、 1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL；八组不带符号的线条从左向右对应的是PDCoV 标准品，其浓度分别为：1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL；检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线。标准品的双重实时荧光定量PCR标准曲线如图2所示，SADS-CoV和PDCoV病毒相关系数分别为R²＝0.998、R²＝1.000，误差较小；线性方程分别为y＝-3.109X+42.405、y＝-3.375X+ 43.415，因此标准曲线可用于对SADS-CoV和PDCoV病毒进行双重实时荧光定量PCR检测。

2.3、对SADS-CoV和PDCoV病毒进行双重实时荧光定量PCR检测

用本发明的双重实时荧光定量PCR检测方法对从金宇保灵生物药品有限公司兽用疫苗国家工程实验室提供的SADS-CoV和PDCoV传代细胞毒液(待测样品)中提取的基因组RNA 进行检测，以从SADS-CoV和PDCoV细胞培养物中提取的RNA作为阳性对照样，以无酶水为阴性对照，根据实时荧光定量PCR检测结果，对待测样品中SADS-CoV和PDCoV病毒进行判定，并对病毒的拷贝数进行定量。

具体检测方法包括以下步骤：

1)以从待测样品中提取的基因组RNA为模板，在实施例1中组1的引物和探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，25μL实时荧光定量PCR的检测体系包括：模板2μL，实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL(购于TakaRa公司)， TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL(购于 TakaRa公司)，SADS-CoV-F(10μM)1μL，SADS-CoV-R(10μM)1μL，SVV-P(10μM)1μL，PDCoV-F(10μM)0.75μL，PDCoV-R(10μM)0.75μL，PDCoV-P(10μM)0.5μL，RNA-free H₂O 4.5μL。实时荧光定量PCR的反应程序为：反转录52℃15min；95℃2min；PCR扩增95℃ 15s，52℃30s，45个循环。在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。

2)用得到的CT值或荧光信号的变化实现对SADS-CoV和PDCoV定性检测，不同荧光通道出现标准的“S”型扩增曲线，表明待测样品中含有SADS-CoV和/或PDCoV病毒，再根据荧光信号的强度和步骤2.2中的标准曲线，得出待测样品中所含有SADS-CoV和/或PDCoV 病毒的拷贝数，实现定量检测。

3)具体判定方法：

①若待测样品只在FAM通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且10＜CT值≤38，则结果判定为SADS-CoV病毒核酸阳性；

②若待测样品只在ROX通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且10＜CT值≤38，则结果判定为PDCoV病毒核酸阳性；

③若待测样品在FAM和ROX两个通道中的扩增曲线均为标准的S型曲线，且10＜CT值≤38，则结果判定为SADS-CoV和PDCoV病毒核酸阳性；

④若待测样品38＜CT值≤40，出现“S”型扩增曲线，则结果判定为可疑，即该样品需要进行复检；

⑤若待测样品CT值＞40，则结果判定为阴性。

实施例3、对SADS-CoV和PDCoV病毒进行双重实时荧光定量PCR检测的灵敏度、特异性和重复性

3.1、特异性检测

按照实施例2中的方法对SADS-CoV、PDCoV、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A型轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(NADC30like)、猪流感病毒 H1型和H3型、猪圆环2型病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬野毒、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、猪猪肺炎支原体提取基因组RNA或DNA，以无酶水为阴性对照，在实施例1中组1所示的引物和探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2中2.3。

检测结果如图3(FAM和ROX两通道)所示，SADS-CoV病毒只在FAM通道出现特定的“S”型扩增曲线，结果阳性；PDCoV病毒只在ROX通道出现特定“S”型扩增曲线，结果阳性，其它样品未出现特定的“S”型扩增曲线，结果阴性。检测结果表明用本发明的方法可同时特异性地检测出SADS-CoV和PDCoV病毒。并且本发明提供的方法在特异性检测方面，能够检测的病毒(细菌)种类较多。

3.2、灵敏度检测

按照实施例2中的方法，将分别携带SADS-CoV和PDCoV病毒目的基因的2个质粒标准品(SADS-CoV标准品和PDCoV标准品)等浓度混合，按照10倍梯度稀释至1×10⁸、1×10⁷、 1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL，以不同浓度的标准品混合液作为模板，在实施例1中组1的引物和TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2中2.3，以验证该方法的灵敏度。

检测结果如图4和5所示，可见，本发明提供的双重实时荧光定量PCR检测方法对SADS-CoV和PDCoV均可以检测至1×10²copies/μL，并且扩增曲线为特定的“S”型曲线，远远超过文献CN108315490公开的检测极限5.02×10^-4ng·μL^-1(相当于约1×10⁵copies/μL)。本发明采用的方法为多重实时荧光定量PCR方法，用于单重PCR检测的引物和探针组合在用于进行多重实时荧光定量PCR时，会由于不同引物和探针进行相互干扰造成其检测敏感性下降，也即是说现有技术中能够用于单重实时荧光定量PCR检测的引物和探针组合不一定能够用于多重PCR检测。

3.3、重复性检测

按照实施例2中的方法，将分别携带SADS-CoV和PDCoV病毒目的基因的2个质粒标准品(SADS-CoV标准品和PDCoV标准品)等浓度混合，按照10倍梯度稀释至1×10⁸、1×10⁷、 1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL，每个梯度重复三次，以不同浓度的标准品混合液作为模板，在实施例1中组1所示的引物和探针的引导下进行多重实时荧光定量 PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2中步骤2.3。

检测结果如图6、7和表3、4所示，可见每一个浓度梯度的扩增曲线较聚拢，循环数无明显差距，表明本发明提供的用于同时检测SADS-CoV和PDCoV的双重实时荧光定量PCR检测方法的重复性较好，循环数标准偏差相差最高为1.09。

表3：SADS-CoV实时荧光定量重复性试验结果

样品信息	重复1	重复2	重复3	标准偏差
					标准品	循环数	循环数	循环数	循环数
1.00E+08	17.53	17.56	17.45	0.27％
					1.00E+07	20.64	20.81	20.78	0.35％
1.00E+06	24.07	24.00	24.02	0.11％
					1.00E+05	27.44	27.47	27.39	0.11％
1.00E+04	30.56	30.52	30.63	0.14％
					1.00E+03	34.08	34.06	33.73	0.47％
1.00E+02	37.25	36.33	36.48	1.09％

表4：PDCoV实时荧光定量重复性试验结果

样品信息	重复1	重复2	重复3	标准偏差
					标准品	循环数	循环数	循环数	循环数
1.00E+08	17.31	17.37	17.25	0.27％
					1.00E+07	20.53	20.61	20.55	0.16％
1.00E+06	23.77	23.90	23.93	0.30％
					1.00E+05	27.32	27.25	27.29	0.11％
1.00E+04	30.60	30.47	30.35	0.34％
					1.00E+03	33.56	34.35	34.14	0.98％
1.00E+02	38.15	37.74	38.12	0.49％

实施例4、SADS-CoV和PDCoV病毒的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒

本实施例提供的SADS-CoV和PDCoV病毒的双重实时荧光定量PCR检测及鉴别试剂盒包括：

实施例1中组1所示的用于对SADS-CoV和PDCoV病毒进行双重实时荧光定量PCR检测的引物(SADS-CoV-F、SADS-CoV-R、PDCoV-F和PDCoV-R)和TaqMan探针(SADS-CoV-P、PDCoV-P)。

具体地，SADS-CoV和PDCoV病毒的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒包括以下用于25μL双重实时荧光定量PCR检测体系的试剂：实时荧光定量一步法PCR反应液2×One StepRT-PCR Buffer III 12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL(购于TakaRa公司)， PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL(购于TakaRa公司)，SADS-CoV-F(10μM)1μL，SADS-CoV-R(10μM)1μL，SADS-CoV-P(10μM)1μL，PDCoV-F(10μM)0.75μL，PDCoV-R (10μM)0.75μL，PDCoV-P(10μM)0.5μL，RNA-free H₂O 4.5μL。

为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为SADS-CoV和 PDCoV基因组RNA，所述阴性对照为不含SADS-CoV和PDCoV的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)。使用该试剂盒对SADS-CoV和PDCoV病毒进行双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品。

为方便检测，试剂盒中还可包括标准品，其为分别携带SADS-CoV和PDCoV的目的基因的SADS-CoV标准品和PDCoV标准品(参见实施例2)，各标准品可为单独包装，也可等浓度混合包装；使用该试剂盒对SADS-CoV和PDCoV病毒进行双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。

为方便检测，试剂盒中还可包括实施例2获得的标准曲线和说明书，该说明书内容包括 PCR反应程序：反转录52℃15min；95℃2min；PCR扩增95℃15s，52℃30s，45个循环。

实施例5、疫苗生产过程中病毒传代抗原含量的实时荧光定量PCR检测

使用实施例4的试剂盒对金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室提供的29份SADS-CoV传代细胞病毒液和31份PDCoV传代细胞病毒液以及5份SADS-CoV和PDCoV 传代细胞病毒液的混合液中的抗原含量进行检测，检测方法与实施例2中步骤2.3相同，待测样品编号为1-65，检测结果如下表5所示，29份为SADS-CoV病毒核酸阳性，31份为PDCoV 病毒核酸阳性，5份为SADS-CoV和PDCoV病毒核酸阳性。已知，病毒拷贝数大于10⁵copies/μL 的传代细胞病毒液可以作为疫苗生产的原料，因此，提供的65份样品中，1-29号样品可以作为生产SADS-CoV疫苗的原料，31-47、50-52、55-60号样品可以作为生产PDCoV疫苗的原料，61-65号样品可以作为生产SADS-CoV和PDCoV双联疫苗的原料。可见本发明提供的对 SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测的试剂盒能够实现同时对传代细胞病毒样品中抗原含量的定量检测，可为疫苗生产过程中原料的筛选、质量监控和合理化配苗(如评估配制疫苗抗原的准确含量，为疫苗抗原含量提供数据基础)提供有力依据，保证疫苗质量，确保疫苗接种的安全性和合理性。

表5 65份传代细胞毒液SADS-CoV和PDCoV双重实时荧光定量PCR检测结果

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 金宇保灵生物药品有限公司

<120> SADS-CoV和PDCoV的双重实时荧光定量PCR检测及专用引物和探针

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 161

<212> DNA

<213> 猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)

<400> 1

cgccattgct gtcatttcag tctttggtag atcctactcg atacctatgc cagtggcacc 60

aacaggtatt actctgacga ttttaagtgg aacactcttt ttcgatggca tcagaattgc 120

tactggtgtg cagcctgcac acttaccgca atttgtgact g 161

<210> 2

<211> 92

<212> DNA

<213> 猪丁型冠状病毒(PDCoV)

<400> 2

gctgatgttt aggattgttg gggttgcgtt tggcaacatg aggtttaata gaagtgtcag 60

ctcccgaacc cttaacccaa gtaacacgag tg 92

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgccattgct gtcatttcag t 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagtcacaaa ttgcggtaag tgt 23

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctactcga tacctatgcc agtggcacc 29

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cactcgtgtt acttgggtta 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggattgttgg ggttgcgttt 20

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacacttcta ttaaacctca tgttgcc 27

<210> 9

<211> 150

<212> DNA

<213> 猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)

<400> 9

gagttccgac aggtaaaggc actccagatc aacagattgg ttattgggtt gaacaaaaac 60

gctggcgaat gcaaaaaggc caacgtaaag atcagccttc taactggcac ttttattacc 120

ttggtactgg tcctcacgca gatgctcctt 150

<210> 10

<211> 137

<212> DNA

<213> 猪丁型冠状病毒(PDCoV)

<400> 10

cttattctgc tttggctgct ccaacccttc accctagtgg tgaccatttg gaccgcagtt 60

gacagatcat ctaagaagga cgcagttttc attgtgtcca taatttttgc cgtactgacc 120

ttcatatcct gggccaa 137

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagttccgac aggtaaagg 19

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaggagcatc tgcgtgag 18

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tggttattgg gttgaacaaa aacgctg 27

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttattctgc tttggctgct c 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttggcccagg atatgaaggt 20

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cctagtggtg accatttgga ccgcagt 27

Claims

1.用于对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测及鉴别的引物和TaqMan探针组，其特征在于，包含：

用于检测SADS-CoV的上游引物(SADS-CoV-F)和下游引物(SADS-CoV-R)，其中所述上游引物(SADS-CoV-F)的核苷酸序列如SED ID NO：3所示，所述下游引物(SADS-CoV-R)的核苷酸序列如SED ID NO：4所示；

2.根据权利要求1所述的引物和TaqMan探针组，其特征在于，所述TaqMan探针(SADS-CoV-P)的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有TAMRA荧光淬灭基团；

所述TaqMan探针(PDCoV-P)的5’端标记有ROX荧光报告基团，3’端标记有BHQ2荧光淬灭基团。

3.用于对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测及鉴别的试剂盒，其特征在于：

包括权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针组；

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为SADS-CoV和PDCoV基因组RNA，各阳性对照品为单一包装或混合包装，所述阴性对照品为不含SADS-CoV和PDCoV的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)；使用所述试剂盒对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括标准品：SADS-CoV标准品和PDCoV标准品；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对SADS-CoV和PDCoV进行双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。

6.权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针组或权利要求3、4或5所述的试剂盒在对SADS-CoV和PDCoV进行非疾病诊断目的的检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的检测应用，其特征在于：

为用实时荧光定量PCR技术对SADS-CoV和PDCoV进行非疾病诊断目的的定性、定量检测方法，包括以下步骤：

1)建立标准曲线：将SADS-CoV标准品和PDCoV标准品等浓度混合，按照10倍梯度将混合液中各标准品浓度稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL；以不同浓度的标准品混合液作为模板，在权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针组的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制各自标准曲线；

2)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针组的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测；

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR检测体系包括：模板2μL，实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRaEx Taq HS 0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL(购于TakaRa公司)，SADS-CoV-F(10μM)1μL，SADS-CoV-R(10μM)1μL，SADS-CoV-P(10μM)1μL，PDCoV-F(10μM)0.75μL，PDCoV-R(10μM)0.75μL，PDCoV-P(10μM)0.5μL，RNA-free H₂O 4.5μL；

所述步骤1)和步骤2)中的双重实时荧光定量PCR检测条件为：反转录52℃15min，95℃2min；PCR扩增95℃15s，52℃30s，45个循环。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：

所述步骤3)中的判定方法为：

若待测样品只在SADS-CoV-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道中出现标准的S型曲线，且10＜CT值≤38，则结果判定为SADS-CoV病毒阳性；若待测样品只在PDCoV-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道中出现标准的S型曲线，且10＜CT值≤38，则结果判定为PDCoV病毒阳性；若待测样品在SADS-CoV-P和PDCoV-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道中均出现标准的S型曲线，且10＜CT值≤38，则结果判定为SADS-CoV和PDCoV病毒阳性；若待测样品在38＜CT值≤40范围出现标准的S型曲线，则结果判定为可疑，需复检；若待测样品CT值＞40范围出现或不出现曲线，则结果判定为阴性；

10.根据权利要求7-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述待测样品包括用于疫苗生产的原料、疫苗半成品及成品。