CN106957927B - 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106957927B
CN106957927B CN201710259976.4A CN201710259976A CN106957927B CN 106957927 B CN106957927 B CN 106957927B CN 201710259976 A CN201710259976 A CN 201710259976A CN 106957927 B CN106957927 B CN 106957927B
Authority
CN
China
Prior art keywords
swine fever
african swine
fluorescent pcr
pcr detection
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710259976.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106957927A (zh
Inventor
邓俊花
刘晗
冯春燕
林祥梅
吴绍强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Original Assignee
Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ filed Critical Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority to CN201710259976.4A priority Critical patent/CN106957927B/zh
Publication of CN106957927A publication Critical patent/CN106957927A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106957927B publication Critical patent/CN106957927B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701Specific hybridization probes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂、非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒及其应用,属于生物工程领域。本发明以p72基因为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,并以p72基因的全长设计引物,扩增p72基因,克隆到pGEM‑T载体中,其阳性质粒作为标准品进行标准曲线的制作,其检测范围为10到1.0×107拷贝。本发明的非洲猪瘟荧光PCR方法在检测非洲猪瘟的整个过程中,从DNA提取到出现检测结果,则只需2.5‑3 h,大大减少手工操作和缩短时间。且本发明一次可检测多个样品,特别适合于大批样品的检测。

Description

非洲猪瘟荧光PCR检测试剂、非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒及 其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域,具体涉及一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂、非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种烈性、出血性传染病,病死率接近100%。1921年Montgomery在非洲肯尼亚首先发现。由于对养猪业危害较大,而且尚无有效的疫苗防治,因此它被OIE列为猪的法定上报传染病之首,并受到世界各国的高度关注(Donald P.King等,2003;常华等,2007)。由于ASFV具有复杂的免疫逃避机制,缺乏典型的中和抗体,又没有有效的疫苗用于防疫(孙怀昌,1999),所以建立一种快速、准确的检测方法就显得尤为重要。虽然目前我国还未发现此病,但是随着国际交流的日益频繁,传入的风险日益加大。
ASFV属于非洲猪瘟科非洲猪瘟属,为正二十面体结构的DNA病毒,分类上接近虹彩病毒科(Iridoviridae),其DNA结构以及复制方式则与痘病毒科(Poxv iridae)相似。ASFV颗粒有囊膜,直径175~215nm,核衣壳20面体对称。基因组由单分子线状双股DNA组成,大小为170~190kbp。DNA分子具有共价的闭合末端,并有倒置末端重复子及发夹结构,编码200多种蛋白,其中34种为病毒颗粒的结构蛋白。
目前,OIE推荐ELISA、IFA等血清学方法用于ASFV的检测。由于抗体产生需要一定的时间,血清学诊断方法不适于感染早期使用。而PCR法,尤其是实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR qPCR)具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低的优点,近年来在各个领域特别是在基因检测方面被广为应用(李维彬等,2007)。2007年,张泉等以p72基因设计荧光探针引物,以重组的p72基因质粒为标准品制作标准曲线,其检测模板浓度的范围为20到2×106拷贝。
本研究根据GenBank上发表的非洲猪瘟病毒基因信息,在序列比较分析的基础上,选取高度保守的p72基因(编码B646L结构蛋白)作为靶基因,建立ASFV特异的荧光PCR检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足,而提供一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂、非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒及其应用,本发明在检测非洲猪瘟的整个过程中,从DNA提取到出现检测结果,则只需2.5-3h,大大减少手工操作和缩短时间。
本发明采用如下技术方案:
非洲猪瘟荧光PCR检测试剂,所述检测试剂是以高度保守的非洲猪瘟病毒p72基因为靶基因的,包括:PCR特异性引物ASFU和ASFL,探针ASFP,其中特异性引物ASFU的序列如SEQ ID NO:1所示,特异性引物ASFL的序列如SEQ ID NO:2所示,探针ASFP的序列如SEQ IDNO:3所示。
更进一步地,所述探针的5′端标记报告荧光染料为FAM,3′端标记荧光淬灭基团为Eclipse。
本发明还提供一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒,包括上所述的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂。
更进一步地,所述试剂盒的PCR反应体系为:10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/LMgCl21.5μL,2.5mM dNTP 2μL,20mmol/L ASFU/ASFL各0.5μL,10μmol/L ASFP 0.5μL,5U/μLTaq DNA聚合酶0.5μL,然后加入1μL pGEM-T-p72质粒DNA作为模板,加灭菌双蒸水使体积至25μL。
更进一步地,所述试剂盒的PCR反应条件为:95℃预变性5min;95℃,5s;60℃,30s,40个循环。
本发明还提供非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒在检测非洲猪瘟中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
荧光PCR方法的主要优势是快速,灵敏性高,特异性强,而且,利用此方法还可以对病原进行定量分析。本发明对不同来源的非洲猪瘟毒株的p72基因,进行序列比较与分析,结果显示它们之间具有很高的同源性,说明p72高度保守。因此,以p72基因为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针。并以p72基因的全长设计引物,扩增p72基因,克隆到pGEM-T载体中,其阳性质粒作为标准品进行标准曲线的制作,其检测范围为10到1.0×107拷贝,本发明设计的引物与探针可检测到10拷贝,灵敏度更高。
本发明的非洲猪瘟荧光PCR方法在检测非洲猪瘟的整个过程中,从DNA提取到出现检测结果,则只需2.5-3h,大大减少手工操作和缩短时间。且本发明一次可检测多个样品,特别适合于大批样品的检测。
本发明的检测方法与虹彩病毒、痘病毒、口蹄疫病毒均无交叉性反应,证明本发明的方法特异性强,且能够检测到的假病毒样品最低浓度为5×102TCID50
本发明的检测方法经验证:同OIE推荐方法相比,诊断敏感性可达99%,诊断特异性可达100%。
附图说明
图1为PCR扩增非洲猪瘟p72基因的结果图;
图2为不同Mg2+浓度与荧光信号关系图;
图3为不同rTaq酶用量与荧光信号关系图;
图4为不同dNTP浓度与荧光信号关系图;
图5为不同引物浓度与荧光信号关系图;
图6为不同探针浓度与荧光信号关系图;
图7为不同退火温度与荧光信号强度关系图;
图8为ASFV质粒DNA拷贝数与荧光信号强度关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。
实施例
本发明中使用的材料及试剂:灭活细胞培养病毒液,非洲猪瘟假病毒样品(5X106TCID50)。
DNeasy Tissue(QIAGEN)动物组织提取DNA试剂盒、DNA扩增基础试剂盒(TaKaRa)、pGEM-T载体系统试剂盒(Promega)、Agarose Gel DNA Purifica tion Kit、DNA Marker等。
本发明中使用的仪器:
iCycler iQTM5荧光实时多波长PCR检测系统,PTC-200梯度PCR仪器,ALPHA-5500凝胶成像系统等。
引物设计与合成
本研究根据ASFV p72(GeneBank No.AY578689)基因序列、采用引物设计软件Primer5.0设计扩增引物。
p72U:5’-TATGGCATCAGGAGGAGC-3’(SEQ ID NO:4)
p72L:5’-GGTACTGTAACGCAGCAC-3’,(SEQ ID NO:5)
扩增产物长度为1939bp。
采用探针设计软件Beacon Designer 7设计荧光PCR特异性引物及探针,引物序列为:
ASFU:5’-ACATTTCCGTAACTGCTCATGG-3,(SEQ ID NO:1)
ASFL:5’-CTCTTGCTCTGGATACGTTAATATG-3’,(SEQ ID NO:2)
探针设计于待扩增序列间的高GC含量区,序列为:
ASFP:5’FAM-CCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTG-Eclipse 3’。(SEQ ID NO:3)
引物和探针均在大连宝生物(TaKaRa)技术有限公司合成。
基因组DNA的提取
采用DNeasy Tissue(QIAGEN)试剂盒,按照说明书提取灭活病毒液的DNA。
p72基因的扩增
PCR反应体系如下:
10×PCR缓冲液2.5μL,2.5mM dNTP 2μL,p72U/p72L各0.5μL,5U/m LTaq DNA聚合酶0.5μL,然后加入2μL从细胞灭活病毒液中提取的基因组DNA作为模板,加灭菌双蒸水使体积至25μL。
PCR反应条件:
在P TC-200梯度PCR仪上,设置如下条件进行反应:94℃预变性5min;然后:94℃,2min;52℃,1min;72℃,2min;45个循环,72℃,延伸10min。
扩增产物的观察
取上述PCR扩增产物5μL,进行1%琼脂糖凝胶电泳,结束后置于凝胶成像仪上观察结果。
标准阳质粒pGEM-T-p72构建
以上述扩增得到的ASFV的p72基因为模板,PCR扩增ASFV的p72基因后,切胶回收PCR产物,克隆到pGEM-T载体,转化E.coli JM 109菌,筛选、鉴定获得含基因片段的重组质粒pGEM-T-p72,送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。
非洲猪瘟荧光PCR检测方法的建立、反应体系和反应条件的优化
荧光PCR反应体系如下:
10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/L MgCl21.5μL,2.5mM dNTP 2μL,20mmol/L ASFU/ASFL各0.5μL,10μmol/L ASFP 0.5μL,5U/μLTaq DNA聚合酶0.5μL,然后加入1μL pGEM-T-p72质粒DNA作为模板,加灭菌双蒸水使体积至25μL。
荧光PCR反应条件:
将样品管放入iCycler IQ Real-time PCR仪后,设置如下条件进行反应:95℃预变性5min;然后采用二步法进行反应:95℃,5s;60℃,30s,40个循环。每个循环结束后采集FAM通道荧光信号数据。
荧光PCR反应体系及反应条件的优化:
分别对反应体系中的MgCl2浓度、dNTP浓度、rTaq酶用量、ASFU/ASFL/ASFP含量以及反应条件中的退火温度逐一进行优化,以获得最佳反应条件。
最佳反应预混液、引物探针预混液的调配:
依据获取的最佳反应体系,进行酶预混液以及引物探针预混液的调配,获得最佳调配组分。
非洲猪瘟荧光PCR检测方法的反应敏感性(ASe)确定
用pGEM-T-p72菌抽提质粒,用核酸蛋白测定仪NanoDrop ND-100进行测定,换算成拷贝数,稀释至1×109copies/μL后,以10倍倍比稀释,稀释至1×100copies/μL。用优化的ASFV荧光PCR条件,进行ASe确定。
非洲猪瘟荧光PCR检测方法的反应特异性(ASp)确定
分别以虹彩病毒DNA、痘病毒DNA、口蹄疫病毒cDNA为模板和pGEM-T-p72的重组质粒同时进行检测,用来确认该检测方法的ASp。
非洲猪瘟假病毒样品方法验证试验
以非洲猪瘟假病毒样品为模板,10倍倍比稀释5个梯度,抽提DNA后,采用上述建立的荧光PCR方法进行验证。
非洲猪瘟荧光PCR检测方法的诊断敏感性(Ase)和诊断特异性(ASp)确定
采用100份已知阳性样品和72份已知阴性样品(俄罗斯联邦兽医研究所提供),提取DNA作为模板,采用本发明建立的荧光PCR方法进行检测。
PCR扩增非洲猪瘟p72基因
以灭活细胞培养病毒液提取的DNA为模板进行扩增,出现特异性条带大小为1939bp,与试验设计引物的预期扩增片段大小相符,插入T载体后的测序结果与GenBank上收录的、美国李子岛(Plum island)非洲猪瘟国际参考实验室Zsak,L.发表的1982株的p72全基因AY578689序列一致性达99%以上。
非洲猪瘟荧光PCR检测方法反应条件的优化的结果
Mg2+浓度的优化结果:
不同Mg2+浓度与荧光信号关系见图2,不同Mg2+浓度与对应的Ct值见表1。由试验结果最终选择1.5μL的MgCl2(25mM)。
表1不同Mg2+浓度与对应Ct值
Figure BDA0001274453840000061
rTaq酶用量的优化结果:
不同rTaq酶用量与荧光信号关系见图3,不同rTaq酶用量与对应的Ct值见表2。由试验结果最终选择0.5μL的rTaq酶。
表2不同rTaq酶用量与对应Ct值
Figure BDA0001274453840000062
dNTP浓度的优化结果:
不同dNTP浓度与荧光信号关系见图4,不同dNTP浓度与对应的Ct值见表3。由试验结果最终选择2μL的dNTP。
表3不同dNTP浓度与对应Ct值
Figure BDA0001274453840000063
引物浓度的优化结果:
不同引物浓度与荧光信号关系见图5,不同引物浓度与对应的Ct值见表4。由试验结果最终选择1μL的引物(上下游引物1:1混合物)。
表4不同引物浓度与对应Ct值
Figure BDA0001274453840000064
探针浓度的优化结果:
不同探针浓度与荧光信号关系见图6,不同探针浓度与对应的Ct值见表5。由试验结果最终选择0.5μL的探针。
表5不同探针浓度与对应Ct值
Figure BDA0001274453840000065
最佳反应预混液、引物探针预混液:
经组分之间最佳量的摸索,最佳反应预混液(2X):10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/LMgCl2 1.5μL,2.5mmol/L dNTP 2μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL。最佳引物探针预混液组分为:10mmol/L ASFU/ASFL各1.0μL,10μmol/L ASFP0.5μL。
不同退火温度的优化结果:
试验结果见图7和表6。图7为不同温度的扩增曲线,发现退火温度在51-60℃之间对反应影响不大。不同温度与对应的Ct值见表6。最终选用60℃作为退火温度。
表6不同温度与对应的Ct值
Figure BDA0001274453840000071
非洲猪瘟荧光PCR检测方法的分析敏感性
使用质粒DNA标准品制作标准曲线。标准品依次10倍稀释,对应的拷贝数为10到1×106作为模板进行荧光定量PCR检测。以获得的临界循环数(thresh old cycle,Ct)为y轴,对应的质粒DNA标准品拷贝数的对数为x轴,制作标准曲线(图8和表7)。得到的标曲线的扩增效率97%,斜率为-3.395,反应的相关系数为0.998。标准曲线方程为:y=-3.395x+40.17。由标准曲线可以得出,该检测方法分析敏感性为10个拷贝数。
表7不同ASFV质粒DNA拷贝数与对应Ct值
Figure BDA0001274453840000072
非洲猪瘟荧光PCR检测方法的分析特异性确定
对虹彩病毒DNA、痘病毒DNA、口蹄疫病毒cDNA和pGEM-T-p72质粒同时进行检测,结果表明只有pGEM-T-p72质粒可产生特异性荧光曲线,其余皆为阴性,证明所设计的引物和探针有着较强的分析特异性。
非洲猪瘟假病毒样品方法验证试验
将不同浓度的假病毒样品进行核酸抽提和荧光PCR扩增。由于浓度为5×101TCID50假病毒样品没有明显且标准的S曲线,因此结论为:该方法能够检测到假病毒样品最低浓度为5×102TCID50,具体对应参考值见表8。
表8不同ASFV假病毒样品浓度与对应Ct值
Figure BDA0001274453840000073
非洲猪瘟荧光PCR检测方法的诊断敏感性(Ase)和诊断特异性(ASp)确定
对已知100份临床阳性样品和72份临床阴性样品进行验证,同OIE推荐方法相比,本发明的检测方法诊断敏感性可达99%,诊断特异性可达100%。
本发明以自行研制的非洲猪瘟假病毒样品为模板,梯度稀释,抽提DNA,进行该方法的验证试验,检测到假病毒样品的检测线为5×102TCID50
本发明的非洲猪瘟荧光PCR方法在检测非洲猪瘟的整个过程中,从DNA提取到出现检测结果,则只需2.5-3h,几种PCR方法相比,大大减少手工操作和缩短时间。该方法一次可检测多个样品,特别适合于大批样品的检测。
本发明优化了非洲猪瘟荧光PCR检测的反应体系:最佳反应预混液(2×):10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/L MgCl2 1.5μL,2.5mmol/L dNTP 2μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL;最佳引物探针预混液组分为:10mmol/L ASFU/ASFL各1.0μL,10μmol/L ASFP0.5μL。
本发明优化了非洲猪瘟荧光PCR检测的PCR条件:设置如下条件进行反应:95℃预变性5min;然后采用二步法进行反应:95℃,5s;60℃,30s,40个循环。每个循环结束后采集数据。
本发明方法分析敏感性结果:以阳性p72质粒为模板进行标准曲线的制作,得到的标曲线的扩增效率97%,斜率为-3.395,反应的相关系数为0.998。标准曲线方程为:y=-3.395+40.17。由标准曲线可以得出,荧光定量PCR的检测灵敏度最低为10个拷贝数。
本发明方法特异性结果:该检测方法与虹彩病毒、痘病毒、口蹄疫病毒均无交叉性反应,证明该方法特异性强。
本发明以非洲猪瘟假病毒样品为模板,进行该荧光检测方法的验证,能够检测到的假病毒样品最低浓度为5×102TCID50
本发明中涉及的序列如下表9所示:
表9本发明中涉及的序列
Figure BDA0001274453840000081
Figure BDA0001274453840000091
假病毒插入序列(SEQ ID NO:6):
ggtactgtaacgcagcacagctgaaccgttctgaagaagaagaaagttaatagcagatgccgataccacaagatcagccgtagtgatagaccccacgtaatccgtgtcccaactaatataaaattctcttgctctggatacgttaatatgaccactgggttggtattcctcccgtggcttcaaagcaaaggtaatcatcatcgcacccggatcatcgggggttttaattgcattgcctccgtagtggaagggtatgtaagagctgcagaactttgatggaaacttatcgataagattgataccatgagcagttacggaaatgtttttaataataggtaatgtgatcggatacgtaacggggctaatatccgatatagatgaacatgcgtctggaagagctgtatctctatcctgaaagcttatctctgcgtggtgagtaggctgcataatggcgttaacaacatgtccgaacttgtgccaatctcggtgttgatgaggattttgatcggagatgttccaggtaggttttaatcctataaacatatattcaatgggccatttaagagcagacattagtttttcatcgtggtggttattgttggtgtgggtcacctgcgttttatggacacgtatcagggaaaatcgaacgcgttttacaaaaaggttgtgtatttcaggggttacaaacaggttattgatgtaaagttcattattcgtgagcgagatttcattaatgactcctgggataaaccatggtttaaagcgtatattgcgtctactggggcgtccaggtataaaacgcgactggcgtataaaaagtccaggaaattcattcaccaaatccttttgcgatgcaagctttatggtgataaagcgctcgccgaagggaatggataccgagggaatagcaaggttcacgttctcgttaaaccaaaagcgcagcttaatccagagcgcaagagggggctgatagtatttaggggtttgaggtccattacagctgtaatgaacattacgtcttatgtccagatacgttgcgtccgtaataggagtaatatcttgtttacctgctgtttggatattgtgagagttctcgggaaaatgttgtgaaaggaatttcgggttggtatggctgcacgttcgctgcgtatcattttcatcggtaagaataggtttgctttggtgcggcttgtgcaaatcatgaatgttgcataggagagggccactagttccctccaccgatacctcctggccgaccaagtgcttatatccagtcattttatcccctgggatgcaaaatttgcgcacaagcgttgtgacatccgaactatattcgtccagggaatttccatttacatcgaatcttacgttttcataaagtcgttctccggggtattcgcagtagtaaaccaagtttcggtacgcattctttgtgccgggtacaataggtcttccaaagggatctacaagcgtgtaaacggcgccctctaaaggtgtttggttgtcccagtcatatccgttgcgaggaaacgtttgaagctgaccatgggcccccatctgggccgtgccctgaatcggagcatcctgccaggacgaatgacatgcacccaatatatggtggcccaccatatcatggaaaaagtctccgtactggggaataccaaaggtaagcttgtttcccaaggtgggggtacccgtatgcgggcgtactttattgtattcaaaccctactggaacataaggcttaaaatgcgcattaaaatgaaccaaatgtgtttcttcgatttgactcaaagtgggttcggggtcgggtttcccataacttttgttcacatttttaatgttagaaatcctgctattaagcaagtcttgggccaatataatcttgtcggccttcccatcgttagcaataagacaaaaagctcctcctgatgccata
本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 非洲猪瘟荧光PCR检测试剂、非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acatttccgt aactgctcat gg 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcttgctct ggatacgtta atatg 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccactgggtt ggtattcctc ccgtg 25
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggcatcag gaggagc 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtactgtaa cgcagcac 18
<210> 6
<211> 1939
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtactgtaa cgcagcacag ctgaaccgtt ctgaagaaga agaaagttaa tagcagatgc 60
cgataccaca agatcagccg tagtgataga ccccacgtaa tccgtgtccc aactaatata 120
aaattctctt gctctggata cgttaatatg accactgggt tggtattcct cccgtggctt 180
caaagcaaag gtaatcatca tcgcacccgg atcatcgggg gttttaattg cattgcctcc 240
gtagtggaag ggtatgtaag agctgcagaa ctttgatgga aacttatcga taagattgat 300
accatgagca gttacggaaa tgtttttaat aataggtaat gtgatcggat acgtaacggg 360
gctaatatcc gatatagatg aacatgcgtc tggaagagct gtatctctat cctgaaagct 420
tatctctgcg tggtgagtag gctgcataat ggcgttaaca acatgtccga acttgtgcca 480
atctcggtgt tgatgaggat tttgatcgga gatgttccag gtaggtttta atcctataaa 540
catatattca atgggccatt taagagcaga cattagtttt tcatcgtggt ggttattgtt 600
ggtgtgggtc acctgcgttt tatggacacg tatcagggaa aatcgaacgc gttttacaaa 660
aaggttgtgt atttcagggg ttacaaacag gttattgatg taaagttcat tattcgtgag 720
cgagatttca ttaatgactc ctgggataaa ccatggttta aagcgtatat tgcgtctact 780
ggggcgtcca ggtataaaac gcgactggcg tataaaaagt ccaggaaatt cattcaccaa 840
atccttttgc gatgcaagct ttatggtgat aaagcgctcg ccgaagggaa tggataccga 900
gggaatagca aggttcacgt tctcgttaaa ccaaaagcgc agcttaatcc agagcgcaag 960
agggggctga tagtatttag gggtttgagg tccattacag ctgtaatgaa cattacgtct 1020
tatgtccaga tacgttgcgt ccgtaatagg agtaatatct tgtttacctg ctgtttggat 1080
attgtgagag ttctcgggaa aatgttgtga aaggaatttc gggttggtat ggctgcacgt 1140
tcgctgcgta tcattttcat cggtaagaat aggtttgctt tggtgcggct tgtgcaaatc 1200
atgaatgttg cataggagag ggccactagt tccctccacc gatacctcct ggccgaccaa 1260
gtgcttatat ccagtcattt tatcccctgg gatgcaaaat ttgcgcacaa gcgttgtgac 1320
atccgaacta tattcgtcca gggaatttcc atttacatcg aatcttacgt tttcataaag 1380
tcgttctccg gggtattcgc agtagtaaac caagtttcgg tacgcattct ttgtgccggg 1440
tacaataggt cttccaaagg gatctacaag cgtgtaaacg gcgccctcta aaggtgtttg 1500
gttgtcccag tcatatccgt tgcgaggaaa cgtttgaagc tgaccatggg cccccatctg 1560
ggccgtgccc tgaatcggag catcctgcca ggacgaatga catgcaccca atatatggtg 1620
gcccaccata tcatggaaaa agtctccgta ctggggaata ccaaaggtaa gcttgtttcc 1680
caaggtgggg gtacccgtat gcgggcgtac tttattgtat tcaaacccta ctggaacata 1740
aggcttaaaa tgcgcattaa aatgaaccaa atgtgtttct tcgatttgac tcaaagtggg 1800
ttcggggtcg ggtttcccat aacttttgtt cacattttta atgttagaaa tcctgctatt 1860
aagcaagtct tgggccaata taatcttgtc ggccttccca tcgttagcaa taagacaaaa 1920
agctcctcct gatgccata 1939

Claims (4)

1.非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,包括非洲猪瘟荧光PCR检测试剂,所述检测试剂包括:PCR特异性引物ASFU和ASFL,探针ASFP,其中特异性引物ASFU的序列如SEQ IDNO:1所示,特异性引物ASFL的序列如SEQ ID NO:2所示,探针ASFP的序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述探针的5′端标记报告荧光染料为FAM,3′端标记荧光淬灭基团为Eclipse。
3.根据权利要求1述的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的PCR反应体系为:2×反应预混液:10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/L MgCl2 1.5μL,2.5mmol/L dNTP2μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL;引物探针预混液:10mmol/L ASFU/ASFL各1.0μL,10μmol/L ASFP 0.5μL。
4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的PCR反应条件为:95℃预变性5min;95℃,5s;60℃,30s,40个循环。
CN201710259976.4A 2017-04-20 2017-04-20 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用 Active CN106957927B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710259976.4A CN106957927B (zh) 2017-04-20 2017-04-20 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710259976.4A CN106957927B (zh) 2017-04-20 2017-04-20 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106957927A CN106957927A (zh) 2017-07-18
CN106957927B true CN106957927B (zh) 2020-11-20

Family

ID=59483847

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710259976.4A Active CN106957927B (zh) 2017-04-20 2017-04-20 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106957927B (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107937349B (zh) * 2017-11-27 2021-01-15 中国检验检疫科学研究院 稳定表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的细胞系及其制备与应用
CN110904099A (zh) * 2018-09-17 2020-03-24 中国动物疫病预防控制中心(农业农村部屠宰技术中心) 一种检测饲料中非洲猪瘟病毒的数字pcr技术及试剂盒
CN111020058A (zh) * 2018-10-09 2020-04-17 福又达生物科技股份有限公司 非洲猪瘟病毒检测方法
CN109735657A (zh) * 2019-02-02 2019-05-10 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN109593893A (zh) * 2019-02-03 2019-04-09 郑州中道生物技术有限公司 非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒
CN110184390A (zh) * 2019-06-10 2019-08-30 河南省动物疫病预防控制中心 用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重fq-pcr检测试剂盒
CN110218762B (zh) * 2019-06-19 2020-12-15 湖南新南方养殖服务有限公司 检测猪场老鼠及其生活环境是否携带非洲猪瘟病毒的方法
CN110358867A (zh) * 2019-08-21 2019-10-22 郑州中道生物技术有限公司 非洲猪瘟病毒荧光型raa检测试剂盒
CN111304361A (zh) * 2019-11-04 2020-06-19 浙江大学 一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及检测非洲猪瘟病毒的方法
CN110777221A (zh) * 2019-12-17 2020-02-11 广东省农业科学院动物卫生研究所 非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量pcr检测组合物、检测方法及检测试剂盒
CN111254220A (zh) * 2020-02-06 2020-06-09 成都导胜生物技术有限公司 一种用于检测非洲猪瘟病毒dna的组合物及试剂盒
CN111218527B (zh) * 2020-03-10 2023-08-22 广州赛百纯生物科技有限公司 一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法
CN111621603A (zh) * 2020-06-23 2020-09-04 广州欧密伽畜牧有限公司 一种鉴定非洲猪瘟病毒的特异性引物及其鉴定方法与检测试剂盒
CN113122549B (zh) * 2021-03-03 2023-02-03 复旦大学 一种非洲猪瘟假病毒及其制备方法和预防或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104745730A (zh) * 2015-04-21 2015-07-01 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 非洲猪瘟病毒cp204l基因的荧光pcr检测试剂及其制备方法与用途
CN105695634A (zh) * 2016-03-28 2016-06-22 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 检测非洲猪瘟病毒的pcr引物、试剂盒及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2649201A4 (en) * 2010-12-10 2014-10-01 Univ Brandeis COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTION AND ANALYSIS OF AFRICAN PORCINE FEVER VIRUS
CN111172321B (zh) * 2020-01-02 2021-04-23 中国检验检疫科学研究院 鉴别非洲猪瘟感染与免疫的荧光pcr检测试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104745730A (zh) * 2015-04-21 2015-07-01 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 非洲猪瘟病毒cp204l基因的荧光pcr检测试剂及其制备方法与用途
CN105695634A (zh) * 2016-03-28 2016-06-22 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 检测非洲猪瘟病毒的pcr引物、试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测技术的研究与评价;郭少平等;《中国畜牧兽医》;20101231;第37卷(第4期);摘要,第77页第2.2-2.4节,图2 *
非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用;李洪利等;《中国畜牧兽医》;20121231;第39卷(第6期);摘要,第39页第2.4-2.6节,图2-4 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106957927A (zh) 2017-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106957927B (zh) 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN110982943A (zh) 一种新型冠状病毒rt-pcr检测方法及试剂盒
CN110760620A (zh) 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法
CN108676920B (zh) 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法
WO2018059195A1 (zh) 一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的hrm检测引物、试剂盒及方法
WO2021238087A1 (zh) 基于热对流pcr的新型冠状病毒快速检测试剂盒
CN110846438A (zh) 犬腺病毒ii型、犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的四重实时荧光定量pcr检测
CN110777221A (zh) 非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量pcr检测组合物、检测方法及检测试剂盒
CN111304371B (zh) 非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量pcr检测组合物、检测方法及检测试剂盒
CN106048094B (zh) 猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量pcr检测试剂盒及引物和探针
CN111286559B (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
CN113462820A (zh) 实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重rt-pcr引物探针组、试剂盒及其检测方法
CN112739833A (zh) 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
Wang et al. Visual detection of porcine epidemic diarrhea virus using a novel reverse transcription polymerase spiral reaction method
CN108624713B (zh) 一种猪伪狂犬病疫苗毒与野毒鉴别检测的方法及试剂盒
CN112553372A (zh) 一种猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒3型双重荧光定量pcr检测引物和探针、试剂盒及方法
CN101178350B (zh) 检测狂犬病毒的试剂盒
CN116814859A (zh) 鉴别非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型的引物探针组合物、试剂盒及方法
Mu et al. Development of a novel SYBR green I-based quantitative RT-PCR assay for Senecavirus A detection in clinical samples of pigs
CN109266786B (zh) 基于e184l基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒和检测方法
CN110885908A (zh) 牛诺如病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN111004868A (zh) 一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光pcr引物、探针及试剂盒
CN111500773A (zh) 一种流行性出血病病毒血清型鉴定荧光定量rt-pcr引物、探针和试剂盒
CN110607404B (zh) 猪肠病毒g型的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒
CN114164300B (zh) 一种可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant