CN106957927B - 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂、非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒及其应用，属于生物工程领域。本发明以p72基因为参考，设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针，并以p72基因的全长设计引物，扩增p72基因，克隆到pGEM‑T载体中，其阳性质粒作为标准品进行标准曲线的制作，其检测范围为10到1.0×10⁷拷贝。本发明的非洲猪瘟荧光PCR方法在检测非洲猪瘟的整个过程中，从DNA提取到出现检测结果，则只需2.5‑3 h，大大减少手工操作和缩短时间。且本发明一次可检测多个样品，特别适合于大批样品的检测。

Description

非洲猪瘟荧光PCR检测试剂、非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒及 其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂、非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种烈性、出血性传染病，病死率接近100％。1921年Montgomery在非洲肯尼亚首先发现。由于对养猪业危害较大，而且尚无有效的疫苗防治，因此它被OIE列为猪的法定上报传染病之首，并受到世界各国的高度关注(Donald P.King等，2003；常华等，2007)。由于ASFV具有复杂的免疫逃避机制，缺乏典型的中和抗体，又没有有效的疫苗用于防疫(孙怀昌，1999)，所以建立一种快速、准确的检测方法就显得尤为重要。虽然目前我国还未发现此病，但是随着国际交流的日益频繁，传入的风险日益加大。

ASFV属于非洲猪瘟科非洲猪瘟属，为正二十面体结构的DNA病毒，分类上接近虹彩病毒科(Iridoviridae)，其DNA结构以及复制方式则与痘病毒科(Poxv iridae)相似。ASFV颗粒有囊膜，直径175～215nm，核衣壳20面体对称。基因组由单分子线状双股DNA组成，大小为170～190kbp。DNA分子具有共价的闭合末端，并有倒置末端重复子及发夹结构，编码200多种蛋白，其中34种为病毒颗粒的结构蛋白。

目前，OIE推荐ELISA、IFA等血清学方法用于ASFV的检测。由于抗体产生需要一定的时间，血清学诊断方法不适于感染早期使用。而PCR法，尤其是实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR qPCR)具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低的优点，近年来在各个领域特别是在基因检测方面被广为应用(李维彬等，2007)。2007年，张泉等以p72基因设计荧光探针引物，以重组的p72基因质粒为标准品制作标准曲线，其检测模板浓度的范围为20到2×10⁶拷贝。

本研究根据GenBank上发表的非洲猪瘟病毒基因信息，在序列比较分析的基础上，选取高度保守的p72基因(编码B646L结构蛋白)作为靶基因，建立ASFV特异的荧光PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂、非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒及其应用，本发明在检测非洲猪瘟的整个过程中，从DNA提取到出现检测结果，则只需2.5-3h，大大减少手工操作和缩短时间。

本发明采用如下技术方案：

非洲猪瘟荧光PCR检测试剂，所述检测试剂是以高度保守的非洲猪瘟病毒p72基因为靶基因的，包括：PCR特异性引物ASFU和ASFL，探针ASFP，其中特异性引物ASFU的序列如SEQ ID NO:1所示，特异性引物ASFL的序列如SEQ ID NO:2所示，探针ASFP的序列如SEQ IDNO:3所示。

更进一步地，所述探针的5′端标记报告荧光染料为FAM，3′端标记荧光淬灭基团为Eclipse。

本发明还提供一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒，包括上所述的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂。

更进一步地，所述试剂盒的PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/LMgCl₂1.5μL，2.5mM dNTP 2μL，20mmol/L ASFU/ASFL各0.5μL，10μmol/L ASFP 0.5μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.5μL，然后加入1μL pGEM-T-p72质粒DNA作为模板，加灭菌双蒸水使体积至25μL。

更进一步地，所述试剂盒的PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃，5s；60℃，30s，40个循环。

本发明还提供非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒在检测非洲猪瘟中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

荧光PCR方法的主要优势是快速，灵敏性高，特异性强，而且，利用此方法还可以对病原进行定量分析。本发明对不同来源的非洲猪瘟毒株的p72基因，进行序列比较与分析，结果显示它们之间具有很高的同源性，说明p72高度保守。因此，以p72基因为参考，设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针。并以p72基因的全长设计引物，扩增p72基因，克隆到pGEM-T载体中，其阳性质粒作为标准品进行标准曲线的制作，其检测范围为10到1.0×10⁷拷贝，本发明设计的引物与探针可检测到10拷贝，灵敏度更高。

本发明的非洲猪瘟荧光PCR方法在检测非洲猪瘟的整个过程中，从DNA提取到出现检测结果，则只需2.5-3h，大大减少手工操作和缩短时间。且本发明一次可检测多个样品，特别适合于大批样品的检测。

本发明的检测方法与虹彩病毒、痘病毒、口蹄疫病毒均无交叉性反应，证明本发明的方法特异性强，且能够检测到的假病毒样品最低浓度为5×10²TCID₅₀。

本发明的检测方法经验证：同OIE推荐方法相比，诊断敏感性可达99％，诊断特异性可达100％。

附图说明

图1为PCR扩增非洲猪瘟p72基因的结果图；

图2为不同Mg2+浓度与荧光信号关系图；

图3为不同rTaq酶用量与荧光信号关系图；

图4为不同dNTP浓度与荧光信号关系图；

图5为不同引物浓度与荧光信号关系图；

图6为不同探针浓度与荧光信号关系图；

图7为不同退火温度与荧光信号强度关系图；

图8为ASFV质粒DNA拷贝数与荧光信号强度关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例

本发明中使用的材料及试剂：灭活细胞培养病毒液，非洲猪瘟假病毒样品(5X10⁶TCID₅₀)。

DNeasy Tissue(QIAGEN)动物组织提取DNA试剂盒、DNA扩增基础试剂盒(TaKaRa)、pGEM-T载体系统试剂盒(Promega)、Agarose Gel DNA Purifica tion Kit、DNA Marker等。

本发明中使用的仪器：

iCycler iQ^TM5荧光实时多波长PCR检测系统，PTC-200梯度PCR仪器，ALPHA-5500凝胶成像系统等。

引物设计与合成

本研究根据ASFV p72(GeneBank No.AY578689)基因序列、采用引物设计软件Primer5.0设计扩增引物。

p72U:5’-TATGGCATCAGGAGGAGC-3’(SEQ ID NO:4)

p72L:5’-GGTACTGTAACGCAGCAC-3’，(SEQ ID NO:5)

扩增产物长度为1939bp。

采用探针设计软件Beacon Designer 7设计荧光PCR特异性引物及探针，引物序列为：

ASFU：5’-ACATTTCCGTAACTGCTCATGG-3，(SEQ ID NO:1)

ASFL：5’-CTCTTGCTCTGGATACGTTAATATG-3’，(SEQ ID NO:2)

探针设计于待扩增序列间的高GC含量区，序列为：

ASFP：5’FAM-CCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTG-Eclipse 3’。(SEQ ID NO:3)

引物和探针均在大连宝生物(TaKaRa)技术有限公司合成。

基因组DNA的提取

采用DNeasy Tissue(QIAGEN)试剂盒，按照说明书提取灭活病毒液的DNA。

p72基因的扩增

PCR反应体系如下：

10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mM dNTP 2μL，p72U/p72L各0.5μL，5U/m LTaq DNA聚合酶0.5μL，然后加入2μL从细胞灭活病毒液中提取的基因组DNA作为模板，加灭菌双蒸水使体积至25μL。

PCR反应条件：

在P TC-200梯度PCR仪上，设置如下条件进行反应：94℃预变性5min；然后：94℃，2min；52℃，1min；72℃，2min；45个循环，72℃，延伸10min。

扩增产物的观察

取上述PCR扩增产物5μL，进行1％琼脂糖凝胶电泳，结束后置于凝胶成像仪上观察结果。

标准阳质粒pGEM-T-p72构建

以上述扩增得到的ASFV的p72基因为模板,PCR扩增ASFV的p72基因后，切胶回收PCR产物，克隆到pGEM-T载体，转化E.coli JM 109菌，筛选、鉴定获得含基因片段的重组质粒pGEM-T-p72，送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。

非洲猪瘟荧光PCR检测方法的建立、反应体系和反应条件的优化

荧光PCR反应体系如下：

10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl₂1.5μL，2.5mM dNTP 2μL，20mmol/L ASFU/ASFL各0.5μL，10μmol/L ASFP 0.5μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.5μL，然后加入1μL pGEM-T-p72质粒DNA作为模板，加灭菌双蒸水使体积至25μL。

荧光PCR反应条件：

将样品管放入iCycler IQ Real-time PCR仪后，设置如下条件进行反应：95℃预变性5min；然后采用二步法进行反应：95℃，5s；60℃，30s，40个循环。每个循环结束后采集FAM通道荧光信号数据。

荧光PCR反应体系及反应条件的优化：

分别对反应体系中的MgCl₂浓度、dNTP浓度、rTaq酶用量、ASFU/ASFL/ASFP含量以及反应条件中的退火温度逐一进行优化，以获得最佳反应条件。

最佳反应预混液、引物探针预混液的调配：

依据获取的最佳反应体系，进行酶预混液以及引物探针预混液的调配，获得最佳调配组分。

非洲猪瘟荧光PCR检测方法的反应敏感性(ASe)确定

用pGEM-T-p72菌抽提质粒，用核酸蛋白测定仪NanoDrop ND-100进行测定，换算成拷贝数，稀释至1×10⁹copies/μL后，以10倍倍比稀释，稀释至1×10⁰copies/μL。用优化的ASFV荧光PCR条件，进行ASe确定。

非洲猪瘟荧光PCR检测方法的反应特异性(ASp)确定

分别以虹彩病毒DNA、痘病毒DNA、口蹄疫病毒cDNA为模板和pGEM-T-p72的重组质粒同时进行检测，用来确认该检测方法的ASp。

非洲猪瘟假病毒样品方法验证试验

以非洲猪瘟假病毒样品为模板，10倍倍比稀释5个梯度，抽提DNA后，采用上述建立的荧光PCR方法进行验证。

非洲猪瘟荧光PCR检测方法的诊断敏感性(Ase)和诊断特异性(ASp)确定

采用100份已知阳性样品和72份已知阴性样品(俄罗斯联邦兽医研究所提供)，提取DNA作为模板，采用本发明建立的荧光PCR方法进行检测。

PCR扩增非洲猪瘟p72基因

以灭活细胞培养病毒液提取的DNA为模板进行扩增，出现特异性条带大小为1939bp，与试验设计引物的预期扩增片段大小相符，插入T载体后的测序结果与GenBank上收录的、美国李子岛(Plum island)非洲猪瘟国际参考实验室Zsak,L.发表的1982株的p72全基因AY578689序列一致性达99％以上。

非洲猪瘟荧光PCR检测方法反应条件的优化的结果

Mg²⁺浓度的优化结果：

不同Mg²⁺浓度与荧光信号关系见图2，不同Mg²⁺浓度与对应的Ct值见表1。由试验结果最终选择1.5μL的MgCl₂(25mM)。

表1不同Mg2+浓度与对应Ct值

rTaq酶用量的优化结果：

不同rTaq酶用量与荧光信号关系见图3，不同rTaq酶用量与对应的Ct值见表2。由试验结果最终选择0.5μL的rTaq酶。

表2不同rTaq酶用量与对应Ct值

dNTP浓度的优化结果：

不同dNTP浓度与荧光信号关系见图4，不同dNTP浓度与对应的Ct值见表3。由试验结果最终选择2μL的dNTP。

表3不同dNTP浓度与对应Ct值

引物浓度的优化结果：

不同引物浓度与荧光信号关系见图5，不同引物浓度与对应的Ct值见表4。由试验结果最终选择1μL的引物(上下游引物1：1混合物)。

表4不同引物浓度与对应Ct值

探针浓度的优化结果：

不同探针浓度与荧光信号关系见图6，不同探针浓度与对应的Ct值见表5。由试验结果最终选择0.5μL的探针。

表5不同探针浓度与对应Ct值

最佳反应预混液、引物探针预混液：

经组分之间最佳量的摸索，最佳反应预混液(2X)：10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/LMgCl₂ 1.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL。最佳引物探针预混液组分为：10mmol/L ASFU/ASFL各1.0μL，10μmol/L ASFP0.5μL。

不同退火温度的优化结果：

试验结果见图7和表6。图7为不同温度的扩增曲线，发现退火温度在51-60℃之间对反应影响不大。不同温度与对应的Ct值见表6。最终选用60℃作为退火温度。

表6不同温度与对应的Ct值

非洲猪瘟荧光PCR检测方法的分析敏感性

使用质粒DNA标准品制作标准曲线。标准品依次10倍稀释,对应的拷贝数为10到1×10⁶作为模板进行荧光定量PCR检测。以获得的临界循环数(thresh old cycle,Ct)为y轴,对应的质粒DNA标准品拷贝数的对数为x轴,制作标准曲线(图8和表7)。得到的标曲线的扩增效率97％，斜率为-3.395,反应的相关系数为0.998。标准曲线方程为：y＝-3.395x+40.17。由标准曲线可以得出，该检测方法分析敏感性为10个拷贝数。

表7不同ASFV质粒DNA拷贝数与对应Ct值

非洲猪瘟荧光PCR检测方法的分析特异性确定

对虹彩病毒DNA、痘病毒DNA、口蹄疫病毒cDNA和pGEM-T-p72质粒同时进行检测，结果表明只有pGEM-T-p72质粒可产生特异性荧光曲线，其余皆为阴性，证明所设计的引物和探针有着较强的分析特异性。

非洲猪瘟假病毒样品方法验证试验

将不同浓度的假病毒样品进行核酸抽提和荧光PCR扩增。由于浓度为5×10¹TCID₅₀假病毒样品没有明显且标准的S曲线，因此结论为：该方法能够检测到假病毒样品最低浓度为5×10²TCID₅₀，具体对应参考值见表8。

表8不同ASFV假病毒样品浓度与对应Ct值

非洲猪瘟荧光PCR检测方法的诊断敏感性(Ase)和诊断特异性(ASp)确定

对已知100份临床阳性样品和72份临床阴性样品进行验证，同OIE推荐方法相比，本发明的检测方法诊断敏感性可达99％，诊断特异性可达100％。

本发明以自行研制的非洲猪瘟假病毒样品为模板，梯度稀释，抽提DNA，进行该方法的验证试验，检测到假病毒样品的检测线为5×10²TCID₅₀。

本发明的非洲猪瘟荧光PCR方法在检测非洲猪瘟的整个过程中，从DNA提取到出现检测结果，则只需2.5-3h，几种PCR方法相比，大大减少手工操作和缩短时间。该方法一次可检测多个样品，特别适合于大批样品的检测。

本发明优化了非洲猪瘟荧光PCR检测的反应体系：最佳反应预混液(2×)：10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl₂ 1.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL；最佳引物探针预混液组分为：10mmol/L ASFU/ASFL各1.0μL，10μmol/L ASFP0.5μL。

本发明优化了非洲猪瘟荧光PCR检测的PCR条件：设置如下条件进行反应：95℃预变性5min；然后采用二步法进行反应：95℃，5s；60℃，30s，40个循环。每个循环结束后采集数据。

本发明方法分析敏感性结果：以阳性p72质粒为模板进行标准曲线的制作，得到的标曲线的扩增效率97％，斜率为-3.395,反应的相关系数为0.998。标准曲线方程为：y＝-3.395+40.17。由标准曲线可以得出，荧光定量PCR的检测灵敏度最低为10个拷贝数。

本发明方法特异性结果：该检测方法与虹彩病毒、痘病毒、口蹄疫病毒均无交叉性反应，证明该方法特异性强。

本发明以非洲猪瘟假病毒样品为模板，进行该荧光检测方法的验证，能够检测到的假病毒样品最低浓度为5×10²TCID₅₀。

本发明中涉及的序列如下表9所示：

表9本发明中涉及的序列

假病毒插入序列(SEQ ID NO:6)：

ggtactgtaacgcagcacagctgaaccgttctgaagaagaagaaagttaatagcagatgccgataccacaagatcagccgtagtgatagaccccacgtaatccgtgtcccaactaatataaaattctcttgctctggatacgttaatatgaccactgggttggtattcctcccgtggcttcaaagcaaaggtaatcatcatcgcacccggatcatcgggggttttaattgcattgcctccgtagtggaagggtatgtaagagctgcagaactttgatggaaacttatcgataagattgataccatgagcagttacggaaatgtttttaataataggtaatgtgatcggatacgtaacggggctaatatccgatatagatgaacatgcgtctggaagagctgtatctctatcctgaaagcttatctctgcgtggtgagtaggctgcataatggcgttaacaacatgtccgaacttgtgccaatctcggtgttgatgaggattttgatcggagatgttccaggtaggttttaatcctataaacatatattcaatgggccatttaagagcagacattagtttttcatcgtggtggttattgttggtgtgggtcacctgcgttttatggacacgtatcagggaaaatcgaacgcgttttacaaaaaggttgtgtatttcaggggttacaaacaggttattgatgtaaagttcattattcgtgagcgagatttcattaatgactcctgggataaaccatggtttaaagcgtatattgcgtctactggggcgtccaggtataaaacgcgactggcgtataaaaagtccaggaaattcattcaccaaatccttttgcgatgcaagctttatggtgataaagcgctcgccgaagggaatggataccgagggaatagcaaggttcacgttctcgttaaaccaaaagcgcagcttaatccagagcgcaagagggggctgatagtatttaggggtttgaggtccattacagctgtaatgaacattacgtcttatgtccagatacgttgcgtccgtaataggagtaatatcttgtttacctgctgtttggatattgtgagagttctcgggaaaatgttgtgaaaggaatttcgggttggtatggctgcacgttcgctgcgtatcattttcatcggtaagaataggtttgctttggtgcggcttgtgcaaatcatgaatgttgcataggagagggccactagttccctccaccgatacctcctggccgaccaagtgcttatatccagtcattttatcccctgggatgcaaaatttgcgcacaagcgttgtgacatccgaactatattcgtccagggaatttccatttacatcgaatcttacgttttcataaagtcgttctccggggtattcgcagtagtaaaccaagtttcggtacgcattctttgtgccgggtacaataggtcttccaaagggatctacaagcgtgtaaacggcgccctctaaaggtgtttggttgtcccagtcatatccgttgcgaggaaacgtttgaagctgaccatgggcccccatctgggccgtgccctgaatcggagcatcctgccaggacgaatgacatgcacccaatatatggtggcccaccatatcatggaaaaagtctccgtactggggaataccaaaggtaagcttgtttcccaaggtgggggtacccgtatgcgggcgtactttattgtattcaaaccctactggaacataaggcttaaaatgcgcattaaaatgaaccaaatgtgtttcttcgatttgactcaaagtgggttcggggtcgggtttcccataacttttgttcacatttttaatgttagaaatcctgctattaagcaagtcttgggccaatataatcttgtcggccttcccatcgttagcaataagacaaaaagctcctcctgatgccata

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 非洲猪瘟荧光PCR检测试剂、非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acatttccgt aactgctcat gg 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcttgctct ggatacgtta atatg 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccactgggtt ggtattcctc ccgtg 25

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggcatcag gaggagc 17

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtactgtaa cgcagcac 18

<210> 6

<211> 1939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtactgtaa cgcagcacag ctgaaccgtt ctgaagaaga agaaagttaa tagcagatgc 60

cgataccaca agatcagccg tagtgataga ccccacgtaa tccgtgtccc aactaatata 120

aaattctctt gctctggata cgttaatatg accactgggt tggtattcct cccgtggctt 180

caaagcaaag gtaatcatca tcgcacccgg atcatcgggg gttttaattg cattgcctcc 240

gtagtggaag ggtatgtaag agctgcagaa ctttgatgga aacttatcga taagattgat 300

accatgagca gttacggaaa tgtttttaat aataggtaat gtgatcggat acgtaacggg 360

gctaatatcc gatatagatg aacatgcgtc tggaagagct gtatctctat cctgaaagct 420

tatctctgcg tggtgagtag gctgcataat ggcgttaaca acatgtccga acttgtgcca 480

atctcggtgt tgatgaggat tttgatcgga gatgttccag gtaggtttta atcctataaa 540

catatattca atgggccatt taagagcaga cattagtttt tcatcgtggt ggttattgtt 600

ggtgtgggtc acctgcgttt tatggacacg tatcagggaa aatcgaacgc gttttacaaa 660

aaggttgtgt atttcagggg ttacaaacag gttattgatg taaagttcat tattcgtgag 720

cgagatttca ttaatgactc ctgggataaa ccatggttta aagcgtatat tgcgtctact 780

ggggcgtcca ggtataaaac gcgactggcg tataaaaagt ccaggaaatt cattcaccaa 840

atccttttgc gatgcaagct ttatggtgat aaagcgctcg ccgaagggaa tggataccga 900

gggaatagca aggttcacgt tctcgttaaa ccaaaagcgc agcttaatcc agagcgcaag 960

agggggctga tagtatttag gggtttgagg tccattacag ctgtaatgaa cattacgtct 1020

tatgtccaga tacgttgcgt ccgtaatagg agtaatatct tgtttacctg ctgtttggat 1080

attgtgagag ttctcgggaa aatgttgtga aaggaatttc gggttggtat ggctgcacgt 1140

tcgctgcgta tcattttcat cggtaagaat aggtttgctt tggtgcggct tgtgcaaatc 1200

atgaatgttg cataggagag ggccactagt tccctccacc gatacctcct ggccgaccaa 1260

gtgcttatat ccagtcattt tatcccctgg gatgcaaaat ttgcgcacaa gcgttgtgac 1320

atccgaacta tattcgtcca gggaatttcc atttacatcg aatcttacgt tttcataaag 1380

tcgttctccg gggtattcgc agtagtaaac caagtttcgg tacgcattct ttgtgccggg 1440

tacaataggt cttccaaagg gatctacaag cgtgtaaacg gcgccctcta aaggtgtttg 1500

gttgtcccag tcatatccgt tgcgaggaaa cgtttgaagc tgaccatggg cccccatctg 1560

ggccgtgccc tgaatcggag catcctgcca ggacgaatga catgcaccca atatatggtg 1620

gcccaccata tcatggaaaa agtctccgta ctggggaata ccaaaggtaa gcttgtttcc 1680

caaggtgggg gtacccgtat gcgggcgtac tttattgtat tcaaacccta ctggaacata 1740

aggcttaaaa tgcgcattaa aatgaaccaa atgtgtttct tcgatttgac tcaaagtggg 1800

ttcggggtcg ggtttcccat aacttttgtt cacattttta atgttagaaa tcctgctatt 1860

aagcaagtct tgggccaata taatcttgtc ggccttccca tcgttagcaa taagacaaaa 1920

agctcctcct gatgccata 1939

Claims (4)

1.非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括非洲猪瘟荧光PCR检测试剂，所述检测试剂包括：PCR特异性引物ASFU和ASFL，探针ASFP，其中特异性引物ASFU的序列如SEQ IDNO:1所示，特异性引物ASFL的序列如SEQ ID NO:2所示，探针ASFP的序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针的5′端标记报告荧光染料为FAM，3′端标记荧光淬灭基团为Eclipse。

3.根据权利要求1述的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR反应体系为：2×反应预混液：10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl₂ 1.5μL，2.5mmol/L dNTP2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL；引物探针预混液：10mmol/L ASFU/ASFL各1.0μL，10μmol/L ASFP 0.5μL。

4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃，5s；60℃，30s，40个循环。

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