CN114164300B - 一种可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒及其使用方法 - Google Patents
一种可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒及其使用方法，iiPCR试剂盒包括iiPCR扩增液、阳性对照和阴性对照，所述iiPCR扩增液包括引物探针组，所述引物探针组所述包括第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针。本发明针对临床中血清和全血样品，无需核酸提取，血清可直接作为iiPCR模板，全血样品仅需瞬时离心取上清作为模板，即可完成iiPCR检测，且不影响其特异性与敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及猪瘟病毒技术领域，尤其涉及一种可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒及其使用方法。
背景技术
非洲猪瘟病毒是全球致病力最强的猪病毒病之一，目前没有有效的疫苗使用，精准诊断和扑杀相结合是各国唯一的防控手段。自2018年以来，我国陆续出现非洲猪瘟病毒基因I型和II型的流行，但目前尚未有能够区分非洲猪瘟病毒基因I型与基因II型的方法。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属成员，该病毒基因组全长可达170-190bp，病毒结构复杂，诊断难度非常大。
目前市场上非洲猪瘟病毒的核酸检测方法主要是PCR和荧光PCR方法，且主要用于区分非洲猪瘟病毒野毒和非洲猪瘟缺失毒株如缺失p72、CD2v、MGF360等蛋白相关基因毒株的鉴别诊断方法，尚无能够区分基因I型和基因II型的分型诊断方法。通过分析大量非洲猪瘟病毒基因I型和基因II型毒株的全基因序列，发现E296R基因相对保守，如果能在此保守区域设计出鉴别基因I型与II型的手段，则会有效提高非洲猪瘟的疫情防控。
其次，现有的样品检测过程中需要进行核酸提取，以提取后的模板进行PCR检测，如果不进行核酸提取，会影响其特异性与敏感性。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒及其使用方法，目的是实现20分钟便能有效鉴定非洲猪瘟病毒I型与II型，且具有灵敏度高、特异性好的特性。
基于上述目的，本发明提供了一种可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒，包括iiPCR扩增液、阳性对照和阴性对照，所述iiPCR扩增液包括引物探针组，所述引物探针组所述包括第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的基因I型上游引物和如SEQ ID NO.2所示的基因I型下游引物，所述第一探针包括如SEQ ID NO.3所示的基因I型探针，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的基因II型上游引物和如SEQ ID NO.5所示的基因II型下游引物，所述第二探针包括如SEQID NO.6所示的基因II型探针。
优选的，所述阳性对照为人工合成的如SEQ ID NO.7所示的非洲猪瘟病毒DNA片段，所述阴性对照为Nuclease-free水。
作为一种可选的实施方式，所述试剂盒还包括待测样品。
作为一种可选的实施方式，所述待测样品为非洲猪的全血、血清、淋巴结、脾脏、扁桃体、肌肉、咽肛拭子或粪便中的一种。
优选的，所述iiPCR扩增液为18μl，采用模板为2μl，iiPCR扩增液包括Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT、甘油和Tween-20，含量分别为0.25U/μl、10mM、0.05mM、0.05mM、30％V/V、0.1％V/V，基因I型上游引物、基因II型上游引物、基因I型下游引物、基因II型下游引物浓度均为5μM，第一探针及第二探针的引物浓度为2.5μM，dNTPs的浓度为2.5mM，所述模板为非洲猪的血清、全血上清液或提取的DNA模板。
优选的，所述第一探针与第二探针的5’端分别用ROX和FAM荧光标记，3’端均标记BHQ荧光。
优选的，所述试剂盒采用的扩增反应程序上加热器60℃，下加热器95℃，在20分钟反应时间内完成至少50次PCR扩增过程。
申请人发现，采用本申请的试剂盒，针对临床中血清和全血样品，无需核酸提取，血清可直接作为iiPCR模板，全血样品仅需瞬时离心取上清作为模板，即可完成iiPCR检测，且不影响其特异性与敏感性。
本发明中，引物和探针设计针对病毒E296R基因，其中针对基因I型和基因II型的上游引物存在3个核苷酸的差异(上游引物3个核苷酸位点在基因I型和基因II型间存在差异，其中，第二个差异在基因I型中不保守)；下游引物存在1个核苷酸差异；探针存在2个氨基酸差异；两条探针5’端分别用ROX和FAM荧光标记，3’端均标记BHQ荧光，据此建立的荧光iiPCR方法可同时检测到基因I型和II型两类非洲猪瘟病毒。
非洲猪瘟病毒基因I型与II型序列比对及引物、探针设计位置如下(下划线处显示基因I型与II型存在的核苷酸差异)：
本发明还提供所述可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
步骤一、取试剂盒中的iiPCR扩增液分装入iiPCR反应管，分装后瞬时离心；
步骤二、取试剂盒中非洲猪的血清、全血上清液或提取的DNA模板加入步骤一离心后的iiPCR反应管，经瞬时离心后放入iiPCR仪器中；
步骤三、选择ROX和FAM两通道检测荧光，在iiPCR仪器中反应后观测。
所述iiPCR仪器采用热对流PCR检测仪或POCKITTM核酸分析仪。
本发明的有益效果：本发明针对临床中血清和全血样品，无需核酸提取，血清可直接作为iiPCR模板，全血样品仅需瞬时离心取上清作为模板，即可完成iiPCR检测，且不影响其特异性与敏感性。本发明的试剂盒灵敏、便捷、特异性强、敏感性高、可靠性好，只需20分钟便能判定样本是否含有不同基因型的非洲猪瘟病毒，可以同时进行大批量的样本分析，为非洲猪瘟疫情的监测、防控提供有力的技术支持，具有重要的临床实用价值和很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的A组引物对扩增效果验证示意图；
图2为本发明的B组引物对扩增效果验证示意图；
图3为本发明的C组引物对扩增效果验证示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
1.非洲猪瘟I型与II型病毒荧光PCR引物、探针组合的设计
1.1引物、探针设计
通过比对104株非洲猪瘟病毒基因I型与基因II型全基因组序列(附录1)，找到能够区分两个不同型病毒最保守的基因为E296R，可有效鉴别基因I型与基因II型，如表1(SEQID NO.1-6)。
表1实时PCR引物/探针设计
其中：I代表基因I型，II代表基因II型；F代表上游引物；P代表探针；R代表下游引物。
1.2iiPCR方法的反应体系优化
本实施例通过多组份微量组合技术工艺将试剂盒原有多种化学试剂及酶类混合成iiPCR扩增液，来实现试剂盒检测使用的便捷性和敏感性，经优化的反应体系如下：
1.3结果描述及判定
阳性对照检测为阳性，阴性对照检测为阴性，需要在实验中同时成立，否则本次实验无效，需重新检测。仪器在检测结束时自动显示样品的检测结果，被检测样品在仪器中对应的检测控中可分别显示：基因I型阳性、基因II型阳性；或基因I型阳性、基因II型阴性；或基因I型阴性、基因II型阳性；或基因I型阴性、基因II型阴性，分别对应基因I型II型均为阳性、基因I型阳性、基因II型阳性、和基因I型II型均为阴性四种结果。
2.iiPCR引物探针组合的筛选
针对非洲猪瘟病毒E296R基因设计针对基因I型与基因II型各3组引物，并于基因I型II型的特异性探针进行组合，(3组引物对应的基因I型与基因II型的探针相同)，其中，3组引物分别为A组、B组和C组，其中B组采用如上表1中的引物组，A组和B组的引物组如下，首先应用荧光PCR方法对上述引物探针组合进行验证，结果发现A组引物敏感性不够，B组引物扩增效果较好，C组引物存在漏检情况(图1-3)，因此选定B组引物和两条探针进行组合，上游引物、下游引物浓度为5μM、探针引物浓度为2.5mM。
A组引物(SEQ ID NO.8-11所示)，具体如下：
I-F：TGAAGTACCTTGGATGTCAAT
I-R：TAGTTAATGGCTAGGCCTACTC
II-F：CGCTTAGCTGGACAAGGTCCATAC
II-R：TTACTTTAAGCGAATTAATGCAT
B组引物(SEQ ID NO.12-15所示)，具体如下：
I-F：AAATCTTACGTTTTACAAAT
I-R：TGATTACCCAAATTCTGAC
II-F：ATTCGTTTCCCATGGCCAT
II-R：GCGGTTTAAACTAACTTTG
3.iiPCR反应方法的建立
1)iiPCR反应体系配置
取适量专用iiPCR反应管，使用窄口枪头对iiPCR扩增液进行分装，分装完后瞬时离心。
2)加样
向上述iiPCR反应管中加入事先提取好的组织样本DNA、或血清、或全血上清2μl，盖紧管盖，瞬时离心，放置iiPCR仪器中，iiPCR仪器可使用台湾瑞基海洋生物科技股份有限公司开发的POCKIT TM核酸分析仪和阿赫姆生物系统公司(韩国)开发的热对流PCR检测仪。
3)上机扩增
使用热对流PCR仪，上加热器60℃，下加热器95℃，选择ROX和FAM两通道检测荧光，反应时间20分钟。样品阴阳性在反应结束后自动显示。
4)结果
上述条件和参数可有效扩增阳性组织样品DNA中、血清中和全血上清中目的基因片段，具有良好的特异性和敏感性。
4.ASFV分型iiPCR试剂盒的设置
试剂盒包括用iiPCR扩增液、阳性对照和阴性对照。其中iiPCR扩增液如上述1.2，阳性对照为人工合成的非洲猪瘟病毒DNA片段，阳性对照为Nuclease-free水。所合成的DNA片段(SEQ ID NO.7所示)如下：
该试剂盒适用于全血、血清、淋巴结、脾脏、扁桃体、肌肉、咽肛拭子、环境样品、粪便等样品的非洲猪瘟病毒基因I型和基因II型核酸检测。
5.iiPCR方法特异性验证
利用本专利中建立iiPCR方法对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)进行扩增，结果均为阴性，无特异性扩增曲线(表2)。
表2.iiPCR方法特异性验证
| 样品 | ASFV基因I型 | ASFV基因II型 |
| ASFV基因I型DNA | + | - |
| ASFV基因II型DNA | - | + |
| CSFV cDNA | - | - |
| PRRSV cDNA | - | - |
| JEV cDNA | - | - |
| PCV2 DNA | - | - |
| PPV DNA | - | - |
6.iiPCR方法敏感性验证
将已知浓度(1000000拷贝数)的质粒连续做10倍倍比稀释后作为模板，用iiPCR进行扩增，验证敏感性。iiPCR对基因I型和基因II型的检测下限均为10个拷贝(表3),且与OIE推荐的荧光PCR方法检测结果相符。
表3.iiPCR方法敏感性验证
7.iiPCR对不同类型样品的检测
取不同类型阳性样品DNA进行检测，并与OIE推荐的荧光PCR方法进行比较，结果显示OIE推荐的方法检测结果均为阳性，但不能区分基因I型和基因II型；而该专利中的方法也均为阳性，且可区分基因I型与基因II型(表4)。
表4.iiPCR方法和OIE推荐方法对不同类型阳性DNA的验证与比对
8.直接用血清和全血上清样品作为模板进行iiPCR检测
为了进一步简化流程，应用本发明中iiPCR方法检测血清和全血样品无需提取核酸DNA，血清样品可直接作为模板，全血样品瞬时离心后取上层澄清样品直接作为模板，可使用iiPCR方法进行检测，且敏感性与提取后的核酸DNA模板相当(表5)。此方法极大简化了PCR操作流程，缩短了检测时间。
表5.iiPCR方法可直接用于血清和全血上清的检测
附录1：104株非洲猪瘟病毒I型与II型全基因组序列用于本专利中PCR引物和探针的设计
其中，下划线部分为基因II型。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种可快速鉴别ASFV 基因I型与基因II型的试剂盒及其使用方法
<130> 1
<141> 2021-12-18
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 1
attagtttta cacctaggcg cc 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 2
gcctgaactt atcgtgga 18
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 3
ctgctccatt gtactgtatt tatatg 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 4
gttagtttta cacctaggcg ct 22
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 5
gcctgaactt attatgga 18
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 6
ctgctcaatt gtactgtatt tatatg 26
<210> 7
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 7
cggtattaaa ggagttagtt ttacacctag gcgctctgtg gagcctgaac ttatctgatg 60
gaaggactaa aaaaaattaa gccggttgag ggggttgtca tttacctgga aaccccgcat 120
aacaaacatc atacatataa atacagtaca atgtgagcag atcaaa 166
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 8
tgaagtacct tggatgtcaa t 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 9
tagttaatgg ctaggcctac tc 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 10
cgcttagctg gacaaggtcc atac 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 11
ttactttaag cgaattaatg cat 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 12
aaatcttacg ttttacaaat 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 13
tgattaccca aattctgac 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 14
attcgtttcc catggccat 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 15
gcggtttaaa ctaactttg 19
Claims (6)
1.一种可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒，其特征在于，包括iiPCR扩增液、阳性对照和阴性对照，所述iiPCR扩增液包括引物探针组，所述引物探针组包括第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的基因I型上游引物和如SEQ ID NO.2所示的基因I型下游引物，所述第一探针包括如SEQ IDNO.3所示的基因I型探针，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的基因II型上游引物和如SEQ ID NO.5所示的基因II型下游引物，所述第二探针包括如SEQ ID NO.6所示的基因II型探针。
2.根据权利要求1所述可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为人工合成的如SEQ ID NO.7所示的非洲猪瘟病毒DNA片段，所述阴性对照为Nuclease-free水。
3.根据权利要求1所述可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括待测样品。
4.根据权利要求3所述可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒，其特征在于，所述待测样品为非洲猪的全血、血清、淋巴结、脾脏、扁桃体、肌肉、咽肛拭子或粪便中的一种。
5.根据权利要求1所述可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒，其特征在于，所述iiPCR扩增液为18μl，采用模板为2μl，iiPCR扩增液包括Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT、甘油和Tween-20，含量分别为0.25U/μl、10mM、0.05mM、0.05mM、30%V/V、0.1% V/V，基因I型上游引物、基因II型上游引物、基因I型下游引物、基因II型下游引物浓度均为5μM，第一探针及第二探针的引物浓度为2.5μM，dNTPs 的浓度为2.5mM，所述模板为非洲猪的血清、全血上清液或提取的DNA模板。
6.根据权利要求1所述可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒，其特征在于，所述第一探针与第二探针的5’端分别用ROX和FAM荧光标记，3’端均标记BHQ荧光。
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