CN111440900A - 用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒及其应用。所述的试剂盒包含核酸提取液、2×Direct qRT‑PCR Mix、酶混合液、阴性对照，阳性对照以及引物和探针的混合物，其中所述的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示，所述的探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示探针的5’端分别标记荧光报告基团HEX和FAM；所述探针的3’端标记小沟结合物(MGB)和荧光淬灭基团(BHQ‑1)。本发明可实现在一个反应中同时对猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒进行快速鉴别检测，具有特异性高，稳定性好，操作简便的优点。不仅适用于科研单位定量分析，而且适合于各级防控单位，基层兽医站，大中型养殖场等的病原检测分析，具有较好的应用前景。

Description

用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量 RT-PCR检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于猪瘟病毒及非洲猪瘟病毒检测的试剂盒及其应用，特别涉及一种采用多重一步直扩实时荧光定量RT-PCR(探针法实时-定量聚合酶链反应)检测猪瘟病毒及非洲猪瘟病毒的试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的使用方法。属于分子生物学检测技术领域。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus，ASFV)引起的、以软蜱为传播媒介的猪的急性、热性、高度接触性传染病，以高热、皮肤发绀及淋巴结和内脏器官的严重出血为患病特征。非洲猪瘟传染性强、死亡率极高，缺少有效疫苗预防和治疗方法，一旦染病即会造成巨大的经济损失。非洲猪瘟虽名为“猪瘟”，但仅有“高热、严重出血”的症状与急性猪瘟相似。实际上，非洲猪瘟和猪瘟分别是由两种完全不同的病毒引起的传染性疾病。非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种单分子线状双链DNA病毒，属于双链DNA病毒目-非洲猪瘟病毒科-非洲猪瘟病毒属，也是ASFV家族中的唯一成员。它通过软蜱传播来感染野猪和家猪，主要在网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制，造成细胞凋亡，严重影响宿主的免疫系统，一旦发病即可致死。
猪瘟(Classical Swine fever，CSF)俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科，猪瘟病毒属的RNA病毒—猪瘟病毒(Classical Swine fever virus，CSFV)引起的一种急性、发热、接触性传染传染病。猪瘟与非洲猪瘟同样具有高度传染性和致死性，在自然条件下也只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。急性猪瘟发病特征与非洲猪瘟相似，呈败血性变化，表现为器官出血、坏死和梗死。
猪瘟对于很多人并不陌生，1885年首次在美国发现，之后传播至世界各大洲。非洲猪瘟于1921年东非国家肯尼亚首次确认非洲猪瘟疫情，1957年传入欧洲，1971年传入美洲，2007年首次传播至欧亚接壤的格鲁吉亚，迅速传入俄罗斯，并在高加索地区定殖。2012年传入乌克兰，2013年传入白俄罗斯。2017年向东长距离跨越式传播至俄罗斯远东地区伊尔库茨克，2018年8月传入我国辽宁。这两种疫病的流行病学不同非洲猪瘟病毒是虫媒DNA病毒，除了接触传播外，软蜱是主要的传播媒介和贮存宿主，而猪瘟不通过软蜱传播，它是由猪瘟病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病，猪是该病毒的自然宿主，猪瘟的传播主要是以接触传播为主。
猪瘟与非洲猪瘟最大的不同点在于，猪瘟尚可采用疫苗防控，但目前还没有可用于预防非洲猪瘟的疫苗。至今ASFV的流行底细不明，还没有商品化的疫苗和诊断试剂可用，ASFV仍然处于失控状态，ASFV防控形式严峻。并且因临床发病症状与猪瘟相似，对猪瘟防控形成严重干扰。因此，建立一种鉴别诊断ASFV和CSFV的方法至关重要。
常规的病原学诊断方法主要有病毒的分离与鉴定、病毒抗原检测等，每种诊断方法都有其适用的范围。用常规病原学方法对血液、淋巴结等病毒含量低微的样品进行检测，往往得不到准确的结果。已有的RT-PCR检测方法只能进行定性检测不能做精确定量分析，且扩增后需要经过电泳分析，每次检测的样品数量较少、对低含量的样品不易检出。
本发明针对目前的现状，在长期研究的基础上，建立并优化出一种简捷、廉价、敏感的Real-Time RT-PCR鉴别检测ASFV和CSFV的检测方法，并组装成试剂盒。该方法无需体外使用核酸提取试剂盒提取核酸、无需反转录，在同一反应管内就可完成反转录和PCR的过程，通过荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，结果更为准确直观，且无需电泳观察结果。大大缩短了时间和减少了污染的机率。
本发明通过反复试验以及对引物浓度和探针浓度的优化，确定以下参数：(1)制作标准曲线的相关系数R2大于0.977；斜率位于-3--3.5之间；PCR扩增效率E位于0.9-1.2之间，符合线性关系、扩增效率要求；(2)35Cycles内可得到好的定量结果，符合灵敏度要求；(3)阴性对照35Cycles内无引物二聚体产生，符合阴性要求。因此，该方法具有快速、灵敏、特异、定性、定量、低污染率等特点，优于普通PCR方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感、准确及定量的检测需求，从而提供一种能够快速、敏感、准确以及定量地检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪瘟病毒(CSFV)的双重一步直扩实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，在一个反应体系中即可完成ASFV和CSFV的核酸检测。
为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：
本发明一种用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述的试剂盒中包含核酸提取液、2×Direct qRT-PCR Mix、酶混合液、阴性对照，阳性对照以及引物和探针的混合物，其中所述的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示，所述的探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示探针的5’端分别标记荧光报告基团HEX和FAM；所述探针的3’端标记小沟结合物(MGB)和荧光淬灭基团(BHQ-1)。
其中，优选的，所述核酸提取液通过以下方法制备得到：
将异硫氰酸胍25g溶于33ml CSB缓冲液中，混合至完全溶解；其中所述的CSB缓冲液中含有42mM柠檬酸钠、0.83％w/v N-lauryl sarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸钠)以及0.2mMβ-巯基乙醇。
其中，优选的，所述SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的引物和SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的探针的浓度均为10pmol/μL，引物及探针的摩尔比为1:1:1:1:1:1。
其中，优选的，所述的阳性对照为含有SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示序列的质粒，所述阴性对照为无核酶水。
其中，优选的，所述的阳性对照为含有SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示序列的pMD-18T质粒。
其中，优选的，所述的试剂盒用于猪瘟和非洲猪瘟病毒检测时，按照以下步骤进行：
a.使用本发明所述的试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR扩增，实时荧光定量RT-PCR总体系为50μl：2×Direct qRT-PCR Mix：37μL；混合酶液:2μL；浓度均为10pmol/μl的引物和探针的混合液：6μL；
实时荧光定量RT-PCR扩增条件为：50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环；
b.结果分析；
根据扩增结果判定：单独选取FAM，在阴性对照没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为猪瘟病毒阳性；Ct值>35为猪瘟病毒阴性；单独选取HEX，在阴性对照没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为非洲猪瘟病毒阳性；Ct值>35为非洲猪瘟病毒阴性。
进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒检测的试剂中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明的试剂盒包涵了快速制备病毒核酸的试剂，适用于从动物血液中和组织病料中直接提取病毒核酸，并用于后续的qPCR扩增和检测，整个提取过程无需有机溶剂抽提，无需乙醇沉淀，简便，快捷，而且质量稳定可靠；
(2)本发明试剂盒在一个体系中可同时鉴别诊断ASFV和CSFV，在不影响扩增效率的前提下实现了双重扩增，而且无需额外提病毒RNA或DNA，无需反转录，只需将待检样品加入反应管中，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，计算待检样品拷贝数，结果更为准确直观，省时省力，成本较低，时间由原来的3-4小时缩短到1-1.5小时，并且比普通PCR的灵敏度高，可用于检测低微含量样品中的猪瘟和非洲猪瘟病毒。
(3)与SYBR等染料法荧光定量PCR技术相比，Taqman qPCR具有更好的特异性，并能缩短反应时间；
(4)一般探针的猝灭集团为TAMRA，TAMRA本身为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，自身会在更高波长处发射荧光，此发射荧光会对报告基团的检测造成影响，探针荧光本底相对较高，本发明使用的淬灭基团BHQ-1为非荧光染料，自身身不发射荧光，因此，探针荧光本底低，信噪比更大，检测灵敏度更高；同时本发明使用了MGB，能提高探针Tm值，从而可缩短探针长度，有利于探针设计，且提高了配对与非配对模板间的Tm值差异，使实验结果更稳定和精确。
(5)本发明的试剂盒不仅适用于科研单位定量分析，而且适合于各级防控单位，基层兽医站，大中型养殖场等的病原检测分析，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明制作的标准曲线；
图2为本发明样本检测图(FAM)；
其中：1.猪瘟与非洲猪瘟病毒混合物；2.口蹄疫O型；3.口蹄疫A型；4.口蹄疫Asia1型；5.非洲猪瘟病毒；
图3为本发明样本检测图(HEX)；
其中：1.猪瘟与非洲猪瘟病毒混合物；2.口蹄疫O型；3.口蹄疫A型；4.口蹄疫Asia1型；5.非洲猪瘟病毒。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1一种用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
1、引物和探针的设计和制备
从GenBank(基因库)查找ASFV和CSFV毒株，经序列比对寻找每个序列上均保守的区域，选取保守区域并设计一对扩增引物，一条探针，序列如下：
用于非洲猪瘟病毒扩增的引物为：
SEQ ID NO.1：上游引物GGTCGGCCAGGAGGTATCG，
SEQ ID NO.2：下游引物CGTTCGCTGCGTATCATTTTCATC。
用于猪瘟病毒扩增的引物为：
SEQ ID NO.3：上游引物CTGGCCAAGAGGGGTGAGC，
SEQ ID NO.4：下游引物ACAGGCCGTCTTGGGTATTC。
用于非洲猪瘟病毒扩增的探针为：
SEQ ID NO.5：GGAACTAGTGGCCCTCTC。
用于猪瘟病毒扩增的探针为：
SEQ ID NO.6：AGAACCCTGAAGTGG。
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示探针的5’端分别标记荧光报告基团HEX和FAM；所述探针的3’端标记小沟结合物(MGB)和荧光淬灭基团(BHQ-1)。
上述引物和探针由大连宝生物工程有限公司合成并进行标记。
2、阳性对照质粒的制备
1)在上述引物(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4)两侧的基因组序列上，分别设计一对扩增引物ASFV-F、ASFV-R和CSFV-F、CSFV-R，其扩增片段长度分别为317bp和229bp，用于构建阳性对照及标准曲线制作，涵盖了荧光定量引物扩增片段的全部，克隆引物如下：
ASFV-F：5’-GGTCGGCCAGGAGGTATCG-3’(SEQ ID NO.7)；
ASFV-R：5’-CGTTCGCTGCGTATCATTTTCATC-3’(SEQ ID NO.8)。
CSFV-F：5’-ACAAGCCGCACCAAAGCAAACC-3’(SEQ ID NO.9)；
CSFV-R：5’-CTCGCCGAAGGGAATGGATACC-3’(SEQ ID NO.10)。
所述扩增引物扩增出的条带序列为：ASFV-F至ASFV-R由5’端向3’端延长的序列(317bp，SEQ ID NO.11)：CSFV-F至CSFV-R由5’端向3’端延长的序列(274bp，SEQ IDNO.12)：
2)将上述扩增得到的片段插入pMD-18T质粒中，经鉴定后，分别得到含有ASFV和CSFV基因序列的阳性对照质粒pMD-317以及pMD-229；
3)阳性对照质粒pMD-317以及pMD-229按照1:1进行混合，命名为pMD-317/229。
3、核酸提取液的制备
将异硫氰酸胍25g溶于33ml CSB缓冲液中，混合至完全溶解；其中所述的CSB缓冲液中含有42mM柠檬酸钠、0.83％w/v N-lauryl sarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸钠)以及0.2mMβ-巯基乙醇。
核酸提取液使用方法：于1.5ml EP管中将1-2mg组织样本，然后加入200μl裂解液，用组织研磨器充分研磨。将研磨物于95℃加热10分钟，12000rpm离心2分钟，取100μl上清于干净的EP管中。
4、制备试剂盒
本发明试剂盒由以下组分组成：
核酸提取液、2×Direct qRT-PCR Mix(含有dNTP/dUTP混合液，Mg2+)、酶混合液(含有AccTaq DNA聚合酶，AMV反转录酶及热稳定剂UDG)、阴性对照(无核酸酶水)，阳性对照以及浓度均为10pmol/μl引物和探针的混合物。
5、用本发明试剂盒检测ASFV和CSFV的使用方法
(1)PCR总体系为50μl：a.2×Direct qRT-PCR Mix：37μL；b.混合酶液:2μL；c.浓度均为10pmol/μl的引物和探针的混合液：6μL，加入到0.2ml扩增管中；
(2)分别向上述扩增管中加入阳性对照5μl、直接加待检猪蹄部水泡液5μl、阴性对照5μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s(收集荧光)，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
(3)标准曲线制作：对pMD-317/229阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其为：10-1-10-15，每个梯度重复三次进行定量PCR。根据扩增情况从中选取5-6个点制作适合标准曲线要求的标准曲线，如图1所示。
(4)结果分析
根据扩增结果判定：单独选取FAM，在NTC没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为猪瘟病毒阳性；Ct值>35为猪瘟病毒阴性；单独选取HEX，在NTC没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为非洲猪瘟病毒阳性；Ct值>35为非洲猪瘟病毒阴性。
实施例2用本发明实施例1制备的试剂盒检测猪脾脏中的ASFV和CSFV
(1)PCR总体系为50μl：a.2×Direct qRT-PCR Mix：37μL；b.混合酶液:2μL；c.浓度均为10pmol/μl引物和探针的混合液：6μL，加入到0.2ml扩增管中；
(2)分别向上述扩增管中加入阳性对照5μl、直接加用核酸提取液处理的待检猪脾脏研磨液5μl、阴性对照5μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s(收集荧光)，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
(3)标准曲线制作：对pMD-317/229阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其为：10-1-10-15，每个梯度重复三次进行定量PCR。根据扩增情况从中选取5-6个点制作适合标准曲线要求的标准曲线。
(4)结果分析
根据扩增结果判定：单独选取FAM，在NTC没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为猪瘟病毒阳性；Ct值>35为猪瘟病毒阴性；单独选取HEX，在NTC没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为非洲猪瘟病毒阳性；Ct值>35为非洲猪瘟病毒阴性。
实施例3用本发明实施例1制备的试剂盒检测猪淋巴结中的ASFV和CSFV
(1)PCR总体系为50μl。分别将本发明试剂盒中a.2×Direct qRT-PCR Mix：37μL；b.混合酶液:2μL；c.浓度均为10pmol/μl引物和探针的混合液：6μL，加入到0.2ml扩增管中；
(2)分别向上述扩增管中加入阳性对照5μl、直接加用核酸提取液处理的待检猪淋巴结5μl、阴性对照5μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
(3)标准曲线制作：对pMD-317/229阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其为：10-1-10-15，每个梯度重复三次进行定量PCR。根据扩增情况从中选取5-6个点制作适合标准曲线要求的标准曲线。
(4)结果分析
根据扩增结果判定：根据扩增结果判定：单独选取FAM，在NTC没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为猪瘟病毒阳性；Ct值>35为猪瘟病毒阴性；单独选取HEX，在NTC没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为非洲猪瘟病毒阳性；Ct值>35为非洲猪瘟病毒阴性。
实施例4本发明实施例1制备的试剂盒的敏感性分析
1、方法
(1)PCR总体系为50μl：a.2×Direct qRT-PCR Mix：37μL；b.混合酶液:2μL；c.浓度均为10pmol/μl引物和探针的混合液：6μL，加入到0.2ml扩增管中；
(2)分别向上述扩增管中加入10倍梯度稀释(10-5～10-9)的阳性对照质粒pMD-317/229(25μg/ml)5μl、阴性对照5μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增:50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s(收集荧光)，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
(3)结果判定依据
根据扩增结果判定：单独选取FAM，在NTC没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为猪瘟病毒阳性；Ct值>35为猪瘟病毒阴性；单独选取HEX，在NTC没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为非洲猪瘟病毒阳性；Ct值>35为非洲猪瘟病毒阴性。
2、结果
从扩增结果看，在稀释至10-9时，扩增结果处于临界值范围，三次重复，有检测检测为阴性的，也有阳性的，结果不可靠，因此本方法的最低检测极限为10-8稀释，即为0.25ng/μl。
实施例5本发明实施例1制备的试剂盒的特异性分析
1、方法
(1)PCR总体系为50μl：a.2×Direct qRT-PCR Mix：37μL；b.混合酶液:2μL；c.浓度均为10pmol/μl引物和探针的混合液：6μL，加入到0.2ml扩增管中；
(2)分别向上述扩增管中分别加入猪瘟与非洲猪瘟病毒核酸混合物、口蹄疫O型、口蹄疫A型、口蹄疫Asia1型及灭活非洲猪瘟病毒核酸5μl，阴性对照5μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
(3)标准曲线制作：对pMD-317/229阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其为：10-1-10-15，每个梯度重复三次进行定量PCR。根据扩增情况从中选取5-6个点制作适合标准曲线要求的标准曲线。
(4)结果判定依据
根据扩增结果判定：根据扩增结果判定：单独选取FAM，在NTC没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为猪瘟病毒阳性；Ct值>35为猪瘟病毒阴性；单独选取HEX，在NTC没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为非洲猪瘟病毒阳性；Ct值>35为非洲猪瘟病毒阴性。
2、结果
从扩增结果看，在HEX通道，猪瘟与非洲猪瘟病毒核酸混合样品及灭活非洲猪瘟样本有明显的扩增曲线，其他样本均无扩增曲线(图3所示)，说明该检测方法能特性扩增非洲猪瘟病毒核酸。在FAM通道，猪瘟和非洲猪瘟混合样品有明显的扩增，而其他样本均无扩增曲线(图2所示)，说明该检测方法能特性扩增猪瘟病毒核酸。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
ggtcggccag gaggtatcg 19
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
cgttcgctgc gtatcatttt catc 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
ctggccaaga ggggtgagc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
acaggccgtc ttgggtattc 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
ggaactagtg gccctctc 18
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 6
agaaccctga agtgg 15
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 7
ggtcggccag gaggtatcg 19
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 8
cgttcgctgc gtatcatttt catc 24
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 9
acaagccgca ccaaagcaaa cc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 10
ctcgccgaag ggaatggata cc 22
<210> 11
<211> 317
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 11
acaagccgca ccaaagcaaa cctattctta ccgatgaaaa tgatacgcag cgaacgtgca 60
gccataccaa cccgaaattc ctttcacaac attttcccga gaactctcac aatatccaaa 120
cagcaggtaa acaagatatt actcctatta cggacgcaac gtatctggac ataagacgta 180
atgttcatta cagctgtaat ggacctcaaa cccctaaata ctatcagccc cctcttgcgc 240
tctggattaa gctgcgcttt tggtttaacg agaacgtgaa ccttgctatt ccctcggtat 300
ccattccctt cggcgag 317
<210> 12
<211> 274
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 12
ctggccaaga ggggtgagcc aagaaccctg aagtggatta gaaatttcac cgactgtcca 60
ttgtgggtta ccagttgctc cgatgatggc gcgagtggga gtaaagagaa gaagccagat 120
aggatcaaca gaggcaaatt aaaaatagcc ccaaaagagc atgagaagga cagcagaact 180
aggccacctg acgctacgat cgtggtggaa ggagtaaaat accaggtcaa aaagaaaggt 240
aaagttaaag gaaagaatac ccaagacggc ctgt 274

Claims (7)

1.一种用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重一步直扩实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含核酸提取液、2×Direct qRT-PCR Mix、酶混合液、阴性对照，阳性对照以及引物和探针的混合物，其中所述的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示，所述的探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示探针的5’端分别标记荧光报告基团HEX和FAM；所述探针的3’端标记小沟结合物(MGB)和荧光淬灭基团(BHQ-1)。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取液通过以下方法制备得到：
将异硫氰酸胍25g溶于33ml CSB缓冲液中，混合至完全溶解；其中所述的CSB缓冲液中含有42mM柠檬酸钠、0.83％w/v N-lauryl sarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸钠)以及0.2mMβ-巯基乙醇。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的引物和SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的探针的浓度均为10pmol/μL，引物及探针的摩尔比为1:1:1:1:1:1。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为含有SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示序列的质粒，所述阴性对照为无核酶水。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为含有SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示序列的pMD-18T质粒。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于猪瘟和非洲猪瘟病毒检测时，按照以下步骤进行：
a.使用权利要求1-5任一项所述的试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR扩增，实时荧光定量RT-PCR总体系为50μl：2×Direct qRT-PCR Mix：37μL；混合酶液:2μL；浓度均为10pmol/μl的引物和探针的混合液：6μL；
实时荧光定量RT-PCR扩增条件为：50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环；
b.结果分析；
根据扩增结果判定：单独选取FAM，在阴性对照没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为猪瘟病毒阳性；Ct值>35为猪瘟病毒阴性；单独选取HEX，在阴性对照没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为非洲猪瘟病毒阳性；Ct值>35为非洲猪瘟病毒阴性。
7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在制备用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒检测的试剂中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114277191A (zh) * 2021-12-31 2022-04-05 华南农业大学 一种检测非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒的引物组合物及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110373500A (zh) * 2019-08-02 2019-10-25 湖南阳铭生物科技有限公司 一种基于双基因的双重荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN110760620A (zh) * 2019-12-12 2020-02-07 黑龙江八一农垦大学 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法
CN110791590A (zh) * 2019-11-12 2020-02-14 南宁众册生物科技有限公司 非洲猪瘟病毒vp72和cd2v基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110373500A (zh) * 2019-08-02 2019-10-25 湖南阳铭生物科技有限公司 一种基于双基因的双重荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN110791590A (zh) * 2019-11-12 2020-02-14 南宁众册生物科技有限公司 非洲猪瘟病毒vp72和cd2v基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及方法
CN110760620A (zh) * 2019-12-12 2020-02-07 黑龙江八一农垦大学 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN,N.等: "Classical swine fever virus strain C-ZJ-2008, complete genome,GenBank: HM175885.1,12311bp RNA linear", 《NCBI GENBANK》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114277191A (zh) * 2021-12-31 2022-04-05 华南农业大学 一种检测非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒的引物组合物及应用
CN114277191B (zh) * 2021-12-31 2023-09-19 华南农业大学 一种检测非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒的引物组合物及应用

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