CN111321248A

CN111321248A - 非洲猪瘟病毒mgf-505r基因荧光pcr检测试剂、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111321248A
Application number: CN202010045654.1A
Authority: CN
Inventors: 邓俊花; 吴绍强; 王彩霞; 冯春燕; 林祥梅
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111321248B

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒（ASFV）MGF‑505R基因荧光PCR检测试剂、试剂盒及其应用，属于病毒检测领域。本发明以MGF‑505R基因为参考，设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针，并以含有MGF‑505R基因序列的质粒作为阳性对照品进行标准曲线的制作，其方法分析敏感性可达到1.36个拷贝。利用本发明检测非洲猪瘟病毒及鉴别以MGF‑505R基因缺失的疫苗株与自然感染株，敏感度高，特异性强，适用于快速检测。

Description

非洲猪瘟病毒MGF-505R基因荧光PCR检测试剂、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体地，涉及非洲猪瘟病毒MGF-505R基因荧光PCR检测试剂、试剂盒及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种烈性、出血性传染病。1921年Montgomery在非洲肯尼亚首先发现。ASFV病毒有囊膜，直径175～215nm，核衣壳20面体对称。基因组由单分子线状双股DNA 组成，大小为170～190Kb，含有151～167个开放阅读框(ORFs)，其中约30％的 ORFs存在多个拷贝，即多基因家族，包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、 MGF505/530和p22，不同分离毒株的ORFs拷贝数也各不相同，MGFs家族基因编码的多个拷贝可能为病毒提供了选择进化的优势。MGFs基因作为免疫逃逸基因，敲除后可降低毒力，增加宿主的免疫应答。Reis等(Reis A L,Abrams C C,Goatley L C.Deletion of African swine fever virus interferon inhibitors[J].Vaccine,2016,34 (39):4698-4705.)将构建的MGF530/505R和MGF360缺陷毒株BeninΔMGF免疫猪后发现，能够100％抵御Benin97/1的攻击，而sanchez-Cordon等(S NCHEZ-CORDN P J,JABBAR T,BERREZAIE M.Evaluation of protection induced by immunisationof domes[J].Vaccine,2018,36(5):707-715.)研究结果最高保护率为83％，提示免疫剂量、免疫方式等影响免疫保护效果。步志高等(步志高陈伟业赵东明等。基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用。申请号：201910348878.7，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)。)研究了针对非洲猪瘟病毒MGF360/505R缺失和CD2V与MGF360/505R联合缺失的基因缺失病毒两种疫苗株，均对非洲猪瘟中国流行强毒株产生100％免疫保护。

ASFV病毒有囊膜，直径175～215nm，核衣壳20面体对称。基因组由单分子线状双股DNA组成，大小为170～190Kb，含有151～167个开放阅读框（ORFs），其中约30%的ORFs存在多个拷贝，即多基因家族，包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505/530和p22，不同分离毒株的ORFs拷贝数也各不相同，MGFs家族基因编码的多个拷贝可能为病毒提供了选择进化的优势。MGFs基因作为免疫逃逸基因，敲除后可降低毒力，增加宿主的免疫应答。Reis等（Reis A L, Abrams C C, Goatley L C. Deletion of African swine fever virusinterferon inhibitors[J]. Vaccine, 2016, 34 (39) :4698-4705.）将构建的MGF530/505R和MGF360缺陷毒株Benin∆MGF免疫猪后发现，能够100%抵御Benin97/1的攻击，而sanchez-Cordon等（S NCHEZ-CORD N P J, JABBAR T, BERREZAIE M. Evaluation ofprotection induced by immunisation of domes [J].Vaccine, 2018, 36 (5) :707-715.）研究结果最高保护率为83%，提示免疫剂量、免疫方式等影响免疫保护效果。步志高等（步志高陈伟业赵东明等。基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用。申请号：201910348878.7，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)。）研究了针对非洲猪瘟病毒MGF360/505R缺失和CD2V与MGF360 /505R联合缺失的基因缺失病毒两种疫苗株，均对非洲猪瘟中国流行强毒株产生100%免疫保护。

然而，目前没有针对非洲猪瘟病毒MGF-505R基因的快速、有效检测试剂盒。另外，适用于MGF-505R基因缺失的非洲猪瘟免疫猪的鉴别诊断尚为空白。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明人基于GeneBank上发表的非洲猪瘟病毒（ASFV）序列，在序列比较分析的基础上，选取MGF-505R基因作为靶基因，建立了ASFV特异的荧光PCR检测方法，从而完成本发明。

本发明一方面提供一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂，所述检测试剂是以相对保守的非洲猪瘟病毒MGF-505R基因为靶基因的，包括：PCR特异性引物及探针，其中，所述引物对包括具有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的下游引物；所述探针具有SEQ ID No. 3所示核苷酸序列。所述探针的5'端和3'端分别利用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰。在本发明的一些优选实施方案中，所述荧光报告基团为HEX；所述荧光淬灭基团为Eclipse。

本发明是针对探针法荧光PCR检测非洲猪瘟病毒，本领域技术人员在实际应用中有可能不用探针，而使用染料例如SYBR Green I，即染料法荧光PCR检测方法来达到同样的检测目的。由于本发明引物对的特异性强，染料法可能能够达到一定的甚至同样的技术效果，这应当视为对本发明的等同替换，同样落入本发明的保护范围中。

本发明第二方面提供本发明第一方面所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂在制备非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒中的应用。

本发明的第三方面提供一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。

在本发明中，所述试剂盒还包括阳性对照品。

在本发明的一些实施方案中，所述阳性对照品为pUC-MGF-505R质粒。

在本发明的一些具体实施方案如此，所述阳性对照品是利用以下方法制备的：

1）根据ASFV MGF（GenBank No. NC_044959.1）基因序列人工合成435bp的505R片段；

2）通过酶切、连接，将合成片段克隆到pUC57-simple载体，转化E.coli JM 109菌，筛选、鉴定获得含MGF-505R片段的重组质粒pUC-MGF-505R。

本发明第四方面提供一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测方法，所述方法包括如下的步骤：

1) 提取待检测对象的核酸样品；

2) 利用本方面第一方面所述的试剂或本发明第三方面所述的试剂盒对所述核酸样品进行荧光PCR扩增；

3) 根据扩增曲线判定结果，

如果有典型的扩增曲线，且Ct值小于40，则判定为阳性；如果无典型的扩增曲线或者Ct值大于等于40，则判定为阴性。

在本发明的一些实施方案中，所述荧光PCR的体系如下：

2×TaqMan PCR mix 10µL，10µmol/L所述上游引物0.8µL，10µmol/L所述下游引物1.2µL，10µmol/L所述探针0.7µL，然后加入5.0µL模板，加灭菌双蒸水使体积至20µL。

在本发明的一些实施方案中，所述荧光PCR的程序如下：95℃ 2min；95℃ 5s，55℃20s，40个循环；每个循环结束后采集荧光信号数据。

本发明的有益效果

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

本发明的引物对和探针具有敏感度高，特异性强的特点。其中，敏感性可达1.36个拷贝数。相关引物和探针经在线BLAST分析，为非洲猪瘟病毒特异性引物和探针；同时，以pUC-MGF-505R质粒为阳性对照，分别以猪瘟活疫苗、高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、伪狂犬病活疫苗、猪细小病毒细胞毒、猪圆环病毒2型细胞培养液以及健康猪组织提取的基因组DNA为模板进行检测，只有pUC- MGF-505R质粒可以产生特异性荧光曲线，证明本发明的引物和探针有着较强的分析特异性。

利用本发明分别以猪全血、猪肉火腿、新鲜猪肉、猪粪便样品的基因组DNA、ASFV-P72质粒及缺失MGF-505R基因的合成质粒ASFV-Δ505R为模板，检测63份DNA模板，检测符合率为100%。

利用本发明检测63份DNA模板，检测符合率为100%，与OIE推荐荧光检测方法检测结果一致。

利用本发明，既可以用于非洲猪瘟疫情监测，又可以为针对MGF-505R基因敲除的非洲猪瘟疫苗株的鉴定提供技术支持。

附图说明

图1示出了ASFV-MGF-F引物BLAST分析结果。

图2示出了ASFV-MGF-R引物BLAST分析结果。

图3示出了ASFV-MGF-P探针BLAST分析结果。

图4示出了不同引物浓度与荧光信号关系。

图5示出了不同探针用量与荧光信号关系。

图6示出了不同退火温度与荧光信号强度关系。

图7示出了ASFV质粒DNA拷贝数与荧光信号强度关系。

图8示出了荧光PCR方法特异性检测结果。

图9示出了本发明方法适用性检测结果。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例

材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料：含有非洲猪瘟病毒MGF-505R基因片断的质粒pUC- MGF-505R、仅含有P72全长基因的合成质粒ASFV-P72、缺失MGF-505R基因的合成质粒ASFV-Δ505R均由中国检科院实验室保存。

猪全血组织基因组DNA 50份，经OIE推荐方法检测，24份为核酸阳性，26份核酸阴性；猪肉火腿DNA 2份，经OIE推荐方法检测，为核酸阳性；新鲜猪肉DNA 1份，经OIE推荐方法检测，为核酸阴性；猪粪便DNA 8份，经OIE推荐方法检测，为核酸阴性，均由中国检科院实验室-20℃保存。

1.1.2 主要试剂

E.coli JM 109感受态细胞均购自大连宝生物工程（大连）有限公司；QuantinovaProbe PCR Kit购自QIAGEN公司；pUC57-simple载体系统试剂盒购自Promega公司；AgaroseGel DNA Purification Kit 及Plasmid Mini Kit购自OMEGA公司等。

1.1.3 主要仪器

LightCycler480II PCR检测系统（Roche）。

方法

1.2.1 引物/探针设计与合成

采用探针设计软件Beacon Designer 7设计荧光PCR特异性引物及探针，引物序列为：

ASFV-MGF-F：5'-ACTCATTTACTTATTGAAAAGG-3'（SEQ ID No. 1），

ASFV-MGF-R：5'-AATATAGATGTAGATCCTTATGG-3'（SEQ ID No. 2），

探针设计于待扩增序列间的高GC含量区，序列为：

ASFV-MGF-P：

5'-TAGCACATTCAAAGGTATCTATCATATT-3'（SEQ ID No. 3），5'端利用荧光报告基团HEX标记，3'端利用荧光淬灭基团Eclipse标记。

引物和探针均在华大基因股份有限公司合成。

相关引物和探针经在线BLAST分析，为非洲猪瘟病毒特异性引物和探针。ASFV-MGF-F引物BLAST分析结果如图1所示；ASFV-MGF-R引物BLAST分析结果如图2所示；ASFV-MGF-P探针BLAST分析结果如图3所示。

1.2.2 非洲猪瘟荧光PCR检测方法反应条件的优化

1.2.2.1 荧光PCR反应体系如下：

2×TaqMan PCR mix 10μL，10µmol/L ASFV-MGF-F 1.0μL，ASFV-MGF-R 1.0μL，10μmol/L ASFV-MGF-P 0.5μL，然后加入5.0μL pUC-MGF-505R质粒DNA作为模板，加灭菌双蒸水使体积至20μL。

1.2.2.2 荧光PCR反应条件：

将样品管放入Roche公司LightCycler480II PCR仪后，设置如下条件进行反应：95℃预变性2min；然后采用二步法进行反应：95℃ 5s；60℃ 20s，40个循环。每个循环结束后采集HEX通道荧光信号数据。

1.2.2.3 荧光PCR反应体系及反应条件的优化

1.2.2.3.1 引物（10µmol/L）用量的优化

将引物ASFV-MGF-F/R（10µmol/L）以终浓度200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L、500nmol/L、600nmol/L 5个梯度、棋盘滴定方式进行优化。从多次重复试验中确定引物ASFV-MGF-F/R（10µmol/L）的最佳用量。

1.2.2.3.2 探针（10µmol/L）用量的优化

将探针ASFV-MGF-P（10µmol/L）以终浓度50nmol/L、150nmol/L、250nmol/L、350nmol/L、450nmol/L 5个梯度进行优化。从多次重复试验中确定探针ASFV-MGF-P（10µmol/L）的最佳用量。

1.2.2.3.3 最佳反应温度的优化

设定常规反应退火温度：55℃，60℃。从多次重复试验中确定退火温度的最佳条件。

1.2.3 非洲猪瘟荧光PCR检测方法的敏感性确定

用pUC-MGF-505R菌抽提质粒，用核酸蛋白测定仪NanoDrop ND-100进行测定，换算成拷贝数，稀释至1.36×10⁵ copies/μL后，以10倍倍比稀释，稀释至1.36×10^-1 copies/μL。用优化的ASFV荧光PCR条件，进行敏感性确定。

1.2.4 非洲猪瘟荧光PCR检测方法的特异性确定

以pUC-MGF-505R质粒为阳性对照，分别以猪瘟活疫苗、高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、伪狂犬病活疫苗、猪细小病毒细胞毒、猪圆环病毒2型细胞培养液以及健康猪组织提取的基因组DNA为模板进行检测，用来确认该检测方法的特异性。

1.2.5 非洲猪瘟荧光PCR检测方法的应用

发明人分别以猪全血基因组DNA、猪肉火腿DNA、新鲜猪肉DNA、猪粪便DNA、ASFV-P72质粒及ASFV-Δ505R质粒为检测模板，采用优化的非洲猪瘟荧光PCR方法进行检测，以验证方法的适用性。

结果

2.1 非洲猪瘟荧光PCR检测方法反应条件的优化的结果

2.1.1 引物（10µmol/L）用量的优化结果

不同引物（10µmol/L）用量与荧光信号关系见图4。由试验结果最终选择引物ASFV-MGF-F（10µmol/L）的最佳用量为400nmoL，ASFV-MGF-R（10µmol/L）的最佳用量为600nmoL。

2.1.2 探针（10µmol/L）用量的优化结果

不同引物探针（10µmol/L）用量与荧光信号关系见图5。由试验结果最终选择探针（10µmol/L）的最佳用量为350nmoL。

2.1.3 最佳反应温度的优化结果

结果见图6：不同温度的扩增曲线，发现退火温度在55℃与60℃对应的Ct值分别为13.02与12.84，差异不显著，但是55℃时扩增效率相对较高。最终选用55℃作为退火温度。

非洲猪瘟荧光PCR检测方法的敏感性

使用质粒DNA标准品制作标准曲线。标准品依次10倍稀释，对应的拷贝数为1.36×10^-1到1.36×10⁵作为模板进行荧光定量PCR检测。以获得的临界循环数（threshold cycle，CT）为y轴，对应的质粒DNA标准品拷贝数的对数为x轴，制作标准曲线（图7和表1）。得到的标曲线的扩增效率96.8%，斜率为-3.401。标准曲线方程为：y=-3.401x+38.43。当采用模板为1.36拷贝质粒时，初次检测Ct值为36.89，判为可疑，复检Ct值为37.01，判为阳性，表明本检测方法分析敏感性可达1.36个拷贝数。

表1不同ASFV质粒DNA拷贝数与对应Ct值

2.3非洲猪瘟荧光PCR检测方法的特异性

对猪瘟活疫苗、高致病性猪蓝耳病活疫苗、伪狂犬病活疫苗、猪细小病毒细胞毒、猪圆环病毒2型细胞培养液以及健康猪组织DNA进行检测，结果表明 (如图8)，只有pUC-MGF-505R质粒为模板时可产生特异性荧光曲线，其余皆为阴性，证明所设计的引物和探针有着较强的分析特异性。

非洲猪瘟荧光PCR检测方法的应用

分别以猪全血、猪肉火腿、新鲜猪肉、猪粪便样品的基因组DNA、ASFV-P72质粒及ASFV-Δ505R质粒为模板，采用建立的荧光PCR检测方法进行扩增，检测数据（如表2所示）及检测图谱（如图9所示）显示，该方法检测63份DNA模板，检测符合率为100%，与OIE推荐荧光检测方法检测结果一致。

表2 荧光PCR检测方法适用性检测结果

样本类型	样品数量	核酸阳性	核酸阴性
				猪全血基因组DNA	50	24	26
猪肉火腿基因组DNA	2	2	0
				新鲜猪肉基因组DNA	1	0	1
猪粪便基因组DNA	8	0	8
				缺失MGF-505R基因的合成质粒ASFV-Δ505R	1	0	1
ASFV-P72质粒	1	0	1
				总计	63	26	37

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 非洲猪瘟病毒MGF-505R基因荧光PCR检测试剂、试剂盒及其应用

<130> XY-2019-1-W-091

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actcatttac ttattgaaaa gg 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aatatagatg tagatcctta tgg 23

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tagcacattc aaaggtatct atcatatt 28

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂是以相对保守的非洲猪瘟病毒MGF-505R基因为靶基因的，包括：PCR特异性引物及探针，其中，所述引物对包括具有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的下游引物；所述探针具有SEQ ID No. 3所示核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂，其特征在于，所述探针的5'端标记报告荧光染料为HEX，3'端标记荧光淬灭基团为Eclipse。

3.权利要求1所述的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂在制备非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒中的应用。

4.一种非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR的体系如下：2×TaqMan PCR mix 10µL，10µmol/L所述上游引物0.8µL，10µmol/L所述下游引物1.2µL，10µmol/L所述探针0.7µL，然后加入5.0µL模板，加灭菌双蒸水使体积至20µL。

6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR的反应条件如下：95℃2min；95℃ 5s，55℃ 20s，40个循环；每个循环结束后采集荧光信号数据。

7.权利要求4所述的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒在检测非洲猪瘟中的应用。

8.一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测方法，所述方法包括如下的步骤：

1) 提取待检测对象的核酸样品；

2) 利用权利要求1所述的检测试剂或权利要求4所述的检测试剂盒对所述核酸样品进行荧光PCR扩增；

3) 根据扩增曲线判定结果，