CN116162734A - 一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物、探针和试剂盒 - Google Patents
一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物、探针和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物、探针和试剂盒，涉及生物检测技术领域。本发明提供了一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物和探针，可用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失毒株三通道荧光定量检测试剂盒，经试验证实，本发明所述特异性引物和探针特异性好，具有较高的敏感性和稳定性。利用本发明包括所述特异性引物和探针的三通道荧光定量检测试剂盒对临床样本进行检测，检测结果与市场商品化非瘟检测试剂盒检测结果一致，符合率为100％，即本发明试剂盒可用于非洲猪瘟临床样本的检测，具有可靠的灵敏度和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物、探针和试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟为双链DNA病毒，是一种高度接触性和致死性传染病，急性病例临床症状以高热、病程短、死亡率高、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征，基因组DNA的碱基数约为17万到19万，其中含有151至167个开放阅读框，ASFV编码多种蛋白质，这些蛋白质组装病毒的结构蛋白，参与逃避宿主防御机制，诸如I型干扰素和细胞凋亡途径等，以及DNA复制的修复和基因表达的调控的生物学过程。
目前所谓的病毒变异主要有两种：一种是病毒的自然变异，另一种是非法使用所谓“非洲猪瘟疫苗”所带来的变异。目前猪场流行的基因缺失毒株主要有三种：第一种为MGF区段缺失毒株，第二种为CD2V区段缺失毒株，第三种为MGF和CD2V两个区段缺失毒株，这几种毒株与野毒株相比毒力有所下降；此外，有报道称出现非洲猪瘟病毒I177L基因缺失的毒株。
然而，基因变异的病毒致死率低，较高致死率的野毒很难提前发现，导致及早发现、精准剔除的效果大打折扣，甚至失灵。尽管行业一直期待疫苗，但世界上的研究进展尚无法满足安全性这一首要需求，截至2022年4月，尚无官方批准的有效疫苗供养猪场使用，国内非洲猪瘟的防控依旧以严格的生物安全定点清除传染源和阻断传播途径为主，因此，能快速区分野毒株和基因缺失毒株的意义重大。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物，能够快速区分非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株，具有良好的敏感性和重复性。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物，所述特异性引物包括CD2V-F、CD2V-R、1R-F、1R-R、I177L-F和I177L-R；所述CD2V-F、CD2V-R、1R-F、1R-R、I177L-F和I177L-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～6所示。
本发明提供了一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性荧光探针，所述特异性荧光探针包括CD2V-P、1R-P和I177L-P，所述CD2V-P、1R-P和I177L-P的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～9所示。
优选的，所述特异性荧光探针的5'端修饰有荧光基团，所述特异性荧光探针的3'端修饰有淬灭基团。
优选的，所述荧光基团为CY5、Texas Red或6-FAM，所述淬灭基团为BHQ2或BHQ1。
本发明提供了上述的特异性引物或上述的特异性荧光探针在鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失毒株中的应用。
本发明还提供了一种鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失毒株的三通道荧光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异性引物和上述的特异性荧光探针。
优选的，所述特异性引物的添加比例为1R：CD2V：I177L＝2-4：1-3：6-9。
优选的，所述特异性荧光探针的添加比例为1R：CD2V：I177L＝1-3：2-5：3-7。
优选的，所述试剂盒包括如下反应体系：2×TTX Buffer(含dUTP)10μL，Taq酶0.25μL，1R-F 0.3μL、1R-R 0.3μL，1R-P探针0.2μL，CD2V-F 0.2μL、CD2V-R 0.2μL，CD2V-P探针0.3μL，I177L-F0.8μL、I177L-R 0.8μL，I177L-P探针0.4μL，去离子水1.5μL，样本核酸5μL。
本发明提供了一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物和探针，可用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失毒株三通道荧光定量检测试剂盒，经试验证实，本发明所述特异性引物和探针特异性好，具有较高的敏感性和稳定性。利用本发明包括所述特异性引物和探针的三通道荧光定量检测试剂盒对临床样本进行检测，检测结果与市场商品化非瘟检测试剂盒检测结果一致，符合率为100％，即本发明试剂盒可用于非洲猪瘟临床样本的检测，具有可靠的灵敏度和准确性。
附图说明
图1为三个通道同时扩增展示图。
图2为三通道荧光定量PCR标准曲线绘制图的结果，其中，A为I177L基因的扩增展示图，B为I177L基因标准曲线绘制图，C为MGF505-1R基因的扩增展示图，D为MGF505-1R基因标准曲线绘制图，E为CD2V基因的扩增展示图，F为CD2V基因标准曲线绘制图。
图3为三通道荧光定量特异性实验，其中，A图为ASFV-△MGF单基因缺失株；B图为ASFV-△CD2V单基因缺失株；C图为ASFV-△MGF-△CD2V双基因缺失株。
具体实施方式
本发明提供了一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物，所述特异性引物包括CD2V-F、CD2V-R、1R-F、1R-R、I177L-F和I177L-R；所述CD2V-F、CD2V-R、1R-F、1R-R、I177L-F和I177L-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～6所示。
本发明提供了一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性荧光探针，所述特异性荧光探针包括CD2V-P、1R-P和I177L-P，所述CD2V-P、1R-P和I177L-P的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～9所示。
本发明中，所述CD2V-F、CD2V-R和CD2V-P根据CD2V基因设计得到，所述CD2V基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述1R-F、1R-R和1R-P根据MGF505-1R基因设计得到，所述MGF505-1R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述I177L-F、I177L-R和I177L-P根据I177L基因设计得到，所述I177L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。本发明以CD2V、MGF505-1R和I177L基因作为靶基因在鉴别非洲猪瘟病毒阳性的情况下，对这三个区域的基因进行鉴别扩增，阳性则代表未缺失，阴性则代表基因缺失。本发明中，所述引物和探针的设计优选的要满足以下原则：1)引物尽可能的靠近探针；2)引物和探针序列要高度特异性，选择具有最小二级结构的扩增片段；3)引物和探针的扩增长度优选的≤200bp，更优选的为100-150bp；4)引物和探针序列中的GC含量为20％-80％，提高扩增效率；设计得到的引物和探针优选的进行配对检测，从而避免二聚体和发卡结构的形成。本发明中，所述特异性引物和探针的核苷酸序列具体如表1所示。
表1 MGF505-1R/CD2V/I177L三基因序列的引物和探针序列
本发明中，所述特异性荧光探针的5'端优选的修饰有荧光基团，所述特异性荧光探针的3'端优选的修饰有淬灭基团；所述荧光基团优选为CY5、Texas Red或6-FAM，所述淬灭基团优选为BHQ2或BHQ1。
本发明提供了上述的特异性引物或上述的特异性荧光探针在鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失毒株中的应用。
本发明还提供了一种鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失毒株的三通道荧光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异性引物和上述的特异性荧光探针。本发明中，所述特异性引物的添加比例优选为1R：CD2V：I177L＝2-4：1-3：6-9，更优选为1R：CD2V：I177L＝3：2：8；所述特异性荧光探针的添加比例优选为1R：CD2V：I177L＝1-3：2-5：3-7，更优选为1R：CD2V：I177L＝2：3：4。
本发明中，所述试剂盒优选包括如下反应体系：2×TTX Buffer(含dUTP)10μL，Taq酶0.25μL，1R-F 0.3μL、1R-R 0.3μL，1R-P探针0.2μL，CD2V-F 0.2μL、CD2V-R 0.2μL，CD2V-P探针0.3μL，I177L-F 0.8μL、I177L-R 0.8μL，I177L-P探针0.4μL，去离子水1.5μL，样本核酸5μL。
在本发明的具体实施例中，所述测试的荧光定量PCR仪器品牌优选为天隆96R。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1.非洲猪瘟病毒荧光定量检测引物探针的设计与合成
根据NCBI上公布的2018年黑龙江非洲猪瘟毒株全基因组序列，Accession:MK333180.1，获取MGF505-1R基因序列、CD2V基因序列和I177L基因序列，根据三个基因序列分别设计对应基因的引物和探针，其序列如上表1所示。
2.阳性质粒的设计及鉴定
根据步骤1得到的引物和探针序列，由浙江有康生物科技有限公司构建重组质粒，得到质粒合成序列如SEQ ID NO.13所示，将所述质粒合成序列发至上海生工进行合成，得到PCU19质粒。
将合成得到的PCU19质粒按指数倍稀释10万倍后利用步骤1的三种引物探针分别去扩增，均为阳性的即为三联阳性质粒。
实施例2
三重荧光定量PCR优化及标准曲线建立
1.引物探针及质粒稀释
三套引物探针按照推荐用TE Buffer稀释至20umol/L，同时质粒按如下方法进行稀释：
(1)将实施例1中的三联阳性质粒放入离心机中，12000r离心3min，在超净台中，加入50μL TE Buffer至三联阳性质粒中，涡旋混匀5min，离心30s，标记为“三联阳性质粒原液”；
(2)取10μL三联阳性质粒原液至1.5mL离心管中，加入990μLTE Buffer，浓度为1.134X 109拷贝/μL，标记为“三联阳性质粒+109”；所述拷贝数计算公式为：拷贝数＝(6.02×1014)a/660b；其中，a代表三联阳性质粒原液浓度，b代表质粒长度；
(3)按下列步骤进行三联阳性质粒的稀释(109～100拷贝/μL)：
取100μL 109拷贝/μL的三联阳性质粒至1.5mL离心管中，加入900μLTE Buffer，浓度为108拷贝/μL，标记为“三联阳性质粒+108”；涡旋5min，离心30s；
取100μL 108拷贝/μL的三联阳性质粒至1.5mL离心管中，加入900μLTE Buffer，浓度为107拷贝/μL，标记为“三联阳性质粒+107”；涡旋5min，离心30s；
重复稀释方法，可得“三联阳性质粒+109”至“三联阳性质粒+100”。
2.三重荧光定量PCR优化
用方阵法对三通道的引物和探针的添加比例进行优化，具体步骤如下：
将1R的引物探针固定，上下游引物为0.3μL(20umol)，探针为0.2μL(10μmol)，改变CD2V和I177L引物探针的添加量，同时根据该步骤设计多个方案，对同一份阳性样本同时上荧光定量PCR仪测试，选择荧光强度一致，Ct值相近的一套方案作为最优方案。其中，PCR反应Taq酶为东洋纺TTX酶，荧光定量PCR仪品牌为天隆科技96R。
上述步骤优化结果：优化后各组分比例为：三组检测基因的引物添加比例为1R：CD2V：I177L＝3：2：8，探针添加比例为1R：CD2V：I177L＝2：3：4。优化后，确定的反应体系为20μL：2×TTX Buffer(含dUTP)10μL、Taq酶0.25μL、MGF505-1R上下游引物各0.3μL、探针0.2μL、CD2V上下游引物各0.2μL、探针0.3μL、I177L上下游引物各0.8μL、探针0.4μL、去离子水1.5μL，样本核酸5μL。
反应程序如下：预变性95℃10s，变性95℃5s，延伸72℃20s，反应循环数40，根据发光基团设置荧光定量PCR反应程序，分别选择FAM，Texas Red，CY5三种荧光发光基团。
测试的荧光定量PCR仪器品牌为天隆96R，荧光基团设置步骤如下：打开天隆96R荧光定量PCR仪进行预热10min，按照上述规定的体系进行qPCR反应体系的配置，加入待检样本和阴阳性对照后上机操作，在电脑上双击打开天隆qPCR扩增软件，点击qPCR仪主界面的样本设置按钮，用鼠标选中样品所在孔位，点击右上角样本类型按钮，选中“待测”，在“荧光”处同时选择“FAM”、“Texas Red”、“CY5”，点击运行设置，按照上述反应程序进行程序设置，并更改反应体系至20uL，点击“运行监控”，选择仪器型号，点击“运行实验”，等待仪器运行结束。
3.三重荧光定量PCR标准曲线的建立
在上述测定的最优的PCR条件下，测定合成的质粒浓度，根据以下公式计算拷贝数：
双链DNA拷贝数(copies/mL)＝6.02×1023(copies/mL)×浓度(g/mL)/重组质粒长度×660；
将三联阳性重组质粒稀释成3×107copies/mL，然后按10倍稀释，选取7个浓度(107copies/mL～103copies/mL)重组质粒标准品混合物作为模板，按照优化好的反应体系和条件进行多重荧光定量PCR扩增，以标准品浓度的对数为横坐标，Ct值为纵坐标建立标准曲线，结果如图1。
根据结果计算得出，CD2V基因的标准曲线为：Y＝-5.5733X+52.0007，r2＝0.9896；MGF505-1R基因的标准曲线为：Y＝-3.5437X+44.426，r2＝0.9903；I177L基因的标准曲线为：Y＝-4.7303X+45.09，r2＝0.9938。
实施例3
三通道荧光定量特异性实验
将PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV，PRoV，JEV，PPV，PRV，PCV2，BVDV，FMDV，ASFV野毒株，ASFV-△MGF单基因缺失株，ASFV-△CD2V单基因缺失株，ASFV-△MGF-△CD2V双基因缺失株等病毒临床样本进行全基因组提取，RNA病毒对其进行反转录为cDNA，此作为模板，同时以去离子水作为阴性对照，利用优化的反应体系和条件进行多重荧光定量PCR扩增，以评估该方法的特异性，得到结果如表2和图2所示。
表2特异性实验结果
注：-代表荧光定量PCR阴性，+代表荧光定量PCR阳性
结果显示，ASFV野毒株的CD2v，MGF和I177L的扩增结果为阳性，ASFV-△MGF单基因缺失株的CD2v和I177L的扩增结果为阳性，ASFV-△CD2V单基因缺失株的MGF和I177L扩增结果为阳性，ASFV-△MGF-△CD2V双基因缺失株I177L的扩增结果为阳性，其它病毒的扩增结果均为阴性，表明利用本发明特异性引物和探针的特异性较高，可鉴别ASFV基因缺失株。
实施例4
三通道荧光定量敏感性实验
对三个通道的检出限进行测定：
利用指数倍稀释法将三联阳性质粒进行稀释，稀释至640copies/mL时进行倍比稀释，1mL/稀释度，直至稀释至10copies/mL，用本发明所述三通道荧光定量检测方法对稀释样本进行检测，每个稀释度做20个重复，测定的结果如下表3所示：
表3检测结果
根据95％置信限下限，可得到三通道的非洲猪瘟病毒的检出限为320copies/mL，表明本发明所述的特异性引物和探针的敏感性较高。
实施例5
三通道荧光定量稳定性实验
选取105copies/mL稀释度的三联质粒标准品(标准品的每个稀释度各取5μL作为模板)进行重复试验，每个重复做10个，利用变异系数计算公式CV＝标准差/平均值计算变异系数，得到表4。
表4三通道荧光定量稳定性实验结果
可以看出，CD2V、MGF505-1R和I177L变异系数均小于2％，具有较好的重复性。
实施例6
临床样本符合性验证
利用本发明三通道荧光定量检测试剂盒及市场商品化非瘟检测试剂盒同时对2020年来源于国内多个猪场的临床样本共计103份进行检测，结果如表5。其中，市场商品化非瘟检测试剂盒购买于北京明日达科技发展有限责任公司公司，是以VP72为靶基因的鉴别检测方法。
表5临床样本检测结果
注：-代表荧光定量PCR阴性，+代表荧光定量PCR阳性。
根据以上结果可以看出，本发明试剂盒的阳性率为21.36％(22份)，本发明试剂盒的检测结果与市场商品化非瘟检测试剂盒检测结果一致，符合率为100％(103/103)，表明本发明三通道荧光定量检测试剂盒可用于临床样本的检测，具有可靠的灵敏度和准确性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括CD2V-F、CD2V-R、1R-F、1R-R、I177L-F和I177L-R；所述CD2V-F、CD2V-R、1R-F、1R-R、I177L-F和I177L-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～6所示。
2.一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性荧光探针，其特征在于，所述特异性荧光探针包括CD2V-P、1R-P和I177L-P，所述CD2V-P、1R-P和I177L-P的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～9所示。
3.根据权利要求2所述的特异性荧光探针，其特征在于，所述特异性荧光探针的5'端修饰有荧光基团，所述特异性荧光探针的3'端修饰有淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的特异性荧光探针，其特征在于，所述荧光基团为CY5、TexasRed或6-FAM，所述淬灭基团为BHQ2或BHQ1。
5.权利要求1所述的特异性引物或权利要求2-4任意一项所述的特异性荧光探针在鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失毒株中的应用。
6.一种鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失毒株的三通道荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物和权利要求2-4任意一项所述的特异性荧光探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物的添加比例为1R：CD2V：I177L＝2-4：1-3：6-9。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性荧光探针的添加比例为1R：CD2V：I177L＝1-3：2-5：3-7。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下反应体系：2×TTXBuffer(含dUTP)10μL，Taq酶0.25μL，1R-F0.3μL、1R-R0.3μL，1R-P探针0.2μL，CD2V-F0.2μL、CD2V-R0.2μL，CD2V-P探针0.3μL，I177L-F0.8μL、I177L-R0.8μL，I177L-P探针0.4μL，去离子水1.5μL，样本核酸5μL。
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