CN111826464B - 一管检测多种胃肠道病毒的引物探针及筛选方法和试剂盒 - Google Patents

一管检测多种胃肠道病毒的引物探针及筛选方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一管检测多种胃肠道病毒的引物探针及筛选方法和试剂盒。所述一管检测多种胃肠道病毒的试剂盒，包括：一管检测多种胃肠道病毒的引物和探针，Buffer Mix，Enzyme Mix，阴性质控品、阳性质控品和内部质控品。所述引物和探针为本发明一管检测多种胃肠道病毒的引物探针的筛选方法筛选得到。本发明有益效果在于：根据本发明筛选方法所得引物和探针制备的试剂盒，为可一次同时检测5种胃肠道病毒的荧光PCR检测试剂盒，显著提升灵敏度和特异性，为出现腹泻症状患者的临床诊断提供依据。

Description

一管检测多种胃肠道病毒的引物探针及筛选方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一管检测多种胃肠道病毒的引物探针及筛选方法和试剂盒。
背景技术
胃肠道病毒指一类引起病毒性肠胃炎的病毒，主要包括轮状病毒、诺如病毒、F组腺病毒、札如病毒、星状病毒等。胃肠道病毒感染肠道，导致其功能出现暂时性紊乱，其特征为急性腹泻、腹痛，可伴有呕吐等症状。
腹泻的症状多种多样，不同原因导致的腹泻症状有很多交集，无法仅凭症状和经验做出准确地判断。由于缺乏对腹泻原因的准确诊断，目前在治疗腹泻过程中存在很多抗生素滥用的现象，是导致细菌耐药性的重要原因之一。临床上迫切需要一种可以快速、准确、方便地检测胃肠道病毒的方法及试剂盒。
目前临床上常用的胃肠道病毒检测方法分为抗原检测，核酸检测两大类。
抗原检测通过特异的抗原-抗体结合反应检测病毒抗原，主要包括以下3类：
胶体金法主要原理是金标记的抗体与待检测病毒抗原特异结合，聚集形成肉眼可见的红色或粉红色斑点，通过观察显色条带判读结果。胶体金法操作简单，使用方便，不需要特殊的仪器设备。
酶联免疫法的原理是酶标记的抗体与待检测病毒抗原特异结合，通过酶促反应显色来判读结果。酶联免疫法操作试剂便宜但操作较为繁琐。
免疫荧光法的主要原理与酶联免疫法类似，通过荧光标记的抗体与待检测病毒抗原特异结合，通过检测荧光来判读结果。免疫荧光可以实现自动化检测。
所有的依赖抗原-抗体反应检测胃肠道病毒的方法都存在检测灵敏度和特异性较差的问题。因为RNA类病毒同一个种内序列差异很大，使用免疫学的方法检测通常需要一组抗体。RNA抗原变异速度很快，存在抗原重组和抗原漂移现象，出现抗体无法特异识别的抗原。某些获得FDA批准的抗原检测类试剂只适用于爆发性的病毒检测，不能用于散发病例检测。因此，使用抗原检测的方法经常无法准确判断引起急性腹泻的病因。
核酸检测通过特定引物对待检测的靶序列进行扩增，对扩增后的核酸产物进行分析。核酸检测通常选择病毒基因组中相对保守的序列设计检测靶点，而且可以使用PCR等方法对待检测靶标进行扩增放量。因此，灵敏度、特异性等指标通常优于抗原检测类方法。目前相关的临床指南也推荐使用核酸扩增方法待检测胃肠道病毒。美国肠胃病协会在2016年发布的临床指南ACG Clinical Guideline:Diagnosis，Treatment，and Prevention ofAcute Diarrheal Infections in Adults中建议使用多重核酸扩增的方法检测引起感染性腹泻的病原体。
核酸检测主要包括：PCR-琼脂糖凝胶电泳法，PCR-Sanger测序法，PCR-荧光探针法，基因芯片法等。
PCR-荧光探针法操作方便，不易污染，性能较好，相关仪器设备较为常见。但目前使用PCR-荧光探针法检测胃肠道病毒的相关试剂存在以下问题：
1、现有的引物设计和筛选方法无法检测简并引物间存在的相互作用。使用多对简并引物及探针在一管中进行检测可能会存在引物/探针间的相互作用，影响试剂性能。
2、胃肠道病毒大多数为RNA病毒，序列差异大，型别众多，现有引物及探针序列组合通常难以覆盖待检测的病毒的主要型别。可能出现漏检的情况。
3、现有的核酸类检测扩增法大多采用质粒为参考品对试剂的检测限等性能进行验证。质粒为DNA序列，无法充分验证试剂扩增RNA的性能。
4、一些试剂采用两步法RT-PCR，先进行逆转录，取逆转录产物再进行PCR扩增检测。操作繁琐，且操作过程中容易出现污染。
5、相关试剂缺乏相应质控品，无法对试剂质量和检测结果进行监控，无法对试剂性能进行验证。有些试剂采用质粒为质控品，其核酸序列为DNA，而实际检测样本基因组为RNA，无法起到监控和对照的作用。
6、试剂中缺乏参与提取的内部质控品，无法对从提取到扩增的整个过程进行监控。有些试剂采用人基因组中序列作为内部质控品，由于粪便样本异质性较大，人基因组的检测很不稳定。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：目前多重扩增技术应用于多种胃肠道病毒检测中存在的灵敏度、特异性较差的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种一管检测多种胃肠道病毒的引物探针的筛选方法，包括如下步骤：
步骤1：根据基因数据库的对应胃肠道病毒的碱基序列，设计生成候选的引物和探针；
步骤2：从步骤1所得候选的引物和探针中筛选出可用候选引物探针；
具体筛选方法为：所述候选的引物探针组合中任意两条的序列或某条序列与其自身不符合以下规则中的任意一条，则判断为两条序列或序列自身可能存在相互作用，则在候选的引物探针中排除该引物探针组合；
所述规则为：
(1)两序列3'末端连续互补碱基数小于第一数值，所述第一数值为4，5或6；
(2)两序列任意位置连续互补碱基数小于第二数值，所述第二数值为7，8，9或10；
(3)两序列任意区域互补碱基比例小于第三数值，所述第三数值为70％，75％，80％或85％；
(4)两序列匹配分数小于第四数值，所述第四数值为8，9，10或11；
(5)两序列形成二聚体的ΔG大于第五数值，所述第五数值为-11，-10，-9或-8；所述第五数值的单位为kcal/mol。
优选的，上述的一管检测多种胃肠道病毒的引物探针的筛选方法中，所述规则具体为：
(1)两序列3'末端连续互补碱基数小于第一数值，所述第一数值为6；
(2)两序列任意位置连续互补碱基数小于第二数值，所述第二数值为10；
(3)两序列任意区域互补碱基比例小于第三数值，所述第三数值为85％；
(4)两序列匹配分数小于第一数值，所述第四数值为10；
(5)两序列形成二聚体的ΔG大于第一数值，所述第五数值为9。
优选的，上述的一管检测多种胃肠道病毒的引物探针的筛选方法中，所述胃肠道病毒包括：腺病毒、星状病毒、札如病毒、诺如病毒和轮状病毒。
本发明提供的另一技术方案为：提供一种一管检测多种胃肠道病毒的引物探针，包括：
检测腺病毒的正向引物为：SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.7，SEQ ID No.8中的任意一条序列；
检测星状病毒的正向引物为：SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.12，SEQ ID No.13，SEQ ID No.14中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.15，SEQ ID No.16中的任意一条序列；
检测札如病毒的正向引物为：SEQ ID No.17，SEQ ID No.18，SEQ ID No.19中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.20，SEQ ID No.21，SEQ ID No.22中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.23，SEQ ID No.24中的任意一条序列；
检测诺如病毒GI的正向引物为：SEQ ID No.25，SEQ ID No.26，SEQ ID No.27中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.28，SEQ ID No.29，SEQ ID No.30中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.31，SEQ ID No.32中的任意一条序列；
检测诺如病毒GII的正向引物为：SEQ ID No.33，SEQ ID No.34，SEQ ID No.35中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.36，SEQ ID No.37，SEQ ID No.38中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.39，SEQ ID No.40中的任意一条序列；
检测轮状病毒的正向引物为：SEQ ID No.41，SEQ ID No.42，SEQ ID No.43中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.44，SEQ ID No.45，SEQ ID No.46中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.47，SEQ ID No.48中的任意一条序列；
检测内控的正向引物为：SEQ ID No.41，SEQ ID No.42，SEQ ID No.43中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.44，SEQ ID No.45，SEQ ID No.46中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.49，SEQ ID No.50中的任意一条序列。
本发明提供的又一技术方案为：提供一种一管检测多种胃肠道病毒的试剂盒，包括：上述的一管检测多种胃肠道病毒的引物和探针，Buffer Mix， Enzyme Mix，阴性质控品、阳性质控品和内部质控品。
优选的，上述的一管检测多种胃肠道病毒的试剂盒中，所述Enzyme Mix包括脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂。
优选的，上述的一管检测多种胃肠道病毒的试剂盒中，所述Buffer Mix包括镁离子和10×PCR Buffer。
优选的，上述的一管检测多种胃肠道病毒的试剂盒中，所述阳性质控品和内部质控品为装甲RNA；
所述阳性质控品为诺如病毒GII装甲RNA；所述内部质控品序列为一段特异的随机序列，参与从样本提取到核酸检测的全过程。
本发明有益效果在于：本申请的一管检测多种胃肠道病毒的引物探针及筛选方法和试剂盒，覆盖相关病毒的主要型别、所得引物和探针可排除序列间相互作用，根据本发明筛选方法所得引物和探针制备的试剂盒，为可一次同时检测5种胃肠道病毒的荧光PCR检测试剂盒，显著提升灵敏度和特异性，为出现腹泻症状患者的临床诊断提供依据。
与目前市场上已有的产品和方法具有如下优点：
1)通过特定的序列分析方法，排除存在相互作用的引物探针组合，避免引物/探针相互作用影响试剂性能。
2)引物/探针采用简并序列，覆盖了主要的病毒亚型序列。
3)采用一步法RT-PCR的方法进行扩增，在一管内完成逆转录和PCR扩增，操作简便，避免污染。
4)提供了一组可以检测5种胃肠道病毒的引物探针序列。提供了一种可以方便，快速，准确地同时检测5种胃肠道病毒的试剂盒。
6)本发明试剂盒采用装甲RNA作为试剂盒的阳性质控品和内部质控品。质控品类型与临床样本一致，可以起监控试剂质量的作用。内部质控品加入样本进行提取，监控从样本提取到反应扩增的全过程。
附图说明
图1为本发明具体实施方式的实施例2的检测限浓度的腺病毒参考品扩增示意图；
图2为本发明具体实施方式的实施例2的检测限浓度的星状病毒参考品扩增示意图；
图3为本发明具体实施方式的实施例2的检测限浓度的札如病毒参考品扩增示意图；
图4为本发明具体实施方式的实施例2的检测限浓度的诺如病毒GI参考品扩增示意图；
图5为本发明具体实施方式的实施例2的检测限浓度的诺如病毒GII参考品扩增示意图；
图6为本发明具体实施方式的实施例2的检测限浓度的轮状病毒参考品扩增示意图；
图7为本发明具体实施方式的实施例2的阴性参考品扩增示意图；
图8为本发明具体实施方式的实施例2的本发明试剂盒扩增临床样本514，腺病毒或星状病毒或札如病毒阳性样本扩增示意图；
图9为本发明具体实施方式的实施例2的本发明试剂盒扩增临床样本548，诺如病毒GI或诺如病毒GII阳性样本扩增示意图；
图10为本发明具体实施方式的实施例2的本发明试剂盒扩增临床样本445，轮状病毒阳性样本扩增示意图；
图11为本发明具体实施方式的实施例2的本发明试剂盒扩增临床样本507，阴性样本扩增示意图；
图12为本发明具体实施方式的实施例2的本发明试剂盒扩增临床样本472，混合感染，轮状病毒阳性，且腺病毒或星状病毒或札如病毒阳性扩增示意图；
图13为本发明具体实施方式的实施例2的使用本发明试剂盒扩增轮状病毒检测结果不一致样本VP4扩增图；
图14为本发明具体实施方式的实施例2的本发明试剂盒扩增轮状病毒检测结果不一致样本VP7扩增图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
实施例1
1、本实施例提供一种一管检测多种胃肠道病毒的引物探针的筛选方法，包括如下步骤：
步骤1：根据基因数据库的对应胃肠道病毒的碱基序列，设计生成候选的引物和探针；包括：
引物/探针序列覆盖待检测靶点的主要型别。通过特定方法排除可能有相互作用的引物/探针，生成候选的引物探针序列。为保证引物探针序列覆盖待检测靶点的主要型别，使用下列方法生成可以覆盖待检测靶点候选参考序列的共同序列(consensussequence)，用于生成候选的引物探针。
具体地，候选引物探针序列生成包括如下过程：
首先，检索相关数据库获得相应病毒的候选参考序列。使用序列比对软件由候选参考序列生成序列比对文件。由序列比对文件生成参考序列的共同序列(consensussequence)，共同序列通过简并碱基(degenerate base)覆盖相应位点可能存在差异的参考序列。在共同序列中选择500～600bp的序列保守区域输入引物设计软件，由引物设计软件生成的候选的简并引物。
具体地，检索数据库为NCBI。
具体地，使用的序列比对软件为Clustal X，MAFFT，MUSCLE，MEGA中的一种或几种。
具体地，使用的生成共同序列的软件为EMBOSS Cons或Python脚本程序。
具体地，使用的引物设计软件为Primer3，Primer 5，Oligo，JCVI PrimerDesigner中的一种或几种。
步骤2：从步骤1所得候选的引物和探针中筛选出可用候选引物探针；
通过步骤1筛选得到的候选引物/探针序列后，通过特定方法进一步排除可能存在相互作用的引物/探针序列。
具体地，如果候选的引物探针组合中任意两条的序列或某条序列与其自身不符合以下规则中的任意一条，则判断为两条序列或序列自身可能存在相互作用，则排除该引物探针组合。规则如下：
1、两序列3'末端连续互补碱基数小于某一数值，该数值可以是4，5，6。优选地，该数值为6。
2、两序列任意位置连续互补碱基数小于某一数值，该数值可以是7，8，9，10。优选地，该数值为10。
3、两序列任意区域(最小长度为14bp)互补碱基比例小于某一数值，该数值可以是70％，75％，80％，85％。优选地，该数值为85％。
4、两序列匹配分数小于某一数值，该数值可以是8，9，10，11。优选地，该数值为10。
5、两序列形成二聚体的ΔG大于某一数值(单位为kcal/mol)，该数值可以是-11，-10，-9，-8。优选地，该数值为-9。
具体地，使用软件Primer3中的方法计算两序列匹配分数和两序列形成二聚体的ΔG。
具体地，根据这些规则使用Python脚本程序检测有相互作用引物/探针序列。Python脚本程序可以将简并序列还原为普通序列，根据上述规则排除可能存在相互作用的序列组合，最后生成可用的候选引物探针。
2、本实施还提供使用上述筛选方法得到的一种一管检测多种胃肠道病毒的引物探针，包括：
检测腺病毒的正向引物为：SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.7，SEQ ID No.8中的任意一条序列；
检测星状病毒的正向引物为：SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.12，SEQ ID No.13，SEQ ID No.14中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.15，SEQ ID No.16中的任意一条序列；
检测札如病毒的正向引物为：SEQ ID No.17，SEQ ID No.18，SEQ ID No.19中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.20，SEQ ID No.21，SEQ ID No.22中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.23，SEQ ID No.24中的任意一条序列；
检测诺如病毒GI的正向引物为：SEQ ID No.25，SEQ ID No.26，SEQ ID No.27中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.28，SEQ ID No.29，SEQ ID No.30中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.31，SEQ ID No.32中的任意一条序列；
检测诺如病毒GII的正向引物为：SEQ ID No.33，SEQ ID No.34，SEQ ID No.35中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.36，SEQ ID No.37，SEQ ID No.38中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.39，SEQ ID No.40中的任意一条序列；
检测轮状病毒的正向引物为：SEQ ID No.41，SEQ ID No.42，SEQ ID No.43中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.44，SEQ ID No.45，SEQ ID No.46中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.47，SEQ ID No.48中的任意一条序列；
检测内控的正向引物为：SEQ ID No.41，SEQ ID No.42，SEQ ID No.43中的任意一条序列；反向引物为：SEQ ID No.44，SEQ ID No.45，SEQ ID No.46中的任意一条序列；探针为：SEQ ID No.49，SEQ ID No.50中的任意一条序列。
简并位点的核苷酸表示为：
R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。
本发明用于检测各靶点的引物及探针序列如下表1所示：
表1
筛选得到的待验证的引物/探针序列后，通过实验进一步验证及优化由上述候选的引物探针序列组成的引物探针组合。
具体地，用于验证及优化引物探针组合的参考品为装甲RNA/DNA。装甲RNA/DNA核酸类型与待检测病毒基因组一致，其噬菌体外壳也可以模拟待检测病毒，参与提取过程。且装甲RNA/DNA使用方便，可以定量，稳定性较好，是理想的参考品类型。
具体地，将覆盖检测靶点的400bp～700bp的保守序列构建为装甲RNA/DNA的参考品，用于实验优化和验证引物探针组合。包括:轮状病毒装甲RNA，诺如病毒GI装甲RNA，诺如病毒GII装甲RNA，星状病毒装甲RNA，札如病毒装甲RNA，腺病毒装甲DNA。
以上述提取后的装甲RNA/DNA作为模板，对比不同引物探针组合扩增各靶点的检测限、重复性、扩增效率等指标，将扩增效果最好的引物探针组合作为最终的引物探针组合。
具体地，使用以下荧光基团和淬灭基团分别对探针的5`端和3`端进行标记：
表2
核酸名称 5`标记 3`标记
腺病毒探针 FAM BHQ1
星状病毒探针 FAM BHQ1
札如病毒探针 FAM MGB
诺如病毒GI探针 CY5 BHQ3
诺如病毒GII探针 CY5 BHQ3
轮状病毒探针 VIC MGB
IC探针 ROX BHQ2
3、本实施还提供一种一管检测多种胃肠道病毒的试剂盒，包括：Buffer Mix，Enzyme Mix，阴性质控品、阳性质控品和内部质控品。
具体地，所述Buffer Mix，主要成分包括：上述的第2部分中的一管检测5种胃肠道病毒的引物和探针，镁离子(Mg2+)，缓冲液(10×PCR Buffer)等。引物探针组合为通过上述方法筛选得到；镁离子(Mg2+)为逆转录及PCR反应的辅酶；缓冲液(10×PCR Buffer)的成分和浓度经过优化，可以同时为逆转录反应、PCR反应提供稳定的反应体系。
所述Enzyme Mix,其主要成分包括：脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、RNase抑制剂、热启动Taq酶、逆转录酶。dNTP是逆转录及PCR反应的底物；逆转录酶以RNA为模板，逆转录生产cDNA；热启动Taq酶在热激活(95℃ 10min)之前没有活性，可以防止非特异扩增，保证了反应具有较好的特异性。在热激活之后，热启动Taq酶以DNA/cDNA为模板进行扩增。
试剂盒中的阳性质控品和内部质控品均为装甲RNA，阴性质控品为生理盐水。
装甲RNA/DNA是使用基因工程的方法构建MS2噬菌体包裹的特定RNA/DNA序列，形成人工构建的假病毒。装甲RNA/DNA不仅核酸类型与待检测病毒基因组一致，其噬菌体外壳也可以模拟待检测病毒，参与提取过程。另外，由于装甲RNA/DNA被病毒外壳包裹，不容易被外源的RNase、DNase所降解，稳定性较好。是理想的分子诊断用质控品。
具体地，所述阳性质控品为诺如病毒GII装甲RNA。
具体地，所述内部质控品包括为一段MS2噬菌体外壳包裹的特异的随机序列。内部质控品的扩增引物与轮状病毒扩增引物相同。避免加入额外的引物序列影响PCR扩增。内部质控品在样本提取的时候加入提取试剂，参与从样本提取到核酸扩增的全过程，保证对整个流程有效性的监控。
实施例2
本发明实施例1的一管检测多种胃肠道病毒的试剂盒的使用，请参考图1～图7，分别是使用本发明本实施例试剂盒扩增检测浓度的6种胃肠道病毒参考品,阴性参考品的示意图。本实施例的试剂盒中具体使用的引物探针组合如下：
检测腺病毒的正向引物为：SEQ ID No.1；反向引物为：SEQ ID No.4；探针为：SEQID No.7。
检测星状病毒的正向引物为：SEQ ID No.9；反向引物为：SEQ ID No.12；探针为：SEQ ID No.15。
检测札如病毒的正向引物为：SEQ ID No.18；反向引物为：SEQ ID No.20；探针为：SEQ ID No.23。
检测诺如病毒GI的正向引物为：SEQ ID No.26；反向引物为：SEQ ID No.29；探针为：SEQ ID No.32。
检测诺如病毒GII的正向引物为：SEQ ID No.33；反向引物为：SEQ ID No.38；探针为：SEQ ID No.40。
检测轮状病毒的正向引物为：SEQ ID No.43；反向引物为：SEQ ID No.44；探针为：SEQ ID No.48。
检测内控的正向引物为：SEQ ID No.43；反向引物为：SEQ ID No.44；探针为：SEQID No.50。
一、样本采集及处理，反应液配置及结果判断
1.样本采集及处理
检测样本为粪便样本，样本采集要求如下：
采集样本时避免混入尿液或其他杂质。
对于异质程度较高的样本，采集样本时应尽量混入各种不同特征的样本。
使用一次性便样采集处理器收集和保存样本。取1g或1mL粪便样本加入1mL样本保存液(生理盐水)中，涡旋30s混匀。
取0.2mL混匀后的粪便样本，加入内控，使用磁珠法病毒总核酸提取试剂盒或同类试剂对样本进行提取。
2.反应液配置及扩增
根据试剂盒说明书操作步骤混合BufferMix和EnzymeMix，加入步骤1中提取的样本，进行PCR反应液配制和加样。
加样完成后，进行PCR扩增，扩增程序如下表3。
表3
步骤 名称 温度 时间 循环数
1 逆转录 50℃ 15min 1
2 预变性 95℃ 10min 1
3 变性 95℃ 15sec 40
4 退火延伸及荧光检测 55℃ 35sec 40
3.结果分析与判读
根据分析后图像调节所有荧光通道的基线和阈值，如果FAM，VIC，CY5荧光通道满足以下条件，则判断对应荧光通道为阳性信号：
检测荧光通道Ct≤36；
出现明显的扩增曲线；
如果不满足1或2，且ROX通道(内部质控品)Ct值≤36，则为对应检测荧光通道为阴性信号。
如果所有荧光通道信号均不满足1或2，且ROX通道(内部质控品)Ct值>36，则检测结果无效。
二、检测限测试
使用提取后装甲RNA/DNA为参考品测试本发明试剂盒的检测限。
所述装甲RNA/DNA参考品包括：轮状病毒装甲RNA、诺如病毒GI装甲RNA、诺如病毒GII装甲RNA、星状病毒装甲RNA、札如病毒装甲RNA、腺病毒装甲DNA。
从1.00E+08copies/mL～1.00E+07copies/mL开始梯度稀释上述装甲RNA/DNA。稀释至1.00E+04copies/mL～1.00E+03copies/mL。
使用磁珠法病毒总核酸提取试剂盒或同类试剂盒提取梯度稀释后的装甲RNA/DNA参考品。
使用一中方法配置反应液，进行PCR扩增反应，测试试剂检测限。
每个阳性参考品在每个浓度测试5个重复，5个重复中可以100％检出的最低浓度的为预期检测限。
对于预期检测限测试20个重复，如95％以上都可以检出，则预期检测限为检测限。否则，提高预期检测限后再进行确认。
经测试，试剂的检测限(Limit of Detection)结果如下表4。
表4
目前中国还没有批准多重胃肠道病毒检测试剂，FDA批准了下列多重胃肠道病毒检测试剂如下表5。
表5
将本试剂盒试剂检测限与FDA批准的同类试剂检测限进行对比，结果如下表6。
表6
可以看出本试剂盒检测限可以达到或超过FDA批准的同类试剂的检测限的水平。
三、交叉反应测试
检测试剂是否会以其他微生物为模板进行非特异扩增，出现交叉反应。
测试微生物包括粪便样本中常见的微生物以及其他可以引起感染性腹泻的病原体，包括以下菌株和病毒：金黄色葡萄球菌；小肠结肠耶尔森菌；副溶血弧菌；大肠杆菌；大肠杆菌O157；枯草芽胞杆菌；志贺杆菌；鲍曼不动杆菌；大肠诶希菌阴沟肠杆菌；铜绿假单胞菌；沙门氏菌；屎肠球菌；粪肠球菌；霍氏肠杆菌；产气肠杆菌；粘质沙雷菌；肺炎克雷伯菌的培养菌株；艰难梭菌；呼吸道腺病毒；肠道病毒通用型。
使用一中方法配置反应液，并对提取后的菌株或病毒进行测试。结果显示均无扩增信号，本发明试剂盒与以上病原体均无交叉反应。
四、临床样本测试
图8～图12是本实施中使用本发明试剂盒扩增临床样本的示意图。其中图8为临床样本514，腺病毒或星状病毒或札如病毒阳性样本；图9为临床样本548，诺如病毒GI或诺如病毒GII阳性样本；图10为临床样本445，轮状病毒阳性样本；图11为临床样本507，阴性样本样本；图12为临床样本472，混合感染，轮状病毒阳性，且腺病毒或星状病毒或札如病毒阳性。图9中，高浓度轮状病毒样本抑制内控扩增，为正常现象。
按照一中的方法收集、提取300例出现腹泻症状，疑似胃肠道病毒感染的临床样本。按照一中的方法配置反应液，进行PCR扩增，对临床样本进行测试。使用一中的方法对检测结果进行判读，统计如下表7。部分样本出现两个阳性信号。
表7
病原体 数目
诺如病毒 45
轮状病毒 37
腺病毒/星状病毒/札如病毒 18
阴性样本 208
总计 300
部分样本出现两个阳性信号。
300例样本中有144例样本使用胶体金或免疫荧光法对轮状病毒进行了检测。与本试剂盒检测结果进行对比(胶体金或免疫荧光法检测任一项为阳性，则判断为阳性)，结果如下表8。
表8
本试剂盒与胶体金法/免疫荧光法检测轮状病毒符合率统计结果如下表9。
表9
阳性符合率 80.00％
阴性符合率 96.27％
总符合率 95.14％
可以看出，二者的阴性符合率、总符合率在95％以上，而阳性符合率则差异较大。
阳性符合率差异较大可能由于检测的方法学差异导致，通常核酸类检测方法的检测限等性能要优于抗原类检测方法。对于检测结果不一致的7例样本，使用VP4、VP7引物对样本进行扩增及测序确认。VP4，VP7分别编码轮状病毒外层衣壳的蛋白酶敏感蛋白和糖蛋白。VP4，VP7的扩增及测序结果可以用于轮状病毒的确认及分型。
采用Van Doorn，Leen-Jan，et al.；Solberg，Owen D.，et al.所发表的文献中检测轮状病毒VP4、VP7的引物，配置反应液，对不一致的7例样本进行测试。扩增结果如附图13，附图14所示。图13轮状病毒检测结果不一致样本VP4扩增图；1～5为检测组阳性，对照组阴性；6～7为检测阴性，对照组阳性；M为Marker DL2000；图14轮状病毒检测结果不一致样本VP7扩增图；1～5为检测组阳性，对照组阴性；6～7为检测组阴性，对照组阳性；M为MarkerDL2000；
本试剂盒检测结果为阴性，对照为阳性的2例样本均无VP4、VP7扩增。本试剂盒检测结果为阳性，对照为阴性的5例样本有4例有VP4、VP7扩增且测序结果正确。轮状病毒的VP4，VP7扩增引物如Seq ID No.27～Seq ID No.30所示。
为预防控制诺如病毒传播，美国CDC(Vega，Everardo，et al)及中国CDC(《诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南(2015版)》)发布了引物探针组合及检测方法用于诺如病毒的检测。其引物探针组合及检测方法是目前的金标准方法。诺如病毒GI，诺如病毒GII扩增检测的引物探针如Seq ID No.31～Seq ID No.36所示。
使用CDC发布的诺如病毒引物探针组合及检测方法(命名为CDC-荧光探针法)，配置检测试剂对300例临床样本进行了诺如病毒测试，结果统计如下表10。
表10
本试剂盒与CDC-荧光探针法检测诺如病毒的符合率统计结果如下表11。
表11
阳性符合率 100.00％
阴性符合率 95.51％
总符合率 96.00％
可以看出，二者的阳性符合率、阴性符合率及总符合率均达到了95％以上。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 亚能生物技术(深圳)有限公司
<120> 一管检测多种胃肠道病毒的引物探针及筛选方法和试剂盒
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (4)

1.一种一管检测多种胃肠道病毒的引物探针，其特征在于，包括：
检测腺病毒的正向引物为：SEQ ID No.1；反向引物为：SEQ ID No.4；探针为：SEQ IDNo.7；
检测星状病毒的正向引物为：SEQ ID No.9；反向引物为：SEQ ID No.12；探针为：SEQID No.15；
检测札如病毒的正向引物为：SEQ ID No.18；反向引物为：SEQ ID No.20；探针为：SEQID No.23；
检测诺如病毒GI的正向引物为：SEQ ID No.26；反向引物为：SEQ ID No.29；探针为：SEQ ID No.32；
检测诺如病毒GII的正向引物为：SEQ ID No.33；反向引物为：SEQ ID No.38；SEQ IDNo.40；
检测轮状病毒的正向引物为：SEQ ID No.43；反向引物为：SEQ ID No.44；探针为： SEQID No.48。
2.一种一管检测多种胃肠道病毒的试剂盒，其特征在于，包括： Buffer Mix， EnzymeMix，阴性质控品、阳性质控品和内部质控品，所述Buffer Mix包括权利要求1所述的一管检测多种胃肠道病毒的引物探针；
所述Enzyme Mix包括脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂。
3.根据权利要求2所述的一管检测多种胃肠道病毒的试剂盒，其特征在于，所述BufferMix还包括镁离子和10×PCR Buffer。
4.根据权利要求2所述的一管检测多种胃肠道病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品和内部质控品为装甲RNA；
所述阳性质控品为诺如病毒GII装甲RNA；所述内部质控品序列为一段特异的随机序列，参与从样本提取到核酸检测的全过程。
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