TW201706415A - 用於檢測病毒的經改良的組成物以及方法 - Google Patents

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Abstract

高度保留的、短的未轉譯之前導序列已於MERS-CoV以及其它人類致病性冠狀病毒中被鑑定出來，而提供針對這些病毒之具有高靈敏度以及精確的分析之準則。利用鎖核酸在針對這些短的序列的擴增反應中被證明是有用的。利用鎖核酸所進行的RT-PCR證實可用以精確檢測每次反應以10個或更少的複本存在的各種不同的人類致病性冠狀病毒。

Description

用於檢測病毒的經改良的組成物以及方法
本申請案主張於2015年5月7日提申之美國臨時申請案第62/158,490號的優先權，該案以其整體於此被併入本案。
本發明領域是關於病毒的檢測，較佳是RNA病毒以及特別是冠狀病毒(coronaviruses)以及流感病毒(influenza viruses)。
背景的敘述包括有益於理解本發明的資訊。這並非是承認任何在此所提供之資訊是先前技藝或是與現在所請求的發明有關，或者任何被特定地或間接地引用的公開文獻是先前技藝。
在整個歷史過程中，病毒(例如冠狀病毒或CoVs)已一再地跨越物種障礙，並且某些已成為人類病原體(human pathogens)(Lau et al,J Virol 85：11325-11337,2011)。它們的臨床顯著性(clinical significance)以及在公共衛生上的影響是藉由2003年的SARS以及自2012年以來的MERS之近代流行病(recent epidemics)而被最佳地例示(Cheng et al,Clin Microbiol Rev 20：660-694,2007；Chan et al,Clin Microbiol Rev 28：465-522,2015)。此處的所有公開文獻是透過引用而被併入本案，其程度如同各個個別的公開文獻或專利申請案被特定地以及個別地指明透過引用而被併入本案。在被併入的參考文獻中的技術用語的定義或使用與本案所提供的該技術用語的定義不一致或相反時，適用本案所提供的該技術用語的定義，而不適用該參考文獻中的該技術用語的定義。高靈敏度以及特定的實驗室診斷測試對於個案鑑定(case identification)、接觸者追蹤(contact tracing)、動物來源認定(animal source finding)以及關於控制新興病毒爆發的感染控制措施的合理化(rationalization of infection control measures)是必需的。
在細胞培養中分離出病毒是實驗室診斷的黃金標準。不幸地，某些重要的新興病原體(包括CoVs)難以在細胞株中培養。此外，許多病毒的培養需要利用生物安全第3等級的設備(biosafety level-3 facilities)，這在大多數臨床實驗室中是不常用的(Chan et al,J Infect Dis 207：1743-1752,2013)。有如藉由進化的MERS流行病而被例示說明的，藉由即時RT-PCR(real time RT-PCR)的分子診斷已成為用於建立CoV感染的實驗室診斷的選擇方式並且在大多數臨床微生物學實驗室中是可廣泛應用的(Corman et al,Euro Surveill 17.pii：20285,2012；Corman et al,Euro Surveill 17.pii：20334,2012)。普遍被接受的是，在CoV基因組中非常大量的基因標的是有用的RT-PCR標的。此原則可由先前所建立的RT-PCR分析而被完整地例示說明，該RT-PCR分析是以被大量地表現的CoVs的N基因(其位於基因組的3’端)作為標的(Cheng et al,Clin Microbiol Rev 20：660-694,2007；Chan et al,Clin Microbiol Rev 28：465-522,2015)。
六種冠狀病毒(CoVs)被知曉造成人類感染(Chan et al,J Infect 65：477-489,2012；Chan et al,J Formos Med Assoc 112：372-381,2013)。人類冠狀病毒(HCoV)-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63以及HCoV-HKU1主要造成輕微的上呼吸道感染(mild upper respiratory tract infections)，而嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome CoV，SARS-CoV)以及新穎的中東呼吸症候群冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome CoV，MERS-CoV)經常造成帶有肺外表現(extrapulmonary manifestation)之嚴重的肺炎(pneumonia)。然而，眾所周知地，大多數的CoVs難以在細胞株中培養(5)。針對MERS-CoV(它在各種細胞株中快速地複製)以及SARS-CoV(它生長於被選擇的細胞株中)，生物安全第3等級的設備之要求限制了細胞培養的實務應用(Chan et al,J Infect Dis 207：1743-1752,2013)。
用來檢測取自相隔14至21天之急性期與恢復期的血清樣品中的專一性中和抗體(specific neutralizing antibodies)的免疫分析亦可提供感染的證據。然而，恢復期樣品的需求以及來自於與其它CoVs交叉反應而有偽陽性結果的問題限制了它們在緊急狀況中的用途(Woo et al,J Clin Microbiol 42：2306-2309,2004)。抗原檢測分析(Antigen detection assay)亦可應用於某些CoVs，但整體靈敏度並不如分子分析，諸如反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)(Lau et al,J Clin Virol 45：54-60,2005；Song et al,J Clin Microbiol 53：1178-1182,2015)。隨著分子診斷設備的可用性以及全球臨床微生物學實驗室的專業技術的增加，RT-PCR已成為用於建立許多病毒感染的診斷的測試選擇(Corman et al,Euro Surveill 17.pii：20285,2012；de Sousa et al,J Clin Virol 59：4-11,2014)。
傳統上，RT-PCR分析的較佳標的是來自於病毒基因組之保留的和/或被大量地表現的基因(Sridhar et al,J Mol Diagn pii：S1525-1578(15)00038-0,2015)。針對CoVs，最常被使用的標的包括結構性核鞘蛋白(nucleocapsid，N)基因以及棘突(spike，S)基因以及非結構性RNA依賴性RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)基因與複製酶ORF1a/b(replicase ORF1a/b)基因。近來，其它非典型存在於相關的CoVs中的獨特的非編碼基因組區域(non-coding genome region)亦已被用來開發針對新興MERS-CoV的RT-PCR。近來，世界衛生組織(World Health Organization)建議利用upE(封套(envelop)(E)基因的上游區域)分析供用於實驗室篩選疑似MERS個案，繼而利用ORF1a或ORF1b分析進行確認。
特別地，在upE分析中正向引子(forward primer)以及探針(probe)所含有的數個在不同位置的單一核苷酸錯配(single nucleotide mismatch)已在近來的MERS-CoV分離株中被檢測到，並且可能影響該分析的靈敏度(sensitivity)(Corman et al,J Clin Virol 60：168-171,2014)。此外，就完全執行為臨床測試而言，目前被開發用來檢測CoVs的RT-PCR分析花費大量時間以及缺乏靈敏度和/或專一性(specificity)。
因此，現仍亟需用於鑑定致病性病毒(pathogenic virus)之快速以及精確且適用於臨床用途的方法。
本發明內容提供裝置(apparatus)、系統(system)以及方 法，其中RNA病毒(例如冠狀病毒(CoV))可被檢測到。在本發明概念的實施例中，在被感染的細胞中以高複本數(high copy number)而被表示的一高度保留的RNA序列(highly conserved RNA sequence)被鑑定。此一序列可表示3%、3.5%、4%、4.5%、5%、7.5%、10%或更多與一被感染的細胞有關聯的病毒RNA。該高度保留的RNA序列可以是一未轉譯的序列(untranslated sequence)，例如一對應於一前導序列(leader sequence)的序列。此一前導序列可以是一位於一轉錄調節序列(transcription regulatory sequence)上游的一個5’非轉譯區(5’untranslated region)。此等標的序列的長度可以落在從30至200核苷酸、從40至100核苷酸或從60至90核苷酸長度的範圍內。
在某些實施例中，標的序列的數量係足以藉由與一探針和/或一捕捉序列(capture sequence)直接雜交(例如，利用雙股/雙鏈體(two-strand/duplex)或三股/三鏈體(three-strand/triplex)形成)而進行檢測，而沒有利用一介入擴增步驟(intervening amplification step)。另擇地，以擴增為基礎的方法(諸如PCR、反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、接合酶鏈反應(ligase chain reaction)等等)可被用來擴增標的序列，俾以有助於一檢測步驟。在某些實施例中，檢測可在擴增期間執行，俾以允許即時檢測(real time detection)。在其它實施例中，檢測可在擴增之後執行，俾以允許終點檢測(end point detection)。
擴增反應可利用非天然存在的核苷酸(non-naturally occurring nucleotide)(例如LNAs)而被執行，俾以增進該等使用相對短的核苷酸序列之以擴增為基礎的方法之效能。類似地，雜交步驟可利用包含非天然存在的核苷酸之核酸序列來執行。其它適合的非天然存在的核酸包括PNAs以及外來核酸(xeno nucleic acid)。
在某些實施例中，相對於一標的序列的錯配可被包含於該等分析中所利用的探針序列和/或引子序列中。例如，一探針序列或引子序列有5%與50%之間的核苷酸可與一標的序列的對應核苷酸產生錯配。
圖1提供了一部分的MERS-CoV基因組的示意圖。5’非轉譯區的前導序列被放大來顯示大量的小RNA序列。在前導序列、ORF1a、S以及N基因區所顯示的被描繪的小RNA序列的百分比被定量以及被顯示。圖1亦顯示MERS-CoV基因組的前導部分的序列(序列辨識編號：1)，並且同時提供了HCoV-229E(序列辨識編號：2)、HCoV-OC43(序列辨識編號：3)、HCoV-NL63(序列辨識編號：4)以及HCoV-HKU1(序列辨識編號：5)之典型70至72核苷酸前導序列。
圖2A至2J描繪了利用本發明概念的引子以及探針擴增各種不同的CoV人類病原體的前導序列之典型RT-PCR結果。圖2A顯示以每反應108至101複本(cpr)而被提供的MERS-CoV的RT-PCR之典型的螢光對時間圖。圖2B顯示利用本發明概念的引子/探針組合的MERS-CoV的RT-PCR的一典型劑量/反應曲線。圖2C顯示以每反應108至101複本(cpr)而被提供的HCoV-229E的RT-PCR之典型的螢光對時間圖。圖2D顯示利用本發明概念的引子/探針組合的HCoV-229E的RT-PCR的一典型劑量/反應曲線。圖2E顯示以每反應108至101複本(cpr)而被提供的HCoV-OC43的RT-PCR之典型的螢光對時間圖。圖2F顯示利用本發明概念的引子/探針組合的HCoV-OC43的RT-PCR的一典型劑量/反應曲線。圖2G顯示以每反應108至101複本(cpr)而被提供的HCoV-NL63的RT-PCR之典型的螢光對時間圖。圖2H顯示利用本發明概念的引子/探針組合的HCoV-NL63的RT-PCR的一典型劑量/反應曲線。圖2I顯示以每反應108至101複本(cpr)而被提供的HCoV-HKU1的RT-PCR之典型的螢光對時間圖。圖2J顯示利用本發明概念的引子/探針組合的HCoV-HKU1的RT-PCR的一典型劑量/反應曲線。
下面的詳細說明包括有益於理解本發明的資訊。這並非是承認任何在此所提供之資訊是先前技藝或是與現在所請求的發明有關，或者任何被特定地或間接地引用的公開文獻是先前技藝。
發明人已鑑定出位於轉錄調節序列的5’上游的相對短的非轉譯區，它意外地於冠狀病毒中被高度表現以及是高度保留的。當被用來作為一用於RT-PCR(特別地連同利用LNAS來至少部分地彌補短長度的作用)或類似的分析方法之標的時，相對於先前技藝中所使用的方法，前述序列針對該等病毒支持針對冠狀病毒分析帶有被增進的靈敏度和/或專一性。
應體會到的是：相對於用於檢測病毒之先前技藝方法，本案所揭露的技術提供許多有利的技術功效，包括增進精確度、增進靈敏度和/或減少得到結果的時間。
根據所討論的發現以及下面的進一步詳細說明，發明人預期：本發明概念的試劑(reagent)、套組(kit)以及方法可應用於任何病毒物種，包括RNA病毒。適合的RNA病毒包括冠狀病毒(亦即甲型冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)、乙型冠狀病毒屬(Betacoronavirus)、丙型冠狀病毒屬(Gammacoronavirus)和/或丁型冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)、包括造成SARS以及MERS的物種)、星狀病毒科(Astroviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)、小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)、黃熱病毒科(Flaviviridae)、反轉錄病毒科(Retroviridae)、披衣病毒科(Togaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、本揚病毒科(Bunyaviridae)、絲狀病毒科(Filoviridae)、正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)、副黏液病毒科(Paramyxoviridae)、桿狀病毒科(Rhabdoviridae)和/或呼腸孤病毒科(Reoviridae)。流感病毒亦被考量，例如A型流感(influenza A)和/或B型流感(influenza B)。在本發明概念的一個較佳實施例中，本發明概念的試劑、套組以及方法是針對冠狀病毒(CoV)。
CoVs的單股RNA基因組之長度是大約26至31kb並且含有5’-帽化的(5’-capped)、3’-聚腺苷酸化的(3’-polyadenylated)、多順反子RNA(polycistronic RNA)。一般而言，基因組排列遵循5’-複製酶(ORF1a/b)-結構蛋白質基因(棘突(S)-封套(E)-膜(M)-結構性核鞘蛋白(N))-聚(A)-3’的順序，除了具有位於複製酶與S基因之間的似S血球凝集素-酯酶(S-like hemagglutinin-esterase)(HE)基因的特徵之βCoVs A譜系 (lineage A)之外。具有長度為大約60至90核苷酸的前導序列可在所有CoVs的基因組中的轉錄調節序列上游的5’-UTR處以及在次基因組RNAs(subgenomic RNAs)處被發現到；然而，這些前導序列的功能鮮為人知。在一典型的研究中，一小RNA序列資料分析(small RNA sequence data analysis)鑑定出一為67-核苷酸前導序列，它意外地是MERS-CoV基因組中被最大量地表現的基因區域(圖1)。
圖1顯示一示意圖，它說明一MERS-COV基因組。在圖1中，與5’非轉譯區有關聯的前導序列被放大來顯示與此區域有關聯的大量小RNA序列。所顯示的百分比表示與此病毒的前導序列、ORF1a、S以及N基因有關聯的小RNA序列的百分比。其它研究已顯示相似的序列存在於其它冠狀病毒中。圖1進一步顯示出呈現大量RNA長度為70至72核苷酸區域的序列，其於其它人類冠狀病毒(諸如HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63以及HCoV-HKU1)中被發現到。適合的小RNA序列可具有30至200核苷酸、40至100核苷酸，或者60至90核苷酸的長度。發明人預期：相似的序列存在於其它人類致病性病毒物種，包括流感病毒、甲型冠狀病毒、乙型冠狀病毒、丙型冠狀病毒和/或丁型冠狀病毒(包括造成SARS以及MERS的物種)、星狀病毒科、杯狀病毒科、小核醣核酸病毒科、黃熱病毒科、反轉錄病毒科、披衣病毒科、沙粒病毒科、本揚病毒科、絲狀病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科、桿狀病毒科和/或呼腸孤病毒科。
發明人已發現到：前導序列不僅針對MERS-CoV是一種有用的診斷標的，並且相似的前導序列可作用為針對同樣具有前導序列的其它近來傳播中的HCoVs之診斷標的。在其它病毒物種(包括星狀病毒科、杯狀病毒科、小核醣核酸病毒科、黃熱病毒科、反轉錄病毒科、披衣病毒科、沙粒病毒科、本揚病毒科、絲狀病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科、桿狀病毒科、呼腸孤病毒科和/或流感病毒)中之相似的前導序列可同樣提供針對該等物種感染的診斷標的。
該等前導序列之相對短的長度可為檢測和/或擴增的阻礙。發明人已發現到：利用非天然存在的核酸(例如，探針序列、引子序 列和/或雜交/捕捉核酸序列)可抵消此作用。適合的非天然存在的核酸包括鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)、肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)以及外源性核酸。例如，在一即時RT-PCR LNA分析中可利用含有LNA的探針序列，而標靶人類致病性CoVs的前導序列。此一含有LNA的探針序列包括對於互補DNA以及RNA序列(complementary DNA and RNA sequence)提供增加的雜交親和性(increased hybridization affinity)(相對於天然的DNA以及RNA)以及亦提供有效的錯配辨識(mismatch discrimination)的一或多種核酸類似物(nucleic acid analog)。這些特性是與由該等寡核苷酸(oligonucleotides)所形成的雜交物(hybrid)之增加的解鏈溫度(melting temperature)有關聯，這使得當於核酸擴增分析(nucleic acid amplification assay)中使用LNA而非DNA核苷酸時可應用較短的探針。該等含有LNA的探針可包括一單一LNA、二LNAs、三LNAs或多於三LNAs。在某些實施例中，在引子、探針或雜交/捕捉核酸序列中有0.5%、1%、2%、3%、4%、5%或更多的核酸可為非天然存在的核酸。
本案的數值範圍的列舉僅旨在用作個別地提及落入該範圍內的各個分開的值的一速記方法(shorthand method)。除非本案另外指出，各個個別的值被併入說明書中，猶如其在本案被個別地列舉。本案所描述的所有方法可以任何適合的順序而被執行，除非本案另外指出或上下文明顯矛盾。除非另外聲明，本案的特定實施例所提供的任何以及所有實例或示例性用語(例如“諸如”)的使用僅旨在更佳地說明本發明而非對本發明的範圍造成一限制。說明書中的用語不應被解釋為表示任何未主張的要素對於實施本發明是必要的。
應理解的是，各種不同的檢測方法學(detection methodology)是適用於本發明概念的方法。例如，樣品可藉由從被感染的細胞或含有被感染的細胞之樣品中所得到的聚核苷酸(polynucleotide)的直接雜交而被分析而不用一介入擴增步驟(例如利用一外源性聚合酶(exogenous polymerase)的擴增，諸如PCR或RT-PCR)。該等方法是相對單純來實施並且較不易受到汙染。適合的直接雜交方法包括利用固相綴合的捕捉序列(solid-phase conjugated capture sequence)來捕捉標的序列(例 如，一核酸微陣列(nucleic acid microarray)、核酸修飾的微井盤(nucleic acid modified microwell plate)、核酸修飾的珠粒(nucleic acid modified bead)，或者核酸綴合的微粒子(nucleic acid conjugated microparticle))以及雜交物形成(hybrid formation)的檢測。雜交物形成可藉由任何適合的方式進行檢測。用於雜交物檢測之適合的方法包括一與一雜交物締合或解離自一雜交物之可看見的標記(observable label)(例如，螢光標記(fluorescent label)、比色標記(colorimetric label)、自旋標記(spin label)、質譜標記(mass label)和/或親和性標記(affinity label))的檢測、雜交物之具有螢光團部分(fluorophore-bearing member)的FRET特性的改變、選擇性染料結合(selective dye binding)(例如，大或小溝結合染料(major or minor groove binding dye))、UV吸光值(UV absorbance)以及折射率(refractive index)的改變。另擇地，雜交物形成可利用一分離技術(separation technique)進行檢測，諸如電泳(electrophoresis)(例如毛細管(capillary)或凝膠電泳(gel electrophoresis))。該等技術可為相對技術上單純的以及定量的。此外，利用序列編碼(sequence encoding)(例如，藉由一微陣列內的位置或藉由一系列微粒子的螢光性質)可簡化一對抗多重探針序列之得自於一樣品的聚核苷酸的同步定性，並且支持多重化測試(multiplex testing)。然而，該等技術可能不適用於標的病毒會以低豐度(low abundance)而存在的情況。
另擇地，在其它實施例中，來自於被感染的細胞或含有被感染的細胞之樣品的聚核苷酸可利用擴增法進行定性，擴增法可使用外源性聚合酶(諸如DNA聚合酶(DNA polymerase)和/或反轉錄酶(reverse transcriptase)，它們可得自於嗜溫生物(thermophilic organism)，藉此而支持熱循環擴增法(thermal cycling amplification method))。適合的擴增法包括PCR、巢式PCR(nested PCR)、RT-PCR、轉錄媒介的擴增(transcription mediated amplification，TMA)、股置換擴增(strand displacement amplification，SDA)以及基於核酸序列的擴增法(nucleic acid based sequence amplification，NASBA)。
藉由將可偵測的標誌(detectable tag)併入至探針和/或引 子序列中可有助於檢測雜交結果和/或擴增產物的形成。適合的可偵測的標誌包括螢光團(fluorophore)、發色團(chromophore)、自旋標記、放射性同位素(radioactive isotope)、親和性抗原決定位(affinity epitope)(例如，生物素(biotin)或地高辛(digoxigenin))和/或質譜標誌(mass tag)。所使用的檢測方法學取決於被併入的標誌。例如，螢光團可藉由螢光量測(fluorescence measurement)、FRET的定性、螢光猝減(fluorescence quenching)和/或螢光非均向性(fluorescence anisotropy)而進行檢測，它們可依次地於一靜止的樣品或一經歷分離(例如，藉由毛細管電泳)的樣品中被量測到。質譜標誌可藉由將產物進行質譜術(mass spectroscopy)的方法而被定性。親和性抗原決定位可藉由使用一對應的親和性導向的分子(affinity-directed molecule)(例如，抗生物素蛋白(avidin)、鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)和/或抗原決定位-專一性抗體(epitope-specific antibody)或抗體片段(antibody fragment))的複合體形成(complex formation)進行檢測。該等親和性導向的分子可包括可直接看見的檢測部分(directly observable detection moiety)(例如，螢光團、發光團(lumiphore)和/或發色團)或不可直接看見的檢測部分(indirectly observable detection moiety)(例如，螢光酵素(luciferase)或帶有染色粒(chromomeric)或螢光基質(fluorogenic substrate)的酵素)。
RT-PCR被使用於本發明概念的一個較佳實施例中。典型即時RT-PCR LNA分析的分析靈敏度以及專一性被發現是極佳的。關於MERS-CoV-LS分析(參見表1)，5至10 RNA複本/反應(活體外RNA轉錄本)以及5.62×10-2 TCID50/ml(基因組RNA)的檢測限制與那些近來世界衛生組織建議用於篩檢和/或確認MERS之其它分析係具有可比性的。
為供比較，針對MERS CoV的先前技藝ORF1b分析具有最少檢測64 RNA複本/反應的最佳限制。本發明概念的CoV即時RT-PCR LNA分析在個別的CoVs中及與其它常見的呼吸系統病毒(respiratory virus)(包括A型與B型流感病毒、副流行性感冒第1至4型病毒(parainfluenza virus types 1 to 4)、鼻病毒(rhinovirus)/腸病毒(enterovirus)、呼吸道融合細胞病毒(respiratory syncytial virus)以及人類偏肺病毒(human metapneumovirus))皆未顯示交叉反應(cross-reactivity)(參見表2)。
評估本發明概念的CoV即時RT-PCR LNA分析的效能並且將它與商業ResPlex II®分析比較亦利用229鼻咽抽取液(nasopharyngeal aspirate)的一使用中評估(in-use evaluation)而被執行。ResPlex II®分析是一種商業上可購得的多重PCR分析(multiplex PCR assay)，其可檢測18種呼吸道病毒(包括HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63以及HCoV-HKU1)，並且常被使用於病毒呼吸道感染(viral respiratory tract infection)的實驗室診斷。本發明概念的CoV即時RT-PCR LNA分析在所有藉由ResPlex II®針對HCoVs被測試陽性的49(100%)鼻咽抽取液中以範圍落在13.7 RNA複本/反應至3.86 108 RNA複本/反應內的病毒負載(viral load)將樣品鑑定為HCoVs陽性(參見表3A與3B)。
表3A
表3B
此外，CoV即時RT-PCR LNA分析在藉由ResPlex II®初始被測試陰性(可能由於大約10至100 RNA複本/反應的低病毒負載)的額外2.2%的鼻咽抽取液中鑑定出HCoVs。大體上，這些結果證明：本發明概念的CoV即時 RT-PCR LNA分析具有高度靈敏度以及專一性。應被理解的是，ResPlex II®以及其它多重PCR分析針對HCoVs以及其它呼吸道病毒(諸如A型流感病毒)會不如單重PCR分析(monoplex PCR assay)。此相對低的靈敏度會限制該等多重PCR分析應用於檢測未來新興CoVs以及A型禽流感病毒(avian influenza A virus)(若一個案被錯誤地診斷，它們是具有顯著的公共衛生影響的潛在流行病劑(pandemic agent))。
發明人已證明：小RNA-Seq資料分析是有助於挑選最佳的基因標的供用於開發分子診斷分析(molecular diagnostic assay)並且應被考慮用於其它新興以及傳播中的致病性病毒。應用LNA探針允許利用相對短的序列(諸如位於CoV基因組的5’-UTR的前導序列)作為一診斷標的。發明人預期：該等分析可為單重或多重分析，取決於所選擇引子序列、探針序列以及可偵測的標誌。應被理解的是，多重分析相對於單重分析會具有增進的臨床實用性(clinical utility)。
實驗例
病毒以及臨床樣品(clinical specimens)：MERS-CoV(HCoV-EMC/2012分離株)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63以及HCoV-HKU1被包括在示範性研究中。MERS-CoV分離株是由R.Fouchier、A.Zaki以及他們的同事們所提供。該分離株是藉由Vero細胞中一額外的繼代(passage)進行擴增，俾以製作病毒的工作原液(working stocks)(5.62 105 50%組織培養感染劑量(50% tissue culture infective dose，TCID50)/ml)。所有涉及活的MERS CoV的實驗操作程序遵循生物安全第3等級的設備之經認可的標準作業程序(standard operating procedures)。HCoV-229E、HCoV-OC43以及其它呼吸道病毒的高效價原液被製備，以及它們的TCID50值是利用習知的方法進行測定。試圖培養HCoV-NL63以及HCoV-HKU1是不成功的，因為難以利用可用的細胞株來培養它們。被用來驗證分析的陽性病毒臨床樣品(n=14)以及實驗室分離株(n=13)是得自於瑪麗醫院(Queen Mary Hospital)的臨床微生物學實驗室的庫存的臨床樣品。ResPlex II®-HCoV陽性(n=180)以及ResPlex II®-HCoV陰性(n=49)呼吸道臨床樣品的總核酸萃取物是利用QIAamp MinElute Virus Spin套組®(QIAamp MinElute Virus Spin Kit®)並依據製造商的操作指南進行製備。於2012年1月1日至2014年10月31日間從243位因上和/或下呼吸道症狀(upper and/or lower respiratory symptom)而被管制於瑪麗醫院或養和醫院(Hong Kong Sanatorium and Hospital)的患者中所收集的一總數為243新鮮或冰凍的鼻咽抽取液被包括在本研究中。
藉由小RNA序列資料分析來測定MERS-CoV基因組中最大量地表現的序列：Calu-3細胞在37℃下以3 logs TCID50/ml MERS-CoV進行接種1小時(三重複)。未結合的病毒以磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)洗去。來自於被感染的細胞之總RNAs是利用EZ1病毒Mini套組v2.0®(EZ1 virus Mini Kit v2.0®)(Qiagen®)在感染後的第12小時之時被獲取。在RNA定量之後，利用隨機六聚物(random hexamer)將1μg的RNA反轉錄成cDNA供進行高通量Illumina®定序(high-throughput Illumina® sequencing)。定序讀序(Sequencing reads)是藉由利用Trimmomatic version 0.32®移除轉接子(adapter)以及低品質末端(low quality ends)進行剪切。乾淨讀序(clean reads)的長度範圍落在13至101核苷酸內。短於或等於40核苷酸的讀序被保留用來進一步比對(mapping)。總數為1,943,705雙端(paired end)剩餘讀序利用Bowtie2 version 2.1.0®而被用來映對至MERS-CoV基因組上，俾以測定個別小RNA的豐度。
這些研究的結果被顯示於圖1中。如圖1所顯示，一高發生率的相對短的RNAs已被發現是與一位於MERS-CoV基因組的ORF1a上游的未轉譯的前導序列有關聯。類似的結果(產生長度為70至72核苷酸的有用的前導序列)被發現於其它人類致病性CoVs，包括HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63以及HCoV-HKU1。這些標的前導序列的序列亦被顯示於圖1中。意外地，這些未轉譯的序列是高度保留的並且可作為用於CoV專一性分析的標的序列。發明人預期：同樣保留的未轉譯的前導序列存在於其它病毒病原體(諸如那些上面所詳述的)，並且可同樣作為用於病毒專一性分析的標的。該等未轉譯的前導序列之大小範圍可落在短如30核苷酸至長如200核苷酸或更長。
核酸萃取：臨床樣品以及帶有病毒分離株的實驗室細胞培養 物的總核酸萃取是利用EZ1病毒Mini套組v2.0®並依據製造商的操作指南對200μL的樣品進行操作。在使用之前，將萃取物儲存於-70℃下或更低的溫度下。
引子以及探針：標靶位於MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63以及HCoV-HKU1的5’-UTR的保留的以及高度表現的70至72核苷酸之部分的前導序列的引子以及探針組合被設計以及被測試。引子以及探針組合被預期專一性地擴增對應的CoV以及不具有與會潛在地產生偽陽性測試結果的BLASTn分析上的人類、其它人類病原性CoVs或微生物基因結合的主要同源性。雙重標記的LNA水解探針(dual labeled LNA hydrolysis probe)被用來檢測小的標的區域以及增加即時RT-PCR LNA分析的專一性以及靈敏度。具有各個病毒的最佳擴增效能的引子以及探針組合被挑選出(參見表4)。
針對MERS-CoV-LS，正向引子序列被辨識為序列辨識編號：6，反向引子被辨識為序列辨識編號：7，以及探針被辨識為序列辨識編號：8。針對HCoV-229-E-LS，正向引子被辨識為序列辨識編號：9，反向引子被辨識為序列辨識編號：10，以及探針被辨識為序列辨識編號：11。針對HCoV-OC43-LS，正向引子被辨識為序列辨識編號：12，反向引子被辨識為序列辨識編號：13，以及探針被辨識為序列辨識編號：14。針對HCoV-NL63-LS，正向引子被辨識為序列辨識編號：15，反向引子被辨識為序列辨識編號：16，以及探針被辨識為序列辨識編號：17。針對HCoV-HKU1-LS，正向引子被辨識為序列辨識編號：18，反向引子被辨識為序列辨識編號：19，以及探針被辨識為序列辨識編號：20。
用於製作正對照組以及標準品的活體外RNA轉錄本：帶有前述五種CoVs的各者的5’-UTR的側翼區(flanking region)以及在5’端含有T7 RNA聚合酶啟動子序列(T7 RNA polymerase promoter sequence)(TAATACGACTCACTATAGGG)(序列辨識編號：13)的標的區域是利用MEGAscript T7®套組(MEGAscript T7® kit)(Ambion)進行擴增，俾以產生活體外轉錄的RNA供用於標準品以及檢測的限制。所使用的引子列示於表5中。
針對MERS-CoV-LS，正向引子序列被辨識為序列辨識編號：21，以及反向引子被辨識為序列辨識編號：22。針對HCoV-229E-LS，正向引子被辨識為序列辨識編號：23，以及反向引子被辨識為序列辨識編號：24。針對HCoV-OC43-LS，正向引子被辨識為序列辨識編號：25，以及反向引子被辨識為序列辨識編號：26。針對HCoV-NL63-LS，正向引子被辨識為序列辨識編號：27，以及反向引子被辨識為序列辨識編號：28。針對HCoV-HKU1-LS，正向引子被辨識為序列辨識編號：29，以及反向引子被辨識為序列辨識編號：30。
PCR產物是利用QIAquick®凝膠萃取套組(QIAquick® gel extraction kit)(QIAgen)進行純化。各個經純化的擴增物(amplicon)於一 為20μl標準反應混合物中被混合以ATP、GTP、CTP以及UTP(各個2μl)、10反應緩衝液以及酵素混合物(enzyme mix)。該反應混合物於37℃下被培育歷時4小時，繼而添加1μl的TURBO DNase®，並於37℃下被進一步培育歷時15分鐘。被合成的RNA是藉由酚-氯仿萃取法(phenol-chloroform extraction)進行純化。經純化的RNA的濃度是藉由UV光吸光值(UV light absorbance)進行定量。
CoV即時RT-PCR LNA分析：即時RT-PCR LNA分析是利用One Step PrimeScriptTM RT-PCR套組(Perfect Real Time)®(TaKaRa，日本)而被執行。各個20μl反應混合物含有1 One Step RT-PCR緩衝液III®(One Step RT-PCR Buffer III®)、正向以及反向引子(各個0.3μM)、0.1μM的探針、2 U的TaKaRa Ex Taq HS®、0.4μl的PrimeScript RT酵素混合物II®(PrimeScript RT enzyme Mix II®)、5.6μl的無核酸酶水以及2μl的RNA模版(RNA template)。擴增以及檢測是在LightCycler 96®系統(Roche Applied Science，曼海姆，德國)或Applied Biosystems 7500 Fast Dx®即時PCR儀器(Life Technologies)上被執行。熱循環條件是由在42℃下反轉錄歷時5分鐘、在95℃下去活化RT酵素歷時10秒，以及擴增45循環(在95℃下歷時5秒以及在56℃下歷時30秒)所構成。除了是使用5μl的RNA模版，MERS-CoV-upE分析的執行是如上所述。陽性測試結果係定義為在40循環內跨越閾值(threshold)的一明確的指數螢光曲線(exponential fluorescence curve)。負以及正對照組被包括在所有執行內俾以監測分析效能。分析結果顯示對於冠狀病毒的不同分離株皆有極佳的靈敏度並且分離株之間無明顯的交叉反應。
利用本發明概念的引子/探針組合所執行的典型RT-PCR分析的結果被顯示於圖2A至2I中。圖2A顯示利用本發明概念的針對MERS-CoV的引子/探針組合而如上所述被執行的RT-PCR的典型結果。典型生長曲線證實範圍落在每反應108複本(cpr)至101(亦即10)cpr的病毒濃度。圖2B描繪針對圖2A的反應的一典型劑量/反應曲線，顯示出RT-PCR結果是高度線性的。亦證實的是，雖然標的序列相對短的長度，RT-PCR反應中的複製效率是接近於理論限制。此一劑量/反應曲線可被用 來作為用於定量CoV病毒的校正曲線(calibration curve)。圖2C以及2D顯示利用針對HCoV-229E的引子/探針組合所執行的RT-PCR的對應結果。圖2E以及2F顯示利用針對HCoV-OC43的引子/探針組合所執行的RT-PCR的對應結果。圖2G以及2H顯示利用針對HCoV-NL63的引子/探針組合所執行的RT-PCR的對應結果。圖2I以及2J顯示利用針對HCoV-HKU1的一引子/探針組合而被執行的RT-PCR的對應結果。
顯示出針對不同MERS-CoV以及人類CoV分離株的檢測限制的典型研究的結果被顯示於表6A以及6B中。
表6B 交叉反應研究的結果顯示於表7中。
藉由選殖(cloning)以及定序確認藉由CoV即時RT-PCR LNA分析被測試為陽性的ResPlex II®-HCoV-陰性樣品：比較CoV即時 RT-PCR LNA分析以及ResPlex II®的結果。針對在兩分析中帶有差異結果的樣品，進行選殖以及定序來確認結果。各個即時RT-PCR產物被選殖來確認相同性(identity)。即時PCR產物是依據製造商的操作指南藉由TaKaRa MiniBEST DNA片段純化套組Ver.3.0®(TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.3.0®)(TaKaRa，中國)進行純化，繼而利用TOPO TA選殖®套組雙啟動子®(TOPO TA Cloning® Kit Dual Promoter®)(Invitrogen,USA)進行選殖。各個即時RT-PCR LNA分析-HCoV-陽性但ResPlex II®HCoV-陰性樣品的質體是利用QIAprep Spin Miniprep®套組(QIAprep Spin Miniprep® Kit)(Qiagen)進行純化以及使用ABI 3130xl遺傳分析儀®(ABI 3130xl Genetic Analyzer®)(Applied Biosystems)進行定序。有差異的樣品的測試的典型結果顯示於表8中。
<110> 新興病毒研究股份有限公司
<120> 用於檢測病毒的經改良的組成物以及方法
<130> 102684.0001PCT
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 67
<212> RNA
<213> MERS-CoV
<220>
<221> 前導
<222> (1)..(67)
<223> 前導序列
<400> 1
<210> 2
<211> 71
<212> RNA
<213> HCoV-229E
<220>
<221> 前導
<222> (1)..(71)
<223> 前導序列
<400> 2
<210> 3
<211> 70
<212> RNA
<213> HCoV-OC43
<220>
<221> 前導
<222> (1)..(70)
<223> 前導序列
<400> 3
<210> 4
<211> 72
<212> RNA
<213> HCoV-NL63
<220>
<221> 前導
<222> (1)..(72)
<223> 前導序列
<400> 4
<210> 5
<211> 71
<212> RNA
<213> HCoV-HKU1
<220>
<221> 前導
<222> (1)..(71)
<223> 前導序列
<400> 5
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於MERS-CoV的正向引子
<400> 6
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於MERS-CoV的反向引子
<400> 7
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於MERS-CoV的探針序列
<400> 8
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於HCoV-229E的正向引子
<400> 9
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於HCoV-229E的反向引子
<400> 10
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於HCoV-229E的探針序列
<400> 11
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於HCoV-OC43的正向引子
<400> 12
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於HCoV-OC43的反向引子
<400> 13
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工的序列
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<223> 用於HCoV-OC43的探針序列
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於HCoV-NL63的正向引子
<400> 15
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
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<223> 用於HCoV-NL63的反向引子
<400> 16
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於HCoV-NL63的探針序列
<400> 17
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工的序列
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<223> 用於HCoV-HKU1的正向引子
<400> 18
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的序列
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<223> 用於HCoV-HKU1的反向引子
<400> 19
<210> 20
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工的序列
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<223> 用於HCoV-HKU1的探針序列
<400> 20
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工的序列
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<223> 用於MERS-CoV 1至563擴增的正向引子
<400> 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的序列
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<223> 用於MERS-CoV 1至563擴增的反向引子
<400> 22
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<212> DNA
<213> 人工的序列
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<223> 用於HCoV-229E 1至563擴增的正向引子
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<212> DNA
<213> 人工的序列
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<223> 用於HCoV-229E 1至563擴增的反向引子
<400> 24
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於HCoV-OC43 1至563擴增的正向引子
<400> 25
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<212> DNA
<213> 人工的序列
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<223> 用於HCoV-OC43 1至563擴增的反向引子
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<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於HCoV-NL63 1至563擴增的正向引子
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工的序列
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<223> 用於HCoV-NL63 1至563擴增的反向引子
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<212> DNA
<213> 人工的序列
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<223> 用於HCoV-HKU1 1至563擴增的正向引子
<400> 29
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於HCoV-HKU1 1至563擴增的反向引子
<400> 30

Claims (77)

  1. 一種檢測一病毒的方法，其包含：鑑定一被表現於3%與10%之間的由該病毒所感染的一適合的宿主細胞之高度保留的核苷酸測試序列；合成一與該測試序列至少部分地互補的探針序列；令該探針序列與該測試序列雜交俾以形成一雜交複合體；以及檢測該雜交複合體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該核苷酸測試序列的長度是介於30以及200核苷酸之間。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該核苷酸測試序列是介於60以及90核苷酸之間。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該測試序列表示一非轉譯區。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該測試序列被表現於大於5%的由該病毒所感染的一適合的宿主細胞。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該核苷酸測試序列包含一位於一轉錄調節序列上游的一個5’非轉譯區的前導序列。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該探針序列是於表1中被辨認。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該探針序列包含0.5%與10%之間與該測試序列缺乏互補性。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該探針序列包含一非天然存在的核苷酸。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的方法，其中該非天然存在的核苷酸包含一LNA。
  11. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該探針序列包含一可偵測的標誌。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的方法，其中該可偵測的標誌是選自於下列所構成的群組：一螢光團、一發色團、一自旋標記、一放射性同位 素、一親和性抗原決定位，以及一質譜標誌。
  13. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該病毒是一RNA病毒。
  14. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該病毒是選自於下列所構成的群組：冠狀病毒、星狀病毒科、杯狀病毒科、小核醣核酸病毒科、黃熱病毒科、反轉錄病毒科、披衣病毒科、沙粒病毒科、本揚病毒科、絲狀病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科、桿狀病毒科，以及呼腸孤病毒科。
  15. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該病毒是SARS或MERS的一致病原。
  16. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該病毒是一流感病毒。
  17. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該雜交複合體包含一多核苷酸雙鏈體。
  18. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該雜交複合體包含一多核苷酸三鏈體。
  19. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該檢測步驟未被執行一外源性聚合酶驅動的擴增步驟。
  20. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該檢測步驟進一步包括一擴增步驟，其中至少一部分的該測試序列是利用一外源性聚合酶進行複製。
  21. 如申請專利範圍第20項所述的方法，其中該擴增步驟包含PCR。
  22. 如申請專利範圍第21項所述的方法，其中該擴增步驟包含RT-PCR。
  23. 如申請專利範圍第21項所述的方法，其中該擴增步驟包含即時RT-PCR。
  24. 如申請專利範圍第21項所述的方法，其中該擴增步驟包含巢式PCR。
  25. 如申請專利範圍第21項所述的方法，其中該擴增步驟包含一接合酶鏈反應。
  26. 如申請專利範圍第21項所述的方法，其中該擴增步驟包含一依賴核酸序列擴增法。
  27. 如申請專利範圍第19或20項所述的方法，其進一步包含令該測試序列與一微陣列接觸。
  28. 如申請專利範圍第19或20項所述的方法，其進一步包含從該雜交複合體中獲得一螢光量測的步驟。
  29. 如申請專利範圍第19或20項所述的方法，其進一步包含令該雜交複合體與一親和性-導向的分子接觸的步驟。
  30. 如申請專利範圍第20項所述的方法，其中該擴增步驟包含一延伸步驟，以及其中該延伸步驟是以具有一高於50℃的溫度為特徵。
  31. 一種用於檢測一病毒的組成物，其包含一與被表現於3%與10%之間的由該病毒所感染的一適合的宿主細胞之一高度保留的核苷酸測試序列至少部分地互補的探針序列。
  32. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該核苷酸測試序列的長度是介於30以及200核苷酸之間。
  33. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該核苷酸測試序列是介於60以及90核苷酸之間。
  34. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該測試序列表示一非轉譯區。
  35. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該測試序列被表現於大於5%的由該病毒所感染的一適合的宿主細胞。
  36. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該核苷酸測試序列包含一位於一轉錄調節序列上游的一個5’非轉譯區的前導序列。
  37. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該探針序列是於表1中被辨認。
  38. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該探針序列包含0.5%與10%之間與該測試序列缺乏互補性。
  39. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該探針序列包含一非天然存在的核苷酸。
  40. 如申請專利範圍第39項所述的組成物，其中該非天然存在的核苷酸包含一LNA。
  41. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該探針序列包含一可偵測的標誌。
  42. 如申請專利範圍第41項所述的組成物，其中該可偵測的標誌是選自於下列所構成的群組：一螢光團、一發色團、一自旋標記、一放射性同位素、一親和性抗原決定位，以及一質譜標誌。
  43. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該病毒是一RNA病毒。
  44. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該病毒是選自於下列所構成的群組：冠狀病毒、星狀病毒科、杯狀病毒科、小核醣核酸病毒科、黃熱病毒科、反轉錄病毒科、披衣病毒科、沙粒病毒科、本揚病毒科、絲狀病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科、桿狀病毒科，以及呼腸孤病毒科。
  45. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該病毒是SARS或MERS的一致病原。
  46. 如申請專利範圍第31項所述的組成物，其中該病毒是一流感病毒。
  47. 一種用於檢測一病毒的套組，其包含：一與被表現於3%與10%之間的由該病毒所感染的一適合的宿主細胞之一高度保留的核苷酸測試序列至少部分地互補的探針序列；以及使用說明。
  48. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該核苷酸測試序列的長度是介於30以及200核苷酸之間。
  49. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該核苷酸測試序列是介於60以及90核苷酸之間。
  50. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該測試序列表示一非轉譯區。
  51. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該測試序列被表現於大於5%的由該病毒所感染的一適合的宿主細胞。
  52. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該核苷酸測試序列包含一位於一轉錄調節序列上游的一個5’非轉譯區的前導序列。
  53. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該探針序列是於表1中被辨認。
  54. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該探針序列包含0.5%與10%之間與該測試序列缺乏互補性。
  55. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該探針序列包含一非天然存在的核苷酸。
  56. 如申請專利範圍第55項所述的套組，其中該非天然存在的核苷酸包含一LNA。
  57. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該探針序列包含一可偵測的標誌。
  58. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該可偵測的標誌是選自於下列所構成的群組：一螢光團、一發色團、一自旋標記、一放射性同位素、一親和性抗原決定位，以及一質譜標誌。
  59. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該病毒是一RNA病毒。
  60. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該病毒是選自於下列所構成的群組：冠狀病毒、星狀病毒科、杯狀病毒科、小核醣核酸病毒科、黃熱病毒科、反轉錄病毒科、披衣病毒科、沙粒病毒科、本揚病毒科、絲狀病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科、桿狀病毒科，以及呼腸孤病毒科。
  61. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該病毒是SARS或MERS的一致病原。
  62. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其中該病毒是一流感病毒。
  63. 如申請專利範圍第47項所述的套組，其進一步包含一外源性聚合酶。
  64. 一種增進針對一RNA病毒的一分析的效能之方法，其包含：鑑定一被表現於3%與10%之間的由該病毒所感染的一適合的宿主細胞之核苷酸測試序列，其中該測試序列不僅是未轉譯的而且是高度保留的；合成一與該測試序列至少部分地互補的探針序列；令該探針序列與該測試序列雜交俾以形成一雜交複合體；以及檢測該雜交複合體，其中該方法顯露增強的專一性以及增強的靈敏度當中的至少一者。
  65. 如申請專利範圍第64項所述的方法，其中該測試序列包含一位於一轉錄調節序列上游的一個5’非轉譯區的前導序列。
  66. 如申請專利範圍第64項所述的方法，其中該探針序列包含一LNA。
  67. 如申請專利範圍第64項所述的方法，其中該檢測該雜交複合體的步驟包含RT-PCR。
  68. 如申請專利範圍第67項所述的方法，其中該RT-PCR利用一第一引子以及一第二引子，其中該第一引子以及該第二引子表示一選自於表1或表2中所示的序列之引子對。
  69. 如申請專利範圍第68項所述的方法，其中該RT-PCR利用一第三引子，其中該第三引子是選自於表1或表2中所示的序列。
  70. 如申請專利範圍第64項所述的方法，其中該病毒是選自於下列所構成的群組：一冠狀病毒、一A型流感病毒，以及一B型流感病毒。
  71. 一種用於一RNA病毒的定性的探針序列，其包含一與位於一轉錄調節序列上游的一個5’非轉譯區的一高度保留的前導序列具有至少部分互補性的核苷酸序列。
  72. 如申請專利範圍第71項所述的探針序列，其中該RNA病毒是選自於下列所構成的群組：一冠狀病毒、一A型流感病毒，以及一B型流感病毒。
  73. 如申請專利範圍第71項所述的探針序列，其包含一選自於表1中所示的序列之核苷酸序列。
  74. 一種用於一RNA病毒的定性的引子序列，其中該引子序列是選自於表1或表2中所示的序列。
  75. 一種用於一RNA病毒的定性的引子對，其中該引子對包含：一第一引子，其包含一第一核苷酸序列，以及一第二引子，其包含一第二核苷酸序列，以及其中該第一核苷酸序列以及該第二核苷酸序列是選自於表1或表2中所示的序列。
  76. 一種用於一RNA病毒的定性的引子組合，其中該引子組合包含：一引子對，其包含一具有一第一核苷酸序列的第一引子，以及一具有一第二核苷酸序列的第二引子，其中該第一核苷酸序列以及該第二核苷酸序列是選自於如表1或表2中的一引子對所示的序列；以及一輔助引子，其具有一選自於表1或表2中所示的序列的第三核苷酸 序列，其中該第三核苷酸序列是不同於該第一核苷酸序列以及該第二核苷酸序列。
  77. 一種用於一RNA病毒的定性的探針序列，其中該引子序列是選自於表1中所示的序列。
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