RU2012115031A

RU2012115031A - Способ выявления кишечных вирусов в клинических образцах и воде методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления

Info

Publication number: RU2012115031A
Application number: RU2012115031/10A
Authority: RU
Inventors: Алексей Сергеевич Оксанич; Евгений Бахтиерович Файзулоев; Анна Александровна Марова; Александра Александровна Никонова; Виталий Васильевич Зверев; Ольга Валерьевна Егорова; Марина Алексеевна Калинкина
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2012-04-17
Publication date: 2013-10-27
Also published as: RU2506317C2

Abstract

1. Способ дифференциальной диагностики кишечных вирусных инфекций, характеризующийся выявлением и идентификацией в клинических образцах и элюатах, полученных в результате концентрирования из воды, одиннадцати групп кишечных вирусов: энтеровирусов (ЭВ), полиовирусов (ПВ), ротавирусов А и С (РВА и РВС соответственно), аденовирусов (АДВ), норовирусов (НВ), саповирусов (СВ), вирусов гепатита А и Е (ВГА и ВГЕ соответственно), астровирусов (АВ), ортореовирусов (ОРВ) в присутствии внутреннего положительного контроля (ВПК), предусматривающий проведение мультиплексной реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с детекцией в режиме реального времени, причем в качестве клинических образцов используют по выбору: 10-20% фекальные экстракты, образцы культуральной жидкости, элюаты, полученные в результате концентрирования вирусов из образцов сточной, водопроводной, речной воды и воды из других источников, отличающийся тем, что для его осуществления используют олигонуклеотиды - SEQ ID NO 1-61 на основе которых готовят смеси праймеров, зондов для проведения ПЦР-РВ; затем с использованием подобранных праймеров и зондов формируют реакционные смеси для мультиплексной ОТ и ПЦР-РВ, в которых олигонуклеотиды распределены по реакционным смесям следующим образом: смесь №1: SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12; смесь №2: SEQ ID NO 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27; смесь №3: SEQ ID NO 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46; смесь №4: SEQ ID NO 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54; смесь №5: SEQ ID NO 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, причем флуоресцентномеченные зонды распределяют по реакционным смесям таким образом, чтобы в одной смеси находились зонды, меченные разными красителями в соответствии с табл�

Claims

1. Способ дифференциальной диагностики кишечных вирусных инфекций, характеризующийся выявлением и идентификацией в клинических образцах и элюатах, полученных в результате концентрирования из воды, одиннадцати групп кишечных вирусов: энтеровирусов (ЭВ), полиовирусов (ПВ), ротавирусов А и С (РВА и РВС соответственно), аденовирусов (АДВ), норовирусов (НВ), саповирусов (СВ), вирусов гепатита А и Е (ВГА и ВГЕ соответственно), астровирусов (АВ), ортореовирусов (ОРВ) в присутствии внутреннего положительного контроля (ВПК), предусматривающий проведение мультиплексной реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с детекцией в режиме реального времени, причем в качестве клинических образцов используют по выбору: 10-20% фекальные экстракты, образцы культуральной жидкости, элюаты, полученные в результате концентрирования вирусов из образцов сточной, водопроводной, речной воды и воды из других источников, отличающийся тем, что для его осуществления используют олигонуклеотиды - SEQ ID NO 1-61 на основе которых готовят смеси праймеров, зондов для проведения ПЦР-РВ; затем с использованием подобранных праймеров и зондов формируют реакционные смеси для мультиплексной ОТ и ПЦР-РВ, в которых олигонуклеотиды распределены по реакционным смесям следующим образом: смесь №1: SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12; смесь №2: SEQ ID NO 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27; смесь №3: SEQ ID NO 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46; смесь №4: SEQ ID NO 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54; смесь №5: SEQ ID NO 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, причем флуоресцентномеченные зонды распределяют по реакционным смесям таким образом, чтобы в одной смеси находились зонды, меченные разными красителями в соответствии с таблицей:

Краситель Реакционная смесь №1 №2 №3 №4 №5 FAM АДВ РВА СВ - - ROX ЭВ НВ - - ПВ R6G ВПК АВ ОРВ ВГЕ - Cy5 - - РВС ВГА -

затем проводят мультиплексную реакцию обратной транскрипции и мультиплексную ПЦР-РВ (каждый образец анализируется в четырех реакционных смесях); наличие в изучаемой пробе нуклеиновых кислот того или иного кишечного вируса определяют ростом сигнала флуоресценции определенного красителя в одной из реакционных смесей; причем при проведении анализа проводят ряд контролей для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов, для чего формируют пулы положительных контрольных образцов (ПКО), которые, наряду с внутренним положительным контролем (ВПК), анализируются при анализе каждой серии образцов, а в состав пулов положительных контролей входят нуклеиновые кислоты кишечных вирусов или РНК-транскрипты фрагментов геномов кишечных вирусов, разведенные и смешанные в определенной концентрации так, чтобы в мультиплексной ПЦР-РВ они определялись на 25-30 цикле; образец анализируют повторно в том случае, когда при постановке ПЦР-РВ наблюдается задержка в значениях пороговых циклов ВПК - это указывает на возможное присутствие ингибиторов в пробе, которые снизили чувствительность анализа, или на ошибки при выделении РНК или постановке реакции.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что каждый вирусспецифический набор праймеров и зондов используют для выявления в образцах нуклеиновых кислот соответствующих вирусов в моноспецифическом формате, в том числе для выявления аденовирусов - SEQ ID NO 1, 2, 3, 4; энтеровирусов - SEQ ID NO 5, 6, 7, 8; ротавирусов А - SEQ ID NO 13, 14, 15, 16, 17; норовирусов - SEQ ID NO 18, 19, 20, 21, 22, 23; астровирусов - SEQ ID NO 24, 25, 26, 27; саповирусов - SEQ ID NO 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35; ортореовирусов - SEQ ID NO 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43; ротавирусов С - SEQ ID NO 44, 45, 46; вируса гепатита Е - SEQ ID NO 47, 48, 49, 50; вируса гепатита А - SEQ ID NO 51, 52, 53, 54; полиовирусов - SEQ ID NO 55, 56, 57; 58, 59, 60, 61.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для исключения ложноположительных результатов наряду со всеми образцами анализируют отрицательный контрольный образец (ОКО), в качестве которого используют дистиллированную воду.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что анализ предусматривает выявление внутреннего положительного контроля (ВПК), представленного РНК-содержащим вирусом или РНК-транскриптом фрагмента генома вируса с целью контроля эффективности и качества выделения нуклеиновых кислот, в том числе для выявления в образце ингибиторов реакций обратной транскрипции и ПЦР-РВ, и для исключения ложноотрицательных результатов.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для исключения ложноотрицательных результатов анализ предусматривает выявление для каждой ПЦР-смеси соответствующего пула положительных контрольных образцов (ПКО), представляющего собой смесь нуклеиновых кислот кишечных вирусов или РНК-транскриптов фрагментов геномов кишечных вирусов, разведенных и смешанных в определенной концентрации так, чтобы в мультиплексной ПЦР-РВ они определялись на 25-30 цикле.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что при анализе образцов в реакционных смесях №1 и №5, проводят дифференциальное выявление энтеровирусов и полиовирусов.

7. Набор для осуществления способа дифференциальной диагностики кишечных вирусных инфекций по п.1 включает праймеры и зонды для мультиплексной ПЦР-РВ со следующими нуклеотидными последовательностями:

5'-3'

SEQ ID NO 1 CTCCAGCAACTTCATGTCYATGGG SEQ ID NO 2 CACTCTGACCACGTCGAARACTTC SEQ ID NO 3 CGCACRACGTCGAAAACTTC SEQ ID NO 4 FAM-AGGGTGGGCTCRTCCATGGGRTCCA-BHQ1 SEQ ID NO 5 GGATGGCCAATCCA SEQ ID NO 6 CTCCGGCCCCTGAAT SEQ ID NO 7 RATTGTCACCATAAGCAGCC SEQ ID NO 8 R6G-GCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCG-BHQ1 SEQ ID NO 9 CAGGACTATGAAAACCATTTAC SEQ ID NO 10 AAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC SEQ ID NO 11 TGCAGGATTGATTGTGGC SEQ ID NO 12 ROX-CTGATCTAGCTGAACTGAGACTTGCTTTC-BHQ2 SEQ ID NO 13 AWGGAAAATACGCCAT SEQ ID NO 14 CTGTTCCGAGAGAGCGC SEQ ID NO 15 GGAAAATACGCCATTCCWGG SEQ ID NO 16 FAM-CGGAAAGATGGAWAAGCTTGCCGACC-BHQ1 SEQ ID NO 17 FAM-CGGAAAGATGGAAAAGTTTACCGACC-BHQ1 SEQ ID NO 18 CAATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTC SEQ ID NO 19 ATGTTCCGCTGGATGCG SEQ ID NO 20 TCGACGCCATCTTCATTCAC SEQ ID NO 21 TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC SEQ ID NO 22 R6G-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ1 SEQ ID NO 23 R6G-GAGATCGCRATCTCCTGCCCGA-BHQ1 SEQ ID NO 24 CTAGCCATCACACTYCTTT SEQ ID NO 25 GTTGCTTGCTGCGTTCATG SEQ ID NO 26 CTAGCCATCACACTYCTTTGGTCC SEQ ID NO 27 ROX-CTCACAGAAGAGCAACTCCATCGCATTTG-BHQ2 SEQ ID NO 28 CAACAGCCARCTCCA SEQ ID NO 29 CCATTGCAAGTTCCA SEQ ID NO 30 AATGTSAACTAYGACCAGGCT SEQ ID NO 31 AACACCAACTATGACCAGGC SEQ ID NO 32 RAATACAAATTTTGATTTGGCC SEQ ID NO 33 CCCTCCATYTCAAACACTAWTTTG SEQ ID NO 34 FAM-TYGTAGGTGGCGAGAGCCTGG-BHQ1 SEQ ID NO 35 FAM-TTGTAGGTGGCGAGGGCCAAA-BHQ1 SEQ ID NO 36 ATGACTGCGACTGGAG SEQ ID NO 37 ATGACGGCGACTG SEQ ID NO 38 ATGACTGCGACTGGAGTTGC SEQ ID NO 39 ATGACGGCGACTGGG SEQ ID NO 40 GATGAGTTGACGCACCACG SEQ ID NO 41 GATGAATTAACGTACGACAGCC SEQ ID NO 42 ROX-ACGGTCAGCATGAGTCTACCGTGG-BHQ2 SEQ ID NO 43 ROX-ACGGTCAGCGTGAGTCTACCATGG-BHQ2 SEQ ID NO 44 GAAGCTGTCTGACAAACTGGTC SEQ ID NO 45 GTATCAGTTATTAGGTGGAACATTTTTCTA SEQ ID NO 46 Cy5-ATGGTTTGTACAACATTGTACACTGTTTGCG-BHQ3 SEQ ID NO 47 CGAYGCCATGGAGGCС SEQ ID NO 48 CTGCCGGGGYTGCAT SEQ ID NO 49 AGCTGSCGAGGTTGCAT SEQ ID NO 50 ROX-ACYACCACAGCATTCGCCAAGGCGGA-BHQ2 SEQ ID NO 51 ATTGCATCATTTGTTTTAGC SEQ ID NO 52 GTGTCAGGATGYCCAATGAGA SEQ ID NO 53 CGATCAATTGCTTCCTTAACATAAAC SEQ ID NO 54 Cy5-GGAGARGAAAAATGYCTGCCCTTCTCCTCAAG-BHQ3 SEQ ID NO 55 AGAGAGATGGACATCCTBGG SEQ ID NO 56 AAGAGTATGAGCATGCTGGG SEQ ID NO 57 GAGTGTGCTGGWCCACTGG SEQ ID NO 58 GAATGCGCCGGGCCACT SEQ ID NO 59 GARTGGGCTGGACCRCT SEQ ID NO 60 R6G-CGCACRCTGAARTCATTACACGCTGACAC-BHQ1 SEQ ID NO 61 R6G-CGCACGCTGAAATCGTTACAYGCTGACAC-BHQ1

Пояснения:

FAM, ROX, R6G, Cy5 - флуоресцентные красители; BHQ1, BHQ2, BHQ3 - гасители флуоресценции; R - А или G, Y - С или Т, S - G или C, W - T или A, B - C, G и T.