CN112322789B - 一种检测大口黑鲈双rna病毒巢式pcr试剂盒及方法 - Google Patents

一种检测大口黑鲈双rna病毒巢式pcr试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及双RNA病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒及方法。本发明的试剂盒包括两对巢式PCR引物，所述两对巢式PCR引物的序列如下：F1：5’‑CAGAAGGACCGATTCAACTCACT‑3’；R1：5’‑CTCTGGTGAGGAGGTAGTAGGCAA‑3’；F2：5’‑CCTGTCGTGCGGGCTCCTATT‑3’；R2：5’‑CTCTTTGTGGCGTTGGCTTCG‑3’。本发明针对LBBV，以其VP1基因保守序列为靶标，建立巢式PCR检测方法，为该病毒病的早期预警及有效防控提供快速灵敏的检测手段。

Description

一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及双RNA病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒及方法。
背景技术
大口黑鲈(Micropterus salmoides)，隶属于太阳鱼科(Centrarchidae)、黑鲈属(Micropterus)。肉质鲜美细嫩，无肌间刺，营养丰富，是一种优质淡水鱼类。发明人从发病的大口黑鲈组织中分离得到一株新型的双RNA病毒，主要临床症状为肠道充满黄色黏液、肝脏出血、有腹水；病毒无囊膜，具有二十面体结构；基因组由双节段双链RNA构成，A节段分别编码VP2、VP4、VP3四种蛋白，B节段编码VP1蛋白；基因同源性分析显示，该病毒与双RNA病毒科(Birnaviridae)的黑鱼斑点病毒属(Blosnavirus)病毒同源性较高，暂命名为大口黑鲈双RNA病毒(Largemouth bass birnavirus,LBBV)。
自19世纪以来，水产动物双RNA病毒病频繁暴发，其代表种传染性胰脏坏死病(infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)已在我国山西、甘肃、辽宁、四川等地流行，患病稚鱼死亡率高达95％，给我国水产养殖业带来巨大损害。徐晔、Rodriguez Saint-Jean等人就曾针对水生动物双RNA病毒建立了qRT-PCR检测方法。而本发明对象为一株未知的水生动物双RNA病毒，目前为止，尚未有关于此种病毒的检测方法发表。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒及方法。本发明针对LBBV，以其VP1基因保守序列为靶标，建立巢式PCR检测方法，为该病毒病的早期预警及有效防控提供快速灵敏的检测手段。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒，所述试剂盒包括两对巢式PCR引物，所述两对巢式PCR引物的序列如下：
F1：5’-CAGAAGGACCGATTCAACTCACT-3’；
R1：5’-CTCTGGTGAGGAGGTAGTAGGCAA-3’；
F2：5’-CCTGTCGTGCGGGCTCCTATT-3’；
R2：5’-CTCTTTGTGGCGTTGGCTTCG-3’。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg2+溶液和ddH2O。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述引物F1/R1和F2/R2的添加量分别为4pmol。
当引物F1/R1和F2/R2的添加量分别为4pmol时，扩增产物条带最亮且无引物二聚体，当引物量大于4pmol时，引物二聚体随着引物量的增加而增加，且目的条带亮度减弱，因此最佳引物添加量为4pmol。
本发明还提供所述试剂盒检测大口黑鲈双RNA病毒的方法，包括以下步骤：
(1)取待测样品提取RNA；
(2)将RNA反转录得到cDNA；
(3)以cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，第一轮PCR扩增引物为F1和R1；
(4)凝胶电泳，观察第一轮PCR产物中是否存在长度为418bp的条带，若存在，则表明样品受到大口黑鲈双RNA病毒感染；
(5)第一轮PCR扩增结束后，若凝胶电泳无条带，则以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增引物为F2和R2；
(6)凝胶电泳，观察第二轮PCR产物中是否存在长度为339bp的条带，若存在，则表明样品受到大口黑鲈双RNA病毒感染。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述第一轮PCR扩增体系为：Green TaqMix 10μL，F1/R1各0.4μL，DEPC水7.2μL，cDNA模板2μL。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述第一轮PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，64.0℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述第二轮PCR体系为：Green Taq Mix 10μL，F2/R2各0.4μL，DEPC水7.2μL，PCR产物模板2μL。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述第二轮PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。
本发明的有益效果：
(1)LBBV是一种新型双RNA病毒，至今为止没有关于LBBV的检测方法文献发表，这就意味着目前没有有效的检测手段来对病毒的传播进行监控，本发明中针对此问题建立的巢式PCR检测方法，补充了疾病早期预警及防控中检测方法的空白。
(2)本发明检测的最低病毒拷贝数低，即灵敏度高，可以检测低含量病毒的临床样本，增加了检测结果的准确性，更大程度的排除了病毒传播风险，为养殖户及公司避免了损失，提高产量，增收效益。
(3)本发明引物仅与LBBV基因特异性结合，检测结果特异，减少了因为假阳性结果而处理掉的养殖鱼的损失，间接增加了养殖户及公司收益。
附图说明
图1：引物浓度优化结果图；其中A：引物F1/R1添加量；B：引物F2/R2添加量；M：DNAMarker DL2000；1～9：2～18pmol。
图2：退火温度优化结果图；其中A：引物F1/R1；B：引物F2/R2；M：DNA MarkerDL2000；1:45.0℃；2:46.1℃；3:47.8℃；4:50.4℃；5:53.5℃；6:56.0℃；7:58.8℃；8:61.5℃；9:64.1℃；10:66.5℃；11:68.0℃；12:70.0℃。
图3：灵敏度检测结果图(质粒标准品)；其中A：引物F1/R1；B：引物F2/R2；M:DNAMarker DL2000；1～13:4.15×109copies/μL～4.15×10-3copies/μL；14:阴性对照。
图4：灵敏度检测结果图(模拟样品)；其中A：引物F1/R1；B:引物F2/R2；M:DNAMarker DL2000；1～10:109PFU/ml～100PFU/ml；11:N；12:阴性对照。
图5特异性检测结果图；其中A：引物F1/R1；B:引物F2/R2；M：DNA Marker DL2000；1:NNV；2:CyHV-II；3:MRV；4:SGIV；5:ADIV；6:ISKNV；7:SCRV；8:TiLV；9:阴性对照；10:LBBV。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1材料与方法
1.1细胞、毒株
鳜脑组织细胞系(Chinese perch brain cell line，CPB)由本实验室建立保存。大口黑鲈双RNA病毒(Largemouth bass birnavirus，LBBV)、石斑鱼神经坏死病毒(NervousNecrosis Virus，NNV)、鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus II，CyHV-II)、鳜蛙病毒(Mandarinfish ranavirus，MRV)、石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)、大鲵虹彩病毒(Andrias davidianus iridovirus，ADIV)、鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)、鳜弹状病毒(Sinipercachuatsi rhabdovirus，SCRV)、罗湖病毒(Tilapia Lake Virus，TiLV)均由本实验室分离、保存。
1.2方法
1.2.1引物设计与合成
根据LBBV的VP1序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，利用Primer 5.0软件，设计VP1基因扩增引物(用于质粒构建)与巢式PCR引物(见表1)。将引物序列上传至GeneBank进行blastn比对分析，初步检测引物特异性，送至广州艾基生物有限公司合成。
表1巢式PCR所用到的引物
Figure BDA0002798157550000051
1.2.2病毒的扩增与病毒滴度TCID50的测定
取LBBV病毒，加至生长状态良好的CPB细胞中，28℃无CO2培养箱孵育1h后，补加血清浓度为5％的L-15培养基，放至28℃无CO2培养箱中培养，直至病变完全，于-80℃反复冻融两次，0.22μm滤器过滤，分装保存至-80℃。TCID50测定：10倍梯度稀释LBAV病毒液，加至96孔板的CPB细胞中，100μl/孔，每个稀释度一列，对照组添加PBS，28℃无CO2培养箱孵育一个小时后，补加血清浓度为5％的L-15培养基(100μl/孔)，连续观察病变7天，根据karber法计算病毒滴度TCID50值。
1.2.3 RNA提取与反转录
取LBBV病毒液500μL，利用Trizol(Invitrogen)法提取病毒RNA，Nanodrop2000分光光度计测RNA浓度，取500ng RNA用Evo M-MLV RT for PCR Kit试剂盒反转录成cDNA。
1.2.4质粒标准品的构建与鉴定
使用引物VP1-F/VP1-R(退火温度50℃，延伸时间2min)扩增VP1蛋白基因，核酸凝胶电泳鉴定后，使用胶回收试剂盒(OMEGA)回收目的片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，1289bp)，并与pMD-18T克隆载体(Takara)连接，构建重组质粒pMD-LBBV-VP1。采用氯化钙法转化DH5ɑ感受态细胞，涂板、挑菌，进行菌液PCR鉴定，并送至广州艾基生物有限公司进行核酸序列的测定，测序正确后于-80℃保存。
1.2.5巢式PCR检测
第一轮PCR：以反转录cDNA为模板，使用F1/R1进行PCR扩增，体系(20μL)：GreenTaq Mix 10μL，F1/R1各0.4μL(浓度为10μmol/L)，DEPC水7.2μL，cDNA模板2μL；反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，64.0℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。
第二轮PCR：以第一轮PCR产物稀释物为模板，使用F2/R2进行PCR扩增，体系(20μL)：Green Taq Mix 10μL，F2/R2各0.4μL(浓度为10μmol/L)，DEPC水7.2μL，PCR产物模板2μL，反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。
1.2.6巢式PCR反应条件的优化
在20μl PCR反应体系中，分别加入终浓度2、4、6、8、10、12、14、16、18pmol上下游引物进行PCR扩增，筛选最佳引物用量。在45℃～70℃范围内梯度设置12个不同的退火温度，使用1.2.5中PCR检测体系进行扩增，根据核酸凝胶电泳结果，挑选最佳退火温度。
1.2.7巢式PCR灵敏度检测
使用质粒标准品和模拟样品两种方式来评判该方法灵敏度。
(1)质粒标准品：以10倍梯度稀释质粒为模板，进行巢式PCR检测，分析该方法检测底限。
(2)模拟样品：根据病毒TCID50值，计算病毒的感染性滴度(PFU/mL)，并据此梯度稀释病毒液，使得病毒浓度依次为109、108、107、106、105、104、103、102、101、100PFU/mL，将1ml梯度稀释的病毒液分别加至生长状态良好的CPB细胞中(6孔板)，对照组加等量无血清L-15培养基，每个处理三个重复，28℃无CO2培养箱孵育1h后，吸走病毒液，PBS清洗两次，加Trizol提取细胞总RNA，反转录成cDNA，巢式PCR检测评价其灵敏度。
1.2.8巢式PCR特异性检测
使用病毒DNA/RNA共提取试剂盒(天根)，提取石斑鱼神经坏死病毒(NNV)、鲤疱疹病毒II型(CyHV-II)、鳜蛙病毒(MRV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、大鲵虹彩病毒(ADIV)、鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、鳜弹状病毒(SCRV)、罗湖病毒(TiLV)与LBBV等9种病毒的核酸，进行巢式PCR检测，评价该方法的特异性。
1.2.9临床样品的检测
对实验室2017～2020年收集的来自不同地点、不同品种、不同季节、不同规格的304个病鱼样品进行巢式PCR检测，分析LBBV的流行情况。具体检测步骤如下：
(1)RNA提取。解剖病鱼，取30mg肝、脾、肾混合组织于1.5mL离心管中，加1mL PBS及2颗钢珠，匀浆3min后，10000r/min离心1min，取200μL上清，使用磁珠法提取组织RNA。
(2)反转录。取300ng RNA用Evo M-MLV RT for PCR Kit试剂盒反转录成cDNA。
(3)第一轮PCR。以反转录cDNA为模板，体系(20μL)：Green Taq Mix 10μL，F1/R1各0.4μL，DEPC水7.2μL，cDNA模板2μL，反应程序95℃预变性5min，95℃变性30s，64.0℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。
(4)凝胶电泳。观察第一轮PCR产物中是否存在长度为418bp的条带，若存在，则表明样品受到大口黑鲈双RNA病毒感染。
(5)第二轮PCR。第一轮PCR扩增结束后，若凝胶电泳无条带，则以第一轮PCR产物稀释物为模板，使用F2/R2进行PCR扩增，体系(20μL)：Green Taq Mix 10μL，F2/R2各0.4μL(浓度为10μmol/L)，DEPC水7.2μL，PCR产物模板2μL，反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。
(6)凝胶电泳。观察第二轮PCR产物中是否存在长度为339bp的条带，若存在，则表明样品受到大口黑鲈双RNA病毒感染。
实施例2结果与分析
2.1引物条件优化
结果如图1所示，当引物F1/R1和F2/R2的添加量分别为4pmol时，扩增产物条带最亮且无引物二聚体，当引物量大于4pmol时，引物二聚体随着引物量的增加而增加，且目的条带亮度减弱，因此得到最佳引物添加量为4pmol。
2.2退火温度优化
如图2(A)显示，F1/R1最佳退火温度为64.1℃，高于或低于64.1℃时扩增效率逐渐降低，条带逐渐变暗，当温度低于50.4℃会引起非特异性扩增；图2(B)显示F2/R2最佳退火温度为61.5℃，高于或低于61.5℃时扩增效率逐渐降低，条带逐渐变暗，当温度低于56.0℃时会引起非特异性扩增。
2.3灵敏度检测
将质粒10倍梯度稀释后进行PCR，第一轮RT-PCR最低能检测至4.15×104copies/μL(图3(A))，第二轮PCR最低能检测至4.15×100copies/μL(图3(B))；模拟样品结果显示，第一轮RT-PCR最低能检测至106PFU/mL(图4(A))，第二轮PCR最低能检测至102PFU/mL(图4(B))，表明本发明建立的巢式PCR检测方法具有很高的灵敏度。
2.4特异性检测
采用建立的巢式PCR对石斑鱼神经坏死病毒(NNV)、鲤疱疹病毒II型(CyHV-II)、鳜蛙病毒(MRV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、大鲵虹彩病毒(ADIV)、鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、鳜弹状病毒(SCRV)、罗湖病毒(TiLV)等9种病毒核酸进行检测，均无特异性条带产生，仅LBBV出现明亮条带(图5)，表明建立的巢式PCR具有良好的特异性。
2.5巢式PCR对临床样品的检测
对本实验室收集于2017～2020年间的304个病鱼样品进行检测。这些样品主要来自广东地区养殖的大口黑鲈、鳜、乌鳢、云斑尖塘鳢，结果显示，304个病鱼样品中，第一轮RT-PCR检出样品14株，检出率为4.60％，巢式RT-PCR检出阳性样品28株，检出率为9.21％。对阳性样品的流行特性进行了初步的分析，发现该病毒主要在清远、佛山、顺德地区检出；主要在6～9月份高温季节暴发流行；感染宿主包括大口黑鲈、鳜、乌鳢；2017～2018年的阳性样品主要为小规格鱼，2019～2020年的阳性样本不仅有小规格鱼，在成鱼中也有检出。
表2临床阳性样本信息
Figure BDA0002798157550000091
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒及方法
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1289
<212> DNA
<213> 大口黑鲈
<400> 1
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<213> 人工合成
<400> 7
ctctttgtgg cgttggcttc g 21

Claims (8)

1.一种检测大口黑鲈双RNA病毒巢式PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两对巢式PCR引物，所述两对巢式PCR引物的序列如下：
F1：5’-CAGAAGGACCGATTCAACTCACT-3’；
R1：5’-CTCTGGTGAGGAGGTAGTAGGCAA-3’；
F2：5’-CCTGTCGTGCGGGCTCCTATT-3’；
R2：5’-CTCTTTGTGGCGTTGGCTTCG-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg2＋溶液和ddH2O。
3.两对巢式PCR引物在制备检测待测样品中是否含有大口黑鲈双RNA病毒试剂盒中的应用，其特征在于，所述两对巢式PCR引物的序列如下：
F1：5’-CAGAAGGACCGATTCAACTCACT-3’；
R1：5’-CTCTGGTGAGGAGGTAGTAGGCAA-3’；
F2：5’-CCTGTCGTGCGGGCTCCTATT-3’；
R2：5’-CTCTTTGTGGCGTTGGCTTCG-3’。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，采用所述检测待测样品中是否含有大口黑鲈双RNA病毒试剂盒对待测样品进行二轮PCR，具体包括以下步骤：
（1）取待测样品提取RNA；
（2）将RNA反转录得到cDNA；
（3）以cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，第一轮PCR扩增引物为F1和R1；
（4）凝胶电泳，观察第一轮PCR产物中是否存在长度为418bp的条带，若存在，则表明样品受到大口黑鲈双RNA病毒感染；
（5）第一轮PCR扩增结束后，若凝胶电泳无条带，则以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增引物为F2和R2；
（6）凝胶电泳，观察第二轮PCR产物中是否存在长度为339bp的条带，若存在，则表明样品受到大口黑鲈双RNA病毒感染。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第一轮PCR扩增体系为：Green TaqMix 10µL，F1和R1各0.4µL，DEPC水7.2µL，cDNA模板2µL。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第一轮PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，64.0℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第二轮PCR体系为：Green Taq Mix 10µL，F2和R2各0.4µL，DEPC水7.2µL，PCR产物模板2µL。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第二轮PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。
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