CN103088164B

CN103088164B - 检测猪细小病毒2型的环介导等温扩增反应引物

Info

Publication number: CN103088164B
Application number: CN201310036544.9A
Authority: CN
Inventors: 李家玉; 张奇; 林志华
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2013-01-31
Filing date: 2013-01-31
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2033-01-31
Also published as: CN103088164A

Abstract

本发明属于动物分子病毒学领域，本发明公开了一种用于检测猪细小病毒2型(PPV2)的环介导等温扩增反应引物。该方法根据猪细小病毒2型VP1基因前段保守序列设计引物两对引物：外引物F3和B3；内引物FIP和BIP组成。具体序列见SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。根据所设计的引物建立一种检测猪细小病毒2型（PPV2）环介导等温扩增方法。该检测方法不与猪常见传染病病毒发生交叉反应。本发明的检测方法现地实用性强，不需要昂贵仪器设备；准确性高，特异性强，灵敏度高。

Description

检测猪细小病毒2型的环介导等温扩增反应引物

技术领域

本发明涉及一种用于检测猪细小病毒2型(PPV2)的环介导等温扩增反应引物，属于动物分子病毒学领域。

背景技术

猪细小病毒2型（Porcine parvovirus 2，PPV2)最早于2001年在缅甸一例患有E型肝炎的猪只中检测到。此后在2006-2007我国（中国）南方地区患有“高热病”的猪群中检测到。最近在匈牙利和美国军用该病的研究报道。目前，关于PPV2的致病性的研究较小，致病机理还未见明确。所以，建立一种简单实用的检测方法对猪细小病毒2型的防控有着重要意义。

基于分子水平对猪细小病毒2型检测常根据病毒基因特征设计特异性引物进行PCR扩增，可及时准确的进行病原鉴别诊断，但是普通的PCR以及灵敏度更高的荧光定量PCR，均需要使用精密仪器，对实验人员有较高的技术要求等，无法在基层实验室广泛使用。环介导等温扩增方法( loop-mediated isothermal amplification , LAMP)可以在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列。该方法特异性强，灵敏度较PCR方法高，无需PCR仪器等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度（60℃—65℃）。大大降低了检测的费用，特别适合基层和现地使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪细小病毒2型的环介导等温扩增反应引物。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

所述用于检测猪细小病毒2型的环介导等温扩增反应引物，由1对外引物和1对内引物组成，其中所述的外引物由F3和B3，内引物由FIP和BIP组成；上述两对引物的序列如下：

F3：5’- CCCGCTGGAGAACCTCAT -3’，

B3： 5’- GCCATCCACCACTGCTTG -3’，

FIP：5’- CATTGATCCCTCTCCGCCCGGGATGCCATGGACAGATCC -3’，

BIP：5’- GCGCCAGGCTCTCTTACAGCCCCAGAAACCACCGTGTT -3’。

本发明还提供了所述的环介导等温扩增反应引物在制备猪细小病毒2型快速诊断试剂中的用途。

本发明根据猪细小病毒2型基因组中VP1基因序列特征，设计特异性的LAMP引物，根据所设计的LAMP引物，建立了检测猪细小病毒2型（PPV2）环介导等温扩增方法。该方法不与猪其他常见传染病发生非特异性反应，该方法适用性好，准确度高，特异性强，灵敏度高。

敏感性实验表明，本发明所建立的LAMP检测方法能在60分钟内检测出26拷贝数/μL的病毒核酸，比常规方法敏感100倍。同时，本发明中，加入一种绿色荧光染料SYBR Ⅰ，该染料在反应液配制是加入，反应结束后，无需开盖，直接根据颜色变化进行结果判定，这极大的降低了污染的可能性，提高该方法的现地使用性。

附图说明

图1为猪细小病毒2型LAMP特异性实验，其中1：PPV2阳性DNA；2：猪细小病毒DNA；3：猪圆环病毒DNA；4：猪伪狂犬病毒DNA；5：猪瘟病毒cDNA。

图2为猪细小病毒2型 LAMP方法琼脂糖电泳实验。其中M：DL2000分子量Marker；1: 构建的p-PPV2阳性质粒；2：猪细小病毒2型阳性；3：猪细小病毒；4：猪圆环病毒；5：猪伪狂犬病毒；6：猪瘟病毒。

具体实施方式

下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。

实施例1

1. LAMP实验引物的设计

下载GenBank中登录的所有猪细小病毒2型基因序列和本研究室从我省现地猪场中检测到的猪细小病毒2型基因序列，进行分析比较，选择VP1基因前段保守区域片段（GenBankJX101461），利用LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)设计引物，包括外引物1对和内引物1对，具体序列见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

2、毒株

猪细小病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。猪细小病毒2型阳性DNA由我省（福建省）现地猪场现地检测并保存。

3、病毒核酸的提取

用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0（宝生物工程（大连）有限公司）按照说明书方法进行操作提取猪细小病毒2型阳性病料的DNA，－20℃保存备用。

4、阳性标准品的制备

以提取的PPV2病毒DNA为模板，用所设计的特异性引物（F：5′- TCGAACACGGTCTTGAGGC-3′和R：5′- TGAATCGCTTTCGAACGGTCTT-3′，扩增片段长度为693bp，扩增体系为50μL，其中Primix Taq^TM（Ex Taq^TM Version）25μL、上下游引物（20μM）各1μL、cDNA1μL，补充灭菌去离子水至终体积50 μL。反应条件：反应条件为94℃ 5 min预变性后进入循环，循环参数为94℃ 50s、53℃ 30s、72℃ 40s，35个循环后，72℃延伸10min。取PCR产物5μL，在1.0 %琼脂糖凝胶上电泳。经胶回收试剂盒切胶回收纯化后与T载体连接，转化JM109感受态细胞，应用PCR和双酶切方法鉴定重组质粒，并将阳性重组质粒进行序列测定。测序结果在NCBI上进行BLAST分析表明，该阳性重组质粒符合实验预期，即作为猪细小病毒2型LAMP阳性标准品(p-PPV2)。将获得的阳性标准品用超微量紫外可见分光光度计测定OD260值对阳性质粒进行定量后计算拷贝数，置于－20℃备用，使用前并进行10倍连续稀释。

5、LAMP实验条件优化

使用Loopamp DNA扩增反应试剂盒（北京蓝谱生物科技有限公司）进行LAMP反应。每25μL反应体系中含有：2×反应液12.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、F3和B3各0.6μM、FIP和BIP各1.5μM、绿色荧光染料SYBR Ⅰ1μL，以猪细小病毒2型LAMP阳性标准品为模板，补充灭菌去离子水至终体积25μL。实验不同温度（60℃、62℃、64℃、66℃）、不同时间（30min、60min、90min）检测引物反应性能。

6、特异性实验

取猪细小病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒提取的DNA（或RNA反转录成cDNA）进行LAMP反应，并重复实验操作一次。

7、敏感性实验

将制备的阳性质粒标准品进行10倍连续稀释，取拷贝数为2.6×10¹拷贝数/μL至2.6×10⁵拷贝数/μL五个梯度的样品进行LAMP反应，确定检测敏感度。并重复实验操作一次。

8、临床样品的检测

对本研究室收集的18份猪组织病料按照步骤3中的方法提取DNA后，进行LAMP和PCR检测。

实验结果

1、LAMP方法的特异性实验

猪细小病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均为阴性，而对猪细小病毒2型阳性DNA有很好的扩增，本方法具有很好的特异性。此外，本结果在自然光条件下可以见到的通过明显的颜色区别进行判定（见图1）。

肉眼观察颜色变化和管底的白色沉淀判定检测结果：可见阳性试管见有明显的翠绿色，阴性则成明显的橙红色。阳性管内液体浑浊，离心或静置后有白色沉淀集于管底，阴性样品则没有。

2、LAMP方法敏感性结果

将制备的阳性质粒标准品进行10倍连续稀释，确定猪细小病毒2型（PPV2）环介导等温扩增方法检测敏感度为2.6×10¹拷贝数/μL，其敏感性为普通PCR的100倍。

3、临床样品的检测

对本研究室收集的18份猪组织病料进行猪细小病毒2型LAMP检测，共有3份阳性样品，PCR检测仅有1份阳性样品。

4、猪细小病毒2型LAMP方法琼脂糖电泳后染色检测

从电泳结果图2可见，本发明建立的猪细小病毒2型LAMP方法对猪细小病毒2型检测有明显的条带，而对猪细小病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均为阴性。

<110> 福建农林大学

<120> 检测猪细小病毒2型的环介导等温扩增反应引物

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccgctggag aacctcat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccatccacc actgcttg 18

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cattgatccc tctccgcccg ggatgccatg gacagatcc 39

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgccaggct ctcttacagc cccagaaacc accgtgtt 38

Claims

1.一种用于检测猪细小病毒2型的环介导等温扩增反应引物，其特征性在于：所述的引物由1对外引物和1对内引物组成，其中所述的外引物由F3和B3，内引物由FIP和BIP组成；上述两对引物的序列如下：

F3：5’- CCCGCTGGAGAACCTCAT -3’，

B3： 5’- GCCATCCACCACTGCTTG -3’，

FIP：5’- CATTGATCCCTCTCCGCCCGGGATGCCATGGACAGATCC -3’，

BIP：5’- GCGCCAGGCTCTCTTACAGCCCCAGAAACCACCGTGTT -3’。

2.权利要求1所述的环介导等温扩增反应引物在制备猪细小病毒2型快速诊断试剂中的用途。