CN106011314B - 一种用于检测猪细小病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于检测猪细小病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法，该LAMP引物组序列分别为引物F3：5’‑ACGGAGGTAAAATTGGACA‑3’；引物B3：5’‑TCCCTTTAGCTTTTTTTTTAGC‑3’；FIP：5’‑GAGATGTAGTTGGTGAGTCTGTTTTTTTTTCTTCAGAGCAAAGCGTG‑3’；引物BIP：5’‑CAACCAGAGGTAAGAAGATCGCTTTTAAAAATATGTCTTGGAGCAGGT‑3’。本发明还提供了含有上述引物组的检测试剂盒及检测方法，通过向LAMP反应产物中加入荧光染料后的颜色变化来判断被测样品是否含有PPV，实现了可视化，反应结果易判定，非常易于临床推广。

Description

一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
猪细小病毒(Porcine Parvoviru，PPV)，它是属于细小病毒科的细小病毒属。猪细小病毒会引起猪的一种繁殖障碍性疾病，受到该病感染的母猪，特别是受到该病感染的初产母猪会出现产死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪、偶有流产的特征，而母猪本身并无明显症状。
猪细小病毒病在世界各地分布广泛并且在大多数猪场流行，猪细小病毒可以通过多种途径对猪感染，比如水源、食物、交配和胎盘等。猪细小病毒对热、消毒药和酸碱的抵抗力均很强，pH适应范围很广。病毒对外界环境的抵抗力也很大，能在被污染的猪舍内生存数月之久，容易造成长期连续传播。当被污染的圈舍按照常规消毒方法处理后，再放入易感染猪时，仍有被病毒感染的可能。由于该病难以防治，给养猪业带来巨大损失和危害，因此，建立一种快速、特异、灵敏并且适合在基层推广的检测方法就非常必要，将这种检测方法研制成试剂盒进行推广使用更具有很强的实用价值。
国内外猪细小病毒现有常用诊断技术主要包括：临床诊断、病原诊断、血清学诊断、分子生物学诊断等。临床诊断主要依据流行病学、临床症状和尸体剖检来判断疾病种类，难以做到确诊。病原分离是最经典和可靠的病原诊断方法，特异性高，可直接确诊，但病毒分离所需时间较长，成本较高。
血清学诊断技术主要包括：血清中和试验(Neutralization test,NT)、凝集性试验(Agglutination test,AT)、荧光抗体技术(Fluorescent-labelled abtibody technic,FA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点金免疫渗滤法、胶体金免疫层析法(Colloidal goldimmimochromatography assay,CGICA)等。应用最多的血清学方法主要是ELISA，该方法具有灵敏、特异性强、快速、简便等特点，常被用于大规模的血清学检查，且目前己经建立了检测PPV的ELISA方法。但由于PPV已经在猪场广泛存在，所以，ELISA的检测结果不能作为判定猪群发生猪细小病毒相关疾病的决定性依据。
分子生物学诊断技术包括聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence Quantitative PCR,FQ-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(Real-time fluorescence Quantitative RT-PCR,RQ-RT-PCR)、环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术、依赖于核酸序列扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)技术、核酸探针技术、基因芯片检测技术等。核酸探针技术特异性强，准确可靠，可用于不同毒株的分离和鉴定，但诊断费用较高。基因芯片包括cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因组芯片等，主要目标是用于DNA序列的测定、基因表达谱鉴定、基因突变体的检测分析，以及基因组的功能研究等。它们都是比较理想的检测方法，但是也存在耗时费力、设备要求特殊等局限性。LAMP是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测猪细小病毒(PPV)的LAMP引物组、试剂盒及检测方法，利用LAMP技术，实现猪细小病毒的可视化、快速检测。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组，其包括如下引物：
本发明所述用于检测猪细小病毒的LAMP引物组在制备猪细小病毒的LAMP检测试剂盒中的应用。
本发明所述包含上述LAMP引物组的猪细小病毒的LAMP检测试剂盒。
本发明所述LAMP检测试剂盒还包括LAMP反应体系：该LAMP反应体系包括：MgSO4、dNTP、buffer缓冲液、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、甜菜碱、模板、Bst酶。
优选的，所述25μL LAMP反应体系中各成分的用量为：MgSO4：20-30nmol，dNTP：0.5-1.0nmol，10×buffer，引物FIP：5-40pmol，引物BIP：5-40pmol，引物F3：2.5-40pmol，引物B3：2.5-40pmol，甜菜碱：15-25μmol，Bst酶：6.4-9.6U。
更优选的，所述25μL LAMP反应体系中各成分的用量为：MgSO4：20nmol，dNTP：1.0nmol，10×buffer，FIP：5pmol，BIP：5pmol，F3：20pmol，B3：20pmol，甜菜碱：25μmol，Bst酶：9.6U。
本发明所述LAMP检测试剂盒还包括：显色剂、阳性对照、无模板对照。
优选的，所述显色剂为SYBR Green I染料；所述阳性对照为PPV质粒。
本发明所述LAMP检测试剂盒的检测反应程序为：首先59-65℃恒温30-60min，再80-85℃恒温3-5min。
优选的，所述LAMP检测试剂盒的检测反应程序为：首先59℃恒温45min，再80℃恒温3min。
一种检测猪细小病毒的LAMP检测方法，其包括如下步骤：
1)提取猪细小病毒DNA作为反应模板；
2)配制LAMP检测体系
LAMP检测体系包含如下成分，按总体积25μL配制：MgSO4：20-30nmol，dNTP：0.5-1.0nmol，10×buffer，引物FIP：5-40pmol，引物BIP：5-40pmol，引物F3：2.5-40pmol，引物B3：2.5-40pmol，甜菜碱：15-25μmol，Bst酶：6.4-9.6U；还包括步骤1)提取的DNA模板；
3)LAMP反应
LAMP反应程序为：首先59-65℃恒温30-60min，再80-85℃恒温3-5min；
4)步骤3)LAMP反应结束后，向反应物中加入SYBR Green I染料，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有猪细小病毒；显色为橘红色的样品为阴性，不含猪细小病毒。
优选的，所述LAMP检测体系中各成分的用量为：MgSO4：20nmol，dNTP：1.0nmol，10×buffer，FIP：5pmol，BIP：5pmol，F3：20pmol，B3：20pmol，甜菜碱：25μmol，Bst酶：9.6U。
优选的，所述LAMP反应程序为：首先59℃恒温45min，再80℃恒温3min。
本发明利用LAMP技术建立针对猪细小病毒的检测方法，该方法具有多引物同时扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于LAMP反应操作步骤简单及反应产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，荧光剂显色后可以用肉眼观察判定反应结果，适用于各种实验条件下检测工作的使用。
本发明根据LAMP的工作原理，以PPV的VP1基因为目标基因，在优化相关反应条件的基础上，建立了适用于临床应用的用于检测猪细小病的LAMP方法，并将该方法研制成诊断试剂盒进行推广应用，为猪细小病毒的防控提供必要的技术。
本发明的有益效果：
本发明根据猪细小病毒的VP1基因序列，设计合成4个引物，通过对LAMP条件的优化，以及敏感性、特异性试验，建立猪细小病毒的LAMP检测方法，通过向LAMP反应产物中加入荧光染料后的颜色变化来判断被测样品是否含有PPV，为猪细小病毒的现场快速诊断提供了一种简便快速的方法，该方法具有反应条件简单、结果读判方便、敏感性高、特异性强、快速等优点。
本发明的优势还在于已经将这种LAMP检测方法研制成试剂盒，并进行推广应用。该试剂盒特异性强，灵敏度高，检测限为101拷贝。
本发明所提供的猪细小病毒的LAMP快速检测试剂盒，操作简单，且直接通过产物颜色变化进行判定，实现了可视化，使反应结果易判定，非常易于临床推广。
附图说明
图1为本发明实施例2的LAMP检测的可视化结果。
图2为本发明实施例4灵敏度试验的可视化结果。
图3为本发明实施例5特异性试验的可视化结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限制。
实施例1检测PPV的LAMP引物组设计
PPV有三种结构蛋白VP1、VP2和VP3，其VP3是VP2水解后的产物，而VP2完全重叠于VP1中。根据GenBank中的猪细小病毒(PPV)的VP1基因序列(如SEQ ID NO.1所示)，针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’端的F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bl、B2和B3区共6个不同的位点设计4种引物，具体序列如表1所示。
表1
实施例2PPV的LAMP检测方法的建立和验证，包括如下步骤：
1)病毒DNA的提取
参照EZgeneTM Blood Viral DNA/RNA Miniperp Kit(VR6511)试剂盒说明书，对上海市农业科学院畜牧研究所李春华老师提供的含有PPV的猪血清样品进行DNA提取，将提取的DNA放在4℃保存。
2)LAMP反应体系的建立
最终优化的反应体系如下：
LAMP反应体系(25μL)的配置为：ddH2O 5.5μL，浓度25mmol/L的MgSO4 0.8μL，浓度2.5mmol/L的1×dNTP 4.0μL，10×buffer 2.5μL，浓度10pmol/μL的FIP 0.5μL，浓度10pmol/μL的引物BIP 0.5μL，浓度10pmol/μL的引物F3 2.0μL，浓度10pmol/μL的引物B32.0μL，浓度5μmol/μL甜菜碱5μL，模板1μL，8U/μL的Bst酶1.2μL。
反应程序：59℃45min，80℃3min。
以阳性对照模板(步骤1)提取PPV DNA，即阳性质粒)、无模板对照分别进行LAMP反应。反应结束后，向两个反应的LAMP产物里加入1μL的SYBR Green I染料，观察颜色变化，显色结果如图1所示。图1中显示：阳性质粒的反应产物颜色变为绿色，无模板对照(图1中阴性质粒组)的反应产物不发生颜色变化，为橘红色。由此可见，本发明的LAMP反应结果易判定，易于临床推广。
实施例3PPV LAMP检测试剂盒的组装
根据以上LAMP反应体系组装检测试剂盒，以方便使用。
1)试剂盒的包装规格为200次/盒，试剂盒组成如表2所示：
表2
2)试剂盒运输及保存方法
低温运输，短期使用放至4℃避光保存，长期保存请置于-20℃或-80℃冰箱避光保存。
实施例4PPV LAMP检测试剂盒的使用
1)样品DNA的提取
参照EZgeneTM Blood Viral DNA/RNA Miniperp Kit(VR6511)试剂盒说明书，提取待测猪血清样品DNA作为模板。
2)反应液的配置
取表1中各成分进行配置，具体取ddH2O 5.5μL，PPV预混合液12.3μL，引物FIP 0.5μL，引物BIP 0.5μL，引物F3 2.0μL，引物B3 2.0μL，模板1μL加入反应小管中，混匀后在95℃水浴锅中加热5min，放置冰上冰浴5min；然后加入1.2μL Bst酶混合均匀。
3)反应的进行
LAMP反应程序为：先59℃恒温45min，再80℃恒温3min；
4)结果判定
LAMP反应结束后，向反应物中加入1μL SYBR Green I染料，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有猪细小病毒；显色为橘红色的样品为阴性，不含猪细小病毒。
实施例5猪细小病毒LAMP检测试剂盒的灵敏度试验
首先将实施例2步骤1)中所得病毒DNA通过转化将目的片段连接至T3CloningVector(T3克隆载体)上，参照博满生物柱离心式质粒小量快速抽提试剂盒说明书制备质粒，并测其浓度，按照病毒学方法计算对应的拷贝数，-20℃保存备用。
将提取到的质PPV粒制备9个样品：1：无模板对照，2：PPV质粒100拷贝，3：PPV质粒101拷贝，4：PPV质粒102拷贝，5：PPV质粒103拷贝，6：PPV质粒104拷贝，7：PPV质粒105拷贝，8：PPV质粒106拷贝，9：PPV质粒107拷贝。使用实施例3组装的检测试剂盒并参照实施例4的使用方法对上述9个样品进行3次重复性LAMP检测试验，具体结果参见图2，图2中竖向为同一样品重复3次的显示结果，横向为不同样品的显示结果。
由图2可知，样品1-2均为橘红色，样品3-9(101拷贝-107拷贝)均呈明显绿色，且随着模板浓度的升高，绿色越来越深，最低DNA浓度为PPV质粒101拷贝。
以上证明本发明所提供PPV的LAMP检测方法和试剂盒针对PPV模板的扩增具有很高的效率，即建立的PPV的LAMP检测下限为101拷贝，符合日常检测要求。
实施例6猪细小病毒LAMP检测试剂盒的特异性试验
特异性实验测试材料设置7个样品分别为：1：无模板对照，02：PCV2病毒(猪圆环病毒)样品，3：PRRSV病毒(猪蓝耳病病毒)样品，4：PRV病毒(猪伪狂犬病病毒)样品，5：CSFV病毒(猪瘟病毒)样品，6：PPV病毒样品，7：PPV质粒。将2-6号样品DNA提取方法同实施例4步骤1)。
用本发明的猪细小病毒LAMP检测试剂盒对供试的特异性实验测试7种材料样品DNA进行LAMP检测，共三次重复试验，具体结果参见图3，图3中竖向为同一样品重复3次的显示结果，横向为不同样品的显示结果。
由图3可知，本发明提供的PPV引物组(FIP、BIP、F3和B3)在非PPV病毒样品(样品1-5)中颜色反应均为橘红色，而在所有供试PPV病毒样品(样品6-7)中颜色反应均为绿色，说明本发明设计的PPV引物组特异于PPV病毒样品检测，本发明提供的LAMP检测方法和试剂盒对PPV病毒具有良好的特异性。
实施例6PPV LAMP检测试剂盒的临床应用试验
使用本发明提供的LAMP检测试剂盒检测1100个血清样品是否感染PPV。结果检出其中有320个临床样品感染PPV，PPV感染率29％。

Claims (5)

1.一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组，其包括如下引物：
引物F3：5’-ACGGAGGTAAAATTGGACA-3’；
引物B3：5’-TCCCTTTAGCTTTTTTTTTAGC-3’；
2.如权利要求1所述用于检测猪细小病毒的LAMP引物组在制备猪细小病毒的LAMP检测试剂盒中的应用。
3.一种包含权利要求1所述的LAMP引物组的猪细小病毒的LAMP检测试剂盒，其包括MgSO4、dNTP、buffer、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、甜菜碱、Bst酶；25μL LAMP反应液中各成分的用量为：MgSO4：20-30nmol，dNTP：0.5-1.0nmol，10×buffer，引物FIP：5-40pmol，引物BIP：5-40pmol，引物F3：2.5-40pmol，引物B3：2.5-40pmol，甜菜碱：15-25μmol，Bst酶：6.4-9.6U。
4.根据权利要求3所述的猪细小病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述25μL LAMP反应液中各成分的用量为：MgSO4：20nmol，dNTP：1.0nmol，10×buffer，FIP：5pmol，BIP：5pmol，F3：20pmol，B3：20pmol，甜菜碱：25μmol，Bst酶：9.6U。
5.根据权利要求3或4所述的猪细小病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP检测试剂盒还包括：显色剂、阳性对照、无模板对照。
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