CN112522444A - 一种非洲猪瘟病毒lamp-crispr检测用组合物、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒LAMP‑CRISPR检测用组合物、检测试剂盒和检测方法，该组合物包括LAMP扩增引物、crRNA和ssDNA荧光报告探针。该试剂盒包括上述组合物，还包括用于LAMP扩增的LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和p72质粒模板，以及用于CRISPR Cas12a检测体系的LbCas12a、RNase抑制剂、CRISPR反应缓冲液。本发明采用LAMP方法与CRISPR相结合的技术，可高效、精准并且不需借助大型仪器达到检测结果可视化的目的，为ASFV的快速诊断提供了新的技术支持。本发明建立的LAMP‑CRISPR对ASFV抗原分子的检测具有较高的灵敏度，能够检测到单拷贝即7×10⁰copies/μL的质粒浓度。

Description

一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物、检测试剂盒和 检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物、检测试剂盒和检测方法。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种感染家猪和各种野猪的急性、出血性、高度接触性的烈性传染病，又称非洲猪瘟疫或疣猪病。非洲猪瘟病毒可以感染不同年龄段的所有猪群，急性症状最为常见，3～10天致死，死亡率可以达到100％。该病的临床症状主要表现为发热、出血以及皮肤发绀，甚至出现血块。病理剖检后通常可见脾脏异常肿大和淤血，淋巴结、肝脏和肾脏出血，这些临床症状与经典猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病等很难区分，因此一般通过实验室手段进行非洲猪瘟的诊断和确诊。

目前非洲猪瘟尚且没有有效安全的商品化疫苗，国际上主要通过病原学和血清学方法进行非洲猪瘟的诊断。然而，该病对于我国来说是一种新发传染病，并且由于非洲猪瘟引起的临床病程较短、发病比较急，通常在病毒抗体产生以前，动物已经发病死亡。因此，我国非洲猪瘟的防控主要应用病原分子学检测方法。国际动物卫生组织(OIE)将传统PCR方法和实时荧光定量PCR作为ASFV检测的金标准。然而，这些检测方法需要大型的仪器设备、专业人员操作和耗时较长等缺点，限制了该方法在现场的即时检测。等温扩增方法如重组酶聚合酶扩增法(RPA)，环介导等温扩增法(LAMP)和交叉引物核酸恒温扩增技术(CPA)的应用避免了大型仪器设备的使用，同时等温扩增方法结合免疫层析条后可以在田间得到应用。但是，这些等温扩增方法的缺点是特异性和敏感性较低，因此，在非洲猪瘟病毒的检测中没有得到推广。

2020年诺贝尔化学奖获得者Jennifer Doudna近期基于CRISPR系统开发的被称作DETECTR的新方法能够实现灵敏而又准确的DNA检测。DETECTR检测依赖于Cas12a酶，一旦Cas12a通过一段CRISPR靶向RNA(crRNA)的引导靶向识别目的DNA序列后，它会变成一种DNA切碎机，将附近的任何单链DNA进行切割。基于CRISPR Cas12a的功能与分子信号枪相结合，研究人员已经在人类样品中发现两种致癌性的人类乳头瘤病毒(HPV)。在CRISPR Cas12a识别目的靶序列之前，首先需要对目的序列进行扩增富集，目前多数扩增手段使用RPA反应，因为RPA的最佳反应温度与Cas12a的最佳切割温度相近。但是，由于RPA反应所需的酶种类多，价格昂贵，很难能够实际应用到基层兽医的病原检测诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种避免采用RPA反应、能够推广到基层应用的非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用序列组合物、检测试剂盒和检测方法。本发明通过对LAMP的扩增方法与CRISPR Cas12的检测方法结合成为LAMP-CRISPR的分子检测试剂盒和检测方法。该分子检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性，操作简便快捷，成本低廉，不需要大型仪器设备，具有可视化的优势，更有利于对ASFV的分子检测技术在基层中的推广和应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物，包括LAMP扩增引物、crRNA和ssDNA探针；

LAMP扩增引物由内引物和外引物组成：

外引物：

2F3：5’-CTATAAACATATATTCAATGGGCC-3’(SEQ ID NO:2)；

2B3：5’-GCAATATACGCTTTAAACCATG-3’(SEQ ID NO:3)；

2FIP：5’-ACGTGTCCATAAAACGCAGGTTTTTCAGACATTAGTTTTTCATCGTG-3’(SEQ ID NO:4)；

2BIP：5’-AGGTTGTGTATTTCAGGGGTTACTTTTTCATTAATGAAATCTCGCTCAC-3’(SEQ IDNO:5)；

crRNA:5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUCGUGGUGGUUAUUGUUGGUGU-3’(SEQ ID NO:6)；

ssDNA探针:FAM:5’-(FAM)CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG(BHQ1)-3’。

在进一步的方案中，LAMP扩增引物中内引物和外引物浓度比为12pmol/μL:2pmol/μL。

本发明第二方面提供一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用试剂盒，该试剂盒包括LAMP扩增体系和CRISPR Cas12a检测体系：

所述LAMP扩增体系包括上述LAMP扩增引物和LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、p72质粒模板、荧光试剂和DEPC水。

所述CRISPR Cas12a检测体系包括上述的crRNA、ssDNA探针和CRISPR反应缓冲液、LbCas12a、RNase抑制剂和DEPC水。

在进一步的方案中，所述LAMP反应缓冲液由40mM Tris-HCl，pH 8.8、20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％Tween 20，1.6M Betaine和2.8mM dNTP组成。

在进一步的方案中，所述crRNA和LbCas12a的摩尔浓度比为1:1。

本发明第三方面提供上述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物或上述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用试剂盒在非诊断治疗目的的非洲猪瘟病毒检测中的应用。

本发明第四方面提供一种非诊断治疗目的非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测方法，包括以下步骤：

(1)使用DNA提取试剂盒提取样品中的核酸或对样品进行裂解释放核酸；

(2)将LAMP反应混合液共18.5μl和提取的核酸2μl共20.5μl加入到PCR管底部；

(3)将CRISPR反应混合液共4.5μl加入到PCR管盖部；

(4)将PCR管置于63℃的反应器中进行30min LMAP扩增；

(5)瞬时离心后将CRISPR反应混合液离心到管底部，并与LAMP扩增产物充分混合；

(6)将PCR管置于37℃进行CRISPR荧光检测；

由于LAMP反应和CRISPR反应体系的反应温度不同，因此将LAMP反应置于PCR管管底，将CRISPR反应置于管盖；两个体系加到一个管是为了避免LAMP反应结束后开盖加CRISPR反应体系引起气溶胶等污染。

(7)将PCR管置于激发波长为485nm的透射光源下观察颜色变化确定检测结果。

在进一步的方案中，所述的p72质粒模板中p72的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明具有以下有益效果：

本发明采用LAMP方法与CRISPR相结合的技术，可高效、精准并且不需借助大型仪器达到检测结果可视化的目的，为ASFV的快速诊断提供了新的技术支持。

本发明建立的LAMP-CRISPR对ASFV抗原分子的检测具有较高的灵敏度，能够检测到单拷贝即7×10⁰copies/μL的质粒浓度。

本申请采用的LAMP反应缓冲液(40mM Tris-HCl，pH 8.8,20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％Tween 20，1.6M Betaine和2.8mM dNTP)具有很强的稳定性，可以在4℃条件下进行较长期的保存而不影响其反应性，赋予了LAMP-CRISPR分子检测方法具有较高的稳定性。

本申请采用ASFV p72蛋白分子作为Cas12a识别的靶序列，p72是ASFV的主要结构蛋白，免疫原性好，且在ASFV的整个感染周期都持续存在于细胞质中。

附图说明

图1为LAMP不同扩增引物的扩增结果图。

图2为LAMP反应不同引物浓度的扩增结果图。

图3为5种不同crRNA在两种不同模板浓度下进行CRISPR Cas12a的切割检测结果图。

图4为crRNA与Cas12a形成复合物RNP在不同配比(1:1、2:1、4:1、1:2、1:4)下、在两种不同模板浓度(7×10¹copies/μL和7×10⁰copies/μL)下进行LAMP-CRISPR Cas12检测结果图。

图5为在模板浓度分别为7×10⁶copies/μL、7×10⁵copies/μL、7×10⁴copies/μL、7×10³copies/μL、7×10²copies/μL、7×10¹copies/μL和7×10⁰copies/μL下的LAMP-CRISPR检测结果图。

图6为LAMP结合CRISPR Cas12a方法特异性检测结果图。具体为使用LAMP-CRISPR方法检测不同猪病病毒在透射光源为485nm下的可视化荧光检测。

图7为LAMP-CRISPR Cas12a检测方法对临床样本的检测结果图。图中A～F分别表示动物的鼻拭子、脾脏、肝脏、肺、颌下淋巴结、肾脏样品使用LAMP-CRISPR方法检测后收集的荧光信号；a～f分别表示鼻拭子、脾脏、肝脏、肺、颌下淋巴结、肾脏样品在激发波长为485nm的透射光源进行可视化检测结果图。其中鼻拭子采集了6头份样品，脾脏、肝脏、肺、颌下淋巴结、肾脏采集了7头份样品。荧光信号中的鼻拭子的S1、S2、S3、S4、S5、S6分别对应可视化检测结果图中鼻拭子的S1、S2、S3、S4、S6、S7，可视化检测结果图中鼻拭子的S5为空PCR管。

上述图中，NC均表示阴性对照。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。

以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：

中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。

一、LAMP-CRISPR新型分子检测ASFV分子方法的建立

1.材料与方法

1.1材料

LAMP扩增引物由奥科鼎盛生物公司合成，LAMP反应缓冲液由40mM Tris-HCl，pH8.8,20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％Tween 20，1.6M Betaine和2.8mM dNTP配制而成，BstDNA聚合酶和LbCas12a酶均购自NEB公司，RNase抑制剂和ssDNA探针由宝生物公司合成，crRNA由上海吉玛基因生物公司合成。p72基因(如SEQ ID NO:1所示)通过NotI和SalI两个酶切位点连接到p3XFLAG-CMV载体构建成为p72质粒模板CMV-p72。

1.2方法

1.2.1 LAMP内外引物的设计

根据GenBank中已公布的ASFV中国流行毒株(MK333180.1；MH766894.1；MK128995.1；MN393476.1；MN172368.1)的p72基因序列，利用MEGA5进行同源比对，选择高度保守的基因序列，使用在线网站PrimerExplorer设计5套不含环引物的LAMP扩增引物，具体序列如下：

1.2.2 LAMP反应最佳引物的筛选

为了筛选5套引物中对LAMP扩增效率的情况，借助ABI QuantStudio 5设备，进行荧光LAMP的扩增，具体反应条件为：FIP和BIP各40pmol，F3和B3各为5pmol，2×ReactionBuffer Mix 12.5μL(40mM Tris-HCl，pH 8.8,20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％Tween 20，1.6M Betaine和2.8mM dNTP)，Bst DNA聚合酶1.0μL，模板质粒CMV-p72 2μL。另外，在反应液中加入1.0μL荧光试剂FDR(Eiken Chemical Co.,Ltd,Tokyo,Japan)，最后补加DEPC水至25μL反应体系。

1.2.3LAMP反应引物最佳浓度和反应温度的筛选

采用25μL反应体系，对LAMP最佳引物的内、外引物浓度比(FIP/BIP:F3/B3)分别采用4pmol/μL:1pmol/μL，8pmol/μL:1pmol/μL，12pmol/μL:1pmol/μL，4pmol/μL:2pmol/μ，8pmol/μL:2pmol/μL，12pmol/μL:2pmol/μL，8pmol/μL:4pmol/μL和12pmol/μL:4pmol/μL，模板质粒CMV-p72，筛选以确定LAMP内、外引物的最佳浓度比。反应温度分别采用60、61、62、63、64、65、66℃依次递增进行优化，确定LAMP的最佳反应温度。

1.2.4 CRISPR Cas12a检测体系的优化

设计5条针对p72靶向的crRNA序列和2条ssDNA探针序列，具体序列如下：

crRNA1：

5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAAAAAGGUUGUGUAUUUCAGGG-3’；crRNA2：

5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGGGGUUACAAACAGGUUAUUGA-3’；crRNA3：

5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAGCAGACAUUAGUUUUUCAUC-3’；crRNA4：

5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUCGUGGUGGUUAUUGUUGGUGU-3’；crRNA5：

5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGGACACGUAUCAGGGAAAAUCG-3’；

ssDNA1：FAM:5’-(FAM)CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG(BHQ1)-3’；

ssDNA2：FAM:5’-(FAM)TTATT(BHQ1)-3’。

在质粒模板浓度分别为50ng/μL和5ng/μL的条件下，采用20μL反应体系，包含50nM的LbCas12a，100nM的crRNA，0.5μL RNase抑制剂，2μL的NEBuffer 2.1，500nM FAM-BHQ1-标记的ssDNA探针以及DEPC水。反应在37℃条件下进行30min。荧光信号由ABI QuantStudio 5采集，可视化结果由激发波长为485nm的透射光源实现。此外，针对crRNA与Cas12a形成复合物RNP的比例作以优化，采用1:1、2:1、4:1、1:2、1:4进行CRISPR切割反应，根据荧光信号强弱决定最佳反应比例条件。

1.2.5 LAMP结合CRISPR Cas12a检测方法敏感性试验

将浓度为5ng/μL的CMV-p72模板质粒换算为分子拷贝数，约为7×10⁸copies/μL，并依次进行10倍稀释，分别稀释为7×10⁷copies/μL、7×10⁶copies/μL、7×10⁵copies/μL、7×10⁴copies/μL、7×10³copies/μL、7×10²copies/μL、7×10¹copies/μL和7×10⁰copies/μL。然后根据LAMP反应体系的最佳反应条件和CRISPR最佳切割反应条件下验证该方法的敏感性，以验证该反应的最低检测极限。

1.2.6 LAMP结合CRISPR Cas12a检测方法特异性试验

根据LAMP反应体系的最佳反应条件和CRISPR最佳切割反应条件下对经典猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、A型塞内卡病毒(SVA)、II型猪圆环病毒(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)进行检测，用以验证该方法对ASFV的特异性检测。

1.2.7 LAMP结合CRISPR Cas12a检测方法对临床样本的检测

对41份感染以及未感染有ASFV的临床样本(6份鼻拭子，7份脾脏、肝脏、肺、颌下淋巴结和肾脏)，通过65℃条件下30min灭活处理，通过快提DNA试剂盒提取临床样本的DNA，使用ASFV抗原分子检测金标准实时荧光定量qPCR检测确定临床样本的阴、阳性以及阳性的CT值，然后使用本发明的LAMP-CRISPR对该临床样本进行检测，以验证LAMP-CRISPR检测临床样本的能力。

2.结果

2.1 LAMP最佳扩增引物的选择

将设计的5套引物按25μL扩增体系分别加入到PCR管，每套引物作以重复，63℃条件下反应60min，使用ABI QuantStudio 5收集荧光，比较不同引物的荧光扩增曲线，如图1所示，第2套引物的扩增效率最高，而且在25min内开始出现扩增曲线。因此，选取第2套引物作为LAMP的最佳反应引物。

2.2LAMP反应引物最佳浓度和反应温度的确定

选取LAMP反应最佳引物(第2套)的不同内、外引物浓度比，按25μL扩增体系分别加入到PCR管，63℃条件下反应50min，使用ABI QuantStudio 5收集荧光，比较内外引物浓度比的荧光扩增曲线，结果显示当内外引物浓度比为12pmol/μL:2pmol/μL，ASFV核酸的扩增效率最高，如图2所示，因此选取该引物配比为ASFV LAMP扩增最适引物比。

2.3 CRISPR Cas12 a切割反应的优化

对设计的5种不同crRNA分别在两种不同模板浓度下进行CRISPR Cas12a的切割检测，反应在37℃条件下进行30min，荧光信号由ABI QuantStudio 5采集。可视化荧光由激发波长为485nm的透射光源实现，检测结果如图3所示。检测结果表明crRNA3、crRNA4和crRNA5在模板浓度为50ng/μL时有扩增曲线产生，且在激发波长为485nm的透射光源下可产生明显的荧光，与阴性产物可以有明显的区分。同时，针对两种不同探针进行CRISPR切割检测反应，筛选出ssDNA2具有较高的荧光值，该探针将用作后续试验的检测。

此外，对crRNA与LbCas12a形成复合物RNP的比例作以优化，采用1:1、2:1、4:1、1:2、1:4进行配比，在两种不同模板浓度(7×10¹copies/μL和7×10⁰copies/μL)进行LAMP-CRISPR Cas12切割检测反应，反应在37℃条件下进行30min，荧光信号由ABI QuantStudio5采集。可视化荧光由激发波长为485nm的透射光源实现，检测结果如图4所示，结果表明当crRNA与Cas12a的比例为1:1(50nM:50nM)时，LAMP-CRISPR Cas12a能够检测到单拷贝(7copies/μL)。

2.4 LAMP结合CRISPR Cas12a检测方法敏感性试验

通过优化确定LAMP-CRISPR反应最佳使用浓度剂量后，对模板浓度分别为7×10⁶copies/μL、7×10⁵copies/μL、7×10⁴copies/μL、7×10³copies/μL、7×10²copies/μL、7×10¹copies/μL和7×10⁰copies/μL分别进行LAMP-CRISPR切割检测反应，确定该反应的敏感性。反应在37℃条件下进行30min，荧光信号由ABI QuantStudio 5采集。可视化荧光由激发波长为485nm的透射光源实现，检测结果如图5所示。检测结果表明LAMP-CRISPR能够检测到单拷贝即7×10⁰copies/μL的质粒浓度。此外，将质粒模板稀释至1copies/μL，10次反应可以检测到6次具有荧光扩增曲线，在激发波长为485nm的透射光源能够观察到荧光。这些结果表明本发明建立的LAMP-CRISPR对ASFV抗原分子的检测具有较高的灵敏度。

2.5 LAMP结合CRISPR Cas12a检测方法特异性

根据最佳优化条件的LAMP-CRISPR检测反应对其它猪病病原进行检测，反应在37℃条件下进行30min，荧光信号由ABI QuantStudio 5采集，可视化荧光由激发波长为485nm的透射光源实现。检测结果表明LAMP-CRISPR方法对经典猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、A型塞内卡病毒(SVA)、II型猪圆环病毒(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)均未能检测到扩增曲线和荧光，只有在ASFV核酸基因组存在的条件能够检测到扩增曲线和荧光，如图6所示，表明了LAMP-CRISPR方法具有较高的特异性。

2.6 LAMP-CRISPR Cas12a检测方法对临床样本的检测

包括以下步骤：

(1)使用DNA快提试剂盒提取样品中的核酸或对样品进行裂解释放核酸。

(2)将LAMP反应混合液(组成：LAMP反应缓冲液，内外引物，p72质粒模板，BstDNA聚合酶和DEPC水)共18.5μl和提取的样品核酸2μl共20.5μl加入到PCR管底部。

(3)将CRISPR反应混合液(组成：CRISPR反应缓冲液(NEBuffer 2.1)，RNA酶抑制剂，LbCas12a，crRNA、ssDNA探针和DEPC水)共4.5μl加入到PCR管盖部。

(4)将PCR管置于63℃条件反应器中进行30min LMAP扩增。

(5)瞬时离心后将CRISPR反应混合液离心到管底部，并与LAMP扩增产物充分混合。

(6)将PCR管置于37℃条件反应器中进行20～30min CRISPR荧光检测

(7)将PCR管置于激发波长为485nm的透射光源观察颜色变化确定检测结果。

针对41份感染以及未感染ASFV并且经过分子检测金标准实时荧光定量qPCR检测确定临床样本的阴、阳性以及阳性的CT值进行LAMP-CRISPR检测方法的验证，通过对ASFVqPCR检测结果CT值为17～35的阳性样本以及阴性样本进行检测，结果表明LAMP-CRISPR能够检测到CT值为35以下的所有阳性样本，如图7所示。表明了LAMP-CRISPR检测方法可以运用到临床样本的检测，而且LAMP-CRISPR检测更加方便快捷，较高灵敏度和特异性，并且能够直观，肉眼可见的观察检测结果。

以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物、检测试剂盒和检测方法

<130> 无

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1941

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 无

<400> 1

atggcatcag gaggagcttt ttgtcttatt gctaacgatg ggaaggccga caagattata 60

ttggcccaag acttgctgaa tagcaggatc tctaacatta aaaatgtgaa caaaagttat 120

gggaaacccg atcccgaacc cactttgagt caaatcgaag aaacacattt ggtgcatttt 180

aatgcgcatt ttaagcctta tgttccagta gggtttgaat acaataaagt acgcccgcat 240

acgggtaccc ccaccttggg aaacaagctt acctttggta ttccccagta cggagacttt 300

ttccatgata tggtgggcca tcatatattg ggtgcatgtc attcatcctg gcaggatgct 360

ccgattcagg gcacgtccca gatgggggcc catgggcagc ttcaaacgtt tcctcgcaac 420

ggatatgact gggacaacca aacaccctta gagggcgccg tttacacgct tgtagatcct 480

tttggaagac ccattgtacc cggcacaaag aatgcgtacc gaaacttggt ttactactgc 540

gaataccccg gagaacgact ttatgaaaac gtaagattcg atgtaaatgg aaattcccta 600

gacgaatata gttcggatgt cacaacgctt gtgcgcaaat tttgcatccc aggggataaa 660

atgactggat ataagcactt ggttggccag gaggtatcgg tggagggaac cagtggccct 720

ctcctatgca acattcatga tttgcacaag ccgcaccaaa gcaaacctat tcttaccgat 780

gaaaatgata cgcagcgaac gtgtagccat accaacccga aatttctttc acagcatttt 840

cccgagaact ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tatcacggac 900

gcaacgtatc tggacataag acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct 960

aaatactatc agccccctct tgcgctctgg attaagttgc gcttttggtt taatgagaac 1020

gtgaaccttg ctattccctc agtatccatt cccttcggcg agcgctttat caccataaag 1080

cttgcatcgc aaaaggattt ggtgaatgaa tttcctggac tttttgtacg ccagtcacgt 1140

tttatagctg gacgccccag tagacgcaat atacgcttta aaccatggtt tatcccagga 1200

gtcattaatg aaatctcgct cacgaataat gaactttaca tcaataacct gtttgtaacc 1260

cctgaaatac acaacctttt tgtaaaacgc gttcgctttt cgctgatacg tgtccataaa 1320

acgcaggtga cccacaccaa caataaccac cacgatgaaa aactaatgtc tgctcttaaa 1380

tggcccattg aatatatgtt tataggatta aaacctacct ggaacatctc cgatcaaaat 1440

cctcatcaac accgagattg gcacaagttc ggacatgttg ttaacgccat tatgcagccc 1500

actcaccacg cagagataag ctttcaggat agagatacag ctcttccaga cgcatgttca 1560

tctatatctg atattagccc cgttacgtat ccgatcacat tacctattat taaaaacatt 1620

tccgtaactg ctcatggtat caatcttatc gataaatttc catcaaagtt ctgcagctct 1680

tacataccct tccactacgg aggcaatgcg attaaaaccc ccgatgatcc gggtgcgatg 1740

atgattacct ttgctttgaa gccacgggag gaataccaac ccagtggtca tattaacgta 1800

tccagagcaa gagaatttta tattagttgg gacacggatt acgtggggtc tatcactacg 1860

gctgatcttg tggtatcggc atctgctatt aactttcttc ttcttcagaa cggttcagct 1920

gtgctgcgtt acagtaccta a 1941

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 无

<400> 2

ctataaacat atattcaatg ggcc 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GCAATATACGCTTTAAACCATG

<400> 3

gcaatatacg ctttaaacca tg 22

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACGTGTCCATAAAACGCAGGTTTTTCAGACATTAGTTTTTCAT

CGTG

<400> 4

acgtgtccat aaaacgcagg tttttcagac attagttttt catcgtg 47

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 无

<400> 5

aggttgtgta tttcaggggt tactttttca ttaatgaaat ctcgctcac 49

<210> 6

<211> 43

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 无

<400> 6

aauuucuacu aaguguagau aucguggugg uuauuguugg ugu 43

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物，其特征在于，包括LAMP扩增引物、crRNA和ssDNA探针；

LAMP扩增引物由内引物和外引物组成：

外引物：

2F3：5’-CTATAAACATATATTCAATGGGCC-3’；

2B3：5’-GCAATATACGCTTTAAACCATG-3’；

内引物：

2FIP：5’-ACGTGTCCATAAAACGCAGGTTTTTCAGACATTAGTTTTTCAT

CGTG-3’；

2BIP：5’-AGGTTGTGTATTTCAGGGGTTACTTTTTCATTAATGAAATCTCG

CTCAC-3’；

crRNA：AAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUCGUGGUGGUUAUUGUUGGUGU；

ssDNA探针：FAM:5’-(FAM)CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG(BHQ1)-3’。

2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物，其特征在于，LAMP扩增引物中内引物和外引物浓度比为12 pmol/μL:2pmol/μL。

3.一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～2任一项所述的组合物。

4.根据权利要求3所述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于LAMP扩增的LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和荧光试剂，以及用于CRISPR Cas12a 检测体系的CRISPR反应缓冲液、LbCas12a和RNase抑制剂。

5.根据权利要求4所述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应缓冲液由40 mM Tris-HCl，pH 8.8、20 mM KCl， 16 mM MgSO₄，20 mM (NH₄)₂SO₄，0.2% Tween 20，1.6 M Betaine和2.8 mM dNTP组成。

6.根据权利要求4所述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用试剂盒，其特征在于，所述crRNA和LbCas12a的摩尔浓度比为1:1。

7.权利要求1～2任一项所述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用组合物在非诊断治疗目的的非洲猪瘟病毒检测中的应用。

8.权利要求3～6任一项所述的一种非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测用试剂盒在非诊断治疗目的的非洲猪瘟病毒检测中的应用。

9.一种非诊断治疗目的非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）使用DNA提取试剂盒提取样品中的核酸或对样品进行裂解释放核酸；

（2）将LAMP反应混合液共18.5 μl和提取的核酸2 μl 共20.5 μl加入到PCR管底部；

（3）将CRISPR反应混合液共4.5 μl加入到PCR管盖部；

（4）将PCR管置于63℃的反应器中进行30min LMAP扩增；

（5）瞬时离心后将CRISPR反应混合液离心到管底部，并与LAMP扩增产物充分混合；

（6）将PCR管置于37℃进行CRISPR荧光检测；

（7）将PCR管置于激发波长为485nm的透射光源下观察颜色变化确定检测结果。

10.根据权利要求9所述的一种非诊断治疗目的非洲猪瘟病毒LAMP-CRISPR检测方法，其特征在于，所述LAMP反应混合液由以下成分组成：LAMP反应缓冲液、内引物、外引物、BstDNA聚合酶、p72质粒模板、荧光试剂和DEPC水，所述的p72质粒模板中p72的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

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