CN107034309B - 快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光rpa试剂盒、试纸条rpa试剂盒及其用途 - Google Patents

快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光rpa试剂盒、试纸条rpa试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA试剂盒及其用途，还公开了一种快速检测猪伪狂犬病毒的试纸条RPA试剂盒及其用途。该两种试剂盒分别包括SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示的引物及各自的探针，虽然针对同一靶标序列，但引物和探针的修饰碱基和检测平台不同。实验证明本发明的两个试剂盒的敏感性均为102拷贝/反应，并均只能特异性检测猪伪狂犬病毒。分别用本发明的两个试剂盒检测猪伪狂犬病毒疑似样品，结果表明这两个试剂盒的检测结果与qPCR的符合度均为100％。因此，本发明的两个试剂盒均能快捷、高效、灵敏的检测猪伪狂犬病毒，为猪伪狂犬病毒的鉴别诊断提供了有效技术手段。

Description

快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA试剂盒、试纸条RPA试 剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及一种检测猪伪狂犬病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种基于RPA反应的用于快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA试剂盒以及试纸条RPA试剂盒，还涉及二者在快速检测猪伪狂犬病毒中的用途，本发明属于预防兽医学检验领域。
背景技术
自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。但是该技术需要特殊昂贵的热循环仪器以及熟练的操作人员，费时费力，难以用在现场诊断以及实验条件差的地方。在发展中国家实验室中，由于PCR实施所需要的基础设备和技术所限，大多数发展中国家仍然集中在使用传统的试验方法，比如血清学方法、显微镜技术，或者培养以及鉴定传染性以及非传染性疾病。为了填补传统方法和PCR之间的空缺，新的等温分子诊断技术正在开发，该方法尤其适用于基础设施、实验设备以及试验技术难于支持使用PCR进行诊断的地方。
与常规方法相比较，等温扩增实验具有很高的敏感性和特异性，这些原因促使不同的公司商业化不同的等温扩增技术，比如，环介导的扩增(LAMP；Eiken,日本)，RPA(RPA；Alere,USA and TwistDx,UK)，链置换扩增(strand displacement amplification,BectonDickson,USA)。在这些技术中，LAMP是使用最为广泛，且最成熟的试验方法。与RPA方法相比较，LAMP技术具有试验设计比较麻烦(3对引物)，特异性相对较弱(能扩增很多条带)，时间仍然相对较长，以及易于污染等不足的地方。
英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的
Figure BDA0000921732710000013
核酸扩增产品能够在15分钟内，37℃-42℃之间进行核酸检测。现在使用最多的、最为成熟的为进行实时监控的体系(如
Figure BDA0000921732710000011
exo试剂盒，real-time RPA)以及基于试纸条的终点检测(
Figure BDA0000921732710000012
nfo试剂盒，Recombinase Polymerase Amplification Assaycombined with lateral flow test，LFS RPA)。
实时荧光RPA(real-time RPA)试验需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器，比如酶标仪或实时检测的热循环仪。自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业中，比如用于土拉弗朗西斯菌、细螺旋体、HIV-1DNA、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、天花病毒、B型链球菌、大肠杆菌产生的志贺毒素、中东呼吸综合征冠状病毒、裂谷热病毒、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、施马伦贝格病毒、牛病毒性腹泻病毒、黄热病毒以及戈登病毒等病原的检测。
对于试纸条RPA(LFS RPA)试验而言，只要温度能控制在37-42℃之间就行，比如可以在水浴锅等设置中进行反应，或者直接用人的体温进行加热，随后可以通过侧流层析试纸条LFS(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)读取试验结果。自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业中，比如用于感染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、恶性疟原虫、洋李痘疱病毒、羌虫、力克次体、隐孢子虫以及黄热病毒等的检测。与常规方法相比较，该实验具有很高的敏感性和特异性。
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的危害家畜以及多种野生动物的一种以发热、奇痒和急性脑脊髓炎等为典型神经症状的急性传染病，猪是伪狂犬病的传染源及自然储存宿主。本病毒感染的仔猪死亡率可以高达100％，该病对于育肥猪的主要影响是减缓其生长速度，种猪可能因此而丧失繁殖能力，怀孕母猪可能会有流产、产出死胎或者木乃伊胎等症状。PRV不仅仅感染猪，而且还可以感染牛、狗、羊和啮齿动物。其他的主要动物感染PRV主要引起快速死亡的临床症状，并伴随有神经系统症状，这和狂犬病的症状相似。已经有报道在全世界的家养猪、野猪群以及野生动物中检测到该病的存在，这些宿主构成了病毒宿主库。因此，建立一种快速、简单、特异、敏感的检测方法来检测PRV对于该病的防控起着关键的作用。
Perez,L.J等(Perez,L.J.,et al.,A multiple SYBR Green I-based real-timePCR system for the simultaneous detection of porcine circovirus type 2,porcine parvovirus,pseudorabies virus and Torque teno sus virus 1 and 2 inpigs.J Virol Methods,2012.179(1):p.233-41.)公开了一种基于SYBR Green I的，可用于同时检测猪2型圆环病毒，猪细小病毒，伪狂犬病毒和猪Torque teno病毒1型和2型的real-time PCR方法。但该方法需要复杂的试验设备以及熟练的操作人员，该方法需要较长的试验时间(大约1.5h)。同时由于SYBR Green I非特异性结合所有的双链DNA，因此，该方法的特异性相对较差。
En,F.X等(En,F.X.,et al.,Loop-mediated isothermal amplificationestablishment for detection of pseudorabies virus.J Virol Methods,2008.151(1):p.35-9.)公开了一种用于检测猪伪狂病毒的环介导等温扩增法。通过LAMP的扩增结果表明，该方法能够出现很多扩增条带，因此该方法存在非特异性扩增，而且该方法需要设计三对引物来进行扩增，因此增加了实验设计的难度，并且增加了其与其他检测平台相结合的难度。并且检测温度较高(63℃)，检测时间较长(60min)。并且需要核酸电泳对扩增产物进行检测，增加了污染的可能性。
本发明针对猪伪狂犬病毒的gD基因，建立并评估了基于荧光探针的RPA(real-time RPA)检测试剂盒以及基于试纸条的LFS RPA检测试剂盒以实现快速检测猪伪狂犬病毒的目的，据我们所知，国内外尚无建立这样的试剂盒用于检测猪伪狂犬病毒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速、简单、特异的鉴定猪伪狂犬病毒的检测方法及试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明发明人针对猪伪狂犬病毒的gD基因设计引物和探针。同时通过对来自于GenBank中的AY217094.1,Y14834.1,KM189914.3,KT253413.1,KR051961.1,KP257591.1,KP315913.1,KM061380.1,KP098534.1,KP259831.1,KC981239.1,KF017335.1和AY196984.1的gD基因同源序列进行比对分析，进一步确定了猪伪狂犬病毒gD基因的保守区域，针对该区域设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的猪伪狂犬病毒。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国)合成。本发明分别设计合成了三对上游引物和三对下游引物，通过对引物与探针组合进行扩增效果评价，最终将其中一对能够产生最强的扩增信号的引物对与探针组合应用到本发明中。针对实时荧光RPA(real-time RPA)与试纸条RPA(LFS RPA，Recombinase Polymerase Amplification Assay combined with lateral flow test)的不同检测特点，本发明分别设计了用于猪伪狂犬病毒检测的实时荧光RPA以及试纸条RPA检测的引物和探针序列，该两种试剂盒针对同一靶标序列，但引物和探针的修饰碱基和检测平台不同。
本发明一种用于快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA(real-time RPA)检测试剂盒，包括有一对引物和一条探针，
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-TACTTTATCGAGTACGCCGACTGCGACCCCAGGCA-3’(SEQ ID NO.1所示)
下游引物：5’-ACCATGAAGTCGGTGAGGATGTTCACGCCGTCGAC-3’(SEQ ID NO.2所示)
探针：5’-CGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACA
(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)TCCCCACGGAGGACG--P-3’(SEQ ID NO.3所示)
其中，FAM-dT表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，BHQ1-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，P表示磷酸，用于阻止链的延伸。
在本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
使用本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒检测猪伪狂犬病毒，优选的，反应体系如下：14.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.075μL的10μM探针，2μL的病毒DNA模板，4.825μL的ddH2O以及1.25μL的280mM醋酸镁；
扩增反应在温度设定为37-39℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min-1h，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
更优选的，扩增反应在温度设定为39℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
对本发明的实时荧光RPA(real-time RPA)试剂盒的检测灵敏度及特异性进行了实验，灵敏度试验结果表明使用该试剂盒检测猪伪狂犬病毒的敏感性为102拷贝/反应，并且具有较广的检测范围，至少在106-102拷贝/反应范围内的样品均能被检测出来。特异性检测结果表明，使用该试剂盒分别检测猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、猪2型圆环病毒、猪细小病毒以及口蹄疫病毒，结果只有猪伪狂犬病毒能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，说明该试剂盒具有很好的特异性。我们用建立的real-timeRPA方法来检测采集自山东省的临床样品(n＝36)以及健康猪的血清样品(n＝12)，并将检测结果与qPCR的检测结果相比较，结果表明real-time RPA的检测结果与qPCR完全一致，即具有100％的符合度。
因此，进一步的，本发明还提出了以上所述的实时荧光RPA检测试剂盒在制备检测猪伪狂犬病毒试剂中的用途。
本发明还提出了一种用于快速检测猪伪狂犬病毒的试纸条RPA(LFS RPA)检测试剂盒，含有侧流层析试纸条(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)，以及有一对引物和一条探针，
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-TACTTTATCGAGTACGCCGACTGCGACCCCAGGCA-3’(SEQ ID NO.1所示)
下游引物：5’-biotin-ACCATGAAGTCGGTGAGGATGTTCACGCCGTCGAC-3’(SEQ ID NO.2所示)
探针：5’-FAM-GATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACAT
-THF-TTCCCCACGGAGGAC-P-3’(SEQ ID NO.4所示)。
其中，biotin表示生物素，FAM表示羧基荧光素，THF表示四氢呋喃连接子，P表示磷酸，用于阻止链的延伸。
在本发明所述的试纸条RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
使用本发明所述的试纸条RPA检测试剂盒检测猪伪狂犬病毒，优选的，反应体系如下：14.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.3μL的10μM探针，2μL的病毒DNA模板，4.6μL的ddH2O以及1.25μL的280mM醋酸镁；
扩增反应在温度设定为39℃的水浴锅中进行，反应时间为15min-30min，结束后使用侧流层析试纸条(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)对结果进行检测。
更优选的，扩增反应在温度设定为39℃的水浴锅中进行，反应时间为20min，结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。
对本发明的试纸条RPA(LFS RPA)试剂盒的检测灵敏度及特异性进行了实验，灵敏度试验结果表明使用该试剂盒检测猪伪狂犬病毒的敏感性为102拷贝/反应，并且具有较广的检测范围，至少在106-102拷贝/反应范围内的样品均能被检测出来。特异性检测结果表明，使用该试剂盒分别检测猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、猪2型圆环病毒、猪细小病毒以及口蹄疫病毒，结果只有猪伪狂犬病毒能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，说明该试剂盒具有很好的特异性。我们用建立的LFS RPA方法来检测采集自山东省的临床样品(n＝36)以及健康猪的血清样品(n＝12)，并将检测结果与qPCR的检测结果相比较，结果表明real-time RPA的检测结果与qPCR完全一致，即具有100％的符合度。
因此，进一步的，本发明还提出了所述的试纸条RPA检测试剂盒在制备检测猪伪狂犬病毒试剂中的用途。
相较于现有技术，本发明的方法具有以下优点：
(1)能够节约试验时间：RPA整个试验过程只需要25min，该时间远远低于qPCR方法的1.5小时以及LAMP的60min。加上样品处理以及准备试验的时间，RPA整个检测过程能够在一个小时之内完成。
(2)能够降低反应温度：RPA只需要恒温39℃即可完成试验，该温度远远低于qPCR方法的60℃-95℃以及LAMP的65℃。
(3)方法更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要的东西已经冻干保存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，LFS RPA方法只需要一个水浴锅即可完成试验，不需要熟练的试验人员。
(4)特异性强：本发明试剂盒中添加了探针，增加了检测的特异性，基于荧光试剂的LAMP方法因为没有探针，特异性相对较差。
(5)更加不易于污染：本发明试剂盒中添加了核酸外切酶III，对扩增产物进行切割，因此降低了产物污染的可能性，qPCR方法没有添加切割产物的酶，LAMP需要跑核酸电泳胶，因此，均有污染的可能性。
(6)检测结果真实可靠：与现有的qPCR方法的符合度为100％。
附图说明
图1(A)为将合成的针对PRV引物和探针的标准品质粒进行十倍倍比稀释，稀释范围为106-101拷贝/反应，随后用Real-time RPA方法进行敏感性检测，如图所示为扩增20min后实时荧光定量PCR仪的结果。此图可看出本发明所设计的引物和探针可以在39℃条件下，很好的检测106-102拷贝/反应的模板。其中NC代表阴性对照。
图1(B)为利用PRISM 5.0软件(GraphPad Software,USA)对Real-time RPA方法的可重复性进行验证。阈值为平均值±标准方差(SD)。该试验进行过6次重复性试验。
图1(C)为对Real-time RPA方法的6次重复性结果进行退行性分析。我们用三角符号标出95％可能性的检测限制。
图2为比较猪伪狂犬病毒混合组织样品(n＝18)和不同代次PRV毒株的Real-timeRPA和qPCR检测结果，用excel软件来进行退行性分析，其中Y轴为RPA的时间阈值，X轴为qPCR循环数阈值。
图3(A)为检测LFS RPA方法的敏感性，我们将合成的标准品质粒进行定量，并以十倍倍比稀释的方式稀释出浓度为106-100拷贝/反应的质粒DNA作为模板进行试验，试验条件为上述的最佳试验条件(39℃，20min)，试验结果如图所示，NC代表阴性对照；图3(B)为检测LFS RPA方法的特异性，我们分别用猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、口蹄疫病毒提取的DNA/RNA作为模板进行试验，试验结果如图所示，NC代表阴性对照。
图4(A)为用LFS RPA方法检测qPCR确认的PRV阳性样品(n＝10)以及(B)阴性样品(n＝6)的检测结果，其中PC代表阳性对照，NC代表阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA(Real-time RPA)检测试剂盒及检测方法的建立
1、引物及探针序列的设计及制备
本发明发明人通过对来自于GenBank中的AY217094.1,Y14834.1,KM189914.3,KT253413.1,KR051961.1,KP257591.1,KP315913.1,KM061380.1,KP098534.1,KP259831.1,KC981239.1,KF017335.1和AY196984.1的gD基因同源序列进行比对分析，确定了猪伪狂犬病毒gD基因的保守区域，针对该区域设计了引物和探针，以期能够检测到尽可能多的猪伪狂犬病毒。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国)合成。本发明分别设计合成了三对上游引物、三对下游引物以及一条探针序列，如下表1所示。
表1、本发明设计的猪伪狂犬病毒Real-time RPA引物和探针
Figure BDA0000921732710000081
2.毒株、细胞以及临床样品
本研究中使用的所有的毒株均由本实验室保存：PRV(Fa)毒株，PCV2NX毒株，PRRSV(SD0907)毒株，CSFV(C-strain)毒株，PPV(AV30)毒株，(FMDV)/O/CHA毒株。猪伪狂犬病毒混合组织样品(n＝18)是由猪的组织混合均浆液混合PRV阳性样品，我们分别收集来自山东省的36份临床样品以及12份健康猪的血清进行试验。PK-15细胞由本实验室保存，用含有10％血清的MEM在37℃，5％CO2的条件下培养。
3.病毒基因组提取
使用高纯度的病毒核酸提取方法(Roche)按照说明书来来提取病毒DNA/RNA，并最终用50μL的无RNase水洗脱。提取的DNA/RNA存放到-80℃冰箱中以待随后的使用。
4.产生质粒DNA标准品
金维智合成PRV的gD基因片段(287bp)，并克隆到pUC57载体，命名为pPRV/RPA。用质粒提取方法(Promega,USA)来提取pPRV/RPA质粒。用Nanovue(GE lifescience)来定量纯化的DNA,并随后进行十倍倍比稀释，并随后储存于-80℃备用。
5、real-time RPA试验扩增条件优化
以提取纯化的病毒DNA/RNA或者标准DNA质粒为模板进行扩增，实验体系如下：14.75μL水解缓冲液(rehydration buffer，TwistDx exo Kit,Cambridge,UnitedKingdom)，1.05μL上游引物(10μM)，1.05μL下游引物(10μM)，0.075μL的RPA exo探针(10μM)，2μL的DNA/RNA模板，4.825μL的ddH2O以及1.25μL的醋酸镁(magnesium acetate，280mM)。
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-TACTTTATCGAGTACGCCGACTGCGACCCCAGGCA-3’(SEQ ID NO.1所示)
下游引物：5’-ACCATGAAGTCGGTGAGGATGTTCACGCCGTCGAC-3’(SEQ ID NO.2所示)
探针：5’-CGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACA
(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)TCCCCACGGAGGACG--P-3’(SEQ ID NO.3所示)
在进行RPA引物的反应温度的确定时，按照上述体系加入反应物。我们分别试验了37℃、38℃、39℃不同的反应温度，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。通过对结果分析表明，39℃扩增结果最佳。所以本发明所设计的猪伪狂犬病毒real-time RPA扩增温度设定为39℃。在进行real-time RPA引物的反应时间的确定时，按照上述体系加入反应物。并将温度设定为39℃时，试验反应不同时间扩增差异。我们将时间分别设定为20min、30min和1h，结果表明，扩增20min之后的阴性在一个小时之后仍然为阴性，20min之后的阳性在一个小时之后仍然为阳性，因此，我们选择20min为本发明的扩增设定时间。
同时本发明分别用该体系对合成的三对上游引物和三对下游引物与探针的组合进行评价，评价结果表明其中一对引物(Fe1/Re3)与探针的组合能够产生最强的扩增信号，因此，该引物对与探针进行组合应用到本发明中。
real-time RPA试验检测结果判定：一个样品所有的重复试验，在特定的时间内(20min)扩增结果均大于背景值3.5个标准方差(3.5SD)的为阳性，反之，该样品为阴性。
6、real-time RPA试验灵敏度和特异性检测
在进行real-time RPA方法反应灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。使用模板为上述合成的标准质粒，通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度为106-101个拷贝/反应的共计6个梯度作为模板。扩增反应在温度设定为39℃的qPCR仪中进行，时间设定为20min，通过实时荧光实时监控扩增结果。结果如图1A所示，从该结果可以看出该方法的敏感性为102拷贝/反应，并且具有较广的检测范围，至少在106-102拷贝/反应范围内的样品均能被检测出来。
在real-time RPA敏感性试验中，我们对于同一个试验进行了6次重复，结果表明6次试验的检测结果一致，均能够很好的检测最低102个拷贝/反应的标准DNA，本发明利用PRISM 5.0软件(GraphPad Software,USA)对试验的可重复性进行统计分析，结果如图1B所示，表明该发明具有很好的可重复性。阈值为平均值±标准方差(SD)。同时，本发明利用Excel软件对real-time RPA试验的6次重复性结果进行退行性分析，结果如图1C所示，说明该方法能够很好的检测猪伪狂犬病毒。
随后我们用猪伪狂犬病毒混合组织样品(n＝18)进一步验证该实验的敏感性，试验数据表明：qPCR检测结果与RPA检测结果完全一致，所有样品均为阳性，并且我们用excel统计了qPCR检测结果(CT值)与RPA检测结果(min)之间的相关性(见图2)。
在进行real-time RPA方法的反应特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。其中使用模板分别为猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(HP-PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪2型圆环病毒(PCV2)、猪细小病毒(PPV)以及口蹄疫病毒(FMDV)。扩增反应在温度设定为39℃的qPCR仪中进行，反应时间设定为20min。结果表明，只有PRV能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，该方法具有很好的特异性，结果如表2所示。
qPCR方法参照文献(Perez,L.J.,et al.,A multiple SYBR Green I-basedreal-time PCR system for the simultaneous detection of porcine circovirustype 2,porcine parvovirus,pseudorabies virus and Torque teno sus virus 1and2in pigs.J Virol Methods,2012.179(1):p.233-41.)方法进行。
表2评估PRV real-time PRA方法的特异性
Figure BDA0000921732710000101
neg:代表阴性
7、real-time RPA试验检测临床样品
我们用建立的real-time RPA方法来检测采集自山东省的临床样品(n＝36)以及健康猪的血清样品(n＝12)，并将检测结果与qPCR的检测结果相比较。结果表明12份健康猪的血清样品real-time RPA检测结果和qPCR检测结果一致，均都为阴性。在36份临床样品中，real-time RPA检测结果为11份阳性样品(时间为：6.6min-8.6min)，这与qPCR检测结果完全一致(CT值为20-29)。基于检测的48份样品，与qPCR检测结果相比较，real-time RPA的敏感性和特异性均为100％。
qPCR方法参照文献(Perez,L.J.,et al.,A multiple SYBR Green I-basedreal-time PCR system for the simultaneous detection of porcine circovirustype 2,porcine parvovirus,pseudorabies virus and Torque teno sus virus 1and2in pigs.J Virol Methods,2012.179(1):p.233-41.)方法进行。
表3比较real-time PRA方法和qPCR方法的临床样品检测结果
Figure BDA0000921732710000111
综上可见，本发明设计合成的一对引物和一条探针基因序列以及其形成的实时荧光PRA(real-time RPA)方法可以快速诊断猪伪狂犬病毒，而且该检测方法简单、快速、检测结果真实可靠。
实施例2快速检测猪伪狂犬病毒的试纸条RPA(LFS RPA)检测试剂盒及检测方法的建立
1、引物及探针序列的设计及制备
本发明发明人通过对来自于GenBank中的AY217094.1,Y14834.1,KM189914.3,KT253413.1,KR051961.1,KP257591.1,KP315913.1,KM061380.1,KP098534.1,KP259831.1,KC981239.1,KF017335.1和AY196984.1的gD基因同源序列进行比对分析，确定了猪伪狂犬病毒gD基因的保守区域，针对该区域设计了引物和探针，以期能够检测到尽可能多的猪伪狂犬病毒。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国)合成。本发明分别设计合成了三对上游引物、三对下游引物以及一条探针序列，如下表1所示。
表1、本发明设计的猪伪狂犬病毒Real-time RPA引物和探针
Figure BDA0000921732710000112
Figure BDA0000921732710000121
2.毒株、细胞以及临床样品
本研究中使用的所有的毒株均由本实验室保存：PRV(Fa)毒株，PCV2NX毒株，PRRSV(SD0907)毒株，CSFV(C-strain)毒株，PPV(AV30)毒株，(FMDV)/O/CHA毒株。猪伪狂犬病毒混合组织样品(n＝18)是由猪的组织混合均浆液混合PRV阳性样品，我们分别收集来自山东省的36份临床样品以及12份健康猪的血清进行试验。PK-15细胞由本实验室保存，用含有10％血清的MEM在37℃，5％CO2的条件下培养。
3.病毒基因组提取
使用高纯度的病毒核酸提取方法(Roche)按照说明书来来提取病毒DNA/RNA，并最终用50μL的无RNase水洗脱。提取的DNA/RNA存放到-80℃冰箱中以待随后的使用。
4.产生质粒DNA标准品
金维智合成PRV的gD基因片段(287bp)，并克隆到pUC57载体，命名为pPRV/RPA。用质粒提取方法(Promega,USA)来提取pPRV/RPA质粒。用Nanovue(GE lifescience)来定量纯化的DNA,并随后进行十倍倍比稀释，并随后储存于-80℃备用。
5.LFS RPA方法扩增条件优化
我们以提取纯化的病毒DNA/RNA或者标准DNA质粒为模板进行扩增，实验体系如下：14.75μL水解缓冲液(rehydration buffer，TwistDx exo Kit,Cambridge,UnitedKingdom)，1.05μL上游引物(10μM)，1.05μL下游引物(10μM)，0.3μL的RPA nfo探针(10μM)，2μL的DNA/RNA模板，4.6μL的ddH2O以及1.25μL的醋酸镁(magnesium acetate，280mM)。
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-TACTTTATCGAGTACGCCGACTGCGACCCCAGGCA-3’(SEQ ID NO.1所示)
下游引物：5’-biotin-ACCATGAAGTCGGTGAGGATGTTCACGCCGTCGAC-3’(SEQ ID NO.2所示)
探针：5’-FAM-GATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACAT
-THF-TTCCCCACGGAGGAC-P-3’(SEQ ID NO.4所示)。
反应条件为39℃，反应可在20min之内完成。同时我们分别设计合成了三对上游引物和三对下游引物，并用该体系对引物与探针组合进行评价，评价结果表明其中一对(Fn1/Rn3)能够产生最强的扩增信号，因此，该引物对与探针进行组合应用到本发明中。
随后，我们测试了39℃条件下，不同孵育时间对于扩增结果的影响，我们试验了0min、1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min的试验结果，在扩增10min的时候，试验条带上出现微弱的条带，当反应时间在15min-30min之间时试验条带没有出现可观测的差异，因此，我们选择20min作为该试验的孵育时间。
检测结果判定：一个样品在特定的条件下(37℃，20min)试纸条上控制线为阳性，并且试验线为阳性的样品为阳性样品；试纸条上控制线为阳性，而试验线为阴性的样品为阴性样品。
6、反应灵敏度检测
在进行LFS RPA方法的灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。使用模板为上述合成的标准质粒，通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度为106-100拷贝/反应的共计7个梯度作为模板。扩增反应在温度设定为39℃的水浴锅中进行，时间设定为20min，通过试纸条终点检测扩增结果。如图3A所示，在6次重复性试验中，只有一次能够检测到101拷贝/反应的质粒DNA，其余5次均不能检测到101拷贝/反应的质粒DNA，并且不能检测100拷贝/反应的质粒DNA，因此该实验的敏感性被判定为102拷贝/反应。同时，该方法具有较广的检测范围，至少在106-102拷贝/反应范围内的样品均能被检测出来。
在进行LFS RPA方法的特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。其中使用模板分别为猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(HP-PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪2型圆环病毒(PCV2)、猪细小病毒(PPV)以及口蹄疫病毒(FMDV)。反应温度设为39℃的水浴锅中进行，反应时间设定为20min，结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。结果表明，只有PRV能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，该方法具有很好的特异性，结果如图3B及表5所示。
qPCR方法参照文献(Perez,L.J.,et al.,A multiple SYBR Green I-basedreal-time PCR system for the simultaneous detection of porcine circovirustype 2,porcine parvovirus,pseudorabies virus and Torque teno sus virus 1and2in pigs.J Virol Methods,2012.179(1):p.233-41.)方法进行。
表5评估LFS RPA方法的特异性
Figure BDA0000921732710000141
neg:代表阴性；pos:代表阳性。
7、LFS RPA方法检测临床样品
首先，我们用LFS RPA方法测试qPCR确认的10份阳性样品和6份阴性样品，LFS RPA试验结果表明：qPCR确认的10份阳性样品均为阳性，qPCR确认的6份阴性样品均为阴性，结果如图4所示。
我们用建立的LFS RPA方法来检测采集自山东省的临床样品(n＝36)以及健康猪的血清样品(n＝12)，并将检测结果与qPCR的检测结果相比较。结果表明12份健康猪的血清样品LFS RPA检测结果和qPCR检测结果一致，均都为阴性。在36份临床样品中，LFS RPA检测结果为11份阳性样品，这与qPCR检测结果完全一致(CT值为18-30)。基于检测的48份样品，与qPCR检测结果相比较，LFS RPA的敏感性和特异性均为100％，结果如表6所示。
qPCR方法参照文献(Perez,L.J.,et al.,A multiple SYBR Green I-basedreal-time PCR system for the simultaneous detection of porcine circovirustype 2,porcine parvovirus,pseudorabies virus and Torque teno sus virus 1and2in pigs.J Virol Methods,2012.179(1):p.233-41.)方法进行。
表6比较LFS RPA方法和qPCR方法的临床样品检测结果
Figure BDA0000921732710000151
综上可见，本发明设计合成的一对引物和一条探针基因序列以及其形成的试纸条RPA(LFS RPA)方法可以快速诊断猪伪狂犬病毒，而且该检测方法简单、快速、检测结果真实可靠。
Figure IDA0000921732790000011
Figure IDA0000921732790000021

Claims (10)

1.一种用于快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于包括有一对引物和一条探针，
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-TACTTTATCGAGTACGCCGACTGCGACCCCAGGCA-3’；
下游引物：5’-ACCATGAAGTCGGTGAGGATGTTCACGCCGTCGAC-3’；
探针：5’-CGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACA
-FAM-dT-THF-BHQ1-dT-TCCCCACGGAGGACG-P-3’。
2.如权利要求1所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
3.如权利要求1或2所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于用于检测猪伪狂犬病毒时，反应体系如下：14.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.075μL的10μM探针，2μL的病毒DNA模板，4.825μL的ddH2O以及1.25μL的280mM醋酸镁；
扩增反应在温度设定为37-39℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min-1h，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
4.如权利要求3所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于扩增反应在温度设定为39℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
5.权利要求1-4任一项所述的实时荧光RPA检测试剂盒在制备检测猪伪狂犬病毒试剂中的用途。
6.一种用于快速检测猪伪狂犬病毒的试纸条RPA检测试剂盒，含有侧流层析试纸条，其特征在于还包括有一对引物和一条探针，
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-TACTTTATCGAGTACGCCGACTGCGACCCCAGGCA-3’；
下游引物：5’-biotin-ACCATGAAGTCGGTGAGGATGTTCACGCCGTCGAC-3’；
探针：5’-FAM-GATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACAT
-THF-TTCCCCACGGAGGAC-P-3’。
7.如权利要求6所述的试纸条RPA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
8.如权利要求6或7所述的试纸条RPA检测试剂盒，其特征在于用于检测猪伪狂犬病毒时，反应体系如下：14.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.3μL的10μM探针，2μL的病毒DNA模板，4.6μL的ddH2O以及1.25μL的280mM醋酸镁；
扩增反应在温度设定为39℃的水浴锅中进行，反应时间为15min-30min，结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。
9.如权利要求8所述的试纸条RPA检测试剂盒，其特征在于扩增反应在温度设定为39℃的水浴锅中进行，反应时间为20min，结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。
10.权利要求6-9任一项所述的试纸条RPA检测试剂盒在制备检测猪伪狂犬病毒试剂中的用途。
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