CN108315476A - 一种用于检测hpv18的rpa荧光定量引物对、探针、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及方法。本发明RPA荧光定量引物对是针对HPV18病毒的基因组中的L1区域设计筛选获得的，本发明方法为基于RPA技术的荧光定量检测方法，可用于特异性检测HPV18，该方法操作简便，灵敏度高，反应条件温和，反应时间短，结合便携式的荧光检测仪即可进行病原微生物的快速定量检测。RPA荧光定量扩增后，再用测流层析试纸条结合便携式的干式荧光免疫分析仪进行结果检测分析，从而整个过程中涉及的仪器均为小体积便携式，不受实验仪器和场地限制，并且在很大程度上减少了传统的胶体金等显色法结果判定时人为因素的影响，灵敏度可以达到5拷贝。

Description

一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及 方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及方法。

背景技术

人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，长期以来，已知HPV可引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。流行病学和分子学研究证实了HPV感染是宫颈癌的病因。生殖道HPV感染是一种常见的性传播疾病。由于女性宫颈癌发生的主要原因是长期反复的高危型HPV感染，故HPV DNA的快速检测为预防和治疗宫颈癌的最有效手段之一。

核酸扩增PCR技术由于其灵敏度高和特异性强等方面的优势，已经成为科学研究和临床研究中的一个基础和必要的技术手段。然而，PCR技术通常需要特制的仪器以及复杂的反应程序，成本高，耗时长，对于需要实时、现场、快速的非实验室环境检测及分析通常难以实现。

近年来，基于模拟体内核酸复制、转录、修复机理发展起来的核酸体外等温扩增(Nucleic acid isothermal amplification，NCIA)技术的出现，解决了PCR技术上的局限，不仅简化了对仪器的要求，不需要昂贵的PCR仪，还缩短了反应时间，恒温条件下即可快速扩增出目标核酸片段。因其反应快速、灵敏度高、操作简便等优点而受到了多个领域的关注，尤其是体外诊断领域。目前，报道的NCIA技术有loop介导的体外恒温扩增(Loop-mediate isothermal amplification，LAMP)，核酸序列依赖扩增(Nucleic acid sequencebased amplification，NASBA)，链置换扩增(Strand displacement amplification，SDA)，滚环扩增技术(rolling circle amplification，RCA)。但这些恒温扩增技术在反应条件、反应试剂、反应时间、仪器设备以及操作简便性等方面存在较大的弊端。如LAMP对引物要求高，设计复杂，且产物结构复杂。NASBA通常扩增时间较长(约2-3小时)，需要抽提RNA，且当模板是DNA时需要高温变性处理。SDA需要反应前对模板进行热变性处理，才能引发带有核酸内切位点引物的配对。RCA需要设计一段锁式探针，通常在100bp左右，合成费用较高，并且在RCA反应过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA或者RNA可能产生一些背景信号。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)能够在恒温条件下(37℃-42℃)实现对核酸的快速特异性扩增，且在20min内可将核酸扩增至可检测水平，具有良好的可操作性，能够在非实验室条件下完成核酸检测，被称为是最具有可替代PCR潜力的核酸检测技术，且可以和琼脂糖凝胶检测、荧光检测技术结合实现实时、快速甚至定量检测。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及方法。

一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对，包括上游引物和下游引物，序列为

上游引物：5’-ATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTAC-3’；

下游引物：5’-ATCATAGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAGCAT-3’，

其中，下游引物的5’端连接或者不连接生物素。

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计，普通PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。生物素主要是用于最后扩增产物的捕获，以便进行信号的检测，根据需要确定是否需要连接。

一种用于检测HPV18的RPA荧光定量探针，序列为：

5’-CAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGG-3’，

其中，探针的其中一个核苷酸上连接有荧光基团，且位于该核苷酸靠近3’端一侧的某一个核苷酸为缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，为脱碱基位点；3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。在RPA体系中引入一个带有荧光标记的探针，可以提高RPA检测的特异性，当上、下游引物扩增出片段后，探针可以结合上去，然后探针在脱碱基位点被切开，5’端的序列可以作为巢式PCR引物，与下游引物作为一对扩增引物继续对模板进行扩增，使正确扩增的模板数量增加，而上、下游引物非特异性扩增出的片段由于探针无法结合，不能被巢式PCR扩增，从而通过加入探针可以降低非特异性扩增，同时起信号放大作用。而荧光基团用于最后的信号检测，通过检测荧光信号判断样本中是否存在目标基因片段，从而判断是否存在HPV18。

脱碱基位点为一个缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，该位点能被一些核酸内切酶或者核酸外切酶识别，从而对序列进行切割，使探针位于脱碱基位点靠近5’端的序列剩下作为巢式PCR引物。荧光基团连接的位置比较随意，只需要连接在脱碱基位点的靠近5’一侧即可，而脱碱基位点在被切割断开后，作为巢式PCR引物的5’一侧需要保留作为巢式PCR引物的足够长度。

优选的，所述的RPA荧光定量探针，序列为：

5’-CAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAAHAGCAGTATTTTAGAGG-3’，

其中，探针的5’端连接荧光基团，H表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核酸，为脱碱基位点，3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

优选的，所述荧光基团为CY5、CY3、FAM、TET、JOE、HEX或TAMRA；所述修饰基团为磷酸基。本发明对荧光基团的选择并没有特殊性，常用的用于荧光定量PCR的荧光基团均可使用。普通引物序列3’没有磷酸基团而是-OH，只有3’末端是-OH的片段才可以被聚合酶延伸，但3’修饰了磷酸基后，所得探针只能结合到模板上而不能扩增。

本发明还提供了一种用于检测HPV18的RPA荧光定量试剂盒，包含所述的RPA荧光定量引物对和所述的RPA荧光定量探针。

优选的，所述的RPA荧光定量试剂盒，包括核酸内切酶EndoⅣ。核酸内切酶EndoⅣ识别dsDNA中的脱嘌呤/嘧啶(AP)位点，切割损伤位点5’端的磷酸二酯键，产生具有羟基基团的3’-末端。

优选的，所述的RPA荧光定量试剂盒，包括试剂盒nfo Kit中的所有试剂。

本发明还提供了一种检测HPV18的方法，使用所述的RPA荧光定量试剂盒进行检测，包括以下步骤：

(1)提取样本DNA作为模板；

(2)使用所述RPA荧光定量引物对及RPA荧光定量探针对步骤(1)所得模板进行RPA荧光定量扩增；

(3)通过检测荧光定量信号对样本中HPV18的含量进行检测。

优选的，所述的方法，步骤(3)中使用测流层析试纸条进行检测，

当下游引物的5’端连接生物素时，所述测流层析试纸条上的检测线包含链霉亲和素或抗生物素抗体或抗所述荧光基团的抗体；

当下游引物的5’端不连接生物素时，所述测流层析试纸条上的检测线包含抗所述荧光基团的抗体，

检测荧光定量信号的方法包括：

(a)取RPA荧光定量扩增产物与展开液混合后滴加在测流层析试纸条的上样处；

(b)滴加的样品自动层析完成后，用干式荧光免疫分析仪检测。

优选的，所述展开液为10mM Tris-HCL、体积比0.1％Tween-20，pH 7.4～8.0。

优选的，所述的方法，RPA荧光定量扩增产物与展开液的体积比为1∶4～1∶10。

该方法可以用于离体检测HPV18，而并非一定要用于检测疾病。离体检测可以是环境样品的检测、实验室或医院消毒后材料检测是否残留HPV18，或者可以对输血或输液制品进行检测以确保没有HPV18污染等。

本发明RPA荧光定量引物对是针对HPV18病毒的基因组中的L1区域设计筛选获得的，为基于RPA技术的荧光定量检测方法而设计，能够特异性扩增HPV18，且扩增效果好。

本发明方法为基于RPA技术的荧光定量检测方法，可用于特异性检测HPV18，该方法操作简便，灵敏度高，反应条件温和，反应时间短，结合便携式的荧光检测仪即可进行病原微生物的快速定量检测。

而将使用本发明试剂盒进行RPA荧光定量扩增后，再用测流层析试纸条结合便携式的干式荧光免疫分析仪进行结果检测分析，从而整个过程中涉及的仪器均为小体积便携式，不受实验仪器和场地限制。并且在很大程度上减少了传统的胶体金等显色法结果判定时人为因素的影响。本发明检测方法的灵敏度可以达到5拷贝。

附图说明

图1为引物筛选电泳结果图，其中泳道M为标准分子量Marker，条带从上到下分别为500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，100bp，50bp；泳道1～8分别为引物对1～8。

图2为RPA-探针设计原理图。

图3为RPA荧光定量扩增所得片段示意图。

图4为测流层析试纸条的结构示意图。

图5为不同材料样品垫的效果比较结果图，其中纵坐标为荧光信号值，横坐标为在试纸条上的相对位置，将试纸条按长度方向均分成400等分(下同)。

图6为灵敏度检测的荧光检测结果图。

图7为灵敏度检测的核酸胶检测结果图，其中泳道1～4分别为5拷贝、10拷贝、100拷贝和1000拷贝，泳道M为标准分子量，条带从上大小分别为500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，100bp，50bp。

具体实施方式

实施例1

RPA技术的关键在于扩增引物和探针的设计，引物的设计与选择对RPA的扩增结果至关重要。

HPV染色体上L1区域的多样性与其亚型有关，不同亚型其L1区域的碱基序列具有特异性。根据HPV18亚型染色体的L1区域(序列如SEQ ID No.1所示)设计等温扩增引物对，共设计8对，如表1所示。

表1

实施例2

将实施例1中8对引物对HPV18亚型进行等温扩增以检测特异性。

采用Twistdx公司的通用试剂盒——Basic Kit进行引物筛选。反应体系如表2所示。

表2

上游引物(10μM)	2.4μL
		下游引物(10μM)	2.4μL
Rehydration Buffer	29.5μL
		模板和ddH2O	13.2μL
总体积	47.5μL

将上表各试剂混匀后，加入至试剂盒的反应管中，并充分混匀，每个反应管中最后加入2.5μL乙酸镁(280mM)。模板为包含HPV18亚型L1区域的基因片段，用量为10⁵拷贝。

反应条件为：反应温度37℃，反应时间为30min。

反应完成后，跑核酸胶进行鉴定，结构如图1所示，其中引物对18-8-S、18-8-AS对HPV18亚型具有非常强的特异性，扩增所得片段的序列如SEQ ID No.2所示，可以使用包含该扩增片段的质粒作为阳性对照样本。

实施例3

RPA技术的关键在于扩增引物和探针的设计，引物的设计与选择对RPA的扩增结果至关重要。如图2所示，在上述第8对引物对(18-8-S和18-8-AS)的基础上进行改进，在18-8-AS的5’端修饰有生物素(Biotin)用于后续检测。

上游引物：5’-ATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTAC-3’；

下游引物：5’-生物素-ATCATAGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAGCAT-3’，

同时，在RPA体系中引入一个带有荧光标记的探针，探针的一端5’端标记有荧光基团(CY5)，3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(本实施例中为磷酸基团)，中部设计一个脱碱基位点，该位点能被核酸内切酶(EndoⅣ)特异性识别并剪切，从而扩增获得如图3所示的产物。该产物可以使用测流层析试纸条进行检测，所述测流层析试纸条上的检测线包含抗所述探针上连接的荧光素的抗体或抗生物素抗体，之后结合便携式的荧光检测仪即可进行病原微生物的快速定量检测。

探针：

5’-荧光基团-CAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAAHAGCAGTATTTTAGAGG-磷酸基-3’，其中H表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核酸，为脱碱基位点。探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(本实施例中为磷酸基团)，探针可以和模板结合，但是不能用来扩增，原因是探针的3’末端被磷酸化标记(而一般的引物的3’末端是OH，只有3’末端是OH的片段才可以被聚合酶延伸)，3’末端磷酸化的片段不会被当成引物而延伸。

实施例4

如图4所示为本发明所用测流层析试纸条的结构示意图，底板采用PVC胶板，底板上铺设有检测膜(本实施例选用硝酸纤维素膜(NC膜))，底板的一端具有样品垫，另一端具有吸水纸，样品垫和吸水纸分别与硝酸纤维素膜的两端配合。样品垫的作用主要是减缓测试液渗透速度，有利于样品在检测膜(硝酸纤维素膜)上均匀展开，去除样品中杂质颗粒，调节液pH值或粘度等。

制作测流层析试纸条的材料如样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸等都购买于上海金标生物科技有限公司。样品垫的材料不同，其作用效果的差异是很大的，针对于RPA组分的特殊性对不同型号的玻璃纤维和聚酯纤维材料进行了实验筛选，其中聚酯纤维的型号有：VL68、VL78、NJ20、KL20、KL43、DL42、VL98；玻璃纤维的型号有：SB06、CB06、RB45、RB65、KB50、BT50、BT40、BT03、CB08。

根据引物标记形式，检测线(目标捕获)的包被物质可选用抗荧光素的抗体，抗生物素抗体，链霉亲合素(streptavidin，SA)等，其中抗体的包被物浓度从1ng/μL～400ng/μL，SA包被浓度为1μg/μL～50μg/μL。检测线的位置在5mm～15mm之间。将要制作测流层析试纸条的样品垫和吸水纸材料在25℃～37℃下烘2h～24h，将准备好的样品垫，检测膜，吸水纸在底板上组装成试纸条，在指定位置喷好检测线，25℃～37℃下烘10min～120min。将批量制作好的试纸条保存在2℃～8℃的干燥容器中备用。

RPA荧光免疫层析检测，使用试剂盒nfo Kit。反应体系如表3所示。

表3

将上表各试剂混匀后，加入至nfo Kit试剂盒的反应管中，溶解反应管中的冻干粉，并充分混匀，每个反应管中最后加入2.5μL乙酸镁(280mM)。反应条件为37℃，恒温反应40min。模板为包含HPV18亚型L1区域基的因片段，用量为10⁵拷贝。

RPA荧光定量扩增完成后，取40μL反应产物，按1∶6的体积比加入展开液，将混合的样品滴加在测流层析试纸条的样品垫上，当滴入的样品都层析完成后，用干式荧光免疫分析仪检测。虽然聚酯纤维和玻璃纤维都可以作样品垫，由于检测样品的性质与样品垫材质有一定的兼容性，导致层析效果上存在一定差异，结果发现，聚酯纤维中最佳的为VL68，玻璃纤维中最佳的为CB06，进一步实验发现聚酯纤维VL68的检测信号高于玻璃纤维CB06(图5)，所以本发明测流层析试纸条的样品垫选择聚酯纤维VL68。

实施例5

使用实施例4中的检测方法，其中测流层析试纸条的样品垫使用聚酯纤维，模板按梯度稀释，分别为5拷贝、10拷贝、10²拷贝、10³拷贝、10⁴拷贝、10⁵拷贝、10⁶拷贝，结果如图6和7所示，最低可检测的拷贝数为5拷贝，表明本发明检测方法的灵敏度较高。

序列表

<110> 杭州德同生物技术有限公司

<120> 一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及方法

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1707

<212> DNA

<213> 人类乳头状瘤病毒18型(Human papillomavirus type 18)

<400> 1

atgtgcctgt atacacgggt cctgatatta cattaccatc tactacctct gtatggccca 60

ttgtatcacc cacggcccct gcctctacac agtatattgg tatacatggt acacattatt 120

atttgtggcc attatattat tttattccta agaaacgtaa acgtgttccc tatttttttg 180

cagatggctt tgtggcggcc tagtgacaat accgtatatc ttccacctcc ttctgtggca 240

agagttgtaa ataccgatga ttatgtgact cccacaagca tattttatca tgctggcagc 300

tctagattat taactgttgg taatccatat tttagggttc ctgcaggtgg tggcaataag 360

caggatattc ctaaggtttc tgcataccaa tatagagtat ttagggtgca gttacctgac 420

ccaaataaat ttggtttacc tgatactagt atttataatc ctgaaacaca acgtttagtg 480

tgggcctgtg ctggagtgga aattggccgt ggtcagcctt taggtgttgg ccttagtggg 540

catccatttt ataataaatt agatgacact gaaagttccc atgccgccac gtctaatgtt 600

tctgaggacg ttagggacaa tgtgtctgta gattataagc agacacagtt atgtattttg 660

ggctgtgccc ctgctattgg ggaacactgg gctaaaggca ctgcttgtaa atcgcgtcct 720

ttatcacagg gcgattgccc ccctttagaa cttaaaaaca cagttttgga agatggtgat 780

atggtagata ctggatatgg tgccatggac tttagtacat tgcaagatac taaatgtgag 840

gtaccattgg atatttgtca gtctatttgt aaatatcctg attatttaca aatgtctgca 900

gatccttatg gggattccat gtttttttgc ttacggcgtg agcagctttt tgctaggcat 960

ttttggaata gagcaggtac tatgggtgac actgtgcctc aatccttata tattaaaggc 1020

acaggtatgc ctgcttcacc tggcagctgt gtgtattctc cctctccaag tggctctatt 1080

gttacctctg actcccagtt gtttaataaa ccatattggt tacataaggc acagggtcat 1140

aacaatggtg tttgctggca taatcaatta tttgttactg tggtagatac cactcccagt 1200

accaatttaa caatatgtgc ttctacacag tctcctgtac ctgggcaata tgatgctacc 1260

aaatttaagc agtatagcag acatgttgag gaatatgatt tgcagtttat ttttcagttg 1320

tgtactatta ctttaactgc agatgttatg tcctatattc atagtatgaa tagcagtatt 1380

ttagaggatt ggaactttgg tgttcccccc cccccaacta ctagtttggt ggatacatat 1440

cgttttgtac aatctgttgc tattacctgt caaaaggatg ctgcaccggc tgaaaataag 1500

gatccctatg ataagttaaa gttttggaat gtggatttaa aggaaaagtt ttctttagac 1560

ttagatcaat atccccttgg acgtaaattt ttggttcagg ctggattgcg tcgcaagccc 1620

accataggcc ctcgcaaacg ttctgctcca tctgccacta cgtcttctaa acctgccaag 1680

cgtgtgcgtg tacgtgccag gaagtaa 1707

<210> 2

<211> 220

<212> DNA

<213> 人类乳头状瘤病毒18型(Human papillomavirus type18)

<400> 2

atatgatttg cagtttattt ttcagttgtg tactattact ttaactgcag atgttatgtc 60

ctatattcat agtatgaata gcagtatttt agaggattgg aactttggtg ttcccccccc 120

cccaactact agtttggtgg atacatatcg ttttgtacaa tctgttgcta ttacctgtca 180

aaaggatgct gcaccggctg aaaataagga tccctatgat 220

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ctctgtatgg cccattgtat cacccacggc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

tcctgcttat tgccaccacc tgcaggaacc 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

gggttcctgc aggtggtggc aataagcagg a 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

cagaaacatt agacgtggcg gcatgggaac 30

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

cactgcttgt aaatcgcgtc ctttatcac 29

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

cacacagctg ccaggtgaag caggcatacc tg 32

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

caggtatgcc tgcttcacct ggcagctgtg tg 32

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

cccaggtaca ggagactgtg tagaagcaca tattg 35

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

tgtttgctgg cataatcaat tatttgttac tgtggtagat ac 42

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

accaaaaatt tacgtccaag gggatattga tctaagtcta 40

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

gctggcataa tcaattattt gttactgtgg tagataccac tcgca 45

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 14

aaaatttacg tccaagggga tattgatcta agtctaaaga aa 42

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 15

aatcaattat ttgttactgt ggtagatacc actcgcagta c 41

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 16

acgtccaagg ggatattgat ctaagtctaa agaaa 35

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 17

atatgatttg cagtttattt ttcagttgtg tac 33

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 18

atcataggga tccttatttt cagccggtgc agcat 35

<210> 19

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 19

cagatgttat gtcctatatt catagtatga atagcagtat tttagagg 48

Claims (10)

1.一种用于检测HPV18的RPA荧光定量引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，序列为

上游引物：5’-ATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTAC-3’；

下游引物：5’-ATCATAGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAGCAT-3’，

其中，下游引物的5’端连接或者不连接生物素。

2.一种用于检测HPV18的RPA荧光定量探针，其特征在于，序列为：

5’-CAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGG-3’，

其中，探针的其中一个核苷酸上连接有荧光基团，且位于该核苷酸靠近3’端一侧的某一个核苷酸为缺失含氮碱基的脱氧核糖核苷酸，为脱碱基位点；3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

3.如权利要求2所述的RPA荧光定量探针，其特征在于，序列为：

5’-CAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAAHAGCAGTATTTTAGAGG-3’，

其中，探针的5’端连接荧光基团，H表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核酸，为脱碱基位点，3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

4.如权利要求2所述的RPA荧光定量探针，其特征在于，所述荧光基团为CY5、CY3、FAM、TET、JOE、HEX或TAMRA；所述修饰基团为磷酸基。

5.一种用于检测HPV18的RPA荧光定量试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的RPA荧光定量引物对和如权利要求2～4任一所述的RPA荧光定量探针。

6.如权利要求5所述的RPA荧光定量试剂盒，其特征在于，包括核酸内切酶EndoⅣ。

7.如权利要求5所述的RPA荧光定量试剂盒，其特征在于，包括试剂盒nfoKit中的所有试剂。

8.一种检测HPV18的方法，其特征在于，使用如权利要求5～7任一所述的RPA荧光定量试剂盒进行检测，包括以下步骤：

(1)提取样本DNA作为模板；

(2)使用所述RPA荧光定量引物对及RPA荧光定量探针对步骤(1)所得模板进行RPA荧光定量扩增；

(3)通过检测荧光定量信号对样本中HPV18的含量进行检测。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中使用测流层析试纸条进行检测，

当下游引物的5’端连接生物素时，所述测流层析试纸条上的检测线包含链霉亲和素或抗生物素抗体或抗所述荧光基团的抗体；

当下游引物的5’端不连接生物素时，所述测流层析试纸条上的检测线包含抗所述荧光基团的抗体，

检测荧光定量信号的方法包括：

(a)取RPA荧光定量扩增产物与展开液混合后滴加在测流层析试纸条的上样处；

(b)滴加的样品自动层析完成后，用干式荧光免疫分析仪检测。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述展开液为10mM Tris-HCL、体积比0.1％Tween-20，pH 7.4～8.0。