CN106811541A

CN106811541A - 用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN106811541A
Application number: CN201710178429.3A
Authority: CN
Inventors: 何洪彬; 赵贵民; 侯佩莉; 王洪梅; 何成强
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2017-03-23
Publication date: 2017-06-09

Abstract

本发明公开了一种应用RPA‑LFD现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明还公开了用于检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒。本发明提供的多杀性巴氏杆菌RPA‑nfo检测引物与探针组合以及试剂盒灵敏度高、特异性强，最低可以检测到6拷贝/反应的多杀性巴氏杆菌DNA。无需特殊仪器设备，借助恒温水浴锅或人体腋窝温度，25min就能对待测样本的粗裂解物进行多杀性巴氏杆菌DNA的灵敏、特异、快速地检测，适合现场或基层多杀性巴氏杆菌病的诊断工作。

Description

用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条技术，用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒。

背景技术

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mutocida，Pm)是引起多种畜禽巴氏杆菌病的革兰氏阴性病原菌，一般寄生于动物的上呼吸道，具有条件致病性，在某些应激条件刺激下，可引起带菌动物发生以出血性败血病或呼吸系统疾病。家畜中以牛、猪、兔、绵羊发病较多，山羊、鹿、骆驼、马、驴、犬、猫和水貂等亦可感染发病。禽类中以鸡、火鸡和鸭最易感，鹅、鸽次之。根据荚膜抗原的特异性，可将Pm分为5个血清型(A、B、D、E、F)。在我国，引起禽和猪巴氏杆菌病的主要病原是荚膜血清A型Pm，引起牛的主要为荚膜A型和B型Pm，荚膜A型主要表现为牛纤维素性化脓性肺炎，荚膜B型主要表现为牛出血性败血症。由于Pm可以在同种或不同种动物间互相传染，对养殖业危害严重。

多杀性巴氏杆菌病的病原学诊断方法主要有细菌的分离培养、生化鉴定、动物回归试验等，这些方法费时、操作繁琐、准确率低，不适合临床快速诊断的需要。近年来PCR方法已经大量应用在巴氏杆菌病的诊断中，根据多杀性巴氏杆菌保守基因设计引物，可以诊断荚膜A、B、D、E和F 5个血清型。但由于PCR方法需要特殊的仪器设备和专业的技术人员，在基层条件差和技术人员匮乏的情况下，现场实地快速诊断很难实现。此外，现有的采用PCR诊断多杀性巴氏杆菌的报道中，其设计引物所依据的保守基因序列有多种，有的以多杀性巴氏杆菌毒素基因(toxA)作为保守序列设计引物(CN104073567A)；有的以多杀性巴氏杆菌的的PlpB基因作为靶基因设计引物(“猪多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增检测方法的建立”，中国预防兽医学报，2014年12月)，而根据不同的靶标(保守基因)设计的引物序列不同，对巴氏杆菌的诊断和检测效果也存在较大差异，因此，选择何种靶标作为引物设计的依据也是PCR诊断多杀性巴氏杆菌的难点之一。

LAMP技术虽然可以进行核酸的恒等温扩增，但由于它的反应温度在60℃-65℃，反应时间在30-60min，仍然不能在常温下进行，并且不能对核酸粗提物的DNA样本进行直接扩增。因此，从诊断的时效性方面考虑，亟需一种可用于现场恒等温条件下的简易核酸检测技术。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术是目前新出现的一种体外快速核酸扩增技术，在37℃左右就能发生反应，并且仅需十几分钟就能扩增出痕量级的检测产物。同时RPA可以完成核酸粗提物的扩增，它可以通过琼脂糖凝胶电泳，荧光扩增曲线和侧流层析试纸条(Lateral Flow Dipstick，LFD)三种方式检测结果，这三种方式的引物与探针反应原理是不同的。基本的RPA扩增只需上下游引物，产物通过凝胶电泳检测，而RPA-nfo和RPA-exo反应，是通过不同的探针结合到模板互补链后再通过核酸内切酶IV(nfo)和核酸内切酶III(exo)切割掉3'端阻止序列，这两种方法分别通过LFD(nfo)和实时荧光(exo)两种不同的手段检测结果。凝胶电泳和荧光扩增曲线法仍然依赖实验室和特殊仪器设备，而LFD是一种无需特殊仪器可用于现场的检测方法。将RPA技术与LFD技术结合，通过LFD读取结果，既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，借助恒温水浴锅用LFD就可以通过肉眼观察结果。

但RPA技术属于新兴的核酸扩增技术，其应用并不十分普遍，其主要技术难点在于特异性引物和探针的设计和筛选，而引物/探针的设计和选择对RPA-nfo的结果是至关重要的，目前并没有像PCR扩增技术那样专门的引物/探针的设计软件，也没有较多的文献和试验数据提供技术依据。经相关检索，目前还未有针对多杀性巴氏杆菌进行RPA-LFD检测的相关报道。

综上，对于多杀性巴氏杆菌的RPA-LFD检测，目前尚无明确可借鉴的思路和结果，还需要技术人员做大量和深入的研究。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针；其RPA-nfo正向引物序列如SEQ IDNO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，其RPA-nfo探针序列如SEQ ID NO.3所示。

具体序列如下：

正向引物：5'-TTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTG-3'；(SEQ ID NO.1)

反向引物：5'-(Biotin)AATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCA-3'；(SEQ ID NO.2)

探针：5'-(FAM)ATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTG(dSpacer)GCTTGTCGGTAGTCTT(C3-Spacer)-3'(SEQ ID NO.3)。

本发明的探针，在其5'端用FAM标记，距离5'端30个碱基左右的位置处用dSpacer替代一个碱基，3’端用C3-spacer阻断。

需要说明的是，与常规PCR反应不同，RPA-nfo反应所需引物的长度通常为30～35bp，引物过短会严重影响重组酶的活性；但长引物也并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性。LF探针长度一般在46～52bp，nfo核酶距离探针5'端30个碱基左右，距离3'端16～22个碱基左右，个别碱基的替换或增减都会对探针的特异性产生影响。因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物和探针组合，然后进行试验进行优化、筛选才能得到。

本发明设计了多组不同的引物和探针组合，经试验反复验证后，确定本发明所列出的上述引物和探针组合，其检测效果最佳。

本发明的第二方面，提供一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物和探针组合。

进一步的，该试剂盒中还包括：阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。

所述阳性质控标准品为：包含多杀性巴氏杆菌Kmt1基因片段阳性质控标准品；

优选的，所述包含多杀性巴氏杆菌Kmt1基因片段阳性质控标准品由含有192个碱基的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；

所述含有192个碱基的核苷酸片段的序列如SEQ ID NO.4所示。

5'-CGATTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTGAAATGGGAAATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTGGGCTTGTCGGTAGTCTTTTATTTGGCTTGTGGCAAAGAAAAGCACAGTTTTGTTGGGCGGAGTTTGGTGTGTTGAGCCAATCTGCTTCCTTGACAACGGCGCAACTGATTGGACGTTATT-3'；(SEQ ID NO.4)

上述含有192个碱基的核苷酸片段是从多杀性巴氏杆菌核酸阳性的临床病料DNA模板中克隆得到。

所述阴性质控标准品为为pEASY-Y3空载质粒。

所述RPA-nfo反应液，包括：recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、rehydration缓冲液、280mM醋酸镁(MgAc)溶液、侧流层析试纸条(LFD；特异性检测生物素与FAM标记基因扩增产物)、LFD检测缓冲液(1×PBS+0.1％吐温20)、灭菌去离子双蒸水(ddH₂O)，TE缓冲液、10％(w/v)SDS、2％(w/v)蛋白酶K和多杀性巴氏杆菌标准阳性模板。

本发明的第三方面，提供一种非诊断目的的检测多杀性巴氏杆菌的方法，步骤如下：

(1)检测样本DNA的提取或检测样本的现场裂解处理；

(2)以步骤(1)中处理的样本为模板，筛选优化引物和探针，进行RPA-nfo扩增；

(3)用LFD检测上述RPA-nfo扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有多杀性巴氏杆菌。

步骤(2)中，RPA-nfo扩增体系为25μL：其中包括1.0μL(10μM)的正向引物，1.0μL(10μM)的反向引物，0.3μL(10μM)的探针，rehydration缓冲液14.75μL，待测样本DNA或粗裂解产物2μL，ddH₂O 4.7μL；将上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液1.25μL，上下颠倒混匀后直接在37℃恒温水浴锅处理25min。

步骤(3)的具体步骤为：取RPA反应产物1μL与49μL LFD检测缓冲液混合，将LFD垂直浸入，5min之内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品中多杀性巴氏杆菌核酸阳性；仅出现对照条带则说明该样品中不含多杀性巴氏杆菌核酸，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的RPA技术是最新的一种核酸体外扩增技术，在检测时间上均优于PCR和环介导等温扩增(LAMP)技术，其反应在25min内就能从单个模板分子得到大约10¹²扩增产物。

(2)本发明提供的多杀性巴氏杆菌RPA-nfo检测引物与探针组合以及试剂盒，最低可以检测到6拷贝/反应的多杀性巴氏杆菌DNA，RPA-nfo检测引物与探针可特异性扩增多杀性巴氏杆菌，但与牛支原体、溶血曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、睡眠嗜组织菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、丝状支原体丝状亚种SC型等细菌均无交叉反应，具有灵敏度高、特异性强的特性。

(3)本发明提供的多杀性巴氏杆菌RPA-nfo引物与探针组合以及试剂盒不仅可用于多杀性巴氏杆菌分菌株的检测，还可用于鼻拭子、气溶胶、血液、组织等临床样本的检测。

(4)本发明提供的多杀性巴氏杆菌RPA-LFD检测方法使用方便，无需特殊仪器设备，在37℃恒温水浴锅中处理25min就能对待测样本的粗裂解物进行多杀性巴氏杆菌DNA的检测，适合现场或基层巴氏杆菌病的诊断工作。

(5)使用本发明的试剂盒能够有效诊断出多杀性巴氏杆菌病原，及时的发现巴氏杆菌阳性动物，为巴氏杆菌病的防制提供技术保障。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：多杀性巴氏杆菌RPA-nfo引物与探针的筛选，A：3对引物与探针的电泳图，B：A图对应引物与探针的LFD结果，其中，1：Kmt1-F1-R-LF(192bp和150bp)，2：Kmt1-F2-R-LF(189bp和150bp)，3：Kmt1-F3-R-LF(179bp和150bp)。B图中a：为3.0×10⁴拷贝/μL多杀性巴氏杆菌阳性质控标准品，b：是以pEASY-T3空载质粒的阴性对照。

图2：多杀性巴氏杆菌RPA-LFD灵敏性检测，其中，1～7：模板分别为6.0×10⁶～6.0×10⁰拷贝/μL阳性质控标准品，8：阴性对照，9：模板为ddH₂O。

图3：多杀性巴氏杆菌RPA-LFD特异性检测，其中，+：模板为3.0×10⁴拷贝/μL多杀性巴氏杆菌DNA，－：阴性对照。1～5：模板分别为荚膜A、B、D、E、F型巴氏杆菌基因组DNA；6～12：模板依次分别为牛支原体、溶血曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、睡眠嗜组织菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、丝状支原体丝状亚种SC型基因组DNA。

图4：多杀性巴氏杆菌RPA-LFD重复性检测，其中1、2、3：分别在三个独立时间段进行的试验，模板为3.0×10⁴拷贝/μL多杀性巴氏杆菌DNA，2是1检测完1周后进行的重复性试验，3是2检测完1个月后进行的重复性试验。

图5：多杀性巴氏杆菌RPA-LFD临床样本的检测，其中，+：模板为3.0×10⁴拷贝/μL多杀性巴氏杆菌DNA，－：阴性对照组，1～5：多杀性巴氏杆菌核酸阳性鼻拭子样本DNA，7：多杀性巴氏杆菌核酸阳性气溶胶样本DNA，9～11：多杀性巴氏杆菌核酸阳性奶牛肺脏组织DNA样本，13：多杀性巴氏杆菌核酸阳性血液样本DNA，6、8、12、14：分别为多杀性巴氏杆菌核酸阴性鼻拭子、气溶胶、牛肺脏组织和血液临床样本DNA。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中还未有针对多杀性巴氏杆菌进行RPA-LFD检测的相关报道。基于此，本发明提出了一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒。

在本申请的一种实施方案中，提供了一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针的序列如下所示：

正向引物：5'-TTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTG-3'；

反向引物：5'-(Biotin)AATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCA-3'；

探针：5'-(FAM)ATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTG(dSpacer)GCTTGTCGGTAGTCTT(C3-Spacer)-3'。

荚膜是多杀性巴氏杆菌表面的主要组分之一，也是其重要的毒力因子之一，在多杀性巴氏杆菌抗吞噬的过程中发挥着十分重要的作用。多杀性巴氏杆菌中负责荚膜合成的基因在其基因组中成簇存在，在所有与多杀性巴氏杆菌荚膜形成的相关基因中，hyaD、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD等基因表现出了相应的荚膜型特异性，Townsend等(2001)利用这些基因不同位点的序列设计引物，用于鉴定多杀性巴氏杆菌荚膜血清型的分型。

脂多糖是多杀性巴氏杆菌表面的另一种重要组成成分，也是其主要毒力因子之一。有报道在多杀性巴氏杆菌Heddleston1、2、3、4、5、8、10、11、12、13、14及15型菌株的外核编码簇中均存在一个高度保守的基因hptE，该基因与fpg相邻，其所编码的庚糖基转移酶(HptE)对于多杀性巴氏杆菌LPS内核多糖和外核多糖之间的相互连接是必需的。由于多杀性巴氏杆菌LPS的外核编码簇位于两个保守的基因priA和fpg之间，并且不同Heddleston血清型菌株外核编码簇的长短不一，因此可以分别基于priA和HptE作为起始和终止位点设计引物，实现对Heddleston血清型多杀性巴氏杆菌的诊断。

综上，对于多杀性巴氏杆菌而言，能够作为靶标序列的保守基因的种类有多种，但以不同的保守基因区域设计的引物不同，对多杀性巴氏杆菌的诊断和检测的效果不同。本申请对用于设计引物的多杀性巴氏杆菌的靶标序列进行了优化筛选，结果发现，以Kmt1基因作为靶标序列设计RPA引物，可以同时诊断多杀性巴氏杆菌荚膜A、B、D、E和F 5个血清型，并能提高检测分析的特异性。

另外，RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计，常规的PCR引物多半是不适用于RPA分析的，因为RPA引物比一般的PCR引物要长，通常需要达到30-35个碱基，引物过短会严重影响重组酶的活性，降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度；但长引物也并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性。另外，在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增的关键因素。但RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，目前还不能仅根据序列判断引物的扩增性能，需要不断的摸索条件进行优化，通过设计多组候选引物进行测试和筛选。对于RPA引物的设计，目前，只有设计引物和探针的长度、GC含量等简单信息，试验表明，一个碱基的删减都有可能影响RPA的扩增性能与成败。RPA技术没有相应的引物和探针的设计软件，需要通过多次的试验筛选和优化。

本申请在试验过程中，设计了多组不同的引物和探针，并分别进行组合，经RPA反应后分别检测其特异性和扩增效率，以筛选最优的可用于临床检测的引物和探针组合。结果发现，以上述的引物和探针组合对多杀性巴氏杆菌进行检测的特异性和灵敏度最优。

在本申请的另一种实施方案中，提供了一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物和探针组合、阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。

本申请通过将上述优选的引物和探针组合设计成试剂盒，结合侧流层析试纸条读取检测结果，方便对试验样品进行快速检测。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用一些材料和试剂如下：多杀性巴氏杆菌A型标准株(CVCC390)、多杀性巴氏杆菌B型标准株(CVCC391)、多杀性巴氏杆菌D型标准株(CVCC392)、多杀性巴氏杆菌E型标准株(CVCC393)、多杀性巴氏杆菌F型标准株(CVCC394)、丝状支原体丝状亚种SC型(MmmSC)PG1株购自中国兽医药品监察所，牛支原体、溶血曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、睡眠嗜组织菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌等常见微生物核酸样品由本实验室保存；临床上确诊为巴氏杆菌病阳性的鼻拭子、血液、肺脏组织DNA样本等均由山东师范大学反刍动物疾病研究中心保存。引物与探针由上海生工生物有限公司合成。TwistAmpDNAAmplification nfo Kits购自TwistDX公司，侧流层析试纸条(HybriDetectDipsticks)购自Milenia公司，pEASY-T3载体试剂盒和PCR mix购自北京全式金生物科技有限公司。其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：引物与探针的设计和筛选

1.引物与探针的设计

目前，RPA-nfo引物与探针的设计没有具体规则，必须经过RPA反应后检测其特异性和扩增效率，才能筛选获得可用于临床检测的引物与探针。实验中需要从靶标序列两端设计多对引物与探针进行优化和筛选，个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响。

本发明根据多杀性巴氏杆菌特异性的Kmt1基因(GengBank No.AF016259)分别设计引物和探针，分别见表1。设计引物时，首先在Genebank数据上BLAST了引物设计区域Kmt1基因的保守性，均与现有多杀性巴氏杆菌菌株序列100％匹配。再对设计的上下游引物和探针进行BLAST对比，结果发现均不与其他基因序列相匹配，保证了引物序列的特异性。

表1引物对与探针序列

注：Biotin：生物素标记；FAM：羧基荧光素标记；dSpacer：核苷酸碱基类似物，是nfo核酸酶切割位点；C3-Spacer：聚合酶延伸阻断物。

2.利用RPA-nfo扩增反应筛选引物和探针

通过建立多杀性巴氏杆菌RPA-LFD检测方法，利用RPA扩增反应对引物和探针进行筛选，具体步骤如下：

(1)阳性质控标准品的制备：

①模板DNA的提取：对本实验室通过PCR检测多杀性巴氏杆菌阳性的奶牛肺脏组织提取基因组DNA。

②PCR扩增：以提取的DNA为模板，用引物Kmt1-S：5'-C G A T T G C C G C G A AA T T G A G T-3'，Kmt1-A：5'-A A T A A C G T C C A A T C A G T T G C-3'，进行扩增，反应体系为50μL，包括2×PCR mix：25μL，上下游引物各2μL，模板2μL，ddH₂O 19μL。反应条件为：94℃3min，94℃30sec、60℃30sec、72℃20sec，35个循环，72℃10min。

③重组质粒的构建及阳性质控标准品的建立：将PCR产物进行凝胶纯化回收，然后连接pEASY-T3载体，转化，提取质粒后双酶切鉴定，将阳性重组质粒进行测序，并进行序列比对。序列正确的重组质粒命名为pEAST-T3-Kmt1，将上述阳性质粒用紫外分光光度计测定浓度，为110ng/μL，按照下述公式计算出每μL质粒中的DNA拷贝数，结果为3.0×10¹⁰拷贝/μL，将该阳性质粒作为阳性质控标准品。

拷贝数(copies/μL)＝质粒浓度×10^-9×6.02×10²³/(660×质粒总长度)

(2)阴性质控标准品：阴性质控标准品为pEASY-T3空载质粒。

(3)多杀性巴氏杆菌RPA-nfo反应体系的建立

RPA-nfo反应体系为25μL：

将上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液1.25μL，上下颠倒混匀后直接置于37℃恒温水浴锅反应25min。

反应结束后取1μL与49μLLFD检测缓冲液混合，将LFD垂直浸入上述混合缓冲液，5min之内观察结果，对结果进行判读：若同时出现检测条带和对照条带，则该样品中多杀性巴氏杆菌核酸阳性；仅出现对照条带则说明该样本中不含多杀性巴氏杆菌核酸，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。

3.引物和探针的筛选结果

RPA技术属于新兴的核酸扩增技术，目前尚无多杀性巴氏杆菌RPA检测的相关报道，现有分子生物学技术如LAMP等的多杀性巴氏杆菌相关的引物和探针并不一定适用于RPA，其引物和探针的设计原理和规则与PCR等扩增技术也不相同，需经过大量实验验证和分析。

对表1中的多杀性巴氏杆菌RPA-nfo引物与探针组合分别进行RPA-LFD检测筛选，优化出1组最优的引物和探针组合，结果如图1所示，3：为最优引物与探针组合扩增结果。2和4也出现了检测条带，但在反应模板和反应条件相同的情况下，3的检测条带最亮，说明扩增效率最高，3的引物与探针组合扩增效率高于2和4。

引物与探针序列见表1，经筛选，Kmt1-F2、Kmt1-R、Kmt1-LF为最优的引物和探针组合，以上述引物和探针组合在进行多杀性巴氏杆菌DNA的检测时，灵敏度高、特异性强、重复性好(图1)。

实施例2：多杀性巴氏杆菌RPA-LFD检测方法的灵敏性、特异性和重复性考察

1.试验方法：

(1)多杀性巴氏杆菌RPA-LFD灵敏性检测

将阳性质粒标准品以10倍倍比稀释成6.0×10⁶～6.0×10⁰拷贝/μL，以本发明实施例1筛选得到的引物与探针按照上述实施例1中步骤(3)进行RPA-nfo扩增，DNA为模板分别为2μL，同时以pEASY-T3空载为阴性对照，检验本方法的敏感性。

(2)多杀性巴氏杆菌RPA-LFD特异性检测

以本发明实施例1筛选得到的引物与探针分别对荚膜A型多杀性巴氏杆菌、荚膜B型多杀性巴氏杆菌、荚膜D型多杀性巴氏杆菌、荚膜E型多杀性巴氏杆菌、荚膜F型多杀性巴氏杆菌，牛支原体、溶血曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、睡眠嗜组织菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、丝状支原体丝状亚种SC型基因组DNA进行扩增，3.0×10⁴拷贝/μL多杀性巴氏杆菌DNA为阳性对照，同时以pEASY-T3空载为阴性对照，验证本方法的特异性。

(3)多杀性巴氏杆菌RPA-LFD重复性检测

以本发明实施例1筛选得到的引物与探针分别对3.0×10⁴拷贝/μL多杀性巴氏杆菌DNA、pEASY-T3空载质粒进行RPA-LFD检测，分别在不同三个时间段进行重复性试验，首次检测、第2和第3次分别间隔1周和1个月后进行，验证本方法的重复性。

2.试验结果

(1)灵敏性考察结果

以10倍倍比稀释的7个梯度的多杀性巴氏杆菌阳性质控标准品DNA为模板进行检测，结果如图2所示，25μL体系的RPA-LFD检测限为6拷贝/反应。说明本发明提供的引物、探针及其检测方法的灵敏性高。

(2)特异性考察结果

对5种荚膜型多杀性巴氏杆菌和7种其他细菌作为对照菌株，分别进行RPA-LFD检测，结果如图3所示，只有以多杀性巴氏杆菌DNA为模板的RPA-nfo反应管在LFD的检测线处出现条带，为阳性结果；而其它细菌菌株以及pEASY-T3空载质粒均未出现检测条带，均出现对照条带。说明多杀性巴氏杆菌RPA-nfo引物与探针组合能特异性检测多杀性巴氏杆菌，与其细菌均无交叉反应。

(3)重复性考察结果

在3个不同时间段进行重复性试验，分别以3.0×10⁴拷贝/μL多杀性巴氏杆菌DNA为模板进行扩增，检测结果一致，结果如图4所示，说明本试剂盒提供的引物、探针以及阳性质控标准品重复性好，可操作性强。

需要说明的是，本发明的多杀性巴氏杆菌RPA-LFD检测方法之所以具有灵敏性高(检测限达6拷贝/μL)、特异性强和重复性好等优势，是基于特殊的靶标(Kmt1基因)设计RPA引物，并对RPA引物进行优化筛选而实现的。首先根据特殊的靶标设计RPA引物能够实现对多杀性巴氏杆菌荚膜A、B、D、E和F 5个血清型的同时诊断；目前已报道的用于多杀性巴氏杆菌分型诊断的多杀性巴氏杆菌的保守基因序列有多个，但如何从众多的保守基因序列中选择靶标进行RPA引物设计是方案设计的难点所在。其次RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，目前还不能仅根据序列判断引物的扩增性能，需要不断的摸索条件进行优化。第三，通过不同的探针结合到模板互补链后再通过核酸内切酶IV(nfo)切割掉3'端阻止序列，也会影响多杀性巴氏杆菌RPA-LFD检测的效果。

本申请在实验过程中以不同的保守基因作为靶标区域，设计了多组RPA引物，但在检测过程中有出现与其他细菌之间的交叉反应，可能会出现假阳性的检测结果，检测的特异性不如以Kmt1基因作为靶标设计的RPA引物。

本申请还以Kmt1基因作为靶标设计了多组RPA引物，为与LFD技术相结合，另外设计了不同的探针序列，通过不同的引物和探针的组合，考察检测的灵敏度，结果发现，不同引物和探针的组合，其检测的灵敏度相差较大，以本发明实施例1中筛选和优化得到的引物和探针组合的检测灵敏度最优。

实施例3：用于多杀性巴氏杆菌检测的试剂盒

1.试剂盒的组成：实施例1筛选的引物和探针组合，阳性质控标准品、阴性质控标准品，rehydration缓冲液，醋酸镁(280mM)、ddH₂O和侧流层析试纸条。

2.扩增体系及检测方法：

RPA-nfo反应体系为25μL：

反应结束后取1μL与49μL LFD检测缓冲液混合，将LFD垂直浸入上述混合缓冲液，5min之内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品中多杀性巴氏杆菌核酸阳性；仅出现对照条带则说明该样本中不含多杀性巴氏杆菌核酸，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。

实施例4：多杀性巴氏杆菌RPA-LFD检测方法的应用

1.实验步骤

(1)临床样本的现场制备

将肺脏组织、气溶胶离心沉淀、奶样离心沉淀等临床样本用200μL TE缓冲液[1.0MTris-HCl(pH8.0)10mL，0.5M Na₂EDTA·2H₂O(pH8.0)2mL，加蒸馏水至1000mL]重悬，鼻拭子溶解液、血液等液体样本直接取200μL，然后加入30μL 10％(w/v)SDS和3μL 2％(w/v)蛋白酶K，混合后37℃温育1h，期间上下颠倒数次。

(2)临床样本的检测

按照步骤(1)中临床样本现场裂解处理的方法，分别对本实验室保存的已经用多杀性巴氏杆菌特异性PCR引物扩增后测序正确的5份鼻拭子样本，1份牛肺脏组织样本，1份气溶胶样本，1份血液样本以及1份奶样样本进行Kmt1基因引物、探针组合的多杀性巴氏杆菌RPA-LFD检测，同时将上述不同类型样本各取1份阴性样本进行处理，以3.0×10⁴拷贝/μL多杀性巴氏杆菌DNA和pEASY-T3空载质粒分别为阳性、阴性对照。

2.试验结果

对本实验室确诊的6份鼻拭子、2份气溶胶、4份牛肺组织、2份奶样样本，分别应用本发明中的试剂盒筛选的多杀性巴氏杆菌RPA-LFD进行了检测，结果见图5。检测结果与测序确诊结果均一致。

以上结果充分说明用本发明提供的多杀性巴氏杆菌RPA-LFD引物、探针组合以及试剂盒可用于不同临床样本的检测，该方法具有较高的灵敏度和特异性，最重要的是可以对临床鼻拭子、气溶胶等样本直接进行现场快速的诊断。

3.结果对比

以本实验室建立的多杀性巴氏杆菌TaqMan荧光定量PCR和LAMP检测方法为对照进行6份鼻拭子的检测。

将上述6份鼻拭子样本(5个阳性样本，1个阴性样本)分别采用TaqMan荧光定量PCR、LAMP快速检测和RPA-LFD检测，对比结果如下：

表2：对比结果

由上述对比结果可以看出，采用本申请的RPA-LFD检测方法与LAMP快速检测相比，其检测的准确性更高，无假阳性或假阴性的检测结果；与TaqMan荧光定量PCR相比，本申请的RPA-LFD检测无需特殊仪器设备，只需借助恒温水浴锅，25min就能对待测样本的粗裂解物进行多杀性巴氏杆菌DNA的灵敏、特异、快速地检测，适合现场或基层试验条件差的地区多杀性巴氏杆菌的诊断工作。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgccgcgaa attgagtttt atgccacttg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aataacgtcc aatcagttgc gccgttgtca 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcattat tttatggctc gttgtgagtg gcttgtcggt agtctt 46

<210> 4

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgattgccgc gaaattgagt tttatgccac ttgaaatggg aaatggcatt attttatggc 60

tcgttgtgag tgggcttgtc ggtagtcttt tatttggctt gtggcaaaga aaagcacagt 120

tttgttgggc ggagtttggt gtgttgagcc aatctgcttc cttgacaacg gcgcaactga 180

ttggacgtta tt 192

Claims

1.一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针的序列如下所示：

正向引物：5'-TTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTG-3'；

反向引物：5'-(Biotin)AATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCA-3'；

2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备多杀性巴氏杆菌检测的试剂盒、芯片和/或扩增反应试剂中的用途。

3.一种检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控标准品为包含多杀性巴氏杆菌Kmt1基因片段阳性质控标准品；

优选的，所述的包含多杀性巴氏杆菌Kmt1基因片段阳性质控标准品，由含有192个碱基的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；

所述含有192个碱基的核苷酸片段的序列如SEQ ID No.4所示。

6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控标准品为pEASY-T3空载质粒。

7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA-nfo反应液，包括下述试剂中的至少一种：

recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、rehydration缓冲液、280mM醋酸镁溶液、侧流层析试纸条、LFD检测缓冲液、灭菌去离子双蒸水，TE缓冲液、SDS、蛋白酶K和多杀性巴氏杆菌标准阳性模板。

8.一种非诊断目的的检测多杀性巴氏杆菌的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)检测样本DNA的提取或检测样本的现场裂解处理；

(2)以步骤(1)中处理的样本为模板，利用权利要求1所述的引物和探针组合进行RPA-nfo扩增；

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述RPA-nfo扩增体系为25μL：其中包括1.0μL的正向引物，1.0μL的反向引物，0.3μL的探针，rehydration缓冲液14.75μL，待测样本DNA或粗裂解产物2μL，ddH₂O 4.7μL；将上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液1.25μL，上下颠倒混匀后直接在37℃恒温水浴锅处理25min。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(3)的具体步骤为：取1μL RPA扩增产物与49μL的LFD检测缓冲液混合，将LFD置入上述混合液中，5min内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品多杀性巴氏杆菌核酸阳性，仅出现对照条带则说明该样品中不含多杀性巴氏杆菌，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。