CN112063727A - 布氏杆菌重组酶介导的等温核酸扩增试剂盒 - Google Patents

布氏杆菌重组酶介导的等温核酸扩增试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种布氏杆菌重组酶介导的等温核酸扩增试剂盒，包括正向引物BrucellaF和反向引物BrucellaR，以及标记有THF残基的探针BrucellaP。基于上述技术方案，等温核酸扩增试剂盒的扩增温度为39℃，扩增时间为20分钟，最低可检测到100拷贝数的布氏杆菌样品，且该特异性高。相对于其他PCR方法，本试剂盒不需要使用复杂的仪器和精良实验室，只需要一台恒温荧光扩增仪。操作简便的同时，反应耗时短，只需15‑20分钟即可完成扩增，且特异性、灵敏度都符合要求。适合畜牧业实地检测或学校、实验室对样品进行研究前的快速检测。

Description

布氏杆菌重组酶介导的等温核酸扩增试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种针对布氏杆菌的重组酶介导的等温核酸扩增试剂盒。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)，又称布病、波状热。是由布氏杆菌(Brucella)引起的侵害关节和生殖系统的慢性流行性人畜共患疾病，在我国，该疾病的主要传染源为牛、羊、猪3种牲畜，其中以羊型布氏杆菌对人体的传播性最强，致病率最高，危害最为严重。布病主要损害人、畜的生殖系统和关节，对畜牧业的发展以及人类健康产生了较大的危害。目前，关于布氏杆菌的实验室标准检测方法主要为血清学方法。血清学的试管凝集试验(SAT)、缓冲平板凝集试验(BPAT)、虎红平板凝集试验(RBT)、全乳环状试验(MPT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、补体结合试验(CFT)和荧光片振试验(FPA)是现行布氏杆菌检疫的标准方法。利用血清学方法检测布氏杆菌所得到的结果相对可靠，但此类方法耗时久、操作繁琐，且针对各种试验方法在结果判定及影响因素都多少存在限制。奶制品、血清及部分组织含有的布氏杆菌较少，利用血清学方法检测需要进行6周左右的增菌培养。
发明内容
本发明提供一种布氏杆菌重组酶介导的等温核酸扩增试剂盒，该试剂盒特异性好，灵敏度高，操作简便，反应耗时短。
一种布氏杆菌重组酶介导的等温核酸扩增试剂盒，包括正向引物BrucellaF和反向引物BrucellaR，以及标记有THF残基的探针BrucellaP；其中特异性引物和探针序列如下：
BrucellaF:5’-GGCCAGTTCCGAGATTGCGCCCGTCGGATAGCCGC-3’(SEQ ID No.01)；
BrucellaR:5’-CGCGTATCGTTCTTGAAGCCTACGGCCTCACGGAA-3’(SEQ ID No.02)；
BrucellaP:5’-CCACAAAGAAATAGGCGTCCAGCGCACCAFCHTQCAGCCTCTCGCCTG-3’(SEQID No.03)；
其中，探针BrucellaP的序列中标注的F为荧光报告基团，H为四氢呋喃残基，Q为荧光猝灭基团，探针的末端具有聚合酶延伸阻断基团C3-spacer(C3-间臂)。
上述重组酶介导的等温核酸扩增试剂盒是针对现有布氏杆菌各种型，因此选择相对保守的基因片段进行扩增，具体是登陆于genbank的序列号为MG457036.1基因片段。
进一步，所述荧光报告基团可以选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，所述荧光淬灭基团可以选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。
该等温核酸扩增试剂盒还包括重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶、核酸外切酶冻干酶粉、Buffer A、Buffer B；所述Buffer A为水解缓冲液；所述Buffer B为醋酸镁溶液。
进一步，该等温核酸扩增试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为布氏杆菌阳性质粒标准体，所述阴性对照为ddH2O或空载体质粒。
基于上述技术方案，等温核酸扩增试剂盒的扩增温度为39℃，扩增时间为20分钟，最低可检测到100拷贝数的布氏杆菌样品，且该特异性高。相对于其他PCR方法，本试剂盒不需要使用复杂的仪器和精良实验室，只需要一台恒温荧光扩增仪。操作简便的同时，反应耗时短，只需15-20分钟即可完成扩增，且特异性、灵敏度都符合要求。适合畜牧业实地检测或学校、实验室对样品进行研究前的快速检测。
附图说明
图1是实施例2特异性试验的扩增曲线图，图中标号1为阳性对照检出的扩增曲线，标号2为其他样品的核酸检出的扩增曲线；
图2是实施例3灵敏度试验的扩增曲线图；
图3是实施例4重复性试验稀释倍数为10-4的阳性质粒溶液的扩增曲线图，图中标号1-8分别为等同稀释倍数的阳性质粒溶液分别进行扩增的数字编号；
图4是实施例4重复性试验稀释倍数为10-5的阳性质粒溶液的扩增曲线图，图中标号1-8分别为等同稀释倍数的阳性质粒溶液分别进行扩增的数字编号；
图5是实施例4重复性试验稀释倍数为10-6的阳性质粒溶液的扩增曲线图，图中标号1-8分别为等同稀释倍数的阳性质粒溶液分别进行扩增的数字编号；
图6是实施例5临床样品试验的扩增曲线图，图中标号1为阳性对照检出的扩增曲线，标号2为阴性对照检出的扩增曲线，标号3和4为灭活牛种布氏杆菌抗原检出的扩增曲线，标号5和6为灭活羊种布氏杆菌抗原检出的扩增曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：布氏杆菌重组酶介导的等温核酸扩增试剂盒的构建及使用
根据GenBank上收录的布氏杆菌基因序列，筛选保守区域，设计引物及探针。正向引物BrucellaF、反向引物BrucellaR、探针BrucellaP，其序列分别如下：
BrucellaF:5’-GGCCAGTTCCGAGATTGCGCCCGTCGGATAGCCGC-3’(SEQ ID No.01)；
BrucellaR:5’-CGCGTATCGTTCTTGAAGCCTACGGCCTCACGGAA-3’(SEQ ID No.02)；
BrucellaP:5’-CCACAAAGAAATAGGCGTCCAGCGCACCA[FAM–dt]C[THF]T[BHQ1-dt]CAGCCTCTCGCCTG-C3-spacer(SEQ ID No.03)。
具体使用步骤包括向装有核酸外切酶冻干酶粉的检测单元管中加入40.9μL的Buffer A、2μL正向引物(10μM)、2μL反向引物(10μM)、0.6μL探针(10μM)、2μL的样本DNA，再向检测单元管盖上加入2.5μL的Buffer B，盖上管盖，上下颠倒5-6次，使管内反应体系充分混匀，再低速离心10秒钟。将检测单元管放入Genchek-1荧光检测仪，开启39℃的RAA程序。
实施例2：特异性试验
取猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗(EO630株)、猪丹毒活疫苗(GC42株)、猪巴氏杆菌病活疫苗(C4株)分别提取各待检品的核酸，以及非洲猪瘟病毒核酸、口蹄疫病毒核酸、猪水疱性口炎病毒核酸、猪圆环病毒核酸分别作为检测样本，按实施例1提供的使用步骤分别进行扩增检测。利用布氏杆菌宿主易患的多种病菌及病毒验证该等温核酸扩增试剂盒的特异性。
实验结果表明，只有阳性对照检出扩增现象，其余7份样品并未检测出扩增现象，即该体系并无出现非特异性扩增。试验结果可以证实实施例1所述试剂盒具有检测布氏杆菌的特异性(如图1)。
实施例3：灵敏度试验
取布氏杆菌阳性质粒标准体的质粒原液(浓度为1010拷贝数)按10倍梯度稀释成以下浓度：109、108、107、106、105、104、103、102、101和100，最小浓度为理论上100拷贝/μL，按实施例1提供的使用步骤分别进行扩增检测。在Genchek-1恒温荧光检测仪上检到的最小拷贝数即是该体系的检测灵敏度。
实验结果表明在相同的反应体系和条件下进行重组酶介导的等温核酸扩增最低能检测到稀释倍数为10-8的含布氏杆菌的重组质粒(即100拷贝)。说明该试剂盒具有高灵敏性(如图2)。
实施例4：重复性试验
分别将灵敏度试验中的4、5、6号管(稀释倍数分别对应10-4～10-6)在相同的反应体系和条件下进行重组酶介导的等温核酸扩增做三组重复性试验。实验结果表明，实际工作中，样品检测时间误差基本在一分钟之内。实验重复性取决于体系是否混合均匀(如图3、4、5)。
实施例5：临床样本的检测
将提取的灭活牛种布氏杆菌抗原的核酸、灭活的羊种布氏杆菌抗原的核酸，以稀释倍数为10-5的布氏杆菌阳性试剂为阳性对照，以等量ddH2O为阴性对照，在恒温荧光检测仪中进行荧光扩增。检验中，两管样品分别设置一组同样的对照。实验结果表明，在现有样品的检测下，本方法检测布氏杆菌检出率为100％(如图6)。
SEQUENCE LISTING
<110> 拱北海关技术中心
<120> 布氏杆菌重组酶介导的等温核酸扩增试剂盒
<130> 2020
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggccagttcc gagattgcgc ccgtcggata gccgc 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgcgtatcgt tcttgaagcc tacggcctca cggaa 35
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccacaaagaa ataggcgtcc agcgcaccac tcagcctctc gcctg 45

Claims (4)

1.布氏杆菌重组酶介导的等温核酸扩增试剂盒，其特征在于，包括正向引物BrucellaF和反向引物BrucellaR，以及标记有THF残基的探针BrucellaP；正向引物、反向引物和探针序列如下：
BrucellaF:5’-GGCCAGTTCCGAGATTGCGCCCGTCGGATAGCCGC-3’(SEQ ID No.01)；
BrucellaR:5’-CGCGTATCGTTCTTGAAGCCTACGGCCTCACGGAA-3’(SEQ ID No.02)；
BrucellaP:5’-CCACAAAGAAATAGGCGTCCAGCGCACCAFCHTQCAGCCTCTCGCCTG-3’(SEQ IDNo.03)；
探针BrucellaP的序列中标注的F为荧光报告基团，H为四氢呋喃残基，Q为荧光猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的等温核酸扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。
3.根据权利要求1所述的等温核酸扩增试剂盒，其特征在于，还包括重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶、核酸外切酶冻干酶粉、Buffer A、Buffer B；所述Buffer A为水解缓冲液；所述Buffer B为醋酸镁溶液。
4.根据权利要求3所述的等温核酸扩增试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为布氏杆菌阳性质粒标准体，所述阴性对照为ddH2O或空载体质粒。
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