CN116024208B

CN116024208B - 一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒

Info

Publication number: CN116024208B
Application number: CN202211425473.7A
Authority: CN
Inventors: 周咏松; 汪劲能; 梅兴林; 李娟�
Original assignee: Shanghai Xiongtu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Xiongtu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-11-15
Filing date: 2022-11-15
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2042-11-15
Also published as: CN116024208A

Abstract

本发明涉及一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒。所述试剂盒含有可复合扩增26种猪疫病的引物组合。所述试剂盒的检测范围涵盖了26种猪疫病病原体，包含17种病毒、7种细菌、1种猪支原体和1种猪衣原体。本发明单管内一次PCR反应即可快速鉴别26种猪疫病，具有检测通量高、灵敏度高、特异性强、成本低和操作简便的特点，为猪疫病的快速、准确检测提供了切实可行的技术方法。

Description

一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，特别涉及一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒。

背景技术

生猪养殖是促进农户致富，扩大国内猪肉市场的重要产业。近年来我国猪肉消费需求呈现逐年递增的发展趋势。但在这个过程中，猪疫病一旦发生，若未及时采取有效防治，都会导致病猪死亡，疫病在猪群中传播扩散，必然将给养猪业带来重大的经济损失。病猪是疫病最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式，所以做好猪疫病防治工作便显得极为必要。

目前国内外对于猪疫病的检测方法主要包括免疫学检测和核酸检测方法。免疫学方法主要是检测疫病病毒的特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述病毒的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。病毒分离和培养法比较敏感，但是这种方法操作繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些基层实验室推广。目前大多数实验室经常用到的核酸检测技术方法：等温扩增法和荧光定量RT-PCR法。等温扩增法存在检测设备、检测试剂昂贵，极易发生交叉污染导致检测结果不确定性等突出问题，而且仅能实现单一病原体检测，无法实现单管多重检测等问题。荧光定量RT-PCR法。等温扩增法存在检测结果稳定性差，一次只能检测单一病原体，无法实现单管多重检测等问题。而荧光定量PCR法，同样存在单管一次最多只能检测4种病原体的低通量问题，增加检测病毒种类，不仅增加了病原体筛查的次数，使得检测结果的时间大大延长，而且增加了操作过程，极大增大了增加了检测成本，不利于疾病的快速诊断和早期防控。

由于引起猪疫病的种类较多，以上技术均具有明显的局限性。所以，本发明基于多重PCR技术和毛细管电泳平台，单管一次检测26种猪疫病，可快速、准确地进行猪疫病鉴别，实现早期精准“拔牙”，防止疫病大规模传播。

发明内容

本发明目的在于公开了一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。

本发明的第一方面在于提供了一套引物组合。所述引物组合的核苷酸序列如SEQID No.1至SEQ ID No.52所示，能够在同管复合扩增反应中特异性扩增26种猪疫病的基因组序列。26种所述猪疫病包括猪水疱病(SVDV)、非洲猪瘟(ASFV)、口蹄疫病(FMDV)、尼帕病毒性脑炎(NIV)、猪瘟(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪流行性腹泻(PED)、猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病毒感染(PPV)、猪伪狂犬病(PRV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪圆环病毒(PCV)、猪流感(SIV)、猪支原体肺炎(MPS)、猪衣原体病(C.suis)、猪塞内卡病毒感染(SVA)、副猪嗜血杆菌病(HPS)、猪丁型冠状病毒感染或猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪丹毒(SE)、猪链球菌病(Ss)、猪轮状病毒(PoRV)、猪波氏菌病(Bb)、猪副伤寒(Swineparatyphoid)、猪传染性胸膜肺炎(PCP)、猪巨细胞病毒(PCMV)、猪坏死梭杆菌病(SwineNecrobacillosis)。

本发明的第二方面在于提供了所述引物组合在非诊断、治疗为目的的猪疫病检测中的应用所述引物组合既可用于活猪的疾病诊断，也可用于进出口猪肉的检验检疫，有效阻断猪疫病的传播风险，起到保障公共卫生安全的效果。

本发明的第三方面在于提供了一种试剂盒。所述试剂盒中含有上述的引物组合。用户只需一次取样，即可通过引物组合中的26组引物对对样品进行特异性扩增，完成26种猪疫病的筛查，具有高效快捷、准确灵敏的优点。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括由上游引物IC-F和下游引物IC-R组成的内标引物对，所述内标引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.53至SEQ ID No.54所示，用于标示试剂盒是否正常工作。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒所含引物如表1所示。

表1特异性扩增猪疫病的引物

在本发明的一些实施方式中，每组所述引物对中至少有一条引物的末端标记有荧光染料，所述荧光染料选自FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ、Alexa 488、R-PH或SIZ。通过不同荧光染料的标记，可以将长度相似的扩增产物区分开来，有助于提高复合扩增的目标数量。

在本发明的一些实施方式中，26组所述引物对分为两群。核苷酸序列如SEQ IDNo.1至SEQ ID No.26所示的引物为第一群，检测SVDV、ASFV、FMDV、NIV、CSFV、PRRSV、PED、JEV、PPV、PRV、TGEV、PCV、SIV；甚至可以将IC一并加入所述第一群中。核苷酸序列如SEQ IDNo.27至SEQ ID No.52所示的引物为第二群，检测MPS、C.suis、SVA、HPS、PDCoV、SE、Ss、PoRV、Bb、Swine paratyphoid、PCP、PCMV、Swine Necrobacillosis。

在本发明的一些实施方式中，所述第一群的所述荧光染料选自Alexa 488，所述第二群的所述荧光染料选自R-PH。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括P-Reaction Mix，所述P-Reaction Mix的组分包括：XT-Taq酶，终浓度为3U；pH 8.4的Tris-HCl，终浓度为20Mm；K₂SO₄，终浓度为30mM；MgCl₂，终浓度为0.35mM；dNTPs，终浓度为0.3mM；甘油，终浓度为6％；SBS，终浓度为0.15mg/mL；(NH₄)₂SO₄，终浓度为20mM；PEG，终浓度为6％。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒的使用方法为：

(1)提取猪的核酸样本

(2)同管复合扩增

所述试剂盒的反应体系包括P-Reaction Mix 10μL，引物混合物5μL，阳性标准品或样本核酸提取液5μL，去离子水补足至25μL。所述试剂盒的扩增程序为：95℃预变性2分钟；94℃变性5秒，60℃退火60秒，共29个循环；最后72℃终延伸10分钟

(3)毛细管电泳

在96孔样品板中配制电泳样品，取高纯甲酰胺8.75μL，标品SIZE-300 0.25μL，PCR产物1μL，混匀离心。将配制好的电泳样品置于3500基因分析仪中，按操作说明进行毛细管电泳。

(4)结果分析

根据所设计的同一色每种猪疫病的PCR产物的片段长度不同，毛细管电泳可获得不同峰图，详细见表2。

表2猪疫病分型各靶点毛细管电泳峰图的位置及荧光标记

阳性结果判定：当IC分型特征峰峰高均大于等于500RFU，且实际片段长度与参考片段长度的差距绝对值小于等于1.5nt时，则检测结果为该阳性。

阴性结果判定：IC峰值均高于500，检测的特征峰峰高均小于500RFU时，则检测结果为阴性。

若内参IC峰高小于500RFU，则可考虑反应失败，需重新对样本进行PCR扩增及毛细管电泳片段分离。

有益效果：(1)本发明所述试剂盒基于同管复合PCR结合毛细管电泳平台，单管单次反应可同时检测26种猪疫病，减少检测次数，防止疫病漏检；(2)本发明所述试剂盒使用方便，操作方法简单，检测时长缩短；(3)本发明含有内参监控，反应内参IC的使用可监测DNA提取及PCR反应的效率，避免了假阴性。

附图说明

图1是本发明试剂盒对阳性对照的检测分型图；

图2为本发明的检测灵敏度试验的检测分型图；

图3为实施例2的待检样品的检测分型图；

图4为实施例3的待检样品的检测分型图；

图5为对比例1的ASFV分型测试图；

图6为对比例1的PRRSV分型测试图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例中，PCR仪购自德国Eppendorf公司，型号为Mastercycler nexus；ABI3500XL遗传分析仪购自美国ABI公司；XT-Taq DNA聚合酶、P-Reaction mix、SIZE-300为上海雄图生物科技有限公司产品。

实施例1一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒的构建

1、基因座筛选以及引物设计

通过数据库和文献报道信息，最终筛选26个猪疫病位点及对应的靶标基因，用于扩增体系构建。

2、PCR反应buffer和扩增程序调节

(1)PCR反应的buffer(即P-Reaction Mix)包含扩增反应所必须的各种离子和dNTP混合物，根据PCR需要还可以添加一些特异性PCR增强剂。但是为了能够提高PCR反应的扩增特异性、扩增效率以及抗干扰能力，需要对以上各种组分进行浓度的优化。

优化后的试剂盒中PCR反应buffer包含的组分优化的浓度范围如表3所示。

表3buffer组分

(2)有别于常规PCR，复合PCR的反应程序将退火和延伸步骤合并，具体扩增程序如表4所示：

表4反应程序

(3)本试剂盒中酶与Mix为预混扩增体系，具体组分及含量见下表5：

表5配置复合PCR反应体系

取1μL PCR产物与9.5μL去离子甲酰胺和0.5μL SIZE-300混匀，95℃保持3min后立即冰浴3min。使用3500XL型基因分析仪以1.2kv，24s的进样模式进行电泳，整个电泳时间30-40min。电泳数据通过GeneMapper IDX v 1.6分析软件进行基因分型。

实施例1

制备含有上述26种猪疫病靶点的阳性质粒作为阳性对照。配制阳性质粒的梯度稀释样品，浓度为1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷贝/mL。以阳性质粒的梯度稀释样品分别作为模板，按表5的反应体系和表4的反应程序进行复合扩增。图1为浓度为1.0×10⁴的检测分型图；浓度为1.0×10¹拷贝/mL的样品无法检出全部分型；最低检出浓度为1.0×10²拷贝/mL，如图2所示。

实施例2

具体步骤如下：

1、使用试剂盒，包括以下组分：P-Reaction Mix、Primers、sdH₂O和阳性对照。

2、样本采集与提取

采集血液样本，过柱法提取核酸。

3、复合PCR

待检测组中加入5μL提取的核酸作为模板，阳性对照组加入5μL阳性质粒溶液，阴性对照组加入5μL去离子水。各组分别加入10μL P-Reaction Mix、5μL引物组合，由sdH₂O补足至25μL。按表4的反应程序进行复合扩增。

4、毛细管电泳

在96孔样品板中配制电泳样品，取8.75μL高纯甲酰胺，0.25μL标品SIZE-300，1μLPCR产物，混匀离心。将配制好的电泳样品置于3500基因分析仪中，按操作说明进行毛细管电泳。

5、结果分析

根据所设计的同一荧光每种猪疫病的PCR产物的片段长度不同，毛细管电泳可获得不同峰图。图1是阳性对照组的检测分型图，图3是本实施例提取的猪血液样品的检测分型图。图中可见IC峰值均高于500RFU，说明检测反应成功；ASFV峰值高于500RFU，可以判断此样品存在ASFV(非洲猪瘟)阳性的情况。

实施例3

本实例采集活猪粪便样本并提取核酸，以提取的核酸为模板进行复合PCR反应，最终用毛细管电泳方法分离样品，具体步骤如下：

2、样本采集与提取

使用磁珠法从经过预处理的粪便样本中提取待检测的核酸。

3、复合PCR

4、毛细管电泳

5、结果分析

图4是本实施例提取的猪粪便样品的检测分型图。图中可见IC峰值均高于500RFU，说明检测反应成功；PRRSV峰值高于500RFU，可以判断此样品存在PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征)阳性的情况。

本发明中检测涉及的26种猪病毒的基因组都具有多个保守序列，直接使用引物设计软件提供的引物序列会对整个引物组的扩增效果造成不良影响，只有通过大量试验才能成功找到合适的引物组合。

对比例1

扩增ASFV片段的引物最初使用软件推荐的核苷酸序列，但在引物测试时出现了非特异峰(如图5a所示)。经过对引物进行修改后，消除了该引物产生的非特异峰(图5b所示)。ASFV修改前后的引物序列见表6。

表6ASFV引物序列的修改前后对比

扩增PRRSV片段引物最初使用软件推荐的核苷酸序列，但在测试PRRSV的阳性样本时出现了效率不佳，且检测峰的形态较差，此外还存在较多二级结构峰(如图6a所示)。经过对PRRSV引物的修改，大大提高了PRRSV引物的扩增效率，峰型也有了较大的改善(如图6b所示)。PRRSV修改前后的引物序列见表7。

表7PRRSV引物序列的修改前后对比

本发明采用复合PCR结合毛细管电泳分析方法，快速对26种猪疫病进行分型检测。同时加入26对特异性猪疫病分型引物及内参引物，复合PCR后获得长度不一的扩增片段，然后使用毛细管电泳进行分离，从而对其疫病进行准确分型。本发明所采用的试剂盒检测方法能快速有效地对猪疫病进行分型，克服了传统方法存在的缺陷，本发明所述的复合扩增检测试剂盒具有以下优点：

(1)通量高：本发明所述试剂盒复合PCR结合毛细管电泳分析方法，单管单次反应可同时检测26种猪疫病，减少检测次数，防止疫病漏检；

(2)操作简便：本发明所述试剂盒使用方便，操作方法简单，检测时长缩短；

(3)内参监控：反应内参IC的使用可监测整个PCR反应过程，避免了假阴性。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims

1.引物组合，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.52所示的26组引物对，26组所述引物对分为两群，核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.26所示的引物为第一群，核苷酸序列如SEQ ID No.27至SEQ ID No.52所示的引物为第二群，每组所述引物对中至少有一条引物的末端标记有荧光染料，第一群和第二群的荧光染料不同。

2.权利要求1所述引物组合在非诊断、非治疗为目的的猪病原体检测中的应用。

3.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括由上游引物IC-F和下游引物IC-R组成的内标引物对，所述IC-F的核苷酸序列如SEQ ID No.53所示，所述IC-R的核苷酸序列如SEQ ID No.54所示。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID No.1和所述SEQ ID No.2的终浓度为0.15μM，所述SEQ ID No.3和所述SEQ ID No.4的终浓度为0.12μM，所述SEQ IDNo.5和所述SEQ ID No.6的终浓度为0.11μM，所述SEQ ID No.7和所述SEQ ID No.8的终浓度为0.15μM，所述SEQ ID No.9和所述SEQ ID No.10的终浓度为0.14μM，所述SEQ ID No.11和所述SEQ ID No.12的终浓度为0.20μM，所述SEQ ID No.13和所述SEQ ID No.14的终浓度为0.13μM，所述SEQ ID No.15和所述SEQ ID No.16的终浓度为0.15μM，所述SEQ ID No.17和所述SEQ ID No.18的终浓度为0.18μM，所述SEQ ID No.19和所述SEQ ID No.20的终浓度为0.23μM，所述SEQ ID No.21和所述SEQ ID No.22的终浓度为0.12μM，所述SEQ ID No.23和所述SEQ ID No.24的终浓度为0.16μM，所述SEQ ID No.25和所述SEQ ID No.26的终浓度为0.23μM，所述SEQ ID No.27和所述SEQ ID No.28的终浓度为0.18μM，所述SEQ ID No.29和所述SEQ ID No.30的终浓度为0.09μM，所述SEQ ID No.31和所述SEQ ID No.32的终浓度为0.13μM，所述SEQ ID No.33和所述SEQ ID No.34的终浓度为0.21μM，所述SEQ ID No.35和所述SEQ ID No.36的终浓度为0.12μM，所述SEQ ID No.37和所述SEQ ID No.38的终浓度为0. 23μM，所述SEQ ID No.39和所述SEQ ID No.40的终浓度为0.14μM，所述SEQ ID No.41和所述SEQ ID No.42的终浓度为0.15μM，所述SEQ ID No.43和所述SEQ ID No.44的终浓度为0.26μM，所述SEQ ID No.45和所述SEQ ID No.46的终浓度为0.17μM，所述SEQ ID No.47和所述SEQ ID No.48的终浓度为0.08μM，所述SEQ ID No.49和所述SEQ ID No.50的终浓度为0.19μM，所述SEQ ID No.51和所述SEQ ID No.52的终浓度为0.24μM，所述SEQ ID No.53和所述SEQ ID No.54的终浓度为0.12μM。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ、Alexa 488、R-PH或SIZ。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述第一群的所述荧光染料选自Alexa488，所述第二群的所述荧光染料选自R-PH。

8.根据权利要求3至7任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括P-Reaction Mix，所述P-Reaction Mix的组分包括：XT-Taq酶，终浓度为3 U；pH 8.4的Tris-HCl，终浓度为20 Mm；K₂SO4，终浓度为30 mM；MgCl₂，终浓度为0.35 mM；dNTPs，终浓度为0.3 mM；甘油，终浓度为6%；SBS，终浓度为0.15 mg/mL；(NH4)₂SO4，终浓度为20 mM；PEG，终浓度为6%。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为：95℃预变性2分钟；94℃变性5秒，60℃退火60秒，共29个循环；最后72℃终延伸10分钟。