CN117051138A - 一种单管检测23种食品致病菌的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种单管检测23种食品致病菌的试剂盒。所述试剂盒含有可复合扩增23种食品致病菌的引物混合物可以一次检测23种食品致病菌，包括副溶血性弧菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157、空肠弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、椰毒假单胞菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、克罗诺杆菌、蜡样芽胞杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和肉毒梭菌。本发明具有单管检测通量大、灵敏度高、检测速度快、操作简便等优点，可为食品检验及食品突发事故快速处理提供有力的技术保障。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，特别涉及一种单管检测23种食品致病菌的试剂盒。
背景技术
食品致病菌是指通过饮食进入人或动物体内的致病性细菌，可能会引起食物中毒以及畜禽传染病的流行。食品致病菌是导致食品安全问题的重要来源，常见种类主要有致病性大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、布氏杆菌、沙门氏菌等。世界卫生组织数据显示，全球平均每年有上亿腹泻病例，食源性疾病患者数以亿计，其中超70％食源性疾病由致病微生物引起。因此，食品致病菌仍是目前引起食源性疾病的主要原因，如何准确、快速、灵敏地检测食品致病菌已成为控制食品安全问题的关键。
目前，食品致病菌检测方法主要有以下几种：(1)传统培养法，包括细菌培养、生理生化鉴定等过程，其检测周期较长，操作较繁琐复杂，且检测时易受微生物生长情况影响；(2)免疫学分析法，基于抗原抗体特异性结合的反应原理，操作简单、方便快速是其突出特点，但其最大的缺点是灵敏性不足，经常造成假阴性结果，容易漏筛；(3)常规PCR法，可以通过检测特定目标DNA序列来检测食品中存在的单一细菌病原体，具有特异性强、仪器便宜的优点，但扩增产物要通过琼脂糖凝胶电泳进行判读，灵敏度、分辨率较低，耗时长；(4)实时荧光定量PCR法，与常规PCR法相比，其不需要扩增后处理，而是通过荧光染料或探针对PCR产物进行实时监测，具有反应快速、特异性强和灵敏度高的特点，但是实时荧光定量PCR法最多支持单管5种靶标的检测，检测通量还有待提高；(5)等温扩增法，不需要复杂的PCR扩增仪器，具有易操作、灵敏度高等优点，但是无法多重检测、假阳性高。
发明内容
本发明目的在于公开了一种单管检测23种食品致病菌的试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明的第一方面在于提供了一种试剂盒，该试剂盒能从混合样本中最多同时检测出23种食品致病菌。所述食品致病菌包括副溶血性弧菌(VP)、沙门氏菌(Sal)、单核细胞增生李斯特氏菌(LM)、志贺氏菌(Shigella spp.)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠埃希菌O157(Escherichia)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter)、椰毒假单胞菌(P.cocovenenans)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、粪肠球菌(粪链球菌，E.faecalis)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)、克罗诺杆菌(阪崎肠杆菌，Cronobacter)、蜡样芽胞杆菌(B.cereus)、霍乱弧菌(V.cholera)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)、类志贺邻单胞菌(PS)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、创伤弧菌(V.vulnificus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、肉毒梭菌(C.botulinum)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)。
在本发明的一些实施方式中，所述引物混合物包括：特异性扩增副溶血性弧菌的上游引物VP-F和下游引物VP-R，特异性扩增沙门氏菌的上游引物Sal-F和下游引物Sal-R，特异性扩增单核细胞增生李斯特氏菌的上游引物LM-F和下游引物LM-R，特异性扩增志贺氏菌的上游引物Shi-F和下游引物Shi-R，特异性扩增金黄色葡萄球菌的上游引物S.a-F和下游引物S.a-R，特异性扩增大肠埃希菌O157的上游引物Esc-F和下游引物Esc-R，特异性扩增空肠弯曲杆菌的上游引物Cam-F和下游引物Cam-R，特异性扩增椰毒假单胞菌的上游引物P.c-F和下游引物P.c-R，特异性扩增产气荚膜梭菌的上游引物C.p-F和下游引物C.p-R，特异性扩增粪肠球菌的上游引物E.f-F和下游引物E.f-R，特异性扩增铜绿假单胞菌的上游引物P.A-F和下游引物P.A-R，特异性扩增克罗诺杆菌的上游引物Cro-F和下游引物Cro-R，特异性扩增蜡样芽胞杆菌的上游引物B.c-F和下游引物B.c-R，特异性扩增霍乱弧菌的上游引物V.c-F和下游引物V.c-R，特异性扩增嗜水气单胞菌的上游引物A.h-F和下游引物A.h-R，特异性扩增小肠结肠炎耶尔森菌的上游引物Y.e-F和下游引物Y.e-R，特异性扩增类志贺邻单胞菌的上游引物PS-F和下游引物PS-R，特异性扩增肠产毒性大肠杆菌的上游引物ETEC-F和下游引物ETEC-R，特异性扩增肠侵袭性大肠杆菌的上游引物EIEC-F和下游引物EIEC-R，特异性扩增创伤弧菌的上游引物V.v-F和下游引物V.v-R，特异性扩增溶藻弧菌的上游引物V.a-F和下游引物V.a-R，特异性扩增肉毒梭菌的上游引物C.b-F和下游引物C.b-R，特异性扩增假结核耶尔森氏菌的上游引物Y.p-F和下游引物Y.p-R。
在本发明的一些实施方式中，所述引物混合物中各引物在特定终浓度下能够取得更优的检测灵敏度。所述VP-F和所述VP-R引物对的终浓度为0.12μM；所述Sal-F和所述Sal-R引物对的终浓度为0.10μM；所述LM-F和所述LM-R引物对的终浓度为0.15μM；所述Shi-F和所述Shi-R引物对的终浓度为0.12μM；所述S.a-F和所述S.a-R引物对的终浓度为0.18μM；所述Shi-F和所述Shi-R引物对的终浓度为0.12μM；所述Esc-F和所述Esc-R引物对的终浓度为0.11μM；所述Cam-F和所述Cam-R引物对的终浓度为0.15μM；所述P.c-F和所述P.c-R引物对的终浓度为0.17μM；所述C.p-F和C.p-R引物对的终浓度为0.18μM；所述E.f-F和所述E.f-R引物对的终浓度为0.19μM；所述P.A-F和所述P.A-R引物对的终浓度为0.15μM；所述Cro-F和所述Cro-R引物对的终浓度为0.12μM；所述B.c-F和所述B.c-R引物对的终浓度为0.20μM；所述V.c-F和所述V.c-R引物对的终浓度为0.12μM；所述A.h-F和所述A.h-R引物对的终浓度为0.13μM；所述Y.e-F和所述Y.e-R引物对的终浓度为0.12μM；所述PS-F和所述PS-R引物对的终浓度为0.14μM；所述ETEC-F和所述ETEC-R引物对的终浓度为0.12μM；所述EIEC-F和所述EIEC-R引物对的终浓度为0.12μM；所述V.v-F和V.v-R引物对的终浓度为0.13μM；所述V.a-F和所述V.a-R引物对的终浓度为0.12μM；所述C.b-F和所述C.b-R引物对的终浓度为0.12μM；所述Y.p-F和所述Y.p-R引物对的终浓度为0.11μM。
在本发明的一些实施方式中，每对引物对中至少有一条引物的末端标记有荧光染料，所述荧光染料选自FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ、Alexa 488、R-PH、SIZ、SF488或SF555。
在本发明的一些实施方式中，所述引物混合物中核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQID No.26所示的引物设为第一组群，核苷酸序列如SEQ ID No.27至SEQID No.46所示的引物设为第二组群，所述第一组群的所述荧光染料选自SF 488，所述第二组群的所述荧光染料选自SF 555。
在本发明的一些实施方式中，所述引物混合物还包括内参引物对IC-F和IC-R，所述IC-F的核苷酸序列如SEQ ID No.47所示，所述IC-R的核苷酸序列如SEQ ID No.48所示。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括增强型PCR反应液，所述增强型PCR反应液组分如下：J型-DNA-Taq酶，浓度为0.5U/μL；pH 8.3的Tris-HCl，浓度为60mM；硫酸钾，浓度为120mM；硫酸镁，浓度为6mM；dNTPs(dATP+dUTP+dCTP+dGTP)，浓度分别为0.2mM；蔗糖，浓度为50mM；甘油，浓度为6％；T4 gene 32蛋白，浓度为0.5μg/μL。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括分子量标准物，所述分子量标准物由14个DNA片段组成，各所述DNA片段的分子量分别是60bp、70bp、80bp、100bp、120bp、140bp、160bp、180bp、200bp、220bp、240bp、260bp、280bp、300bp，均标记有SF 590荧光染料。检测结果通过与所述分子量标准物进行对比，可以快速知扩增产物的长度，以便于确认样品是否受食品致病菌污染。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品，所述阴性对照品为TE缓冲液，所述阳性对照品为所述食品致病菌的检测基因片段的混合物。
本发明的第二方面在于提供了所述试剂盒在食品安全检测中的应用。所述试剂盒的应用使得本领域获得一种通量大、准确、快速、经济的食品致病菌检测方法，从而克服现有技术中的局限性，满足我国公共卫生突发事件应急检测的需要。
附图说明
图1是实施例1中肠产毒性大肠杆菌(ETEC)引物单扩测试修改前后对比；
图2是实施例1中类志贺邻单胞菌(PS)引物复扩测试修改前后对比；
图3是实施例5中使用所述试剂盒检测所述阳性对照的分型检测结果；
图4是实施例5中使用所述试剂盒检测待检牛奶样本分型检测结果；
图5是实施例6中所述试剂盒检测灵敏度检测结果。
具体实施方式
单管反应中同时对多个靶标进行特异性扩增，整个PCR体系要比单靶标扩增体系复杂很多。影响多重PCR反应效果的因素很多，大体可分为PCR体系和PCR条件两大类。其中，PCR体系主要包括复合扩增引物和PCR buffer，反应条件主要包括退火温度和循环数等。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)或者按照方法和产品说明书进行；所述方法生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：23种食品致病菌复合扩增引物设计
复合扩增引物设计是多重PCR的关键，直接影响多重PCR的灵敏度和特异性。如果引物设计不当，各靶标扩增引物之间易形成引物二聚体或形成非特异性扩增，不仅消耗PCR体系中的各组分而且还影响退火与延伸的速率。应注意扩增引物间的退火温度尽可能相同且相互之间无交互反应，一般复合扩增的靶标数目越多，引物设计的难度会越大。
设计引物时，首先利用NCBI数据库下载23种食品致病菌的全基因组序列。其次，利用全基因组序列比对方法，分别对23种食品致病菌的基因组序列进行比对分析，筛选保守的靶标基因，作为引物设计的优选靶标。再利用软件进行单引物设计，需要考虑引物的反应动力学特点、Tm值相近、GC含量接近、引物之间不能形成二聚体。最后，要进行数据库同源性比对，保证每一条引物扩增的特异性。有些靶标基因之间的同源性比较高，为了保证引物的保守性，需要重新筛选保守序列设计引物。引物设计好后，送公司合成。引物合成后，需要利用PCR-毛细管电泳验证单引物的特异性、扩增效率及扩增产物峰型。单引物合格后再利用逐条累加的方法，测试复合扩增过程中引物的特异性、扩增效率及扩增产物峰型。如果任何一条引物出现非特异或扩增效率下降或扩增产物峰型差，则需要重新设计该引物，直至所有复合扩增引物均符合特异性、效率和扩增产物峰型的要求。以下展示设计过程中的两次引物修改实例：
1-1.在设计测试肠产毒性大肠杆菌的引物时选用了5’-GGTATTATGATGTTTGTT-3’的上游引物和5’-TGCATAAATAGAGCGATG-3’的下游引物。但进行测试肠产毒性大肠杆菌(ETEC)阳性样本时，ETEC检测效率很低，峰型较差，且存在较多二级结构峰(如图1中“引物修改前”所示)。修改引物后，提高了ETEC引物的效率，且扩增产物峰型得到改善(如图1中“引物修改后”所示)。
表1-ETEC引物序列修改对照
1-2.在设计测试类志贺邻单胞菌的引物时选用了5’-TTCCCAGCAGCTCCT-3’的上游引物和5’-ATTTTCACCGGCTCAGA-3’的下游引物。但进行复合扩增时，反应体系出现了非特异扩增(如图2中“引物修改前”所示)。经过修改PS引物才消除了复合体系中的非特异扩增(如图2中“引物修改后”所示)。
表2-PS引物序列修改对照
本发明单管检测23种食品致病菌的DNA序列，无法使用常规软件进行复合扩增引物的设计，只有通过大量的试验才能成功找到合适的引物组合。同时，随着复合扩增体系中检测靶标数目的增加，由于各靶标扩增引物间的竞争，对每个靶标扩增均衡性的控制难度加大，需要进行大量反复试验，调节各靶标引物浓度和配比，最终达到平衡。23种食品致病菌的引物序列及终浓度如表3所示：
表3-23种食品致病菌的引物序列&引物终浓度
实施例2：PCR buffer优化
PCR buffer中的DNA聚合酶、缓冲液、Mgcl2、dNTP浓度和添加剂都会影响检测结果。DNA聚合酶用于催化PCR反应，由于多重PCR中存在多个靶标的扩增反应，每个靶标扩增都会不同程度地竞争DNA聚合酶，若DNA聚合酶终浓度过低会抑制效率低的靶标扩增，过多则会导致非特异性扩增。为了增强PCR扩增的特异性和灵敏度，PCR buffer中还需要添加合适的Mgcl2、dNTP浓度和添加剂。PCR buffer中离子和添加剂成分只有在其最适反应浓度下，才能发挥最大作用，如果浓度过低，则效果不显著，反之，则会抑制PCR扩增。所以，不但需要选择合适的PCR组分，还需要对PCR buffer的各种组分进行浓度的优化。PCR buffer最终优化结果如表4所示：
表4-PCR buffer组分以及终浓度
实施例3：PCR扩增程序优化
一般PCR扩增需要经历变性、退火、延伸三个步骤的循环，才能富集目的片段。本发明使用快速PCR扩增程序，将退火和延伸步骤合二为一，三步法程序改为两步法程序，并减少每一步骤的反应时间。退火温度是影响PCR反应特异性的重要因素。一定温度范围内，退火温度越高，扩增特异性越高。退火温度越低，扩增特异性也就降低。虽然降低退火温度可能增加扩增产量，但引物与模板间的错配现象也会增多，导致非特异性扩增上升。相反，提高退火温度虽然可以提高反应的特异性，但会引起扩增效率下降，甚至无扩增产物出现。本发明通过优化扩增时间和退火温度，具体扩增程序如下表5所示：
表5-优化后的PCR扩增程序
实施例4：结果分析
依据毛细管电泳的检测原理，不同食品致病菌的PCR扩增子的片段长度存在差异，所以，毛细管电泳过程中相同荧光通道可获得不同大小的检测片段，而不同荧光通道则允许相近或相同大小的检测片段。不同食品致病菌的PCR扩增子的片段见表6。
表6-不同食品致病菌检测靶点电泳大小
实施例5：牛奶样本检测
从牧场未经消杀的鲜奶中采样，作为待检牛奶样本并提取核酸，以提取的核酸为模板进行检测，具体步骤如下：
(1)样本采集与提取
采集牛奶样本，利用磁珠法或硅胶膜法对样本进行提取。
(2)PCR扩增
配置PCR反应体系，以提取的核酸为模板进行多重PCR扩增。
表7-PCR体系配制
(3)毛细管电泳
在96孔反应板中加入混匀的电泳样品，其中混合液的组分包括取甲酰胺10μL，分子量标准物1μL，PCR产物1μL。最后，将96孔反应板置于ABI遗传分析仪中跑样分析。
(4)结果分析
图3是试剂盒中阳性标准品的分型检测结果，图4是待检牛奶样本检测结果。图中可见IC峰值均高于500RFU，说明检测反应成功；沙门氏菌(Sal)和单核细胞增生李斯特氏菌(LM)峰值均高于500RFU，说明此待检牛奶样本中沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌阳性。
实施例6：灵敏度探究
本发明所述的阳性对照(23种食品致病菌靶点质粒的溶液)，每个质粒为105拷贝/mL。将阳性对照梯度稀释为1.0×105、5.0×104、5.0×103、5.0×102、5.0×101拷贝/mL，作为待检测样品。图5为本发明的检测灵敏度为：5.0×102拷贝/mL。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
Claims (10)
1.一种试剂盒，其特征在于，包括可同时检测23种食品致病菌的引物混合物，所述食品致病菌包括副溶血性弧菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157、空肠弯曲杆菌、椰毒假单胞菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、克罗诺杆菌、蜡样芽胞杆菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌、类志贺邻单胞菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、肉毒梭菌、假结核耶尔森氏菌。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述引物混合物包括：
特异性扩增副溶血性弧菌的引物对VP-F和VP-R，所述VP-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述VP-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
特异性扩增沙门氏菌的引物对Sal-F和Sal-R，所述Sal-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述Sal-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
特异性扩增单核细胞增生李斯特氏菌的引物对LM-F和LM-R，所述LM-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述LM-R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
特异性扩增志贺氏菌的引物对Shi-F和Shi-R，所述Shi-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述Shi-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
特异性扩增金黄色葡萄球菌的引物对S.a-F和S.a-R，所述S.a-F的核苷酸序列如SEQID No.9所示，所述S.a-R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；特异性扩增大肠埃希菌O157的引物对Esc-F和Esc-R，所述Esc-F的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述Esc-R的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
特异性扩增空肠弯曲杆菌的引物对Cam-F和Cam-R，所述Cam-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.13所示，所述Cam-R的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
特异性扩增椰毒假单胞菌的引物对P.c-F和P.c-R，所述P.c-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.15所示，所述P.c-R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；特异性扩增产气荚膜梭菌的引物对C.p-F和C.p-R，所述C.p-F的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，所述C.p-R的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；特异性扩增粪肠球菌的引物对E.f-F和E.f-R，所述E.f-F的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，所述E.f-R的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；
特异性扩增铜绿假单胞菌的引物对P.A-F和P.A-R，所述P.A-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.21所示，所述P.A-R的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；特异性扩增克罗诺杆菌的引物对Cro-F和Cro-R，所述Cro-F的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，所述Cro-R的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；特异性扩增蜡样芽胞杆菌的引物对B.c-F和B.c-R，所述B.c-F的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，所述B.c-R的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；特异性扩增霍乱弧菌的引物对V.c-F和V.c-R，所述V.c-F的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示，所述V.c-R的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；
特异性扩增嗜水气单胞菌的引物对A.h-F和A.h-R，所述A.h-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.29所示，所述A.h-R的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示；特异性扩增小肠结肠炎耶尔森菌的引物对Y.e-F和Y.e-R，所述Y.e-F的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示，所述Y.e-R的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示；
特异性扩增类志贺邻单胞菌的引物对PS-F和PS-R，所述PS-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.33所示，所述PS-R的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示；特异性扩增肠产毒性大肠杆菌的引物对ETEC-F和ETEC-R，所述ETEC-F的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示，所述ETEC-R的核苷酸序列如SEQ IDNo.36所示；
特异性扩增肠侵袭性大肠杆菌的引物对EIEC-F和EIEC-R，所述EIEC-F的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示，所述EIEC-R的核苷酸序列如SEQ IDNo.38所示；
特异性扩增创伤弧菌的引物对V.v-F和V.v-R，所述V.v-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.39所示，所述V.v-R的核苷酸序列如SEQ ID No.40所示；
特异性扩增溶藻弧菌的引物对V.a-F和V.a-R，所述V.a-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.41所示，所述V.a-R的核苷酸序列如SEQ ID No.42所示；
特异性扩增肉毒梭菌的引物对C.b-F和C.b-R，所述C.b-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.43所示，所述C.b-R的核苷酸序列如SEQ ID No.44所示；
特异性扩增假结核耶尔森氏菌的引物对Y.p-F和Y.p-R，所述Y.p-F的核苷酸序列如SEQID No.45所示，所述Y.p-R的核苷酸序列如SEQ ID No.46所示。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述VP-F和所述VP-R引物对的终浓度为0.12μM；所述Sal-F和所述Sal-R引物对的终浓度为0.10μM；所述LM-F和所述LM-R引物对的终浓度为0.15μM；所述Shi-F和所述Shi-R引物对的终浓度为0.12μM；所述S.a-F和所述S.a-R引物对的终浓度为0.18μM；所述Shi-F和所述Shi-R引物对的终浓度为0.12μM；所述Esc-F和所述Esc-R引物对的终浓度为0.11μM；所述Cam-F和所述Cam-R引物对的终浓度为0.15μM；所述P.c-F和所述P.c-R引物对的终浓度为0.17μM；所述C.p-F和C.p-R引物对的终浓度为0.18μM；所述E.f-F和所述E.f-R引物对的终浓度为0.19μM；所述P.A-F和所述P.A-R引物对的终浓度为0.15μM；所述Cro-F和所述Cro-R引物对的终浓度为0.12μM；所述B.c-F和所述B.c-R引物对的终浓度为0.20μM；所述V.c-F和所述V.c-R引物对的终浓度为0.12μM；所述A.h-F和所述A.h-R引物对的终浓度为0.13μM；所述Y.e-F和所述Y.e-R引物对的终浓度为0.12μM；所述PS-F和所述PS-R引物对的终浓度为0.14μM；所述ETEC-F和所述ETEC-R引物对的终浓度为0.12μM；所述EIEC-F和所述EIEC-R引物对的终浓度为0.12μM；所述V.v-F和V.v-R引物对的终浓度为0.13μM；所述V.a-F和所述V.a-R引物对的终浓度为0.12μM；所述C.b-F和所述C.b-R引物对的终浓度为0.12μM；所述Y.p-F和所述Y.p-R引物对的终浓度为0.11μM。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，每对引物对中至少有一条引物的末端标记有荧光染料，所述荧光染料选自FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ、Alexa 488、R-PH、SIZ、SF488或SF555。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述引物混合物中核苷酸序列如SEQ IDNo.1至SEQ ID No.26所示的引物设为第一组群，核苷酸序列如SEQ ID No.27至SEQ IDNo.46所示的引物设为第二组群，所述第一组群的所述荧光染料选自SF 488，所述第二组群的所述荧光染料选自SF 555。
6.根据权利要求2至5任一项所述试剂盒，其特征在于，所述引物混合物还包括内参引物对IC-F和IC-R，所述IC-F的核苷酸序列如SEQ ID No.47所示，所述IC-R的核苷酸序列如SEQ ID No.48所示。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括增强型PCR反应液，所述增强型PCR反应液组分如下：J型-DNA-Taq酶，浓度为0.5U/μL；pH 8.3的Tris-HCl，浓度为60mM；硫酸钾，浓度为120mM；硫酸镁，浓度为6mM；dNTPs，浓度为0.2mM；蔗糖，浓度为50mM；甘油，浓度为6％；T4 gene 32蛋白，浓度为0.5μg/μL。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括分子量标准物，所述分子量标准物由14个DNA片段组成，各所述DNA片段的分子量分别是60bp、70bp、80bp、100bp、120bp、140bp、160bp、180bp、200bp、220bp、240bp、260bp、280bp、300bp，均标记有SF 590荧光染料。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照品和阳性对照品，所述阴性对照品为TE缓冲液，所述阳性对照品为所述食品致病菌的检测基因片段的混合物。
10.权利要求1至9任一项所述试剂盒在食品安全检测中的应用。
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