CN108220464A - 一种16种食源性致病菌检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种16种食源性致病菌检测试剂盒，包括PCR扩增试剂和对照试剂，所述的PCR扩增试剂由PCR反应缓冲液A、酶系B和16种食源性致病菌的引物探针混合液构成，所述的对照试剂主要由阴性对照和阳性对照组成，所述的PCR反应缓冲液A的成分为5*Buffer，25mM dN(U)TPs，所述的酶系B主要由HotStart Hi Taq DNA聚合酶、UNG防污染酶构成，所述的16种食源性致病菌检测引物探针包含含沙门氏菌、志贺氏菌、肠致病性大肠杆菌、产毒素大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、黏附性大肠杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、小肠结肠炎耶尔森菌和阪崎肠杆菌检测引物探针混合液。本发明具有检测灵敏度高、简便快捷等优点。

Description

一种16种食源性致病菌检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术和致病菌检测领域，具体来说是一种16种食源性致病菌检测试剂盒。
背景技术
民以食为天，食以安为先。但近年来，食品安全件事频发，对人们的健康构成了较大的威胁。食品微生物污染问题日渐突出，已成为全球范围内重要的公共卫生问题。根据美国农业部经济研究局的统计结果显示,沙门氏菌、致病性大肠杆菌(EPEC、ETEC、EIEC、EAEC、EHEC)、弯曲杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌及毒素、致病性蜡样芽胞杆菌、变形杆菌属、李斯特菌、志贺氏菌等几类重要的细菌会造成巨大的经济损失。
沙门氏菌(Salmonella)为肠杆菌科中重要的一类革兰氏阴性菌，极易污染食品、水源及畜产品，是畜禽肉胴体、畜禽产品污染的重要来源，并可通过各种途经传染给人，引起人食物中毒、急性肠胃炎和动物腹泻等疾病。我国细菌性食物中毒70％～80％是由沙门氏菌引起。
志贺氏菌(Shigella spp.)通称痢疾杆菌，是一类具有高度传染性的肠道致病菌。主要通过消化道途径传播，侵袭肠上皮细胞，引起以发热、腹痛、腹泻为特征的典型的痢疾症状，严重危害人类健康。根据WHO统计，每年有1.647亿人感染痢疾，约有110万死亡，其中多数为5岁以下的儿童。在成年患者中，10～100CFU志贺氏菌就可通过感染肠道致病，引发严重的炎症反应。在我国感染性腹泻病原菌中高居首位经常有由于水源或食品受到志贺菌污染而引起痢疾、腹泻等疾病流行的报道。
引起腹泻的大肠杆菌称为致泻性大肠杆菌，根据毒力因子、致病机理和流行病学特征，通常将致泻性大肠杆菌分为5类，分别为肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)以及肠出血性大肠杆菌(EHEC)。肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)的多数菌株无动力，生化反应和抗原结构均近似痢疾杆菌，应予注意。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为革兰氏阳性菌，是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一。其产生的金黄色葡萄球菌肠毒素在食物中毒事件中占50％，居于整个细菌性食物中毒首位。金黄色葡萄球菌肠毒素按照血清型可以分为14型(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O)。爆发性食物中毒最常见的血清型为A型和D型。
单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)单增李斯特菌为革兰阳性短小杆菌，无芽孢，不分支，形状规则。主要以食物为传染媒介，是重要的食源性人兽共患病原菌，WHO将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一。该菌在自然界中分布广泛，极易污染食品而引起食物中毒和李氏杆菌病的暴发。
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus，B.ce)芽孢杆菌科芽孢杆菌属，革兰染色阳性粗大杆菌。其芽孢能耐高温，至少需100℃20min以上才能杀死，是最常见的食源性病原菌之一。致病性菌株能产生呕吐毒素和肠毒素，引起呕吐型和腹泻型两种不同类型的食物中毒。呕吐型食物中毒是由于蜡样芽孢菌产生呕吐毒素引起的，是我国蜡样芽孢菌食物中毒的主要类型(约占76％)。蜡状芽孢杆菌是条件致病菌，能导致人的眼部感染，严重感染时可致心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病。根据我国食品污染物和食源性疾病监测网络在2003年的统计，蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒占所有食物中毒事件的4％，为细菌性食物中毒的第四位，在1993～2003十年之间，蜡样芽孢杆菌引起的中毒者高达人1758人。因此，建立有效的蜡样芽孢杆菌检测方法，对于预防和鉴别因误食该菌污染食物导致的中毒事件具有重要意义。
空肠弯曲茵是一种人畜共患病原茵，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种食源性病原茵，被认为是引起人类细菌性腹泻的主要原因。空肠弯曲菌分布广泛，多种动物身上都分离到该菌，尤其是广泛存在于家禽类动物的肠道中，鸡的带菌率占首位，其次为猪。人类感染主要是由被空肠弯曲菌污染的食品、引用水以及环境引起的，美国疾病预防控制中心公布的美国食源性病原微生物导致疾病人数的统计数据表明空肠弯曲菌所导致的发病人数居第二位。空肠弯曲菌感染的典型症状主要表现为发热、明显腹痛、里急后重，腹泻多为脓血便或粘液稀便，便中带有大量红、白细胞，病程较长易发展成慢性，且多数需要治疗。
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰阴性嗜盐性弧菌，是弧菌属内比较重要的致病菌之一，人类食用生的或未煮熟的被该菌污染的海产品后会引起急性肠胃炎，临床症状为腹泻，且伴随着腹部痉挛、恶心、呕吐、低烧和发冷。为确保食品安全，欧盟、美国等发达国家对水产品中的副溶血性弧菌做出了明确的规定，欧盟规定副溶血性弧菌不得检出，而美国规定小于l×104CFU/g。我国国家食源性疾病监测网数据显示沿海省份副溶血性弧菌引起食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已经高居微生物食物中毒首位。目前，我国已将该菌列为主要的检验或监测对象，是多数进出口水产品必检的致病菌之一。
霍乱弧菌(Vibrio Cholerae)是革兰氏阴性菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，是引起烈性肠道传染病霍乱的主要病原菌，患者的临床症状常表现为大量米汤状排泄，造成迅速脱水。如不及时治疗，可导致低血容量休克、酸中毒，甚至致人死亡，威胁公众生命安全。鉴于霍乱流行的危害性较大，使霍乱弧菌的检测尤为重要。
小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica，YE)肠杆菌科，耶尔森菌属，革兰氏染色阴性，需氧或兼性厌氧。小肠结肠炎耶尔森菌所致疾病在世界上广泛分布，多集中在寒冷地区，在我国东北地区小肠结肠炎耶尔森菌各血清型的分布亦较广泛。可感染人类以及多种动物，包括家畜、兽类、禽类、鸟类和昆虫，并通过排泄物和污染的水、食品传播。小肠结肠炎耶尔森菌除引起腹泻外，还能引起严重的呼吸道、心血管、骨髓、结缔组织和全身疾病，出现败血症时死亡率达到30％以上。
阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii)属肠杆菌科肠杆菌属，革兰染色阴性杆菌。阪崎肠杆菌在自然界分布广泛，繁殖迅速，不耐热，可通过巴斯德消毒法杀灭。阪崎肠杆菌属条件致病菌，在一般情况下，不对人体健康产生危害，但对于免疫力低下者和婴幼儿、新生儿，尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感染来源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉，人与人之间无传染性。
食源性致病微生物是引起食物中毒的重要生物学因素，随着国家对食品安全工作的重视，快速筛查食物中毒原因成为当务之急。常规检测采用传统培养方法，每个致病菌需应用独立的检测方法单独进行检测，工作量大；使用荧光定量单个检测方法逐个操作，配置反应体系数目多，要消耗大量的试剂、人力、物力和时间；免疫胶体金方法检测灵敏度和特异性较低；ELISA方法操作过程复杂，检测手段不够灵活，很难应对应急处置等场景的快速筛查。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的检测手段不够灵活、操作不便的缺陷，而提供一种16种食源性致病菌检测试剂盒。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种16种食源性致病菌检测试剂盒，包括PCR扩增试剂和对照试剂，所述的PCR扩增试剂由PCR反应缓冲液A、酶系B和16种食源性致病菌的引物探针混合液构成，所述的对照试剂主要由阴性对照和阳性对照组成。
作为优选，所述的PCR反应缓冲液A的成分为5*Buffer，25mM dN(U)TPs，所述的酶系B主要由HotStart Hi Taq DNA聚合酶、UNG防污染酶构成，所述的16种食源性致病菌检测引物探针包含含沙门氏菌、志贺氏菌、肠致病性大肠杆菌、产毒素大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、黏附性大肠杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、小肠结肠炎耶尔森菌和阪崎肠杆菌检测引物探针混合液。
作为优选，所述的5*Buffer的组分为50mM Tris-HCl、75mM KCl、12.5mM MgCl2，所述的dN(U)TPs的组分中dATP：dCTP：dGTP：dUTP＝1:1:1:2，
作为优选，所述的16种食源性致病菌的探针和引物的具体序列和序号如下：
沙门氏菌invA基因上游引物F：CGAGCAGTAATGGTATCTGC SEQ ID NO.1；
沙门氏菌invA基因下游引物R：GGAGGCTTCCGGGTCAAG SEQ ID NO.2；
沙门氏菌invA基因探针P：5’-荧光报告基团-CGCAAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCA-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.3；
志贺氏菌ipaH基因上游引物F：GCTCTCCACTGCCGTGAAGG SEQ ID NO.4；
志贺氏菌ipaH基因下游引物R：TCATTCTCTTCACGGCTTCTGA SEQ ID NO.5；
志贺氏菌ipaH基因探针P：5’-荧光报告基团-CGTGTCGGGAGTGACAGCAAATG-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.6；
EPEC eae基因上游引物F：ATGTTGCTTTGTTTAATTCCGA SEQ ID NO.7；
EPEC eae基因下游引物R：TAATCAAYCCCCATCGTCACC SEQ ID NO.8；
EPEC eae基因探针P：5’-荧光报告基团-CACCAACGGTCGCCGCRC-荧光淬基团-3’SEQID NO.9；
ETEC elt基因上游引物F：ATTTAAGAGCGGCGMAACA SEQ ID NO.10；
ETEC elt基因下游引物R：GTCCTTCATCCTTTCAATGGC SEQ ID NO.11；
ETEC elt基因探针P：5’-荧光报告基团-ACTGCCCGGGACTTCGACCTGA-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.12；
ETEC est基因上游引物F：AGTAGCAATTACTGCTGTGAATTG SEQ ID NO.13；
ETEC est基因下游引物R：ACGTTACAGACATCATCAGAATC SEQ ID NO.14；
ETEC est基因探针P：5’-荧光报告基团-TTGTAATCCTGCTTGTACCGGGTGCT-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.15；
EIEC ipaH基因上游引物F：ACTCTCCATTTTGTGGATGAGATA SEQ ID NO.16；
EIEC ipaH基因下游引物R：TTCCTTCACGGCAGTGGAG SEQ ID NO.17；
EIEC ipaH基因探针P：5’-荧光报告基团-TACCTGGCCTTCCAGACCATGCT-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.18；
EAEC aggR基因上游引物F CTAAAGGATGCCCTGATGATAAT SEQ ID NO.19；
EAEC aggR基因下游引物R：ATACAGAATCGTCAGCATCAGC SEQ ID NO.20；
EAEC aggR基因探针P：5’-荧光报告基团-CCAATTCGGACAACTGCAAGC-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.21；
O157rfbE基因上游引物F：CCAACACTGACATATATAGCATCA SEQ ID NO.22；
O157rfbE基因下游引物R：CAGACATTTGCCAAGTTTCATT SEQ ID NO.23；
O157rfbE基因探针P：5’-荧光报告基团-CACAGGAGCCACCCCCATTTTCG-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.24；
金黄色葡萄球菌nuc基因上游引物F：GAAGTCGAGTTTGACAAAGG SEQ ID NO.25；
金黄色葡萄球菌nuc基因下游引物R：ACTTTAGCCAAGCCTTGACG SEQ ID NO.26；
金黄色葡萄球菌nuc基因探针P：5’-荧光报告基团-CCATCAGCATAAATATACGCTAAGC-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.27；
单增李斯特菌hlyO基因上游引物F：ATGCTAGCACTACAAGAATTTCT SEQ ID NO.28；
单增李斯特菌hlyO基因下游引物R：TAACGCCATTGTCTTGCGCG SEQ ID NO.29；
单增李斯特菌hlyO基因探针P：5’-荧光报告基团-CGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACGT-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.30；
蜡样芽孢菌16S rRNA上游引物F：AACATTTTGAACCGCATGGT SEQ ID NO.31；
蜡样芽孢菌16S rRNA下游引物R：CACCAACTAGCTAATGCGAC SEQ ID NO.32；
蜡样芽孢菌16S rRNA探针P：5’-荧光报告基团-CCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCC-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.33；
空肠弯曲菌hipO基因上游引物F：CAATATGCCTTTTGGTAGCGA SEQ ID NO.34；
空肠弯曲菌hipO基因下游引物R：CACTTCCATGACTACCTCTTCC SEQ ID NO.35；
空肠弯曲菌hipO基因探针P：5’-荧光报告基团-CCGAAGAAGCCATCATCGCACC-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.36；
副溶血弧菌tlh基因上游引物F：CATGTACACCCACGCATTGC SEQ ID NO.37；
副溶血弧菌tlh基因下游引物R：CTCTGCAACATAGCGGTGAGT SEQ ID NO.38；
副溶血弧菌tlh基因探针P：5’-荧光报告基团-CTCAGCACCAGACGCCGCACACT-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.39；
霍乱弧菌O1群上游引物F：CAGTTTTTCTTCACATGCTGTCA SEQ ID NO.40；
霍乱弧菌O1群下游引物R：GGAAGAAGTGATGAAGGCGAT SEQ ID NO.41；
霍乱弧菌O1群探针P：5’-荧光报告基团-CTAGTGCCTTCCACATTCTCTCCG-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.42；
霍乱弧菌O139群上游引物F：CGATGGCGTGTTCATTAGAAGG SEQ ID NO.43；
霍乱弧菌O139群下游引物R：CACTTTCCCTTTCCACCTCG SEQ ID NO.44；
霍乱弧菌O139群探针P：5’-荧光报告基团-CGGCAAACTGGCAGCAAACTCAGCA-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.45；
小肠结肠炎耶尔森菌ail基因上游引物F：ACAGTTTCAGGGCAGTTCAGT SEQ IDNO.46；
小肠结肠炎耶尔森菌ail基因下游引物R：AATCACTACTGACTTCGGCTGG SEQ IDNO.47；
小肠结肠炎耶尔森菌ail基因探针P：5’-荧光报告基团-CCAATAACCGCTGAGGTATACAAGCAAGC-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.48；
阪崎肠杆菌alpha-1,6-glucosidase上游引物F：GATCTCAACTGGGAAAACCCG SEQ IDNO.49；
阪崎肠杆菌alpha-1,6-glucosidase下游引物R：CGATAACGTCCATGCGGAAASEQ IDNO.50；
阪崎肠杆菌alpha-1,6-glucosidase探针P：5’-荧光报告基团-AGATCCACGCGATGATGAACCGCT-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.51。
作为优选，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、CY3、CY5荧光报告基团，所述的淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA荧光淬灭基团。
一种采用上述16种食源性致病菌检测试剂盒对16种食源性致病菌进行检测的检测方法，具体步骤如下：
(1)、样本核酸提取：
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取样本核酸；
(2)、加样：
用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样本、阴性对照、阳性对照上清各5μl分别加到装有PCR反应混合液的8联排管中，盖上管盖，离心数秒后移至扩增检测区；
(3)、扩增：
将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。
作为优选，所述的步骤(1)中，采用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit(货号：51304)或天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒。
作为优选，所述的步骤(2)中，各联排管在96孔PCR仪上检测布局如下：
作为优选，所述的步骤(3)中，循环参数设定如下：(AB：ABI 7500FAST，Anlong：ProEco48，SLAN-96)：
相对于现有技术，具有以下优点：
1、快速便捷、无污染，试剂盒采用试剂预分装技术，将每种病原体检测的PCR反应MIX预分装于8联排或微流体反应孔中，扩增时仅需加入核酸模板，扩增结束后根据相应孔内有无荧光信号判断是否有相应细菌感染，同时采用UNG防污染酶技术，杜绝PCR气溶胶污染；
2、准确性好、灵敏度高，采用taqman探针法荧光定量PCR检测，所有致病菌均根据其特异性基因设计引物探针，保证检测结果的可靠性，化学热启动DNA聚合酶具有低温抑制，耐高温扩增能力，检测灵敏度高，最低检测限为103CFU/mL；
3、通量大，一次扩增可筛选16种常见的食品致病菌，检测通量大；
4、采用试剂预分装方法将16种食源性致病菌检测引物探针混合液预分装于两个8联排反应管和(或)16孔道蝶式扩增盘和(或)16孔道微流体扩增管中，用于对样本中的食源性致病菌进行定性检测，检测结果可自动化分析，简便快捷。
附图说明
图1为16种食源性致病菌检测试剂盒检测沙门氏菌灵敏度结果
图2为16种食源性致病菌检测试剂盒检测志贺氏菌灵敏度结果
图3为16种食源性致病菌检测试剂盒检测EPEC灵敏度结果
图4为16种食源性致病菌检测试剂盒检测ETEC灵敏度结果
图5为16种食源性致病菌检测试剂盒检测EIEC灵敏度结果
图6为16种食源性致病菌检测试剂盒检测EAEC灵敏度结果
图7为16种食源性致病菌检测试剂盒检测O157灵敏度结果
图8为16种食源性致病菌检测试剂盒检测金黄色葡萄球菌灵敏度结果
图9为16种食源性致病菌检测试剂盒检测单增李斯特菌灵敏度结果
图10为16种食源性致病菌检测试剂盒检测蜡样芽孢菌灵敏度结果
图11为16种食源性致病菌检测试剂盒检测空肠弯曲菌灵敏度结果
图12为16种食源性致病菌检测试剂盒检测副溶血弧菌灵敏度结果
图13为16种食源性致病菌检测试剂盒检测霍乱弧菌O1群灵敏度结果
图14为16种食源性致病菌检测试剂盒检测霍乱弧菌O139群灵敏度结果
图15为16种食源性致病菌检测试剂盒检测小肠结肠炎耶尔森菌灵敏度结果
图16为16种食源性致病菌检测试剂盒检测阪崎肠杆菌灵敏度结果
图17为临床沙门氏菌阳性样本检测结果
图18为临床金黄色葡萄球菌阳性样本检测结果
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
实施例1扩增体系优化，以沙门氏菌为例
一、引物浓度优化
PCR体系中，引物浓度过高可能会引发错配，导致非特异扩增，而浓度过低时，会影响PCR产物的生成，因此有必要对引物浓度进行优化。在实验中，我们设置了3个不同引物浓度，用质粒菌(1×105CFU/ml和1×103CFU/ml)及阴性对照作为检测样本，模板用量为5μl，每个反应体系终体积均为25μl，检测不同浓度的扩增差异。当引物浓度低时，扩增效率稍差，而且荧光响应强度也较低。当invA基因引物(10μmol/L)用量为0.5μL以上时，其扩增效率无显著差异。综合考虑，选用200n mol/L作为引物终浓度。
表2-1SS基因引物浓度的确定
二、探针浓度优化
荧光探针是整个定量PCR体系的核心，直接影响着荧光PCR检测结果的好坏。在实验中共设置了三个浓度进行比较。用invAlid质粒菌(1×105CFU/ml和1×103CFU/ml)及阴性对照作为检测样本，模板用量为5μl，每个反应体系终体积均为25μl。实验结果见下表3-1，不同的探针浓度对Ct值和荧光高度有影响，当invA基因荧光探针(10μmol/L)用量为0.25μL时整体能达到理想的试验效果。
表2-2EV71探针的浓度对荧光PCR检测的影响
三、热启动Taq酶用量的优化
热启动Taq酶是PCR反应中的重要成份，其用量多少直接影响到PCR的扩增效率，因此本次实验配制了4种不同热启动Taq酶用量的PCR反应液，热启动Taq酶用量分别是1.5U/人份，2.0U/人份，2.5U/人份，3.0U/人份；用invA基因质粒菌(1×105CFU/ml和1×103CFU/ml)和阴性对照作为检测样本，模板用量为5μl,每个反应体系终体积均为25μl。实验结果表明，适当增加热启动Taq酶的用量有利于PCR扩增检测，每个体系中加入1.5U/人份体系热启动Taq酶就能达到较为理想的扩增效果，见表2-3。
表2-3热启动Taq酶用量对SS扩增效率的影响
实施例2食源性致病菌检测操作规范
一、在样本处理区进行样本准备
1.1食物标本：选取可疑食物1g，置于装有1ml生理盐水的离心管中，颠倒混匀3次，静置2min，将上清转移至另一离心管中，12,000rpm离心2分钟。去上清，沉淀用于样本核酸提取。
1.2食品培养标本：食物样本在肉汤培养基中增菌6h，取增菌液1ml，12,000rpm离心2分钟，弃上清，沉淀用于样本核酸提取。
1.3粪便标本：挑取约0.2g粪便(尽可能取黏液脓血部分)置于装有0.5ml生理盐水的离心管中，震荡混匀，12,000rpm离心2分钟。去上清，沉淀用于样本核酸提取。
1.4核酸提取：本试剂盒不含提取试剂，推荐使用QIAGEN公司的QIAamp DNA MiniKit(货号：51304)或天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(货号：DP302)，阳性对照与阴性对照与待测样本同步进行处理。具体提取步骤请参照相应提取试剂盒说明书。二、试剂准备
2.1根据待检DNA样品数量(n)，取出相应数目(n+2)的PCR 8联排管试剂及阴阳性对照试剂，于室温融化后简短离心；
2.2将上述8联排反应管移至样本处理区。
三、在样本处理区进行加样
用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样本、阴性对照、阳性对照上清各5μl分别加到装有PCR反应液的PCR反应管中，盖上管盖，离心数秒后移至扩增检测区；
四、在扩增检测区进行PCR扩增检测
4.1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测；
4.2循环参数设定：(ABI 7500，SLAN96P)：
五、质控标准
5.1阴性对照：结果为阴性；
5.2阳性对照：结果为阳性，阳性对照Ct值≤38；
5.3以上两项需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，实验应重新进行。
以上显示和描述了发明的基本原理、主要特征和发明的优点。本行业的技术人员应该了解，发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是发明的原理，在不脱离发明精神和范围的前提下发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的发明的范围内。发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<120> 一种16种食源性致病菌检测试剂盒
<141> 2018-04-08
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 93
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
nvnvnvaaaa aatttststs taaaaggagg aggrbrbrbn cncnchyhyh yrrrhhhtht 60
hthaaaahag csdasahagc sdasahagcs das 93

Claims (9)

1.一种16种食源性致病菌检测试剂盒，包括PCR扩增试剂和对照试剂，其特征在于：所述的PCR扩增试剂由PCR反应缓冲液A、酶系B和16种食源性致病菌的引物探针混合液构成，所述的对照试剂主要由阴性对照和阳性对照组成。
2.根据权利要求1所述的一种16种食源性致病菌检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR反应缓冲液A的成分为5*Buffer，25mM dN(U)TPs，所述的酶系B主要由HotStart Hi TaqDNA聚合酶、UNG防污染酶构成，所述的16种食源性致病菌检测引物探针包含含沙门氏菌、志贺氏菌、肠致病性大肠杆菌、产毒素大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、黏附性大肠杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、小肠结肠炎耶尔森菌和阪崎肠杆菌检测引物探针混合液。
3.根据权利要求1所述的一种16种食源性致病菌检测试剂盒，其特征在于：所述的5*Buffer的组分为50mM Tris-HCl、75mM KCl、12.5mM MgCl2，所述的dN(U)TPs的组分中dATP：dCTP：dGTP：dUTP＝1:1:1:2。
4.根据权利要求1所述的一种16种食源性致病菌检测试剂盒，其特征在于：所述的16种食源性致病菌的探针和引物的具体序列和序号如下：
沙门氏菌invA基因上游引物F：CGAGCAGTAATGGTATCTGC SEQ ID NO.1；
沙门氏菌invA基因下游引物R：GGAGGCTTCCGGGTCAAG SEQ ID NO.2；
沙门氏菌invA基因探针P：5’-荧光报告基团-CGCAAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCA-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.3；
志贺氏菌ipaH基因上游引物F：GCTCTCCACTGCCGTGAAGG SEQ ID NO.4；
志贺氏菌ipaH基因下游引物R：TCATTCTCTTCACGGCTTCTGA SEQ ID NO.5；
志贺氏菌ipaH基因探针P：5’-荧光报告基团-CGTGTCGGGAGTGACAGCAAATG-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.6；
EPEC eae基因上游引物F：ATGTTGCTTTGTTTAATTCCGA SEQ ID NO.7；
EPEC eae基因下游引物R：TAATCAAYCCCCATCGTCACC SEQ ID NO.8；
EPEC eae基因探针P：5’-荧光报告基团-CACCAACGGTCGCCGCRC-荧光淬基团-3’SEQ IDNO.9；
ETEC elt基因上游引物F：ATTTAAGAGCGGCGMAACA SEQ ID NO.10；
ETEC elt基因下游引物R：GTCCTTCATCCTTTCAATGGC SEQ ID NO.11；
ETEC elt基因探针P：5’-荧光报告基团-ACTGCCCGGGACTTCGACCTGA-荧光淬基团-3’SEQID NO.12；
ETEC est基因上游引物F：AGTAGCAATTACTGCTGTGAATTG SEQ ID NO.13；
ETEC est基因下游引物R：ACGTTACAGACATCATCAGAATC SEQ ID NO.14；
ETEC est基因探针P：5’-荧光报告基团-TTGTAATCCTGCTTGTACCGGGTGCT-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.15；
EIEC ipaH基因上游引物F：ACTCTCCATTTTGTGGATGAGATA SEQ ID NO.16；
EIEC ipaH基因下游引物R：TTCCTTCACGGCAGTGGAG SEQ ID NO.17；
EIEC ipaH基因探针P：5’-荧光报告基团-TACCTGGCCTTCCAGACCATGCT-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.18；
EAEC aggR基因上游引物F CTAAAGGATGCCCTGATGATAAT SEQ ID NO.19；
EAEC aggR基因下游引物R：ATACAGAATCGTCAGCATCAGC SEQ ID NO.20；
EAEC aggR基因探针P：5’-荧光报告基团-CCAATTCGGACAACTGCAAGC-荧光淬基团-3’SEQID NO.21；
O157rfbE基因上游引物F：CCAACACTGACATATATAGCATCA SEQ ID NO.22；
O157rfbE基因下游引物R：CAGACATTTGCCAAGTTTCATT SEQ ID NO.23；
O157rfbE基因探针P：5’-荧光报告基团-CACAGGAGCCACCCCCATTTTCG-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.24；
金黄色葡萄球菌nuc基因上游引物F：GAAGTCGAGTTTGACAAAGG SEQ ID NO.25；
金黄色葡萄球菌nuc基因下游引物R：ACTTTAGCCAAGCCTTGACG SEQ ID NO.26；
金黄色葡萄球菌nuc基因探针P：5’-荧光报告基团-CCATCAGCATAAATATACGCTAAGC-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.27；
单增李斯特菌hlyO基因上游引物F：ATGCTAGCACTACAAGAATTTCT SEQ ID NO.28；
单增李斯特菌hlyO基因下游引物R：TAACGCCATTGTCTTGCGCG SEQ ID NO.29；
单增李斯特菌hlyO基因探针P：5’-荧光报告基团-CGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACGT-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.30；
蜡样芽孢菌16S rRNA上游引物F：AACATTTTGAACCGCATGGT SEQ ID NO.31；
蜡样芽孢菌16S rRNA下游引物R：CACCAACTAGCTAATGCGAC SEQ ID NO.32；
蜡样芽孢菌16S rRNA探针P：5’-荧光报告基团-CCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCC-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.33；
空肠弯曲菌hipO基因上游引物F：CAATATGCCTTTTGGTAGCGA SEQ ID NO.34；
空肠弯曲菌hipO基因下游引物R：CACTTCCATGACTACCTCTTCC SEQ ID NO.35；
空肠弯曲菌hipO基因探针P：5’-荧光报告基团-CCGAAGAAGCCATCATCGCACC-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.36；
副溶血弧菌tlh基因上游引物F：CATGTACACCCACGCATTGC SEQ ID NO.37；
副溶血弧菌tlh基因下游引物R：CTCTGCAACATAGCGGTGAGT SEQ ID NO.38；
副溶血弧菌tlh基因探针P：5’-荧光报告基团-CTCAGCACCAGACGCCGCACACT-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.39；
霍乱弧菌O1群上游引物F：CAGTTTTTCTTCACATGCTGTCA SEQ ID NO.40；
霍乱弧菌O1群下游引物R：GGAAGAAGTGATGAAGGCGAT SEQ ID NO.41；
霍乱弧菌O1群探针P：5’-荧光报告基团-CTAGTGCCTTCCACATTCTCTCCG-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.42；
霍乱弧菌O139群上游引物F：CGATGGCGTGTTCATTAGAAGG SEQ ID NO.43；
霍乱弧菌O139群下游引物R：CACTTTCCCTTTCCACCTCG SEQ ID NO.44；
霍乱弧菌O139群探针P：5’-荧光报告基团-CGGCAAACTGGCAGCAAACTCAGCA-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.45；
小肠结肠炎耶尔森菌ail基因上游引物F：ACAGTTTCAGGGCAGTTCAGT SEQ ID NO.46；
小肠结肠炎耶尔森菌ail基因下游引物R：AATCACTACTGACTTCGGCTGG SEQ ID NO.47；
小肠结肠炎耶尔森菌ail基因探针P：5’-荧光报告基团-CCAATAACCGCTGAGGTATACAAGCAAGC-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.48；
阪崎肠杆菌alpha-1,6-glucosidase上游引物F：GATCTCAACTGGGAAAACCCG SEQ IDNO.49；
阪崎肠杆菌alpha-1,6-glucosidase下游引物R：CGATAACGTCCATGCGGAAA SEQ IDNO.50；
阪崎肠杆菌alpha-1,6-glucosidase探针P：5’-荧光报告基团-AGATCCACGCGATGATGAACCGCT-荧光淬基团-3’SEQ ID NO.51。
5.根据权利要求1所述的一种16种食源性致病菌检测试剂盒，其特征在于：所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、CY3、CY5荧光报告基团，所述的淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA荧光淬灭基团。
6.一种采用权利要求1-5任一所述的16种食源性致病菌检测试剂盒对16种食源性致病菌进行检测的检测方法，具体步骤如下：
(1)、样本核酸提取：
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取样本核酸；
(2)、加样：
用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样本、阴性对照、阳性对照上清各5μl分别加到装有PCR反应混合液的8联排管中，盖上管盖，离心数秒后移至扩增检测区；
(3)、扩增：
将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述的步骤(1)中，采用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit(货号：51304)或天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述的步骤(2)中，各联排管在96孔PCR仪上检测布局如下：
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述的步骤(3)中，循环参数设定如下：(AB：ABI 7500FAST，Anlong：Pro Eco48，SLAN-96)：
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