CN104531898A - 一种多重pcr肠道致病菌检测引物组、试剂盒 - Google Patents

一种多重pcr肠道致病菌检测引物组、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多重PCR肠道致病菌检测引物组、试剂盒，属于涉及PCR应用技术领域。更具体是涉及14种肠道致病菌检测，包括：霍乱弧菌（O1群、O139群、非O1/O139群）、单核增生李斯特菌、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠聚集性大肠杆菌（EAEC）、志贺菌、肠道病毒EV71、肠出血性大肠杆菌O157：H7、艰难梭菌、副溶血性弧菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌。改变一次性只能检测较少肠道致病菌的局面，同时检测14种肠道致病菌共26个基因。

Description

一种多重PCR肠道致病菌检测引物组、试剂盒
技术领域
本发明涉及一种多重PCR肠道致病菌检测引物组、试剂盒，属于涉及PCR应用技术领域。更具体是涉及14种肠道致病菌检测，包括：霍乱弧菌(O1群、O139群、非O1/O139群)、单核增生李斯特菌、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、志贺菌、肠道病毒EV71、肠出血性大肠杆菌O157：H7、艰难梭菌、副溶血性弧菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌。
背景技术
肠道致病菌引起的传染病是危害公共卫生安全的主要因素。多数国家都采取了相应的措施检测肠道致病菌和控制疫情的传播。肠道致病菌主要包括单核增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、产气荚膜梭菌、变形杆菌、布鲁氏菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7、耶尔森氏菌和霍乱弧菌等。
国际公认的李斯特菌有10种，其中与人的李斯菌症相关的通常只有单核增生李斯特氏菌。据报道，有1-10％的人类肠道中存在单核增生李斯特氏菌，该菌造成的脑膜炎的致死率可高达70％，败血症的死亡率达50％，围产期或新生儿感染的死亡率超过80％。李斯特菌溶血素(GGH)是产单核细胞李斯特菌的主要毒力因子，由hlyA基因编码。
肠病毒71型(EV71)是肠病毒的一种，多见于东南亚地区的夏季期间，主要病征是手足口病的一系列征状上包括发烧、食欲不振、喉咙痛及口腔溃疡等。也可能导致神经感染。目前在我国有逐渐增加的倾向。EV71病毒结构蛋白由VP1基因编码，通过鉴定VP1的有无判断是感染肠病毒71型。
志贺菌属的细菌，通称痢疾杆菌，是人类细菌性痢疾的病原菌，以病人和带菌者为传染源，无动物宿主。其致病物质主要是侵袭力和内毒素,有的菌株尚产生外毒素。
霍乱弧菌是霍乱的病原体，根据血清型的不同可以分为O1群、O139群、非O1/O139群。O1群、O139群霍乱弧菌产生的霍乱肠毒素(也称霍乱毒素)是产生霍乱的主要原因，也只有O1群和O1群霍乱弧菌可引起霍乱，而其他群的霍乱弧菌毒性不高。霍乱弧菌的致病因子主要有CTX元件(其中的CtxA基因编码霍乱肠毒素)、TcpA致病岛(编码TcpA菌毛)和 toxR(毒力调控基因，调节编码CtxA和TcpA的基因)。霍乱弧菌ompW基因编码外膜蛋白，是所有霍乱弧菌所共有的。研究表明，O1群和O139群在许多基因和组成上高度相似，一些毒力基因CtxA和TcpA基因相同，而通过比对两种血清型霍乱弧菌的糖基转移酶基因(LPSgt)，发现它们序列存在较大差异。
致病性大肠杆菌感染的主要症状是致泻。根据其致病机理不同主要分为肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)、肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)。eae基因编码一个被称为紧密粘附素的外膜蛋白，此蛋白能使细菌黏附于宿主肠壁上，是EPEC的重要毒力基因。EHEC的stx1和stx2基因编码志贺样毒素I和志贺样毒素II。EIEC的invE基因(又称virB)编码蛋白介导侵袭。ETEC有两种肠毒素不耐热肠毒素(由LT基因编码)和耐热肠毒素基因(可分两种，分别由ST1和ST2)。EAEC的毒力基因编码蛋白介导集聚性黏附上皮细胞，阻止液体吸收，其特异性基因为中转录激活因子基因(aggR)。大肠杆菌O157：H7是肠出血性大肠杆菌一种主要致病菌，其中rfbE基因编码大肠杆菌O157菌体O抗原(多糖)特异性转移酶，参与脂多糖的生物合成。
艰难梭菌(Clostridium difficile)为革兰阳性产芽孢厌氧杆菌。艰难梭菌本身没有侵袭性，部分产毒细菌通过分泌毒素A、毒素B以及二元毒素引起抗生素相关性腹泻、结肠炎甚至致死性假膜性肠炎，统称为艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)。医院获得感染性腹泻所明确的病原中，以艰难梭菌最为常见；在抗生素相关性腹泻病因中，艰难梭菌亦占20％～30％；而假膜性肠炎则几乎100％由艰难梭菌所致。在美国，艰难梭菌感染是引起医院感染性腹泻的第一位原因。
肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)，又称副溶血性弧菌是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌，属于弧菌属，是一种常见的病原菌。肠炎弧菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，广泛存在于海水和海产品中,是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌。副溶血弧菌分离株都含有不耐热溶血毒素(tlH)，这种溶血素是副溶血弧菌所特有的，因此它的编码基因tlH基因常被用作检测副溶血弧菌的靶基因。而tlH并不是一个毒素基因，真正与致病相关的是副溶血弧菌的耐热直接溶血素(tdH)和溶血相关溶血素(trH)。
沙门氏菌(Salmonella)属肠杆菌科，革兰阴性无芽孢杆菌，是一种广泛分布于自然界的危害极大的肠道致病菌，有其引起的食物中毒数量为世界食物中毒病例之首。按其抗原成份可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。其中与人体疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，丁组的伤寒杆菌和 肠炎杆菌等。沙门菌具有侵袭宿主上皮细胞的能力，其侵袭力和毒力与invA基因相关。sefA是肠炎沙门菌SEF14菌毛操纵子的亚单位。鞭毛是沙门氏菌的重要毒力基因，鞭毛提供了的动力可能是细菌侵入细胞的重要因素，而且鞭毛可以作为黏附素，决定了细菌在细胞表面的吸附，以及其后的侵入和定居过程。fliC是鼠伤寒沙门菌的鞭毛抗原，为该菌所特有的保守基因。
检测和鉴定多种肠道致病菌对于传染病预防控制工作提供了坚实的理论依据和可靠的技术保障。目前，采用的生化鉴定、定量PCR和ELISA等方法均是对少数细菌进行鉴别，不能达到短时间内对多种致病菌平行检测和鉴定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：常规的肠道致病菌检测方法一次性只能检测较少肠道致病菌，本申请能够同时检测14种肠道致病菌共26个基因，提出了一种多重PCR肠道致病菌检测引物组、试剂盒。
技术方案： 
一种多重PCR肠道致病菌检测引物组，所述的引物组包括有如下的引物对中的至少两对：
用于扩增单核增生李斯特菌的特异性基因溶血素A基因(hlyA)的引物对、
用于扩增肠道病毒EV71的特异性基因结构蛋白基因(VP1)的引物对、 
用于扩增志贺菌的特异性基因的侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的引物对、
用于扩增肠出血性大肠杆菌O157：H7编码脂多糖基因(rfbE)的引物对、
用于扩增霍乱弧菌外膜蛋白基因(ompW)的引物对、 
用于扩增霍乱毒素基因(CtxA)的引物对、 
用于扩增霍乱弧菌的毒素协同菌毛基因(TcpA)的引物对、 
用于扩增霍乱糖基转移酶基因(LPSgt)的引物对、 
用于扩增肠致病性大肠杆菌(EPEC)的紧密黏附素基因(eae)的引物对、 
用于扩增肠出血性大肠杆菌(EHEC)的志贺样毒素I基因(stx1)的引物对、 
用于扩增肠出血性大肠杆菌(EHEC)的志贺样毒素II基因(stx2)的引物对、 
用于扩增肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的不耐热热肠毒素基因(LT)的引物对、 
用于扩增肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的耐热肠毒素ST1基因的引物对、
用于扩增肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的耐热肠毒素ST2基因的引物对、
用于扩增肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)的invE基因(又称virB)的引物对、
用于扩增肠聚集性大肠杆菌(EAEC)的转录激活因子基因(aggR)的引物对、 
用于扩增艰难梭菌毒素A基因(tcdA)的引物对、 
用于扩增艰难梭菌毒素B基因(tcdB)的引物对、 
用于扩增艰难梭菌二元毒素A基因(cdtA)的引物对、 
用于扩增艰难梭菌二元毒素B基因(cdtB)的引物对、 
用于扩增副溶血性弧菌不耐热溶血毒素基因(tlH)的引物对、 
用于扩增副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因(tdH)的引物对、 
用于扩增副溶血性弧菌溶血相关溶血素基因(trH)的引物对、 
用于扩增沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的基因(invA)的引物对、
用于扩增肠炎沙门菌的sefA基因的引物对、
用于扩增伤寒沙门氏菌的编码鞭毛抗原基因(fliC)的引物对。 
所述的引物对中的引物碱基序列如下所示：
用于扩增单核增生李斯特菌的特异性基因溶血素A基因(hlyA)的引物对SEQ ID NO.1～2、
用于扩增肠道病毒EV71的特异性基因结构蛋白基因(VP1)的引物对SEQ ID NO.3～4、
用于扩增志贺菌的特异性基因的侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的引物对SEQ ID NO.5～6、
用于扩增肠出血性大肠杆菌O157：H7编码脂多糖基因(rfbE)的引物对SEQ ID NO.7～8、
用于扩增霍乱弧菌外膜蛋白基因(ompW)的引物对SEQ ID NO.9～10、
用于扩增霍乱毒素基因(CtxA)的引物对SEQ ID NO.11～12、
用于扩增霍乱弧菌的毒素协同菌毛基因(TcpA)的引物对SEQ ID NO.13～14、
用于扩增霍乱糖基转移酶基因(LPSgt)的引物对SEQ ID NO.15～16、
用于扩增肠致病性大肠杆菌(EPEC)的紧密黏附素基因(eae)的引物对SEQ ID NO.17～18、
用于扩增肠出血性大肠杆菌(EHEC)的志贺样毒素I基因(stx1)的引物对SEQ ID NO.19～20、
用于扩增肠出血性大肠杆菌(EHEC)的志贺样毒素II基因(stx2)的引物对SEQ IDNO.21～22、
用于扩增肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的不耐热热肠毒素基因(LT)的引物对SEQ IDNO.23～24、
用于扩增肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的耐热肠毒素ST1基因的引物对SEQ ID NO.25～26、
用于扩增肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的耐热肠毒素ST2基因的引物对SEQ ID NO.27～28、
用于扩增肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)的invE基因(又称virB)的引物对SEQ ID NO.29～30、
用于扩增肠聚集性大肠杆菌(EAEC)的转录激活因子基因(aggR)的引物对SEQ ID NO.31～32、
用于扩增艰难梭菌毒素A基因(tcdA)的引物对SEQ ID NO.33～34、
用于扩增艰难梭菌毒素B基因(tcdB)的引物对SEQ ID NO.35～36、
用于扩增艰难梭菌二元毒素A基因(cdtA)的引物对SEQ ID NO.37～38、
用于扩增艰难梭菌二元毒素B基因(cdtB)的引物对SEQ ID NO.39～40、
用于扩增副溶血性弧菌不耐热溶血毒素基因(tlH)的引物对SEQ ID NO.41～42、
用于扩增副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因(tdH)的引物对SEQ ID NO.43～44、
用于扩增副溶血性弧菌溶血相关溶血素基因(trH)的引物对SEQ ID NO.45～46、
用于扩增沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的基因(invA)的引物对SEQ ID NO.47～48、
用于扩增肠炎沙门菌的sefA基因的引物对SEQ ID NO.49～50、
用于扩增伤寒沙门氏菌的编码鞭毛抗原基因(fliC)的引物对SEQ ID NO.51～52。
所述的引物组中包括有所述的引物对中的全部。
所述的引物对中至少有一个引物的5’端经荧光标记。
所述的引物是通过6-FAM、HEX、TEMRA、ROX中的任一种进行标记。
包括有所述的多重PCR肠道致病菌检测引物组的试剂盒。
所述的试剂盒中，还包括反应混合物、热启动Taq酶、sdH2O；所述的反应混合物中包括有：MgCl24.5mM，Tris-HCl buffer 150mM，KCl 150mM，dNTPs 2.5mM，BSA 1.5mg/ml。
有益效果
本发明提供一种利用荧光PCR扩增、毛细管电泳检测技术，一次性可特异性的检测14种肠道致病菌的26个基因的方法，克服了目前一次性只能检测少数菌的不足，并且可较快速的完成检测。
本发明可鉴定霍乱弧菌的有无，检测其肠道毒素(CtxA)的有无，鉴定霍乱弧菌是否属于O139群；鉴定单核增生李斯特菌的有无，鉴定是否有肠致病性大肠杆菌的紧密黏附素基因(eae)、肠出血性大肠杆菌的志贺样毒素I基因(stx1)、肠出血性大肠杆菌的志贺样毒素II基因(stx2)、肠产毒性大肠杆菌的不耐热热肠毒素基因(LT)、肠产毒性大肠杆菌的耐热肠毒素基因(ST1和ST2)、肠侵袭性大肠杆菌的invE基因(又称virB)、肠聚集性大肠杆菌的转录激活因子基因(aggR)，鉴定志贺菌的特异性基因的侵袭性质粒抗原H(ipaH)的有无，鉴定肠道病毒EV71的有无，鉴定肠出血性大肠杆菌O157：H7的有无，鉴定艰难梭菌毒素A、毒素B、二院毒素A、二元毒素B的有无，鉴定副溶血性弧菌的有无、耐热直接溶血素和溶血相关溶血素的有无，鉴定沙门氏菌的有无、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的有无。一次性检测位点多，包括菌的特异性位点和毒力相关位点，可以获得更多的信息，为分析病情指导用药提供依据。
附图说明
图1为实施1中的cholera1的扩增结果图，检测到ompW、CtxA、TcpA基因，为霍乱弧菌O1群。
图2为实施1中的cholera2的扩增结果图，检测到ompW、CtxA、TcpA、LPSgt，为霍乱弧菌O139群。
图3为实施1中的cholera3的扩增结果图，检测到ompW基因，为霍乱弧菌非O1群/O139群。
图4为实施1中的LstM的扩增结果图，检测到hlyA基因，为单核增生李斯特菌。
图5为实施1中的EPEC的扩增结果图，检测到eae基因，为肠致病性大肠杆菌。
图6为实施1中的EHEC1的扩增结果图，检测到stx1基因，为肠出血性性大肠杆菌。
图7为实施1中的EHEC2的扩增结果图，检测到stx2基因，为肠出血性性大肠杆菌。
图8为实施1中的O157H7的扩增结果图，检测到stx1、stx2、rfbe基因，为肠出血性性大肠杆菌O157：H7。
图9为实施1中的ETEC1的扩增结果图，检测到LT基因，为肠产毒性大肠杆菌。
图10为实施1中的ETEC2的扩增结果图，检测到ST1基因，为肠产毒性大肠杆菌。
图11为实施1中的ETEC3的扩增结果图，检测到ST2基因，为肠产毒性大肠杆菌。
图12为实施1中的EIEC的扩增结果图，检测到invE基因，为肠侵袭性大肠杆菌。
图13为实施1中的EAEC的扩增结果图，检测到aggR基因，为肠聚集性大肠杆菌。
图14为实施1中的Shi的扩增结果图,检测到ipaH基因，为志贺菌。
图15为实施1中的EV71的扩增结果图，检测到VP1基因，为肠道病毒EV71。
图16为实施1中的Cdiff1的扩增结果图，检测到tcdA、tcdB基因，为艰难梭菌(产毒)。
图17为实施1中的Cdiff2的扩增结果图，检测到tcdA、tcdB、cdtA、cdtB基因，为艰难梭菌(产二元毒素)。
图18为实施1中的VibP1的扩增结果图，检测到tlH、tdH基因，为副溶血性弧菌。
图19为实施1中的VibP2的扩增结果图，检测到tlH、trH基因，为副溶血性弧菌。
图20为实施1中的Sall的扩增结果图，检测到invA、sefA基因，为肠炎沙门氏菌。
图21为实施1中的Salt的扩增结果图，检测到invA、fliC基因,为鼠伤寒沙门氏菌。
图22为实施例2中的J1的扩增结果图，无扩增产物。
图23为实施例2中的J2的扩增结果图，无扩增产物。
图24为实施例2中的J3的扩增结果图，无扩增产物。
图25为实施例2中的J4的扩增结果图，无扩增产物。
图26为实施例2中的J5的扩增结果图，无扩增产物。
图27为实施例2中的J6的扩增结果图，无扩增产物。
图28为实施例2中的H1的扩增结果图，检测到ompW、CtxA、TcpA、hlyA、eae、LT、ST1、ST2、invE、aggR、stx1、stx2、rfbE、ipaH、VP1、tcdA、tcdB、tlH、tdH、trH、invA、sefA、fliC基因，为霍乱弧菌O1群、单核增生李斯特菌、肠致病性大肠杆菌、三种肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7、志贺菌、肠道病毒EV71、两种副溶血性弧菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌这几种菌混合液
图29为实施例2中的H2的扩增结果图，检测到ompW、CtxA、TcpA、LPSgt、stx1、stx2、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB、tlH、trH、invA、sefA基因，为霍乱弧菌O139群、两种肠出血性大肠杆菌、艰难梭菌(产二元毒素)、副溶血性弧菌、肠炎沙门氏菌这几种菌的混合液。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本申请通过查阅了大量肠道菌的文献资料，对常见的几种肠道致病菌的主要与致病有关的基因进行筛选，选取了致病菌携带的特异的基因进行设计特异性引物。
本发明提供的多重荧光PCR检测试剂盒，一次同时检测14种肠道致病菌，涉及26个基因。该试剂盒包括26对荧光标记引物，分别检测单核增生李斯特菌的溶血素A基因(hlyA)、肠道病毒EV71的结构蛋白基因(VP1)、志贺菌的侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、肠出血性大肠杆菌O157：H7编码脂多糖基因(rfbE)、霍乱弧菌外膜蛋白基因(ompW)、霍乱毒素基因(CtxA)、霍乱弧菌的毒素协同菌毛基因(TcpA)、霍乱糖基转移酶基因(LPSgt)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)的紧密黏附素基因(eae)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)的志贺样毒素I基因(stx1)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)的志贺样毒素II基因(stx2)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的不耐热热肠毒素基因(LT)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的耐热肠毒素基因(ST1和ST2)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)的invE基因(又称virB)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)的转录激活因子基因(aggR)、艰难梭菌毒素A基因(tcdA)、艰难梭菌毒素B基因(tcdB)、艰难梭菌二元毒素A基因(cdtA)、艰难梭菌二元毒素B基因(cdtB)、副溶血性弧菌不耐热溶血毒素基因(tlH)、耐热直接溶血素基因(tdH)、溶血相关溶血素基因(trH)、沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的基因invA、肠炎沙门菌的基因sefA、鼠伤寒沙门氏菌的编码鞭毛抗原基因(fliC)。
以上基因的模板序列可以从NCBI genebank中下载：
表1  genebank号
基因名称 NCBIgenebank号
hlyA JF967613.1
VP1 KC866707.1
ipaH EU743832.1
rfbe JQ907523.1
ompW GQ427179.1
CtxA KF664567.1
TcpA KC918809.1
LPSgt U72485.1
eae KF771381.1
stx1 JX206444.1
stx2 AB854289.1
LT JX504011.1
ST1 M25607.1
ST2 M35586.1
invE AF283289.1
aggR Z32523.1
tcdA KC292125.1
tcdB JQ809336.1
cdtA HQ639678.1
cdtB HQ639678.1
tdH JQ029156.1
trH DQ359748.1
tlH GU971655.1
invA KJ718887.1
sefA L11008.1
fliC KJ700871.1
每个基因序列在genebank中比对，选择其中最保守的区域设计引物。所谓保守区指的是与其他菌种差异大；同一菌种，不同菌株序列之间不存在突变位点。特定基因座引物只能检测对对应菌种基因序列扩增，对其他菌种无扩增。如霍乱弧菌01与霍乱弧菌0139虽然都有LPSgt基因，本发明通过比对二者序列，设计特异性引物，仅对霍乱弧菌0139有扩增。
本发明通过检测溶血素A基因(hlyA)有无，来判断单核增生李斯特菌的有无；检测结构蛋白基因(VP1)有无，判断肠道病毒EV71的有无；检测侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的有无，判断志贺菌的有无；检测编码脂多糖基因(rfbE)有无，判断大肠杆菌O157：H7有无；检测外膜蛋白基因(ompW)有无，判断霍乱弧菌的有无，检测CtxA和TcpA任意一种基因的有无，判断毒力的有无，借此可判断出O1或者O139群的有无，检测糖基转移酶基因(LPSgt)有无判断O139群的有无；检测紧密黏附素基因(eae)的有无，判断肠致病性大肠杆菌(EPEC)的有无；检测志贺样毒素I基因(stx1)、志贺样毒素II基因(stx2)任意一种的有无，判断肠出血性大肠杆菌(EHEC)的有无；检测不耐热热肠毒素基因(LT)、致病性大肠杆菌的耐热肠毒素基因(ST1或者ST2)任意一种的有无，判断肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的有无；检测invE的有无，判断肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)的有无；检测转录激活因子基因(aggR)的有无，判断是肠聚集性大肠杆菌(EAEC)；检测艰难梭菌毒素A基因(tcdA)、毒素B基因(tcdB)、二元毒素A基因(cdtA)、二元毒素B基因(cdtB)任意一种毒素，判断是含毒力基因艰难梭菌的有无；检测tlH有无可判断副溶血性弧菌有无，检测耐热直接溶血素基因(tdH)、溶血相关溶血素基因(trH)的有无判断是何种毒素，检测编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的基因invA基因有无判断沙门氏菌有无、检测sefA基因的有无判断否是肠炎沙门菌有无、检测fliC基因的有无判断伤寒沙门氏菌有无。
PCR用引物对是为了利用PCR法来扩增试样中的基因组DNA的一部分而使用，利用正向引物和反向引物的两种引物扩增特定的区域。PCR用引物对包含在PCR反应液中。在PCR反应液中还含有核酸合成底物、核酸合成酶、试样的基因组DNA、缓冲液等。并且，使用该PCR反应液，采用热循环仪等核酸扩增装置，扩增试样中的基因组DNA的一部分。当在试样中存在具有基于PCR用引物对的扩增对象区域的基因组DNA时，扩增该对象区域。本实施方式的PCR用引物对能够在通常的PCR法中使用。
在确定突变区域以后，避开突变区域设计引物，引物的TM值在60℃±5℃之间，每个基因都设计了20对引物，用于测试，每对引物其中一条以荧光标记。引物由上海生工合成，单对引物做退火温度梯度扩增。
在一个优选的实施方式中，采用的引物序列如下表2所示：
表2  26个基因引物表 
在上表中，序列编号显示出序列表中所示的碱基序列的序列编号。基因名称后的F/R代表正向引物和反向引物的区别，F表示正向引物，R表示反向引物。这些序列编号所示的碱基序列示出从5’末端到3’末端方向的序列。
在使上述26种PCR用引物对包含在PCR反应液中并进行利用PCR法的扩增反应的情况下，只要在PCR反应液中所含有的试样中包含任意上述扩增对象食物中毒菌的基因组 DNA，则能够特异性地扩增该扩增对象区域。
此外，在试样中含有两种以上的上述扩增对象细菌的基因组DNA的情况下，能够同时且特异性地扩增各个基因组DNA的扩增对象区域。即使在试样中含有14种扩增对象细菌的基因组DNA的26个区域所有的基因的情况下，也能够同时且特异性地扩增各基因组DNA的扩增对象区域。即，如果利用本实施方式的PCR用引物对，则不会进行除了各对象细菌以外的基因组DNA所引起的竞争。此外，即使同时使用多个PCR用引物对，也不进行因不同的引物对中的引物的组合而引起的非特异性扩增。因此，通过将本实施方式的PCR用引物对加入到PCR反应液中，在试样中包含具有扩增对象区域的食物中毒菌的基因组DNA的情况下，能够特异性地扩增该区域。即使在PCR反应液中不包含所有的上述26种PCR用引物对，而包含其中的2种至25种PCR用引物对的情况下，当在PCR反应液中包含具有该PCR用引物对的扩增对象区域的食物中毒菌的基因组DNA的情况下，也能够特异性地扩增该对象区域。
本实施方式的PCR反应液至少含有上述26种PCR用引物对中的任一种，优选含有其中两种以上，更优选含有所有的26种PCR用引物对。PCR反应液中的除PCR用引物对以外的成分可以使用通常物质，包括但不限于：缓冲液、核酸合成底物、正向引物、反向引物、核酸合成酶、试样DNA、水。在以下的实施例中采用的扩增体系是：
表3  PCR加样体系
组分 体积
Reaction Mix 10.0μL
基因组DNA 0.1～10μl含量为0.5pg～0.5ng
引物混合物 5μL
热启动Taq酶(5U/μL) 0.5μL
sdH2O 补足至25.0μL
其中所述的Reaction Mix为MgCl2 4.5mM，Tris-HCl buffer 150mM，KCl 150mM，dNTPs2.5mM，BSA 1.5mg/ml。
在利用PCR法扩增基因时，使用核酸扩增装置。作为该核酸扩增装置，可以使用通常的热循环仪等。
在进行扩增条件试验时，采用了如表4所示的扩增程序：
表4  温度梯度扩增程序
其中延伸温度分别为54℃，56℃，58℃，60℃，62℃，64℃。其余步骤温度相同。做梯 度测试。选择从54℃～64℃扩增特异性、扩增效率都好的4对引物用于复合扩增测试。
复合扩增引物之间存在相互干扰，比如不同基因座引物形成二级结构、产生非特异扩增。复合扩增引物测试的加样体系如表3。经过筛查之后最终确定了引物序列及引物浓度如表2，引物扩增效率高，相互之间无非特异扩增。最终确定的扩增程序如表5所示，但并不限此：
表5  热循环仪的扩增程序
接着，使用扩增产物进行电泳，确认是否得到了基于本实施方式的PCR用引物对的扩增产物。电泳可以利用琼脂糖凝胶电泳、丙烯酰胺电泳或微芯片电泳等通常的方法来进行。以下实施例中，采用毛细管电泳，分型方法：
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔(0.5μl AGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与1μlPCR产物，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；
用片段分析软件GeneMapper分析步骤上述遗传分析仪检测收集的数据。
电泳采用多道或单道毛细管电泳。软件分析峰高高于200rfu，认为相应的基因有扩增。反之，分析结果峰高低于200rfu，认为无扩增，即不含相应的基因。
实施例1菌种检测测试 
本实施例中采用的霍乱弧菌O1、O139群、非O1/O139群的DNA样本，单核增生李斯特菌的DNA样本、致病性大肠杆菌(EAEC、EPEC、ETEC、EIEC、EHEC)的DNA样本、痢疾志贺菌的DNA样本、EV71的DNA样本、肠出血性大肠杆菌O157：H7的DNA样本、鼠伤寒沙门氏菌的DNA样本、肠炎沙门氏菌的DNA样本、副溶血性弧菌的DNA样本由浙江疾控馈赠，每种样本各5个，这些样本为先期经过菌种培养鉴定，确定了相关毒素(样本编号及培养鉴定结果见表6)。
表6  样本编号及培养鉴定结果
采用表2中所述的引物组进行复合扩增，按表3配制反应体系，分别加入上述提取的DNA模板，按表5反应程序进行反应。
在反应结束后，对扩增产物在遗传分析仪上荧光检测，步骤是：
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔(0.5μl AGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司，专利CN101307226A))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与1μl PCR产物混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；
再用片段分析软件GeneMapper分析步骤上述遗传分析仪检测收集的数据。
电泳采用多道或单道毛细管电泳。软件分析峰高高于200rfu，认为相应的基因有扩增。反之，分析结果峰高低于200rfu，认为无扩增，即不含相应的基因。
电泳结果如附图1～21、28～29。
附图1为cholera1的扩增结果，检测到ompW、CtxA、TcpA基因，为霍乱弧菌群，因LPSgt、ompW无扩增，所以判断为霍乱弧菌O1群。附图2为cholera2的扩增结果，检测到ompW、CtxA、TcpA、LPSgt，为霍乱弧菌O139群。附图3为cholera3的扩增结果，检测到ompW基因，为霍乱弧菌非O1群/O139群。附图4为LstM的扩增结果，检测到hlyA基因，为单核增生李斯特菌。附图5为EPEC的扩增结果，检测到eae基因，为肠致病性大肠杆菌。附图6为EHEC1的扩增结果，检测到stx1基因，为肠出血性性大肠杆菌。附图7为EHEC2的扩增结果，检测到stx2基因，为肠出血性性大肠杆菌。附图8为O157：H7的扩增结果，检测到stx1、stx2、rfbe基因，为肠出血性性大肠杆菌O157：H7。附图9为ETEC1的扩增结果，检测到LT基因，为肠产毒性大肠杆菌。附图10为ETEC2的扩增结果，检测到ST1基因，为肠产毒性大肠杆菌。附图11为ETEC3的扩增结果，检测到ST2基因，为肠产毒性大肠杆菌。附图12为中EIEC的扩增结果，检测到invE基因，为肠侵袭性大肠杆菌。附图13为中EAEC的扩增结果，检测到aggR基因，为肠聚集性大肠杆菌。附图14为中Shi的扩增结果,检测到ipaH基因，为志贺菌。附图15为中EV71的扩增结果,检测到VP1基因，为肠道病毒EV71。附图16为中Cdiff1的扩增结果,检测到tcdA、tcdB基因，为艰难梭菌(产毒)。附图17为中Cdiff2的扩增结果,检测到tcdA、tcdB、cdtA、cdtB基因，为艰难梭菌(产二元 毒素)。附图18为中VibP1的扩增结果,检测到tlH、tdH基因，为副溶血性弧菌。附图19为中VibP2的扩增结果，检测到tlH、trH基因，为副溶血性弧菌。附图20为中Sall的扩增结果，检测到invA、sefA基因，为肠炎沙门氏菌。附图21为中Salt的扩增结果，检测到invA、fliC基因,为鼠伤寒沙门氏菌。附图28为中霍乱弧菌O1群、单核增生李斯特菌、肠致病性大肠杆菌、三种肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7、志贺菌、肠道病毒EV71、两种副溶血性弧菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌混合菌液的扩增结果，检测到ompW、CtxA、TcpA、hlyA、eae、LT、ST1、ST2、invE、aggR、stx1、stx2、rfbE、ipaH、VP1、tcdA、tcdB、tlH、tdH、trH、invA、sefA、fliC基因。附图29为霍乱弧菌O139群、两种肠出血性大肠杆菌、艰难梭菌(产二元毒素)、副溶血性弧菌、肠炎沙门氏菌这几种菌的混合液混合样本的扩增结果，检测到ompW、CtxA、TcpA、LPSgt、stx1、stx2、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB、tlH、trH、invA、sefA基因。所有结果显示样本都得到了特异性的扩增，检测结果符合预期，各基因的扩增片段大小与理论值一致。
实施例3特异性测试 
本特异性试验中采用的如下样本：艰难梭菌(不产毒)的DNA样本、空肠弯曲菌的DNA样本、小肠结肠炎耶尔森氏菌的DNA样本、金黄色葡萄球菌的DNA样本、肉毒梭菌的DNA样本、蜡样芽孢杆菌的DNA样本，由浙江疾控馈赠，每种样本各5个，先期经过培养鉴定。样本列表如下：
表7 特异性试验样本
样本编号 菌种
J1 艰难梭菌(不产毒)
J2 空肠弯曲菌
J3 小肠结肠炎耶尔森氏菌
J4 金黄色葡萄球菌
J5 肉毒梭菌
J6 蜡样芽孢杆菌
采用表2中所述的引物组进行复合扩增，按表3配制反应体系，分别加入上述提取的DNA模板，按表5反应程序进行反应。
在反应结束后，对扩增产物在遗传分析仪上荧光检测，步骤是：
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔(0.5μl AGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司，专利CN101307226A))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与1μl PCR产物混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；
再用片段分析软件GeneMapper分析步骤上述遗传分析仪检测收集的数据。
电泳采用多道或单道毛细管电泳。
电泳检测结果如图22～27所示，分别为J1～J6的扩展结果，没有检测到扩增峰，表示这些样本均没有扩增，与预期结果符合，也说明了引物具很好的特异性。
                         序列表
 
<110>  无锡中德美联生物技术有限公司
 <120>  一种多重PCR肠道致病菌检测引物组、试剂盒
<130> 
<160>  52   
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
aagcaaaacc tggtgattta g                                                 21
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
aagccaacta gatatttacc cc                                                22
<210>  3
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  3
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<210>  4
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  4
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<210>  5
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<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  5
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<210>  6
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  6
ttccgcgttc cttgaccg                                                     18
<210>  7
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  7
ttcacactta ttggatggtc tcaa                                              24
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  8
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<212>  DNA
<213>  人工序列
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<210>  10
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  10
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<212>  DNA
<213>  人工序列
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<213>  人工序列
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<213>  人工序列
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<210>  15
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
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<210>  16
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<212>  DNA
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taaaactgct ccattttatc tt                                                22
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<212>  DNA
<213>  人工序列
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<212>  DNA
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<212>  DNA
<213>  人工序列
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tttccttatt gttatctctg at                                                22
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ggatattcca cttactatat at                                                22
 
 
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<212>  DNA
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tcagattctg ggtctcctca ttaca                                             25
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gcgagtgcac ctcgacatat a                                                 21
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<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  26
caaagttcac agcagtaaaa tgtg                                              24
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tatcatcgag gaacgtacat cattg                                             25
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<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  28
taccagtggg cctttatatg ag                                                22
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<212>  DNA
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<400>  29
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<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  30
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<211>  24
<212>  DNA
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<400>  31
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<210>  32
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  32
tttccttatt gttatctctg at                                                22
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<213>  人工序列
<400>  33
gggatagata tcagggctaa ta                                                22
<210>  34
<211>  22
<212>  DNA
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taacttcata atagcctcta at                                                22
<210>  35
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<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  35
ggcgtatttg atacttcaga tgaat                                             25
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<212>  DNA
<213>  人工序列
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ttctcattat gccattctca tc                                                22
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<212>  DNA
<213>  人工序列
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<210>  38
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
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Claims (7)

1.一种多重PCR肠道致病菌检测引物组，其特征在于，所述的引物组包括有如下的引物对中的至少两对：
用于扩增单核增生李斯特菌的特异性基因溶血素A基因的引物对、
用于扩增肠道病毒EV71的特异性基因结构蛋白基因的引物对、
用于扩增志贺菌的特异性基因的侵袭性质粒抗原H基因的引物对、
用于扩增肠出血性大肠杆菌O157：H7编码脂多糖基因的引物对、
用于扩增霍乱弧菌外膜蛋白基因的引物对、
用于扩增霍乱毒素基因的引物对、
用于扩增霍乱弧菌的毒素协同菌毛基因的引物对、
用于扩增霍乱糖基转移酶基因的引物对、
用于扩增肠致病性大肠杆菌的紧密黏附素基因的引物对、
用于扩增肠出血性大肠杆菌的志贺样毒素I基因的引物对、
用于扩增肠出血性大肠杆菌的志贺样毒素II基因的引物对、
用于扩增肠产毒性大肠杆菌的不耐热热肠毒素基因的引物对、
用于扩增肠产毒性大肠杆菌的耐热肠毒素ST1基因的引物对、
用于扩增肠产毒性大肠杆菌的耐热肠毒素ST2基因的引物对、
用于扩增肠侵袭性大肠杆菌的invE基因的引物对、
用于扩增肠聚集性大肠杆菌的转录激活因子基因的引物对、
用于扩增艰难梭菌毒素A基因的引物对、
用于扩增艰难梭菌毒素B基因的引物对、
用于扩增艰难梭菌二元毒素A基因的引物对、
用于扩增艰难梭菌二元毒素B基因的引物对、
用于扩增副溶血性弧菌不耐热溶血毒素基因的引物对、
用于扩增副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因的引物对、
用于扩增副溶血性弧菌溶血相关溶血素基因的引物对、
用于扩增沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的基因的引物对、
用于扩增肠炎沙门菌的sefA基因的引物对、
用于扩增伤寒沙门氏菌的编码鞭毛抗原基因的引物对。
2.根据权利要求1所述的多重PCR肠道致病菌检测引物组，其特征在于：所述的引物对中的引物碱基序列如下所示：
用于扩增单核增生李斯特菌的特异性基因溶血素A基因的引物对SEQ ID NO.1～2、
用于扩增肠道病毒EV71的特异性基因结构蛋白基因的引物对SEQ ID NO.3～4、
用于扩增志贺菌的特异性基因的侵袭性质粒抗原H基因的引物对SEQ ID NO.5～6、
用于扩增肠出血性大肠杆菌O157：H7编码脂多糖基因的引物对SEQ ID NO.7～8、
用于扩增霍乱弧菌外膜蛋白基因的引物对SEQ ID NO.9～10、
用于扩增霍乱毒素基因的引物对SEQ ID NO.11～12、
用于扩增霍乱弧菌的毒素协同菌毛基因的引物对SEQ ID NO.13～14、
用于扩增霍乱糖基转移酶基因的引物对SEQ ID NO.15～16、
用于扩增肠致病性大肠杆菌的紧密黏附素基因的引物对SEQ ID NO.17～18、
用于扩增肠出血性大肠杆菌的志贺样毒素I基因的引物对SEQ ID NO.19～20、
用于扩增肠出血性大肠杆菌的志贺样毒素II基因的引物对SEQ ID NO.21～22、
用于扩增肠产毒性大肠杆菌的不耐热热肠毒素基因的引物对SEQ ID NO.23～24、
用于扩增肠产毒性大肠杆菌的耐热肠毒素ST1基因的引物对SEQ ID NO.25～26、
用于扩增肠产毒性大肠杆菌的耐热肠毒素ST2基因的引物对SEQ ID NO.27～28、
用于扩增肠侵袭性大肠杆菌的invE基因的引物对SEQ ID NO.29～30、
用于扩增肠聚集性大肠杆菌的转录激活因子基因的引物对SEQ ID NO.31～32、
用于扩增艰难梭菌毒素A基因的引物对SEQ ID NO.33～34、
用于扩增艰难梭菌毒素B基因的引物对SEQ ID NO.35～36、
用于扩增艰难梭菌二元毒素A基因的引物对SEQ ID NO.37～38、
用于扩增艰难梭菌二元毒素B基因的引物对SEQ ID NO.39～40、
用于扩增副溶血性弧菌不耐热溶血毒素基因的引物对SEQ ID NO.41～42、
用于扩增耐热直接溶血素基因的引物对SEQ ID NO.43～44、
用于扩增溶血相关溶血素基因的引物对SEQ ID NO.45～46、
用于扩增沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的基因的引物对SEQ ID NO.47～48、
用于扩增肠炎沙门菌的sefA基因的引物对SEQ ID NO.49～50、
用于扩增伤寒沙门氏菌的编码鞭毛抗原基因的引物对SEQ ID NO.51～52。
3.根据权利要求1所述的多重PCR肠道致病菌检测引物组，其特征在于：所述的引物组中包括有所述的引物对中的全部。
4.根据权利要求1所述的多重PCR肠道致病菌检测引物组，其特征在于：所述的引物对中至少有一个引物的5’端经荧光标记。
5.根据权利要求4所述的多重PCR肠道致病菌检测引物组，其特征在于：所述的引物是通过6-FAM、HEX、TEMRA、ROX荧光染料中的任一种进行标记。
6.包括权利要求1～5任一项所述的多重PCR肠道致病菌检测引物组的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的多重PCR肠道致病菌检测引物组的试剂盒，其特征在于：还包括反应混合物、热启动Taq酶、sdH2O；所述的反应混合物中包括有：MgCl2 4.5mM，Tris-HCl buffer 150mM，KCl 150mM，dNTPs 2.5mM，BSA 1.5mg/ml。
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