CN109652571A - 一套快速定性、定量检测六种肠道微生物的引物组及其应用 - Google Patents

一套快速定性、定量检测六种肠道微生物的引物组及其应用 Download PDF

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CN109652571A CN201910075618.7A CN201910075618A CN109652571A CN 109652571 A CN109652571 A CN 109652571A CN 201910075618 A CN201910075618 A CN 201910075618A CN 109652571 A CN109652571 A CN 109652571A
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Abstract

本发明公开了一套快速定性、定量检测六种常见肠道微生物的引物组，由分别用于检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的六组特异性引物对组成。应用此引物组进行PCR检测结合琼脂糖凝胶电泳可对样品进行定量分析；应用此引物组进行荧光定量PCR检测可对样品进行定量检测。本发明设计的引物组可在同一PCR反应程序下进行，四小时内实现对肠道中六种常见微生物进行定性、定量检测，在医疗检测和食品卫生等领域应用前景广阔。

Description

一套快速定性、定量检测六种肠道微生物的引物组及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一套快速定性、定量检测六种常见肠道微生物的引物组及其应用。
背景技术
肠道是人体最为重要的消化器官，也是一个多元化并充满活力的微生物生态系统，寄居着数万亿的微生物。大量研究表明，肠道微生物不仅参与宿主的食物转化，对于机体的神经、免疫等生理功能也具有重要的作用。宏基因组测序发现，在肠道中占优势地位的细菌主要分布于拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和变形菌门中，其中包括拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属等常见的肠道微生物；这些微生物的组成与数量保持动态平衡，同时机体内外的多种因素可能会改变这种平衡，进而影响宿主的生理状态。因此，快速准确地跟踪肠道中常见肠道微生物的组成变化对于监测机体健康具有重要意义。
目前对于肠道微生物组成的鉴定主要通过宏基因组测序完成，过程较为复杂，耗时耗力，且花费较多；利用种属特异性引物进行PCR检测和实时荧光定量PCR检测，能够更为快速地实现肠道微生物的定量检测。目前已有的种属特异性检测引物大多以疾病相关的肠道菌作目标菌，针对性强，但普适性较差，且每种引物有单独的检测程序，退火温度与延伸时间不能统一，无法进行同批次实验，过程繁琐。
申请人基于拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属以及与其亲缘关系较近的其他菌的16S rRNA基因序列相似性比对，获得了各目标菌区别于其他五种菌以及相近菌的特异性保守序列，并根据该保守序列设计了六组特异性引物对，同时所述的引物组可在同一PCR反应程序下，四小时内实现对肠道中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的微生物进行定性、定量检测，且不涉及价格高昂的试剂和设备。经检索，有关这种能快速定性、定量检测肠道中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的特异性引物组及其应用的专利还未见报道。
发明内容
针对现有方法不足，本发明要解决的问题是提供一套快速定性、定量检测六种微生物的引物组及其应用。利用该引物组通过PCR反应可以便捷、准确地检测样品中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属六种肠道微生物的存在及数量。
本发明所述的一套快速定性、定量检测六种常见肠道微生物的引物组，由分别用于检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的六组特异性引物对组成；
其特征在于：
所述用于拟杆菌属检测的引物对是上游引物Bacter F5与下游引物Bacter R6，该对引物扩增获得135bp拟杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，所述上游引物Bacter F5与下游引物Bacter R6的核苷酸序列为：
上游引物Bacter F5：5’-AAGACAACGATGGATAGGGGTT-3’，
下游引物Bacter R6：5’-TTCACGCTACTTGGCTGGT-3’；
所述用于乳杆菌科检测的引物对是上游引物Lacter F5与下游引物Lacter R6，该对引物扩增获得322bp乳杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，所述上游引物Lacter F5与下游引物Lacter R6的核苷酸序列为：
上游引物Lacter F5：5’-ACAATGGACGCAAGTCTGATG-3’，
下游引物Lacter R6：5’-ACCGCTACACATGGAGTTCCACWGT-3’；
所述用于大肠杆菌检测的引物对是上游引物E.coli F3与下游引物E.coli R4，该对引物扩增获得416bp大肠杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，所述上游引物E.coli F3与下游引物E.coli R4的核苷酸序列为：
上游引物E.coli F3：5’-GAACGGTAACAGGAAGCAG-3’，
下游引物E.coli R4：5’-ATGAACAAAGGTATTAACTTTACT-3’；
所述用于肠球菌属检测的引物对是上游引物Enter F3与下游引物Enter R4，该对引物扩增获得180bp肠球菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；其中，所述上游引物Enter F3与下游引物Enter R4的核苷酸序列为：
上游引物Enter F3：5’-CTTTCGGGTGTCGCTGAT-3’，
下游引物Enter R4：5’-AGACTTTCGTCCATTGCC-3’；
所述用于链球菌属检测的引物对是上游引物Strep R4与下游引物Strep R3，该对引物扩增获得267bp链球菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；其中，所述上游引物Strep R4与下游引物Strep R3的核苷酸序列为：
上游引物Strep F4：5’-ACAAGATGGACCTGCGTT-3’，
下游引物Strep R3：5’-TTACCGTCACTGTGTGAACTT-3’；
所述用于双歧杆菌属检测的引物对是上游引物Bifi F3与下游引物Bifi R4，该对引物扩增获得154bp双歧杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；其中，所述上游引物Bifi F3与下游引物Bifi R4的核苷酸序列为：
上游引物Bifi F3：5’-GTCCGGTGTGAAAGTCCATC-3’，
下游引物Bifi R4：5’-GTAACGGCCCAGAGACCT-3’。
本发明所述检测六种常见肠道微生物的引物组在利用PCR快速定性检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属中的应用。
其中：所述应用方法中涉及的步骤和条件是：
(1)配制PCR反应体系，其中每20μL反应体系中含有以下组分：0.2μL rTaq DNAPolymerase、2μL 10×PCR Buffer、1.6μL 10mM、dNTP Mixture、0.8±0.2μL上游引物、0.8±0.2μL下游引物、0.2±0.2μL DNA模板、14.4±0.6μL ddH2O；
(2)PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55±2℃退火30s，72℃延伸15±5s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。
进一步优选的实施方式是：步骤(1)所述PCR反应体系优选0.2μL rTaq DNAPolymerase、2μL 10×PCR Buffer、1.6μL 10mMdNTP Mixture、0.8μL上游引物、0.8μL下游引物、0.2μL DNA模板、14.4μL ddH2O。步骤(2)所述PCR反应程序优选94℃预变性3min；94℃变性30s，55.7℃退火30s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。
上述定性检测肠道中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的应用方法中的引物浓度为：拟杆菌属特异性检测引物的上游引物Bacter F5与下游引物Bacter R6的浓度为5μM，乳杆菌科特异性检测引物的上游引物Lacter F5与下游引物Lacter R6的浓度为5μM，大肠杆菌特异性检测引物的上游引物E.coli F3与下游引物E.coli R4的浓度为2.5μM，肠球菌属特异性检测引物的上游引物Enter F3与下游引物Enter R4的浓度为2.5μM，链球菌属特异性检测引物的上游引物Strep F4与下游引物StrepR3的浓度为10μM，双歧杆菌属特异性检测引物的上游引物Bifi F3与下游引物Bifi R4的浓度为2.5μM。
本发明所述检测六种常见肠道微生物的引物组在利用荧光定量PCR定量检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属中的应用。
其中：应用方法中涉及的步骤和条件是：
(1)荧光定量PCR反应体系配制，其中每20μL反应体系中含有以下组分：10μL TBGreen Premix Ex Taq、0.8±0.2μL上游引物、0.8±0.2μL下游引物、1±0.5μL DNA模板、7.4±0.9μL dd H2O。
(2)荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性35s；95℃变性10s，55±2℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环；Melt 60℃-95℃，6s。
进一步优选的实施方式是：步骤(1)所述荧光定量PCR反应体系配制优选10μL TBGreen Premix Ex Taq、0.8μL上游引物、0.8μL下游引物、1μL DNA模板、7.4μL dd H2O。步骤(2)所述荧光定量PCR反应程序优选95℃预变性35s；95℃变性10s，55.7℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环；Melt 60℃-95℃，6s。
上述定量检测肠道中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的应用方法中的引物浓度为：拟杆菌属特异性检测引物的上游引物Bacter F5与下游引物Bacter R6的浓度为5μM，乳杆菌科特异性检测引物的上游引物Lacter F5与下游引物Lacter R6的浓度为5μM，大肠杆菌特异性检测引物的上游引物E.coli F3与下游引物E.coli R4的浓度为2.5μM，肠球菌属特异性检测引物的上游引物Enter F3与下游引物Enter R4的浓度为2.5μM，链球菌属特异性检测引物的上游引物Strep F4与下游引物StrepR3的浓度为10μM，双歧杆菌属特异性检测引物的上游引物Bifi F3与下游引物Bifi R4的浓度为2.5μM。
本发明公开了一套快速定性、定量检测六种微生物的引物组及其应用。是申请人基于拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属以及与其亲缘关系较近的其他菌的16S rRNA基因序列相似性比对，获得了各目标菌区别于其他五种菌以及相近菌的特异性保守序列，并根据该保守序列设计了六组特异性引物对，并提供了一套较为完整的常见肠道微生物的特异性检测引物。实验证实各特异性检测引物的PCR退火温度及延伸时间均一致，可利用一种反应条件下进行PCR和实时荧光定量PCR反应，并根据琼脂糖凝胶电泳结果和实时荧光定量PCR分析，实现对粪便、肠溶物样品中上述六种微生物快速的定性、定量检测。本发明中公开的引物组、反应体系和反应条件，有效避免了检测过程中引物二聚体和非特异性扩增的出现，使定量检测的准确性高，检测过程在四小时内完成；且不涉及价格高昂的试剂和设备，经济实惠，在医疗检测和食品卫生等领域应用前景广阔。
综上，应用本发明所述引物组进行PCR检测结合琼脂糖凝胶电泳可对样品进行定量分析；应用本发明所述引物组进行荧光定量PCR检测可对样品进行定量检测。与现有技术相比，本发明所述的引物组可在同一PCR反应程序下，四小时内实现对肠道中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的微生物进行定性、定量检测，同时还具有检测粪便、肠溶物等复杂生物样品中所述六种肠道微生物的潜力，在医疗检测和食品卫生等领域应用前景广阔。
附图说明
图1、粪便样品中六种肠道微生物的定性检测电泳图。
其中：泳道M，DL5000 DNA Marker；泳道1，拟杆菌属定性检测PCR产物电泳条带，泳道2，乳杆菌科定性检测PCR产物电泳条带，泳道3，大肠杆菌定性检测PCR产物电泳条带，泳道4，肠球菌属定性检测PCR产物电泳条带，泳道5，链球菌属定性检测PCR产物电泳条带，泳道6，双歧杆菌属定性检测PCR产物电泳条带。
具体实施方式
实施例1：粪便样品中六种肠道微生物(拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属)的定性分析
基于拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属以及与其亲缘关系较近的其他菌的16S rRNA基因序列相似性比对，获得各目标菌区别于其他五种菌以及相近菌的特异性保守序列，并根据保守序列设计出六组特异性引物对。其中：拟杆菌属特异性检测引物对的上游引物Bacter F5:5’-AAGACAACGATGGATAGGGGTT-3’，下游引物Bacter R6:5’-TTCACGCTACTTGGCTGGT-3’，该对引物扩增获得135bp拟杆菌基因组DNA片段；乳杆菌科特异性检测引物对的上游引物Lacter F5:5’-ACAATGGACGCAAGTCTGATG-3’，下游引物Lacter R6；5’-ACCGCTACACATGGAGTTCCACWGT-3’，该对引物扩增获得322bp乳杆菌基因组DNA片段；大肠杆菌特异性检测引物对的上游引物E.coli F3:5’-GAACGGTAACAGGAAGCAG-3’，下游引物E.coli R4:5’-ATGAACAAAGGTATTAACTTTACT-3’，该对引物扩增获得416bp大肠杆菌基因组DNA片段；肠球菌属特异性检测引物对的上游引物Enter F3:5’-CTTTCGGGTGTCGCTGAT-3’，下游引物Enter R4:5’-AGACTTTCGTCCATTGCC-3’，该对引物扩增获得180bp肠球菌基因组DNA片段；链球菌属特异性检测引物对的上游引物Strep R4:5’-ACAAGATGGACCTGCGTT-3’，下游引物Strep R3:5’-TTACCGTCACTGTGTGAACTT-3’，该对引物扩增获得267bp链球菌基因组DNA片段；双歧杆菌属特异性检测引物对的上游引物BifiF3:5’-GTCCGGTGTGAAAGTCCATC-3’，下游引物Bifi R4:5’-GTAACGGCCCAGAGACCT-3’，该对引物扩增获得154bp双歧杆菌基因组DNA片段。
上述六组引物对在利用PCR快速定性检测志愿者粪便样品中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属中的应用。
其中，具体应用方法中涉及的步骤和条件是：
(1)基因组DNA的制备：取志愿者的新鲜粪便样品，每份200μL或200mg分装到2mL离心管中，使用QIAamp DNA Stool Mini Kit按照说明书步骤提取粪便样品的总DNA，-20℃保存待用。
(2)PCR反应体系配制：准确吸取0.2μL rTaq DNA Polymerase、2μL 10×PCRBuffer、1.6μL 10mMdNTP Mixture、0.8μL上游引物、0.8μL下游引物、0.2μL DNA模板和14.4μL ddH2O。
其中：上游引物和下游引物分别为：Bacter F5、Bacter R6浓度为5μM用于拟杆菌属定性分析，Lacter F5、Lacter R6浓度为5μM用于乳杆菌科定性分析，E.coli F3、E.coliR4浓度为2.5μM用于大肠杆菌定性分析，Enter F3、EnterR4浓度为2.5μM用于肠球菌属定性分析，Strep F4、Strep R3浓度为10μM用于链球菌属定性分析，Bifi F3、Bifi R4浓度为2.5μM用于双歧杆菌属定性分析。
(3)PCR反应：使用普通PCR仪设置反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，55.7℃退火30s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。
(4)琼脂糖凝胶电泳：取7μL PCR产物与2μL 10×Quick Cut Green Buffer混匀后上样，在2.0％琼脂糖凝胶中电泳30min，溴化乙锭染色后在凝胶成像分析系统中成像。
(5)结果分析：图1中，发现上述Bacter F5、R6引物对在粪便样品基因组DNA中扩增获得135bp拟杆菌基因组DNA片段，上述Lacter F5、R6引物对在粪便样品基因组DNA中扩增获得322bp乳杆菌基因组DNA片段，上述的E.coli F3、R4引物对在粪便样品基因组DNA中扩增获得416bp大肠杆菌基因组DNA片段，上述的Enter F3、R4引物对在粪便样品基因组DNA中扩增获得180bp肠球菌基因组DNA片段，上述的Strep F4、R3引物对在粪便样品基因组DNA中扩增获得267bp链球菌基因组DNA片段，上述的Bifi F3、R4引物对在粪便样品基因组DNA中扩增获得154bp双歧杆菌基因组DNA片段。
由电泳结果可以快速确定被测志愿者粪便样品中含有拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属六种肠道微生物。
(6)PCR产物测序结果：
对上述扩增获得的135bp拟杆菌基因组DNA片段测序，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
对上述扩增获得的322bp乳杆菌基因组DNA片段测序，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
对上述扩增获得的416bp大肠杆菌基因组DNA片段测序，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
对上述扩增获得的180bp肠球菌基因组DNA片段测序，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
对上述扩增获得的180bp肠球菌基因组DNA片段测序，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
对上述扩增获得的154bp双歧杆菌基因组DNA片段测序，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
上述试验证实：本发明所述六组引物可以用于粪便样品中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的定性分析。
实施例2：粪便样品中六种肠道微生物(拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属)的定量检测
上述六组引物对在利用荧光定量PCR定量检测志愿者粪便样品中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属中的应用。
其中，具体应用方法中涉及的步骤和条件是：
(1)基因组DNA的制备：取志愿者的新鲜粪便样品，每份200μL或200mg分装到2mL离心管中，使用QIAampDNA Stool Mini Kit按照说明书步骤提取粪便样品的总DNA，-20℃保存待用。
(2)荧光定量PCR反应体系配制：准确吸取10μL TB Green Premix Ex Taq、0.8μL上游引物、0.8μL下游引物、1μL DNA模板和7.4μL ddH2O。上游引物和下游引物分别为：Bacter F5、Bacter R6浓度为5μM用于拟杆菌属定量检测，Lacter F5、Lacter R6浓度为5μM用于乳杆菌科定量检测，E.coli F3、E.coli R4浓度为2.5μM用于大肠杆菌定量检测，EnterF3、EnterR4浓度为2.5μM用于肠球菌属定量检测，Strep F4、Strep R3浓度为10μM用于链球菌属定量检测，Bifi F3、Bifi R4浓度为2.5μM用于双歧杆菌属定量检测。
(3)荧光定量PCR反应：使用荧光定量PCR仪设置反应程序为95℃预变性35s；95℃变性10s，55.7℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环；Melt 60℃-95℃，6s。
(4)结果分析：根据荧光定量PCR反应所得的CT值，计算粪便样品中六种肠道微生物的数量，结果如表1。
表1粪便样品中六种肠道微生物的定量检测结果
每克粪便样品中细菌数
拟杆菌属 10^7.479±10^0.137
乳杆菌科 10^3.667±10^0.094
大肠杆菌 10^7.539±10^0.082
肠球菌属 10^2.033±10^0.091
链球菌属 10^8.317±10^0.025
双歧杆菌属 10^8.732±10^0.066
上述试验证实：本发明所述六组引物可以用于粪便样品中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的定量检测。
序 列 表
<110>山东大学
<120>一套快速定性、定量检测六种肠道微生物的引物组及其应用
<141> 2019-1-24
<160> 18
<210> 1
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 拟杆菌基因组DNA片段
<222>（1）…（135）
<400> 1
aagacaacga tggatagggg ttctgagagg aaggtccccc acattggaac tgagacacgg 60
tccaaactct acgggaggca gcagtgagga atattggtca atggacgaga gtctgaacca 120
gccaagtagc gtgaa 135
<210> 2
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 乳杆菌基因组DNA片段
<222>（1）…（322）
<400> 2
acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggctt tcgggtcgta 60
aaactctgtt gttggagaag aatggtcggc agagtaactg ttgtcggcgt gacggtatcc 120
aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 180
ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag 240
ccctcggctt aaccgaggaa gcgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca 300
gtggaactcc atgtgtagcg gt 322
<210> 3
<211> 416
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 大肠杆菌基因组DNA片段
<222>（1）…（416）
<400> 3
gaacggtaac aggaagcagc ttgctgcttc gctgacgagt ggcggacggg tgagtaatgt 60
ctgggaaact gcctgatgga gggggataac tactggaaac ggtagctaat accgcataac 120
gtcgcaagac caaagagggg gaccttcggg cctcttgcca tcggatgtgc ccagatggga 180
ttagctagta ggtggggtaa cggctcacct aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga 240
tgaccagcca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300
atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca gccatgccgc gtgtatgaag aaggccttcg 360
ggttgtaaag tactttcagc ggggaggaag ggagtaaagt taataccttt gctcat 416
<210> 4
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 肠球菌基因组DNA片段
<222>（1）…（180）
<400> 4
ctttcgggtg tcgctgatgg atggacccgc ggtgcattag ctagttggtg aggtaacggc 60
tcaccaaggc cacgatgcat agccgacctg agagggtgat cggccacatt gggactgaga 120
cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tcggcaatgg acgaaagtct 180
<210>5
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 链球菌基因组DNA片段
<222>（1）…（267）
<400> 5
ttaccgtcac tgtgtgaact ttccactctc acacacattc ttctcttaca acagagcttt 60
acgatccgaa aaccttcttc actcacgcgg cgttgctcgg tcagggttgc ccccattgcc 120
gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc 180
cgatcaccct ctcaggtcgg ctatgtatcg tcgccttggt gagccgttac ctcaccaact 240
agctaataca acgcaggtcc atctact 267
<210>6
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 双歧杆菌基因组DNA片段
<222>（1）…（154）
<400> 6
gtaacggccc agagacctgc cttcgccatt ggtgttcttc ccgatatcta cacattccac 60
cgttacaccg ggaattccag tctcccctac cgcactcaag cccgcccgta cccggcgcgg 120
atccaccgtt aagcgatgga ctttcacacc ggac 154
<210>7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 上游引物Bacter F5
<222>（1）…（22）
<400>7
aagacaacga tggatagggg tt 22
<210>8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物Bacter R6
<222>（1）…（19）
<400>8
ttcacgctac ttggctggt 19
<210>9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 上游引物Lacter F5
<222>（1）…（21）
<400>9
acaatggacg caagtctgat g 21
<210>10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物Lacter R6
<222>（1）…（25）
<400>10
accgctacac atggagttcc acwgt 25
<210>11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 上游引物E.coli F3
<222>（1）…（19）
<400>11
gaacggtaac aggaagcag 19
<210>12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物E.coli R4
<222>（1）…（24）
<400>12
atgaacaaag gtattaactt tact 24
<210>13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 上游引物Enter F3
<222>（1）…（18）
<400>13
ctttcgggtg tcgctgat 18
<210>14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物Enter R4
<222>（1）…（18）
<400>14
agactttcgt ccattgcc 18
<210>15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 上游引物Strep F4
<222>（1）…（18）
<400>15
acaagatgga cctgcgtt 18
<210>16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物Strep R3
<222>（1）…（21）
<400>16
ttaccgtcac tgtgtgaact t 21
<210>17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 上游引物Bifi F3
<222>（1）…（20）
<400>17
gtccggtgtg aaagtccatc 20
<210>18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物Bifi R4
<222>（1）…（18）
<400>18
gtaacggccc agagacct 18

Claims (10)

1.一套快速定性、定量检测六种常见肠道微生物的引物组，由分别用于检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的六组特异性引物对组成；
其特征在于：
所述用于拟杆菌属检测的引物对是上游引物Bacter F5与下游引物Bacter R6，该对引物扩增获得135bp拟杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，所述上游引物Bacter F5与下游引物Bacter R6的核苷酸序列为：
上游引物Bacter F5：5’-AAGACAACGATGGATAGGGGTT-3’，
下游引物Bacter R6：5’-TTCACGCTACTTGGCTGGT-3’；
所述用于乳杆菌科检测的引物对是上游引物Lacter F5与下游引物Lacter R6，该对引物扩增获得322bp乳杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，所述上游引物Lacter F5与下游引物Lacter R6的核苷酸序列为：
上游引物Lacter F5：5’-ACAATGGACGCAAGTCTGATG-3’，
下游引物Lacter R6：5’-ACCGCTACACATGGAGTTCCACWGT-3’；
所述用于大肠杆菌检测的引物对是上游引物E.coli F3与下游引物E.coli R4，该对引物扩增获得416bp大肠杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，所述上游引物E.coli F3与下游引物E.coli R4的核苷酸序列为：
上游引物E.coli F3：5’-GAACGGTAACAGGAAGCAG-3’，
下游引物E.coli R4：5’-ATGAACAAAGGTATTAACTTTACT-3’；
所述用于肠球菌属检测的引物对是上游引物Enter F3与下游引物Enter R4，该对引物扩增获得180bp肠球菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；其中，所述上游引物Enter F3与下游引物Enter R4的核苷酸序列为：
上游引物Enter F3：5’-CTTTCGGGTGTCGCTGAT-3’，
下游引物Enter R4：5’-AGACTTTCGTCCATTGCC-3’；
所述用于链球菌属检测的引物对是上游引物Strep R4与下游引物Strep R3，该对引物扩增获得267bp链球菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；其中，所述上游引物Strep R4与下游引物Strep R3的核苷酸序列为：
上游引物Strep F4：5’-ACAAGATGGACCTGCGTT-3’，
下游引物Strep R3：5’-TTACCGTCACTGTGTGAACTT-3’；
所述用于双歧杆菌属检测的引物对是上游引物Bifi F3与下游引物Bifi R4，该对引物扩增获得154bp双歧杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；其中，所述上游引物Bifi F3与下游引物Bifi R4的核苷酸序列为：
上游引物Bifi F3：5’-GTCCGGTGTGAAAGTCCATC-3’，
下游引物Bifi R4：5’-GTAACGGCCCAGAGACCT-3’。
2.权利要求1所述检测六种常见肠道微生物的引物组在利用PCR快速定性检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于：应用方法中涉及的步骤和条件是：
(2)配制PCR反应体系，其中每20μL反应体系中含有以下组分：0.2μL rTaq DNAPolymerase、2μL 10×PCR Buffer、1.6μL 10mM、dNTP Mixture、0.8±0.2μL上游引物、0.8±0.2μL下游引物、0.2±0.2μL DNA模板、14.4±0.6μL ddH2O；
(2)PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55±2℃退火30s，72℃延伸15±5s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：步骤(1)所述PCR反应体系选0.2μL rTaq DNAPolymerase、2μL 10×PCR Buffer、1.6μL 10mMdNTP Mixture、0.8μL上游引物、0.8μL下游引物、0.2μL DNA模板、14.4μL ddH2O。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于：步骤(2)所述PCR反应程序选94℃预变性3min；94℃变性30s，55.7℃退火30s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。
6.权利要求1所述检测六种常见肠道微生物的引物组在利用荧光定量PCR定量检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于：应用方法中涉及的步骤和条件是：
(1)荧光定量PCR反应体系配制，其中每20μL反应体系中含有以下组分：10μL TB GreenPremix Ex Taq、0.8±0.2μL上游引物、0.8±0.2μL下游引物、1±0.5μL DNA模板、7.4±0.9μL dd H2O。
(2)荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性35s；95℃变性10s，55±2℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环；Melt 60℃-95℃，6s。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：步骤(1)所述荧光定量PCR反应体系配制选10μL TB Green Premix Ex Taq、0.8μL上游引物、0.8μL下游引物、1μL DNA模板、7.4μL ddH2O。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于：步骤(2)所述荧光定量PCR反应程序选95℃预变性35s；95℃变性10s，55.7℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环；Melt 60℃-95℃，6s。
10.根据权利要求3或7所述应用，其特征在于：拟杆菌属特异性检测引物的上游引物Bacter F5与下游引物Bacter R6的浓度为5μM，乳杆菌科特异性检测引物的上游引物Lacter F5与下游引物Lacter R6的浓度为5μM，大肠杆菌特异性检测引物的上游引物E.coli F3与下游引物E.coli R4的浓度为2.5μM，肠球菌属特异性检测引物的上游引物Enter F3与下游引物Enter R4的浓度为2.5μM，链球菌属特异性检测引物的上游引物StrepF4与下游引物Strep R3的浓度为10μM，双歧杆菌属特异性检测引物的上游引物Bifi F3与下游引物Bifi R4的浓度为2.5μM。
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