CN112980975A - 一种具核梭杆菌的亚种检测和鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种具核梭杆菌的亚种检测和鉴定方法。具核梭杆菌与多种疾病密切关联，近期研究表明其可促进结直肠肿瘤发生发展。但目前还缺乏一种精确、直观的检测方法用来区别具核梭杆菌的不同亚种。具核梭杆菌不同亚种在生物学特性、定植及致病能力上均存在差异，因此精确的亚种鉴定对于了解其致病机制具有深远意义。本发明提供了一组用于鉴定具核梭杆菌亚种的特异性DNA序列，并设计了相应的检测引物，阐述了其在亚种水平检测和鉴定具核梭杆菌的应用。该发明可促进揭示病灶中具核梭杆菌的亚种构成及来源，将有助于探究不同亚种与疾病间的关系，及相关流行病学特征。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种具核梭杆菌的亚种检测和鉴定方法，尤其涉及一组具核梭杆菌亚种特异性DNA序列，并阐述了其在具核梭杆菌亚种水平检测和鉴定方面的应用。
背景技术
具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)是口腔中常见的定植菌，在特定条件下参与多种口腔疾病，如牙周炎、口腔肿瘤等。具核梭杆菌还可播散至口腔以外的其他身体部位，并引起多种与细菌感染相关的疾病，包括冠心病、肝脓肿、炎症性肠病、早产等各种妊娠并发症。尤其，近期发现结直肠癌患者的肿瘤组织及粪便中存在高丰度具核梭杆菌，且存在多种机制促进结直肠肿瘤发生发展，表明具核梭杆菌与结直肠肿瘤存在密切关联。
具核梭杆菌目前分为四个亚种，包括具核亚种(F.nucleatum subsp.nucleatum)、多形亚种(F.nucleatum subsp.polymorphum)、文氏亚种(F.nucleatum subsp.vincentii)和动物亚种(F.nucleatum subsp.animalis)。不同亚种具核梭杆菌的生物学习性、致病能力存在差异。但因缺乏有效的鉴别手段，不同亚种与疾病间的关系仍未得到充分的研究。具核梭杆菌单一菌株的亚种鉴定可通过对特定遗传标记基因(如16S rRNA基因、rpoB基因等)测序后经序列比对或进化分析完成。目前也有研究开发了基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的方法，但该方法需要有特定的昂贵设备，且准确度(约80％)存在一定欠缺。这些方法在分离培养成功后方可使用，而针对诸如粪便、肠道组织等含有大量混合菌体的样本，分离培养技术仍存在很大的限制，使得基于这类样本的分离培养需要较大的人力物力投入。此外，在这类样本中常用的16S rRNA基因扩增子测序、宏基因组测序等高通量测序技术尚无法达到亚种水平鉴定。
因此，目前还缺乏一种精确、直观的检测方法用来区别具核梭杆菌的不同亚种。具核梭杆菌不同亚种在生物学特性、定植及致病能力上均存在差异，因此精确的亚种鉴定对于了解其致病机制具有深远意义。
发明内容
针对现有技术不足，本发明的目的在于提供一种具核梭杆菌的亚种检测和鉴定方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一组特异性DNA序列在检测和鉴定具核酸杆菌亚种中的应用，所述特异性DNA序列包括SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6、SR-a1、SR-v1、SR-p1、SR-p2、SR-p3中的至少一种；
所述SR-n1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SR-n2的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述SR-n3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SR-n4的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述SR-n5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述SR-n6的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述SR-a1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述SR-v1的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述SR-p1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述SR-p2的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；所述SR-p3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
优选地，所述特异性DNA序列包括：
1)SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6中的至少一种；和
2)SR-a1；和
3)SR-v1；和
4)SR-p1与SR-p2或SR-p3的组合。
第二方面，本发明提供了一组特异性DNA序列在制备具核酸杆菌亚种的检测和鉴定产品中的应用，所述特异性DNA序列包括SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6、SR-a1、SR-v1、SR-p1、SR-p2、SR-p3中的至少一种；
所述SR-n1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SR-n2的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述SR-n3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SR-n4的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述SR-n5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述SR-n6的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述SR-a1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述SR-v1的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述SR-p1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述SR-p2的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；所述SR-p3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
或所述SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6、SR-a1、SR-v1、SR-p1、SR-p2、SR-p3的核苷酸序列为与相应的SEQ ID NO.1～11所示核苷酸序列具有80-99％相似性的同源序列。
优选地，所述特异性DNA序列包括：
1)SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6中的至少一种；和
2)SR-a1；和
3)SR-v1；和
4)SR-p1与SR-p2或SR-p3的组合。
根据前期的实验发现，SR-p1、SR-p2、SR-p3中任意一条序列均无法覆盖该亚种的全部已知菌株，只有组合使用才能实现对该亚种的全覆盖，而适用的组合必须为：SR-p1与SR-p2或SR-p3的组合。
优选地，所述具核酸杆菌亚种的检测和鉴定产品包括检测试剂盒、检测芯片。
优选地，用于扩增SR-n1的引物对序列如SEQ ID NO.12和13所示；用于扩增SR-n2的引物对序列如SEQ ID NO.14和15所示；用于扩增SR-n3的引物对序列如SEQ ID NO.16和17所示；用于扩增SR-n4的引物对序列如SEQ ID NO.18和19所示；用于扩增SR-n5的引物对序列如SEQ ID NO.20和21所示；用于扩增SR-n6的引物对序列如SEQ ID NO.22和23所示；用于扩增SR-a1的引物对序列如SEQ ID NO.24和25所示；用于扩增SR-v1的引物对序列如SEQID NO.26和27所示；用于扩增SR-p1的引物对序列如SEQ ID NO.28和29所示；用于扩增SR-p2的引物对序列如SEQ ID NO.30和31所示；用于扩增SR-p3的引物对序列如SEQ ID NO.32和33所示。
第三方面，本发明提供了一种具核梭杆菌的亚种检测和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待检测和鉴定的具核梭杆菌进行PCR扩增，对所得扩增产物进行分析和鉴定，即可；
所述进行PCR扩增采用的引物对包括序列如SEQ ID NO.14和15所示引物对、序列如SEQ ID NO.16和17所示引物对、序列如SEQ ID NO.18和19所示引物对、序列如SEQ IDNO.20和21所示引物对、序列如SEQ ID NO.22和23所示引物对、序列如SEQ ID NO.24和25所示引物对、序列如SEQ ID NO.26和27所示引物对、序列如SEQ ID NO.28和29所示引物对、序列如SEQ ID NO.30和31所示引物对、序列如SEQ ID NO.32和33所示引物对中的至少一对引物对。
优选地，所述进行PCR扩增采用的引物对包括：
序列如SEQ ID NO.14和15所示引物对、序列如SEQ ID NO.16和17所示引物对、序列如SEQ ID NO.18和19所示引物对、序列如SEQ ID NO.20和21所示引物对、序列如SEQ IDNO.22和23所示引物对、序列如SEQ ID NO.24和25所示引物对中的一对引物对；和
序列如SEQ ID NO.26和27所示引物对、序列如SEQ ID NO.28和29所示引物对；
以及序列如SEQ ID NO.28和29所示引物对和序列如SEQ ID NO.30和31所示引物对或序列如SEQ ID NO.28和29所示引物对的组合。
本发明提供了一组特异性DNA序列在生物信息学分析中的应用。例如通过序列比对鉴定已测序菌株的亚种，或在宏基因组测序数据中分析是否存在某一亚种。
本发明提供的所有引物均可应用于普通PCR及实时定量PCR。
与现有技术相比，本发明实施例具有如下有益效果：
1、本发明提出的方法适用于单一菌株样本或含混合菌体的样本，如粪便、离体组织等。可根据PCR结果直接进行判读，不需要额外的测序和数据分析工作，在目前所测试的菌株中准确度可达到100％。
2、本发明可促进揭示病灶中具核梭杆菌的亚种构成及来源，将有助于探究不同亚种与疾病间的关系，及相关流行病学特征。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为使用亚种特异性引物在梭杆菌菌株中进行亚种鉴定的结果；
图2为使用亚种特异性引物在组织样本中进行检测的结果；
图3为使用亚种特异性片段用于基因组分析的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1：亚种特异性DNA序列的获得
本实施例首先通过比较基因组学获得具核梭杆菌的亚种特异性DNA序列。具体方法为，从NCBI公共数据库中下载已测序的具核梭杆菌菌株(如图3所示)基因组，包括完成图和草图；应用kSNP软件构建全基因组进化树，确定分属不同亚种的菌株；使用PGAP软件对所有纳入的基因组进行泛基因组分析。从所得的基因聚类簇(gene cluster)中，选出在某一具核梭杆菌亚种的所有菌株中保守存在，但在其他亚种中均不存在的基因。将对应基因序列与NCBI核苷酸数据库进行比对，观察其是否在其他亚种中、以及除具核梭杆菌之外物种中存在同源序列，确认其是否对该亚种真正特异。最后，排除含有插入、截断以及拷贝数在菌株间存在较大差异的基因。将最终通过筛选的基因定义为该亚种特异性的DNA片段。若某亚种通过上述方法无法获得特异性DNA片段，则对基因间序列进行上述的类似分析。若依然无法获得特异性DNA片段，则在只在该亚种中出现、但未覆盖该亚种全部菌株的特异性基因中，挑选能够覆盖全部菌株的基因组合。最终我们获得可用于表征不同亚种的特异性DNA片段，各片段的代表性序列结果(图3)显示各特异性片段仅在对应亚种的具核梭杆菌基因组中出现(存在同源序列)，未在其他亚种出现。说明相应DNA片段可用于表征具核梭杆菌亚种。其中，SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6均为具核亚种(subsp.nucleatum)亚种特异性片段；SR-a1为动物亚种特异性(subsp.animalis)片段；SR-v1为文氏亚种特异性(subsp.vincentii)片段；SR-p1、SR-p2、SR-p3为多形亚种特异性(subsp.polymorphum)片段。SR-p1须与SR-p2或SR-p3组合使用。由于DNA序列存在不可避免的多态性，因无法穷举，此处所指的DNA特征序列包含以下序列及与下列任一段序列具有核苷酸序列相似性的未列出的片段。
进一步，在此基础上对各特异性片段所对应的所有已知序列进行多序列比对，在相对保守的区域设计扩增引物，序列如下表1(均为5`至3`)所示：
表1.具核梭杆菌亚种鉴定引物
上述引物对可通过扩增对应的DNA片段，用于具核梭杆菌亚种水平检测和鉴定。其中，具核亚种、文氏亚种和动物亚种的对应引物可单独或组合应用于亚种鉴定；但多形亚种需要P1+P2或P1+P3引物组合使用。
实施例2亚种特异性引物在单一菌株样本中应用示例
提取如图1中所列的亚种已知的具核梭杆菌菌株的总DNA。使用表1中的亚种特异性引物进行PCR扩增。另使用人全血DNA作为PCR负控制，使用16S rRNA基因扩增引物(27F和1429R)作为细菌DNA模板正控制。琼脂糖凝胶电泳结果(图1)显示各特异性引物在对应亚种的具核梭杆菌菌株中的相应位置有单一的特异性扩增条带，在其他亚种及其他梭杆菌菌种中无扩增。在10株覆盖4个亚种的具核梭杆菌菌株的检测中，检测结果与菌株亚种分类完全一致，准确度为100％。
实施例3亚种特异性引物在含混合菌体样本中的应用示例
以20位结直肠癌患者的肿瘤组织为例。提取组织DNA，使用表1中的亚种特异性引物进行PCR扩增。另使用16S rRNA基因V6区的通用引物作为DNA模板正控制，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。nucleatum亚种6对引物的结果存在差异，但相对一致，其中N3-F/R和N4-F/R的结果完全一致。其他引物的阳性扩增未能完全覆盖N3-F/R和N4-F/R有阳性扩增的菌株，推测在复杂菌群背景下它们可能在敏感性上存在差异；另有个别引物(N1-F/R和N5-F/R)在其他引物为阴性扩增的菌株中获得阳性扩增，推测它们可能在特异性方面存在一定不足。另外，polymorphum亚种P1+P2与P1+P3引物组合的结果基本一致。整体应用结果表明，结直肠癌肿瘤组织中具核梭杆菌的亚种组成存在广泛多样性，有的样本仅含有单一具核梭杆菌亚种，有的样本含有多种亚种，有的样本中则未检测到具核梭杆菌的存在。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110> 上海市第十人民医院
<120> 一种具核梭杆菌的亚种检测和鉴定方法
<130> SHX1140I
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaaagt tattaatata tttattagga attttaggtg ttttacttct tgtttcttgt 60
ggtgaaggta aagttgatga aagtcgtatt tatcatatag attttccatt ttatgataga 120
gatggaagta caaaacaaat tacagtagaa ttatatgttg ttagacctga tgggaaagat 180
tatccagatg gtttaaagaa ttttattaaa aatcaagtaa aaaattataa agagccttta 240
gcaaaggctt tatatttaca agaagattta ttctattttg ttcctttatc tgtttatgat 300
gttgatgtcc aagaagaaat taacaaatat ttagaagata atggttatag tttggaaata 360
tcaaaaggaa tagatagtct tgatatatct aagtacagac ctactagaga aaatgaacaa 420
gatttatata tacagcttat agaacttggg aaaaaagaca attattttca agatagatat 480
tttttgtata cttatgttaa aaacaaatag 510
<210> 2
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtttaaat atattaaata tatttatgaa atatatgaga atcaaagttt ttcaaaagct 60
gctaaaaaat tatatatatc tcaacctgct ttaagtagta taataaaaaa agctgaagat 120
gagttacaac ttcctatatt tgaccgaagt acaaacccca tctcattaac agaagctggc 180
gaatactata ttacagctgc aaaagaaata atagaaattg aaaataaaat aaaacataaa 240
tttaaagaac taagaacttc tatagaagat agcttttcta taggtggttc tacatttttt 300
tgtacacatg tgctcccaaa tttagttgat gcttttactg atttatattc taactactct 360
ataaaagtta tagaagccaa tgcagatgaa ttatcaaaat gtttgaaatc tgatattgtg 420
gatttaatca tagatgtaga aatgttggat ttaaatattt ttaattctat aaaatgggct 480
tctgaaaata taatccttgc tgttccttca caatttcata ttaataaaaa acttcaagaa 540
tataaatttt cttttgagca aataaaaaca ggagaatatc taaaagaaaa atataaaagt 600
gtaaatttaa aatattttaa agatgaacct tttatctttt taaaaaatgg aaatgatatg 660
tattcaagag gtcttagaat gtgtaaaaaa gcaaactata gtcctaatat aattatgtat 720
atggatcaac tgttaacttc ttattatgtt tctaaattag gaaatggaat ttcctttatt 780
agggacacaa ttactaaata tgaggatcct acagataaat tagtctttta taaaatagat 840
gatattgaag ccacacgtaa tattatgtta tactataaaa aaaatattaa attatctgaa 900
gttactaaaa aatttatatc ttttataact aataatattt tataa 945
<210> 3
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgaaagaaa ataataaagt aatacctcaa ggaaaatata ttccagcaaa aagatgtgga 60
aatttagttt ttactgctgg aatgacacca agaaataatg gtgttttaat tatggaaggt 120
aaaatagata ataatgaacc attagaaaaa tatattatta ctgtagaaca agcaactgaa 180
aatgctttaa aagcaataaa aaatatatta tctaaagatg aagtaattgt tgatatttta 240
tctctaaatg tatatgtcaa ttcagaaaat aattttaaaa aacatagtaa attggctgat 300
tttgcaagtg aatatttatt taaagaacta ggtgaaatag gaattgcaag tcgtacttca 360
gtaggtgtaa tttccttacc tggaaatgca cctgtggaaa ttcaaattat tgcagcaata 420
gaataa 426
<210> 4
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgagtatgg ttgaagaaaa atttaaaaaa cttggagttg aaaatgcacc aggacaagaa 60
ttattacaaa aaggagtaaa attagattta aaaggtgaaa aaattttagg cgaaaaaata 120
gatttttcac atggagatgt agatgcacat aagccattac ctaattcttt agagcttttt 180
attgaaggct ttaataaagg aggtattcaa gcatatacag aatacaaagg taataaagag 240
ataagggaat atatagcagg aaaattatca gaatacatta aaatgaatat acctgctgat 300
aacttaatta ttactcctgg aacacaggga gccttatttt tagctactgg ctctttaatt 360
acaagaggaa ctaaagtatc aatagttgag cccgattatt ttgctaatag aaaattagta 420
gaattttttg aaggagaaat agtccctata gaattagatt attttaatgt aaatgaaaaa 480
aaagctggat taaatttaaa gcaattggaa gaagctttta aatcaggggt agaattattt 540
ttgttttcaa atcctaataa ccctacaggt gtaatttact cagatgaaga aattaccgaa 600
attgctagat tagtaaataa atataatgtg acagtaattg cagatgagct atattcaaga 660
caaatttttg ataatagaga attttatcat ttaataacaa aaaatataaa tcaagataaa 720
ctaataacca ttataggacc ttcaaaaaca gaatctttaa gtggatttag attaggaatt 780
gcttatggtt ctcctactat aataaaaaga atggaaaaac ttcaagcaat tacaactttg 840
agaactgcag gatataacca agctgtttta aaatcttggt tttctgaacc agatggattt 900
atgaaggata gaatagaaaa acatcaagcc ataagagata atttaattga aaaatttaaa 960
actattgatg gtattaaaat aagaaaaact gaagcaggga gctacatttt tcctactctt 1020
ccagagttag aagtaaattt aggagatttt gtaaaaattt taagaattta tgcaaatgta 1080
atagttaccc ctggaacaga atttggaaaa agcttcataa atagcattag attaaatttt 1140
tcacaagatg aaaaaaaggc tgctgaaggt gtagatagaa ttttagaaat gataaggagg 1200
tataaaaagt ga 1212
<210> 5
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaaaccta tttggcaaag acaaaataat acagatgata actcaacaaa ttttatttat 60
aattgtaatt ccttagatga aataattaaa gtatctaaat ctaaaaatct tgatttaaat 120
tatgtattac atagatggta taattttaaa acttctgatg cctgtgaaaa aatctttgaa 180
ttttatggag ctatcaaaga aaaaaatccc actcatcatg atattgattt ctatattgca 240
aacgagcctt ttgatttaaa acttactgtc tatccctatg ctttaaaaaa tactggaata 300
tattatgatt taacaaaaac taatgaaaaa aataaactta tagaatggtt ttacttaaac 360
caatctcaac aaaatcgtaa acatatgaaa aataggattt ttattgtgtg tgatggtagt 420
aataatatga aattaaaatc agatttttct aaaatttgta aagaagttaa attatggata 480
gaaccctact tgaataaaga aaaaactcct tcttttaata cattaataat taaagatatt 540
gatgataaag aatacactgt aaaaagtgat ataattctca taacagatta a 591
<210> 6
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgataaatc agcaaaatgc tcaaagattt cttgatagtc aactgcaggg acagctagaa 60
gttgatagac aacgaagaga aagagaagct gctgctgcac aacaatatca agaaccaaga 120
gatgatagaa tatatcatag atatgcagtc tttgtatgga atgaggatac aggacatttt 180
tatggtttcc ctgagctttt aatgacacct agtaatagca gtaaaaaagc agctattaaa 240
ttggctaaaa aagaatttag aaggataggt aatgcagatg gacttgatat taaagcaact 300
aatcatctta tctgggatgg tggacttaga tatattgttg ttatgggaac aaataaaaaa 360
actggaaaat gggaagcttt tacaaaattt gaagtagatg atgaaaatat aaaaatttta 420
ataaataaat gtagcgaaac ttgtgataat tgtgactttt cttggtctaa ctaa 474
<210> 7
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggcaaaaa ttataatgtt ggaaaaaaat ggtgtccaaa aacaaggttt tgttggtttt 60
agttggacaa tgctcttctt tggatttttt gttccattat ttagaggaga ttttaaatgg 120
cttttaatta cccttatatt aatgtttctt agttttggat tagctcagtt catattatgt 180
tttctttata ataaatttta cacaataaat ttgctggaac agggctataa accagcagat 240
gattattctg aaaatatttt aaatatgaaa ggaatatata gagcatag 288
<210> 8
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgaggctatt gcaaattaaa ctgttaaaat gaaaataaaa aatttagcta gtactgaaca 60
atttttttat tttatttaga agtttgcaac agtctcattt atttagttta taatagtggt 120
aaag 124
<210> 9
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgaaaaaga aaataatttt atttatattt cttatattag gaaatctttt agaagcaaaa 60
acatactgta aagtagttag tgagtttgga ctacttaaag aagaaactct tacaaaggca 120
attcaagaag aagaaaagaa gggtgcagag tttgtaacta ttacagtaga taatgaaact 180
gcatatataa tatttaaaac taaaaaataa 210
<210> 10
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgaaaatta taaaaaaatg tttaatgttt atattaatga tatttgcttt cacttcttgt 60
tcattgttat ttccagagtc agaaccagaa gtatcaactg taaatacacc acaatcattt 120
acaagagcac aaaaaagagt ggctatagtt aatggtacag attatattag aagaaaggta 180
gcagatcaat tatcaaatag aggttggaaa gtttcaggag caatgacagg aaaagaaact 240
tttgcaattt actttgatca attagatgaa ataactacaa caactaaatc tagaacagat 300
tattatgatg gttatggtag ctataaaggt tcaggcccaa caagtacaag tgtatcaaaa 360
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gatattacta gggacagtga agatagaatt atacaaggta taatagcagc tatggataaa 480
gttgaagaac aaatgagata g 501
<210> 11
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgctttttc caattgatag attacaattt attgataata ctttaattgc atatgaattt 60
attgatattt ctgataaaag attaaataaa gatggaaata accatgaatt tatgagattt 120
aaaattaatt atttgagtga aacctttaaa gataattttt acttaataca atataatata 180
gatgaagata tatattgtat tggaaaacag catataaaaa tgaataaaga tgaatttaag 240
gagtggttta tagaaaaaaa taattgctca aatatttgtg cttcatcact aaacagcaaa 300
cctctaggtt cagcaacttc aaatttaggg gatccatatg ttcaaaaaat attacaagaa 360
atttataaag aaaaaaatga atttaaaaat gtagattttt ttaatgatga taatggatta 420
atactagttc aaaatattct aaatggtgaa aatacctatg gttttgattt tgacttattt 480
gaaagttcag aaaatatagt tattgaattt ttaaaaaggg atagttcatt tacaactaac 540
ttaacagctc atcctaatag atatttacaa aattatcata aatttcttag tttatggaat 600
gcagcaaatt taataaaaaa ggaagaaaca aatttatttt tagtaaatta tagtgatgat 660
cctaaagaag caataaatct aataaaagta ctggaattta ataaagaagc ttcttctgga 720
aaggttggaa taatctcaga tattagttat cagttttctg gttattttga atttctaaat 780
tggttaaaaa aattgaataa taatgctcaa gaggctttaa ttactttgga aaattttcct 840
aaagaaatta gaaataatga cttttggaaa ggctttggag atggaaagag tagtagtgca 900
aaagaaataa agaagagaat tggaaaaaat tatcagaaat attaa 945
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gagatggaag tacaaaacaa attacagtag 30
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcttggacat caacatcata aacaga 26
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagttacaac ttcctatatt tgaccga 27
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaacatttt gataattcat ctgcat 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caagcaactg aaaatgcttt aaaag 25
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tccaggtaag gaaattacac ctactg 26
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gggagctaca tttttcctac tcttcc 26
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tctatctaca ccttcagcag ccttt 25
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaacttactg tctatcccta tgctttaa 28
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctttattcaa gtagggttct atccataat 29
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gatagacaac gaagagaaag agaagct 27
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtatcctcat tccatacaaa gactgc 26
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttggtttyag ttggacaatg ctctt 25
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
catctgctgg tttatarccc tgt 23
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaggctattg caaattaaac tgttaaa 27
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctttaccact attataaact aaataaatga gac 33
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttaggaaatc ttttagaagc aaaaaca 27
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tctactgtaa tagttacaaa ctctgcwcc 29
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tkgctttcac ttcttgttca ttgtt 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tagcyayyct tttttgtgct cttgt 25
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cytatggytt tgattttgac ttatttg 27
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ccaaagtaat taaagcctct tgagc 25
Claims (9)
1.一组特异性DNA序列在检测和鉴定具核酸杆菌亚种中的应用，其特征在于，所述特异性DNA序列包括SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6、SR-a1、SR-v1、SR-p1、SR-p2、SR-p3中的至少一种；
所述SR-n1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SR-n2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述SR-n3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SR-n4的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述SR-n5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述SR-n6的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述SR-a1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述SR-v1的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述SR-p1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述SR-p2的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；所述SR-p3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
或所述SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6、SR-a1、SR-v1、SR-p1、SR-p2、SR-p3的核苷酸序列为与相应的SEQ ID NO.1～11所示核苷酸序列具有80-99％相似性的同源序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性DNA序列包括：
1)SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6中的至少一种；和
2)SR-a1；和
3)SR-v1；和
4)SR-p1与SR-p2或SR-p3的组合。
3.一组特异性DNA序列在制备具核酸杆菌亚种的检测和鉴定产品中的应用，其特征在于，所述特异性DNA序列包括SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6、SR-a1、SR-v1、SR-p1、SR-p2、SR-p3中的至少一种；
所述SR-n1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SR-n2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述SR-n3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SR-n4的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述SR-n5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述SR-n6的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述SR-a1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述SR-v1的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述SR-p1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述SR-p2的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；所述SR-p3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
或所述SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6、SR-a1、SR-v1、SR-p1、SR-p2、SR-p3的核苷酸序列为与相应的SEQ ID NO.1～11所示核苷酸序列具有80-99％相似性的同源序列。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性DNA序列包括：
1)SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6中的至少一种；和
2)SR-a1；和
3)SR-v1；和
4)SR-p1与SR-p2或SR-p3的组合。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述具核酸杆菌亚种的检测和鉴定产品包括检测试剂盒、检测芯片任一种。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用于扩增SR-n1的引物对序列如SEQ IDNO.12和13所示；用于扩增SR-n2的引物对序列如SEQ ID NO.14和15所示；用于扩增SR-n3的引物对序列如SEQ ID NO.16和17所示；用于扩增SR-n4的引物对序列如SEQ ID NO.18和19所示；用于扩增SR-n5的引物对序列如SEQ ID NO.20和21所示；用于扩增SR-n6的引物对序列如SEQ ID NO.22和23所示；用于扩增SR-a1的引物对序列如SEQ ID NO.24和25所示；用于扩增SR-v1的引物对序列如SEQ ID NO.26和27所示；用于扩增SR-p1的引物对序列如SEQ IDNO.28和29所示；用于扩增SR-p2的引物对序列如SEQ ID NO.30和31所示；用于扩增SR-p3的引物对序列如SEQ ID NO.32和33所示。
7.一种具核梭杆菌的亚种检测和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待检测和鉴定的具核梭杆菌进行PCR扩增，对所得扩增产物进行分析和鉴定，即可；
所述进行PCR扩增采用的引物对包括序列如SEQ ID NO.14和15所示引物对、序列如SEQID NO.16和17所示引物对、序列如SEQ ID NO.18和19所示引物对、序列如SEQ ID NO.20和21所示引物对、序列如SEQ ID NO.22和23所示引物对、序列如SEQ ID NO.24和25所示引物对、序列如SEQ ID NO.26和27所示引物对、序列如SEQ ID NO.28和29所示引物对、序列如SEQ ID NO.30和31所示引物对、序列如SEQ ID NO.32和33所示引物对中的至少一对引物对。
8.根据权利要求7所述的具核梭杆菌的亚种检测和鉴定方法，其特征在于，所述进行PCR扩增采用的引物对包括：
序列如SEQ ID NO.14和15所示引物对、序列如SEQ ID NO.16和17所示引物对、序列如SEQ ID NO.18和19所示引物对、序列如SEQ ID NO.20和21所示引物对、序列如SEQ IDNO.22和23所示引物对、序列如SEQ ID NO.24和25所示引物对中的一对引物对；和
序列如SEQ ID NO.26和27所示引物对、序列如SEQ ID NO.28和29所示引物对；
以及序列如SEQ ID NO.28和29所示引物对和序列如SEQ ID NO.30和31所示引物对或序列如SEQ ID NO.28和29所示引物对的组合。
9.一组如权利要求1所述的特异性DNA序列在生物信息学分析中的应用。
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