CN110903999B - 一株人类肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株THCT6b3，该菌株的16SrRNA基因序列具体如SEQ ID NO:1所示。该菌株分类命名为Fusobacterium nucleatum subsp.animalis，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019367，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。本发明还提供了该菌株在肠道具核梭杆菌检测中的应用，首次建立基于PCR的具核梭杆菌动物亚种分子鉴定方法。本发明可促进揭示结直肠癌患者中肠道具核梭杆菌的构成及来源，并将有助于分析具核梭杆菌的分子流行病学特征。

Description

一株人类肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用

技术领域

本发明涉及具核梭杆菌领域，具体涉及一株肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株及其在肠道具核梭杆菌检测中的应用。

背景技术

具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)是人类共生菌，为革兰阴性专性厌氧菌，在口腔中定植；同时是条件致病菌，在牙周病中起主导作用，常在龈下菌斑中分离得到。具核梭杆菌还可引起身体其他部位感染，包括脑、肺、肝、血液、关节、胸、腹、宫内等。具核梭杆菌目前可分为四个亚种，包括具核亚种(F.nucleatum subsp.nucleatum)、多形亚种(F.nucleatumsubsp.polymorphum)、文氏亚种(F.nucleatumsubsp.vincentii)和动物亚种(F.nucleatumsubsp.animalis)。

肠道中的具核梭杆菌可促进结直肠癌的发生发展。具核梭杆菌能够通过Fap2与肿瘤细胞过表达的Gal-GalNAc结合而在肿瘤微环境中富集。具核梭杆菌的FadA黏附素能够结合结直肠癌细胞的E-cadherin，激活了细胞内的β-catenin信号，差异性调节炎症和致癌反应。具核梭杆菌与免疫细胞之间的相互作用亦参与大肠癌发病过程。具核梭杆菌的Fap2能够作用于TIGIT受体，保护肿瘤细胞免受免疫攻击；而TIGIT是人类NK细胞上的抑制性受体，能对多种T细胞产生抑制效应。

具核梭杆菌非肠道定植菌，并非所有结直肠癌患者肠道中都存在具核梭杆菌，因此通过检测患者肠道中具核梭杆菌的存在情况及丰度高低，将有助于对患者进行细分，有针对性的制定干预策略。但于肠道菌群种类繁多、组成结构复杂，难以通过分离培养方法获得单一菌株；且肠道中具核梭杆菌可能由多亚种多克隆构成，更无法一一分离获得。难以追溯其来源及播散。

肠道菌群鉴定的方法包括培养、定量PCR、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、16S rRNA基因的末端限制性片段分析(T-RFLP)、荧光原位杂交(FISH)、DNA芯片、16S rRNA基因克隆测序、16S rRNA高通量测序和宏基因组测序。目前16S rRNA测序和宏基因组测序是最为常用的方法，可以直观全面地反映肠道菌群的组成，但价格比较昂贵，产生的大量测序数据需要高性能计算机进行解析，若用于临床则经济成本较高，难以推广，而且其只能检测到梭杆菌的属(genus)水平，无法达到种(species)水平的分辨率。而qPCR是相对经济、简单、快速、并能够准确定量特定细菌丰度的方法。但qPCR检测对扩增位点的选择和扩引物的设计有着极高的要求。目前已知的具核梭杆菌检测引物及探针，缺乏足够特异性，对Fusobacteriumhwasookii和Fusobacterium periodonticum亦有阳性扩增，同时也无法在具核梭杆菌亚种水平进行区分。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了一株肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株及其在肠道具核梭杆菌检测中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一株肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株，命名为THCT6b3，该菌株的16SrRNA基因序列具体如下所示：

>16S_rRNA_gene THCT6b3[CCTCC M 2019367]

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGACAGAATGCTTAACACATGCAAGTCAACTTGAATTTGGGTTTTTAACTTAGATTTGGGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAAAGAACTTGCCTCACAGCTAGGGACAACATTTAGAAATGAATGCTAATACCTGATATTATGATTTTAAGGCATCTTAGAATTATGAAAGCTATAAGCACTGTGAGAGAGCTTTGCGTCCCATTAGCTAGTTGGAGAGGTAACAGCTCACCAAGGCGATGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACAAGGGGACTGAGACACGGCCCTTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGACCGAGAGTCTGATCCAGCAATTCTGTGTGCACGATGAAGTTTTTCGGAATGTAAAGTGCTTTCAGTTGGGAAGAAAAAAATGACGGTACCAACAGAAGAAGTGACGGCTAAATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGTCACGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGTCTAGGTGGTTATGTAAGTCTGATGTGAAAATGCAGGGCTCAACTCTGTATTGCGTTGGAAACTGTATAACTAGAGTACTGGAGAGGTAAGCGGAACTACAAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTTGTAGGAATGCCGATGGGGAAGCCAGCTTACTGGACAGATACTGACGCTAAAGCGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGATTACTAGGTGTTGGGGGTCGAACCTCAGCGCCCAAGCAAACGCGATAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGTACGCAAGTATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAGGAACCTTACCAGCGTTTGACATCTTAGGAATGAGATAGAGATATTTCAGTATCCCTTCGGGGAAACCTAAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTTTCGTATGTTACCATCATTAAGTTGGGGACTCATGCGATACTGCCTACGATGAGTAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATACGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGTAGAACAGAGAGTTGCAAAGCCGTGAGGTGAAGCTAATCTCAGAAAACTATTCTTAGTTCGGATTGTACTCTGCAACTCGAGTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGGTTGCACCTGAAGTAGCAGGCCTAACCGTAAGGAGGGATGCTCCGAGGGTGTGATTAGCGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTATCCGTACGGGAACGTGCGGATGGATCACCT(SEQID NO:1)。

进一步地，该菌株的分类命名为Fusobacterium nucleatum subsp.animalis，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019367，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。

进一步地，该菌株分离自新鲜的直肠腺癌手术切除标本，分离培养基为CrystalViolet Erythromycin agar(结晶紫红霉素琼脂)。

进一步地，该菌株在厌氧条件下生长，哥伦比亚血平板上培养7天菌落呈白色、圆形、半透明、中间有凸起的相对较小菌落。

进一步地，该菌株革兰染色后镜下为红色，呈典型梭杆菌形态，菌体间可见线性串联排布。

本发明的第二个方面是提供用于鉴定该具核梭杆菌动物亚种菌株的6个特异性DNA序列，包括如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的其中一种或几种。

进一步地，该用于鉴定该具核梭杆菌动物亚种菌株的6个特异性DNA序列的扩增引物序列分别如SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:19所示。

本发明的第三个方面是提供用于鉴定具核梭杆菌动物亚种的特异性DNA序列，包括如SEQ ID NO:20～SEQ ID NO:22所示的序列的一种或几种或包含SEQ ID NO:20～SEQID NO:22所示的序列及与SEQ ID NO:20～SEQ ID NO:22所示的序列具有BLASTn相似性的片段。

进一步地，该用于鉴定具核梭杆菌动物亚种的特异性DNA序列SEQ ID NO:20～SEQID NO:22的扩增引物序列分别如SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:28所示。

进一步地，该三对引物可应用于普通PCR和实时定量PCR。

进一步地，该三段特异性DNA序列及对应引物对即可单独使用亦可组合使用，可对单一培养菌体样本或含混合菌体的样本进行鉴定。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明提供的具核梭杆菌动物亚种THCT6b3直接来源于直肠腺癌组织。此外，在具核梭杆菌动物亚种THCT6b3基础上首次建立基于PCR的具核梭杆菌动物亚种分子鉴定方法。本发明可促进揭示结直肠癌患者中肠道具核梭杆菌的构成及来源，并将有助于分析具核梭杆菌的分子流行病学特征。

附图说明

本发明公开的一株肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株THCT6b3，其已进行保藏，分类命名为Fusobacterium nucleatum subsp.animalis，其保藏编号为CCTCC NO：M2019367，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。

图1为本发明一实施例中使用THCT6b3特异性引物在梭杆菌菌株中鉴定THCT6b3菌株的琼脂糖凝胶电泳结果图；

图2为本发明一实施例中使用A2124-F/A2124-R引物在梭杆菌菌株中鉴定具核梭杆菌动物亚种菌株的琼脂糖凝胶电泳结果图；

图3为本发明一实施例中使用A2140-F/A2140-R引物在梭杆菌菌株中鉴定具核梭杆菌动物亚种菌株的琼脂糖凝胶电泳结果图。

图4为本发明一实施例中使用A2134-F/A2134-R引物在梭杆菌菌株中鉴定具核梭杆菌动物亚种菌株的琼脂糖凝胶电泳结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例一

本实施例提供一株肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株THCT6b3。

该菌株现已被保藏，分类命名为Fusobacterium nucleatumsubsp.animalis，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019367，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

该菌株的16SrRNA基因序列具体如SEQ ID NO:1所示，与F.nucleatumsubsp.animalis菌株JCM 11025的16SrRNA基因序列(NCBI登录号NR_113378.1)有99.80％一致性，与F.nucleatum subsp.nucleatum菌株ATCC 25586的16SrRNA基因序列(NCBI登录号NR_114702.1)有98.38％一致性。

该菌株的全基因组测序表明该菌株含有一条环状染色体，为2268559bp，GC含量27.32％，含2115个蛋白编码基因，63个非编码基因(45个tRNA基因、5套5S-16S-23SrRNA基因和3个sRNA基因)。该菌株的全基因组经Jspecies软件分析其相对F.nucleatumsubsp.nucleatum菌株ATCC 25586(NCBI基因组登录号：GCA_003019295.1)的全基因组ANIb值为90.89，相对F.nucleatum subsp.animalis菌株7_1(NCBI基因组登录号：GCA_000158275.2)的全基因组ANIb值为97.37，说明其属于动物(animalis)亚种。ANIb，即average nucleotide identity using BLAST(基于BLAST的平均核苷酸序列一致性)，是一种评价菌株亲缘性的指标，一般认为≥95即同属一种(species)。

实施例二

本实施例提供六段用于鉴定实施例一中的具核梭杆菌动物亚种菌株THCT6b3的特异性DNA序列。

通过比较基因组学分析，该六段用于鉴定该菌株的特异性DNA序列：THCT6b3_specific_region_1～THCT6b3_specific_region_6，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:19所示。

在该六段用于鉴定该菌株的特异性DNA序列的基础上设计的扩增引物的序列如SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:19所示，分别如下(均为5’至3’)：

上述六对引物可通过扩增对应的DNA片段，用于THCT6b3的特异性识别。六对引物可应用于普通PCR和实时定量PCR。上述六段序列及对应引物对即可单独使用亦可组合使用。

实施例三

本实施例提供可用于鉴定具核梭杆菌动物亚种的特异性DNA序列。

具体的获得上述用于鉴定具核梭杆菌动物亚种的特异性DNA序列的方法为：从NCBI下载具核梭杆菌基因组，并结合THCT6b3基因组；按ANIb值进行亚种分类；进而在动物亚种基因组中通过BLASTn分析，找到在所有菌株中保守存在的区域；将这些保守区域与其他亚种基因组进行BLASTn分析，保留在其他亚种基因组中不存在的区域；从而获得亚种特异性DNA序列。

三段特异性DNA序列：animalis_specific_region_1～animalis_specific_region_3，分别如SEQ ID NO:20～SEQ ID NO:22所示。该亚种特异性DNA序列包括如如SEQID NO:20～SEQ ID NO:22所示的序列或包含SEQ ID NO:20～SEQ ID NO:22所示的序列及与SEQ ID NO:20～SEQ ID NO:22所示的序列具有BLASTn相似性的片段。

该三段DNA序列对应的PCR扩增引物如下所示(均为5’至3’)：

animalis_specific_region_1	A2124-F	AGGAATGACAACAACAAACACTATTACTA
				A2124-R	TTTTACAACTTTYACCACTGATTTACC
animalis_specific_region_2	A2140-F	ACTCAAATTATTATGAATGTGATGAAAGA
				A2140-R	GCTACTGAAGGATGAAATGCTGG
animalis_specific_region_3	A2134-F	TTTCTTTATCCTGTTGTTTATGTGATTAA
				A2134-R	ACAATTTCTATATTGCCAATATATGAGATT

上述三对引物可通过扩增对应的DNA片段，用于具核梭杆菌动物亚种的鉴定。三对引物可应用于普通PCR和实时定量PCR。上述三段序列及对应引物对即可单独使用亦可组合使用。

应用实施例一

本应用实施例以THCT6b3特异性引物为例鉴定THCT6b3菌株。步骤为：制备表1中所列菌株的总DNA，使用引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。

表1.实验所用梭杆菌菌株

由图1可知，该对引物只在THCT6b3菌株中在对应位置有阳性扩增，在其他梭杆菌菌种中无扩增。所以，引物的特异性良好，无非特异性扩增。

应用实施例二

本应用实施例以动物亚种鉴定引物A2124-F/A2124-R为例鉴定具核梭杆菌动物亚种。步骤为：制备表1中所列菌株的总DNA，使用引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。

由图2可知，该对引物只在具核梭杆菌动物亚种的菌株中在对应位置(112bp)有阳性扩增，在其他梭杆菌亚种中无扩增。所以，该引物对的特异性良好，无非特异性扩增。

应用实施例三

本实施例以动物亚种鉴定引物A2140-F/A2140-R为例鉴定具核梭杆菌动物亚种。步骤为：制备表1中所列菌株的总DNA，使用引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。

由图3可知，该对引物只在具核梭杆菌动物亚种的菌株中在对应位置(125bp)有阳性扩增，在其他梭杆菌亚种中无扩增。所以，该引物对的特异性良好，无非特异性扩增。

应用实施例四

本应用实施例以动物亚种鉴定引物A2134-F/A2134-R为例鉴定具核梭杆菌动物亚种。步骤为：制备表1中所列菌株的总DNA，使用引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。

由图4可知，该对引物只在具核梭杆菌动物亚种的菌株中在对应位置(224bp)有阳性扩增，在其他梭杆菌亚种中无扩增。所以，该引物的特异性良好，无非特异性扩增。

由以上应用实施例可知，本发明提供的特异性DNA序列可用于肠道具核梭杆菌的鉴定，尤其是亚种水平及菌株水平的鉴定。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海市第十人民医院

<120> 一株人类肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1507

<212> DNA

<213> 16S_rRNA_gene THCT6b3 [CCTCC M 2019367]

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct gacagaatgc ttaacacatg caagtcaact 60

tgaatttggg tttttaactt agatttgggt ggcggacggg tgagtaacgc gtaaagaact 120

tgcctcacag ctagggacaa catttagaaa tgaatgctaa tacctgatat tatgatttta 180

aggcatctta gaattatgaa agctataagc actgtgagag agctttgcgt cccattagct 240

agttggagag gtaacagctc accaaggcga tgatgggtag ccggcctgag agggtgaacg 300

gccacaaggg gactgagaca cggcccttac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360

gacaatggac cgagagtctg atccagcaat tctgtgtgca cgatgaagtt tttcggaatg 420

taaagtgctt tcagttggga agaaaaaaat gacggtacca acagaagaag tgacggctaa 480

atacgtgcca gcagccgcgg taatacgtat gtcacgagcg ttatccggat ttattgggcg 540

taaagcgcgt ctaggtggtt atgtaagtct gatgtgaaaa tgcagggctc aactctgtat 600

tgcgttggaa actgtataac tagagtactg gagaggtaag cggaactaca agtgtagagg 660

tgaaattcgt agatatttgt aggaatgccg atggggaagc cagcttactg gacagatact 720

gacgctaaag cgcgaaagcg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgct 780

gtaaacgatg attactaggt gttgggggtc gaacctcagc gcccaagcaa acgcgataag 840

taatccgcct ggggagtacg tacgcaagta tgaaactcaa aggaattgac ggggacccgc 900

acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga cgcaacgcga ggaaccttac cagcgtttga 960

catcttagga atgagataga gatatttcag tatcccttcg gggaaaccta aagacaggtg 1020

gtgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080

acccctttcg tatgttacca tcattaagtt ggggactcat gcgatactgc ctacgatgag 1140

taggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatgcccct tatacgctgg gctacacacg 1200

tgctacaatg ggtagaacag agagttgcaa agccgtgagg tgaagctaat ctcagaaaac 1260

tattcttagt tcggattgta ctctgcaact cgagtacatg aagttggaat cgctagtaat 1320

cgcgaatcag caatgtcgcg gtgaatacgt tctcgggtct tgtacacacc gcccgtcaca 1380

ccacgagagt tggttgcacc tgaagtagca ggcctaaccg taaggaggga tgctccgagg 1440

gtgtgattag cgattggggt gaagtcgtaa caaggtatcc gtacgggaac gtgcggatgg 1500

atcacct 1507

<210> 2

<211> 999

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_1 [B2GL000155]

<400> 2

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attataactt acatttttca aatacaaggt tataattgga aaatagttaa aacagttcca 360

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gtaagtatat taaataatat ttacactaag aatacatag 999

<210> 3

<211> 876

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_2 [B2GL002076]

<400> 3

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cagttagatg taagaaattt tggtgaaatg ttgattgaca cagaaaatat attaaaaaaa 120

ataacaagtg ttactaagga aaattcttct ttagagttaa aaataattgc tataaaagaa 180

ggaagttttg agtttgattt acttgctata ttaggtacat tacctgaatt gtttcaaggt 240

attaccactg catacaattt aatagaagcc tttttagaat ggatatattt taaaaattgg 300

ttaaaaggag aagagataaa acaaatggtt aataatggaa ataatgttat tgttaataaa 360

gtagatggca gtaatcatac tattacaaat aatttaaatg tgaatatttt tggaagtgat 420

aaaaaagtag aagagataga taaattgttt gtagcacttg gaagttctat tccaattggt 480

agagatttaa cacttaaagc gaatgatgag gcacatactt atactgctaa aattaaagag 540

cacttagaaa ctcctattca aatcaagcct caagaagatg aaaaagtaga aaaaagcatt 600

gttacaagag aggtaataat taaaaaacca gatttagaaa tgaaatctaa gtggcaaatt 660

tatatacata ataaattgta tcatgttgat ataaatgatg aattttttaa agaatttgtt 720

atatctggaa gattttcagc acataatggt atgaaattaa gagtagattt agaagaagta 780

gttagatata atttacaaaa agaaacagtg gatatagact acactactat attaaaagtt 840

catcctacta ctgaaactaa tttagcattt ttttaa 876

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<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_3 [B2GL000152]

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tcaattttta cacaatatta ttatgcttta gtctggaaac ttttactaca agctgataag 420

aaatcatata tatcatcata tattcaaata tttattacta ttttactttt aatagtttca 480

tcttatttta tgtataagaa attggatatt atatttgtaa aattgattag tgcagtaata 540

ctaatattac agccattatt atatgtttat tttataaata aaagatatat aataaaaaaa 600

agtaaaaaga taaataataa tttattagct cagagatggg aaggatttgg aataaatgta 660

gcagctttta ttcataataa tacagatgtt gtgttaataa cattattttt aactttaaaa 720

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tctatatcaa ctgggttttc acctgtttta ggaggtttat atgcaaaaaa tagaaagaat 840

aaattaaata cttattttag tttgtatgaa tatgtaattt atttttttag ttttttattt 900

ttttctgtgg cttcagaaaa tattttctct tttatacaaa actatacaaa aggagtaaca 960

gatactgaat actatagacc aatttttgct tatttaatga tattgtcata tttgattttt 1020

tgtttaagag aaccatatat aaacatggca tattcaagtg gtgtttttaa acaagtaaca 1080

aaatttgcgt atatggaagc tataataaat ctaattctat ctttaatttg tttaaagtac 1140

tttggtttgt atggtgtagc aataggaaca ttaatttcaa ttctttatag aacattagca 1200

caagtatatt ttttgaaaaa gaatattctt tatagaaaat atagtttttt cttaagaaat 1260

atagctattt ttatattttc atggattatt agtcatcaaa tcattaattt gttaatttat 1320

gaagataata taaatacttg gttaaaatgg attatatatt caataaaaat atctattata 1380

gttttcattg tacaaatgct aatatcaata ttattttata taaaaaaatt aaaaaaactt 1440

aggttactat attggagtaa gttaagaaaa aaactaacta tgaaaagtaa ggaacttaga 1500

aaatttgaat aa 1512

<210> 5

<211> 924

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_4 [B2GL000950]

<400> 5

atgaaatcaa aaaaatcaaa tcaagaatat gattgtaatc aagatactat aaaagatata 60

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tttgttattg catataagtt aatatgtata gatttttcag aaatgcatat tgaattatct 180

tcattattat cttttgcagt agcttttttt gctatatggc tttctattct attttatttt 240

aaagctgatg aagcaagtaa aagattttac aatgatacat ataaatttat aaaagataca 300

tcgataatat taggtgaaat aaaggcaact tttggagaaa aatttaataa tgttgaaaga 360

tatatgttaa aatttgatgg tggctataaa aaagatgatg aaaaaaaaat tgaagaatta 420

gaaaatgaac taaataagat aagagaagat aaaaaaaata cagagaatga attagagaaa 480

tctaaaagag aactaaaaga tgcaatagaa aaaatatcta aggatgatag aaaaaaagaa 540

atgttaaaaa agtttgaggc tgtccaagaa cagattcaaa aattaaaaga aaaagatact 600

caaaaagatg aattagaaaa agagaaagaa agttatcaaa acgacaaaag gttatctagt 660

ctagcaataa gagatttctg tgaatattta aagaagatag ggatagggga tgagcttatt 720

catcttcctc atcaaattat gttggaaaat ttagaaaagt atcttaatag gtttatactt 780

acaaatagaa gtatgcgtct ttacttactg agaagaggaa tgtataatag tataaataga 840

agtatcctca ctgatgttgt aatagaaaat gcagatagga tattaaatat gtatagagat 900

atctatgata ttagcgaaaa ttaa 924

<210> 6

<211> 1158

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_5 [B2GL000156]

<400> 6

atgttaaaaa ataaaaatat atacaatttt atgattattt caatttgttt ttattgtttt 60

tgtgtttggg catcagcaca aaatccaaga atagaagatc aattttattt aaataataga 120

gagctgatag aaaaattaga tacagtaatt agacatacac tatatattat tttttttatg 180

ttttctaata tattactaat aaaaaaaaat aatatttttt tgtatgtaat tactatcatt 240

ttatttttgc aatttttaat aacaaaaaat actgatttaa ttacagtaat aataacattg 300

tttactttaa aagcactgat agaaaataca aagtatatta acaaaaagtt aataaaaaaa 360

ttttgttata tttatattgt tggagtaatt attcaattat cattatttaa atatttcggg 420

agaagagttt tatcactttt agatccaaat tggactgcat atttattatt tttatttttt 480

atactactgg ataaaataaa attatcattt ttaaagtggt tagttttatt tatgggtttt 540

ttaatgttaa gtagaaatta tgtcttagga gtagtgctat atttcttatt aaaaatacca 600

ataatattaa aaatttctag aaaagtttta aaaaaaattt ttagagataa cacaatagca 660

gtaagtttat tcatattttc tatgacaata tttattggat acttattctt aaaagtaagt 720

catcattctg attataatta tacagcttca agaattttaa ctataaatga tgattcaaat 780

tatttaagat ttgaacaata tttttctttt tttaaagctc taaaagaata tgatatttta 840

agaaattatg ggttaacaga tagtgaatat aaaaaaattg catacataaa aataaatcca 900

cataacccat tgttagtttt gataagaggt atgggaattt atataggatg tatagtttat 960

ttaagtacta ttcggttact ttttggaaaa aaaataacaa aatatataac tttcgccatt 1020

cctttattag tataccaaac ttttttttta gcgccatata tgggatttta tataatgtta 1080

gttggagtga ttgtaagttt tattaaatat gaaaatgaac tggaaaaaat tgaatttgaa 1140

aggttaaaaa atgtataa 1158

<210> 7

<211> 366

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_6 [B2GL002079]

<400> 7

atgcttaaaa taaaatcaaa aaaaataaat aatgaattag aaatttttaa aaaaggttta 60

gaaaaaattg aaatatttga tatgaaagca gaaaatgata tggaacattc atgtagatta 120

aagggaagtt atcaattatt agaatatgat gttgaaaatt atgaagtaga aggggattta 180

ttaaaacttt atacagttaa tggagacaaa gtaatattta aaggagggct taattatcca 240

aaaattttga tagatgaaga gaagttattg tattcatttg gtcgtttgag agaatatatt 300

caaaaaataa atgaaaaaat tgaattttat aaaaattatt atgaaacaat agaagaaaat 360

aaataa 366

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_1(B0155-F)

<400> 8

tcaacaataa gggctatatc tgtct 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_1(B0155-R）

<400> 9

cataaatgtg ttaaacctgg aactg 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_2(B2076-F）

<400> 10

gaaactccta ttcaaatcaa gcctc 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_2(B2076-R）

<400> 11

taccattatg tgctgaaaat cttcc 25

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_3(B0152-F）

<400> 12

aatgggctag ttctttcaat aacaca 26

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_3(B0152-R）

<400> 13

tatcagcttg tagtaaaagt ttccagac 28

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_4(B0950-F）

<400> 14

attcttgggc agttatagga atagg 25

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_4(B0950-R）

<400> 15

gtaaaatctt ttacttgctt catcagc 27

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_5(B0156-F）

<400> 16

gcacaaaatc caagaataga agatca 26

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_5(B0156-R）

<400> 17

aatatagcac tactcctaag acataatttc tac 33

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_6(B2079-F）

<400> 18

tgaaagcaga aaatgatatg gaaca 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> THCT6b3_specific_region_6(B2079-R）

<400> 19

tctctcaaac gaccaaatga ataca 25

<210> 20

<211> 1170

<212> DNA

<213> animalis_specific_region_1 [ortho2124]

<400> 20

atgctaagaa aatatttaaa atggataata cttataattg tattaatctt aggagtagtc 60

tactactctt tttttagaaa aaaagatgat ggagttaaat acttaacaga aacagtaaaa 120

aaaagtgata tttctcaaac aatagttgca tcagggacgg taagaagtaa tgacagagtt 180

gaggtaggtg cataggtttc aggtaaaatt acaaaaatta atgtagtttt agggcaagaa 240

gtaaaaaaag gagatttact tgcaacaata gattcattga cacaaaataa taatttagat 300

gaagctaaat caaagttaaa agtttatcaa gctcaaagaa aaagtgctag tgtaaaatat 360

caagtagctc aatcaaaatt taacagaatt tcaaaacttt accaaatgaa ctctatttca 420

caagatgatt atgaaactgc aaaagaagaa ttagaagttg caaaggcaag tgtaactgaa 480

tatgatgaat tgattgcaca agcatctata tctgtaaaga ctgctgaaac aaatttatca 540

tatacatcaa taacttcacc aatagatgga gttgtaatat ctattccagt atctgaggga 600

caaacagtaa atagtaatca atctgctcca acaatagtac aggttgctga tttatctaag 660

atgttaatta aggcagaggt tgcagagggc gatataacaa aagtcaaaaa gggaatggaa 720

gttgaggttg caacagttgc taatccagat aaaacataca aatcaactgt acaatcagta 780

gattatgcaa cttcaacatt gacagataat gaatacagtg agtcagtaag taatacttca 840

gcagtttatt attatgcaaa tattatttta gataataaag atggaaattt aagaatagga 900

atgacaacaa caaacactat tactataaat tcagttaaaa atgttttatc tgttcctgtg 960

gtagccgttc aaaaagtaaa tggtaaatca gtggtaaaag ttgtaaaaga taaagaaaaa 1020

aatataatag aagaaagaga agttacaact ggaatacaag atgggctttc aattgaaata 1080

aaaagtggtt tatcagaagg agaagaagtc gttgtaactc agttaaatgg aacagatggt 1140

ttggatagtc ttcctcaaag aagaatgtaa 1170

<210> 21

<211> 1173

<212> DNA

<213> animalis_specific_region_2 [ortho2140]

<400> 21

atgattttag aaaaaaaatt aattaacagt atagaaaaat ataaagaaga ggcttttgct 60

ttaaattatt atttggcaaa aaatcctgag atatctggaa aagaatataa ctcctgcaaa 120

aaaataatgg aaattttaaa taggcatcaa attgctacca aagaaaaatt ttcagatata 180

gatacctcat ttttaggtga agttataaaa aaagaaaact caaatataaa tattgcaata 240

ttgacagaat atgatgctct tcctgaagta gggcatgcct gtggacattc tgcaagtgca 300

gcaatatctg tactagcagc tcttgcactt aaagataatg aagaatatat aaatgcaaat 360

atagatatta ttggtacacc agatgaagaa gatattggta tgaaagttac tatggctgat 420

aaaggagttt ttgacaaata tgattgtgca attatggttc atctaggtat taaaaatatc 480

cctaactgga aaatgcttgc ctttgaaact tatgaaatag aatttactgg gtttcctgct 540

catacagctg ttgctccttg gtgtggaaga tcagcattag atggattgat gttatccatt 600

catgcttttg atttaatgag aaaatgcact aaacgaaata ctataataga aggatttata 660

caagaaggag gaagtgcaac aaatataata ccaaatagag ctaaagctaa atatactttt 720

agatcagatt ctttgaaata tttaaaagaa gaaataatac catggtttaa aaatataatt 780

gaaggttgct cacttgcaac tcaaacaaaa tctaaaatag aaatttttgg taattcattt 840

agtgatatga attatttaaa aagtgggact caaattatta tgaatgtgat gaaagattat 900

ggaatggaat atgaaactat ggactatcca gaaggttcat cagatatggg aaatgtaagt 960

tatagatgtc cagcatttca tccttcagta gcaataacaa ataaaaatat agctcttcat 1020

acaaaagagt ttgcagatat tgttgtatct gaaaaatccg aaccttgtat tataaatggt 1080

gcaactgtta ttgatgggtt cttagcaaga atacttgaaa attctgaaat attaaaatct 1140

ataaaacaag aattcttaaa gaataaaatt taa 1173

<210> 22

<211> 858

<212> DNA

<213> animalis_specific_region_3 [ortho2134]

<400> 22

atgacttata attttagata tagtaagttt ctacaaggtg gtattttaaa tattattttt 60

ttgggattac tttgtatggc aagtattggt atttctatgt taattttaaa attaattgga 120

attagtaata caaaagttag tatattttgg gataataatc caaatattgc actaatatta 180

gtccttttgt tacctctaat acttctagta ttatttataa tcactggctc tatattatat 240

agacaactta ttgacagcaa agggatactt aatatattta ataattgtgc tattcttcat 300

tataaaggaa aagaaataac attagaaaaa ggtgaatttt ctgtttctta tggtaaagta 360

cattttggta gaaatggaat tagtaatttt ctttatcctg ttgtttatgt gattaaaaca 420

aaaaatgaaa aatttaaaat atataaatct gttcaggagg cttatgaatt aacaactttt 480

aagcaaagaa tgaaaaaatt atgtcctgaa ctttctttgg atattgcaat gaatgctcta 540

attaaattgt caaatacaaa aaataaaaaa ataaaaaatg aaatctcata tattggcaat 600

atagaaattg ttttaaatat atcaacaatt gatgtatttg aaaatacaga ttactttgta 660

gatatagaaa atgctcttgt tcttaaggat gtaccattta ttacttgtga tatttatgaa 720

aataaaaact caaatcattt aattggtgag attgctctat tagatgacga aaaaaatggt 780

aaattaccaa gtgtagaaga attaaaaaag agagtaattg tttctgtgat aaaattagat 840

gaatatataa aaaaataa 858

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> animalis_specific_region_1(A2124-F)

<400> 23

aggaatgaca acaacaaaca ctattacta 29

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> animalis_specific_region_1(A2124-R）

<400> 24

ttttacaact ttyaccactg atttacc 27

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> animalis_specific_region_2(A2140-F）

<400> 25

actcaaatta ttatgaatgt gatgaaaga 29

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> animalis_specific_region_2(A2140-R）

<400> 26

actcaaatta ttatgaatgt gatgaaaga 29

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> animalis_specific_region_3(A2134-F）

<400> 27

tttctttatc ctgttgttta tgtgattaa 29

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> animalis_specific_region_3(A2134-R）

<400> 28

acaatttcta tattgccaat atatgagatt 30

Claims (2)

1.用于鉴定具核梭杆菌动物亚种（ Fusobacterium nucleatum subsp.animalis ） 菌株的特异性DNA分子，其特征在于，所述特异性DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:20～SEQID NO:22所示。

2.权利要求1所述的用于鉴定具核梭杆菌动物亚种菌株的特异性DNA分子的扩增引物，其特征在于，如SEQ ID NO:20所示DNA分子的扩增引物序列如SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:24所示；如SEQ ID NO:21所示DNA分子的扩增引物序列如SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:26所示；如SEQ ID NO:22所示DNA分子的扩增引物序列如SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:28所示。

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