CN109971822B - 一种菌群绝对定量方法及在中国白酒发酵过程中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种菌群绝对定量方法及在中国白酒发酵过程中的应用，属于生物领域和发酵工程领域。本发明首次构建一种基于天然内标计算微生物菌群绝对含量的方法。本发明所提供的天然内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的特异性引物可以在白酒发酵系统中检测和定量内标。进一步地，本发明针对内标的分布范围进行统计，结果显示内标广泛分布在清香型、酱香型、浓香型、豉香型、芝麻香型白酒发酵系统中。通过对内标的绝对定量，能够对不同香型的菌群含量进行计算，具有操作方便、应用范围广的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌群绝对定量方法及在中国白酒发酵过程中的应用，属于生物领域和发酵工程领域。
背景技术
中国白酒具有几千年的发展历史，是中国宝贵的文化财富。中国白酒属于固态多菌种混合发酵系统，其中细菌群落在发酵过程中扮演着重要的角色，如芽胞杆菌、乳酸菌、乳球菌等。细菌菌群绝对定量是研究菌群功能的基础，过去研究中使用高通量扩增子测序技术有效地揭示了白酒发酵过程中细菌群落的组成和结构，但是由于只能使用相对丰度来定量细菌群落，不能真实反应菌群在时间和空间上的动态变化特征，所以建立绝对定量细菌菌群方法是白酒微生物研究的方向。除了白酒以外，其他发酵物中也存在类似的问题。
最新的研究中，通过人为添加内标片段的方式，结合高通量扩增子测序技术构建细菌菌群绝对定量方法。这种方法是将原始体系不存在的菌种，或带有随机产生的16SrRNA片段或带有16S rRNA片段质粒作为内标，人为添加到原始体系中，通过计算内标在高通量测序结果中所占比例与所添加内标的绝对含量之间的对应关系，推算整个细菌菌群或某一特定分类的绝对含量。但是寻找原始体系中绝对不存在的菌种存在困难，较难实现；通过添加内标的方法不仅操作不便，而且会对原始的菌群结构测序结果产生干扰。
发明内容
本发明提出的采用天然内标方法对菌群定量的方法，能够有效解决背景技术中的至少一个问题。同时，本发明通过筛选系统中的天然内标，构建菌群绝对定量方法在白酒酿造体系具有重要的研究和使用价值，该技术方法为其它发酵食品体系中微生物菌群绝对定量提供借鉴。
本发明的采用天然内标方法对发酵物的菌群进行定量的方法，包括：
(1)获取两个以上发酵物样品中的菌群的种属情况，然后选择在该两个以上发酵物样品中都存在的菌种作为天然内标；
(2)对待测发酵物样本中的天然内标进行绝对定量；
(3)确定待测发酵物样本中，需要绝对定量的待测菌群与天然内标的相对含量；
(4)根据(1)和(2)，换算得到待测发酵物样本中待测菌群的绝对含量。
所述发酵物，可以是任意一种微生物种类在两种以上的发酵物。
所述发酵物，可以是食醋、酱油、奶酪、虾酱、泡菜、香肠、白酒发酵体系中的发酵物。
在一种实施方式中，所述(2)中，对待测样本中的内标进行绝对定量，可通过荧光定量PCR(qPCR)来实现。可选地，所述荧光定量PCR所用的引物为内标的特异性引物。
在一种实施方式中，所述(3)中，确定待测菌群与内标的相对含量，可以通过现有的扩增子测序来实现。可选地，扩增子测序结果中的相对含量是利用通用细菌测序引物基于任何测序平台测序所得。
在一种实施方式中，所述(4)中，换算可以是结合扩增子测序结果和荧光定量PCR结果来实现：计算方法为Ax＝Lg(10^(a*Ct+b)/Ri*Rx)，其中Ax代表待测样本的菌群中x分类单元的绝对含量，a代表内标的特异性引物所对应的荧光定量PCR标准曲线的斜率，Ct代表以待测样本DNA为模板对待测样本中内标进行qPCR检测的Ct值，b代表内标的特异性引物所对应标准曲线的截距，Ri代表内标OTU(Operational Taxonomic Units)在菌群中所占的总体比例，Rx代表x分类单元在菌群中所占的总体比例。所述x分类单元，可以是前面提及的总菌群、任意一个菌种、任意多个菌种等。
可选地，所述的荧光定量PCR结果中的Ct值是通过利用内标特异性引物基于任何荧光定量PCR仪检测所得。可选地，所述的内标特异性引物的标准曲线是通过带有目标片段的质粒与在其为模板的荧光定量PCR检测中Ct值之间的线性关系。
在长期致力于白酒发酵体系群落结构的研究中，发明人通过大量的数据和实验发现，在白酒发酵体系的群落中都至少存在Lactobacillus sp.或Lactobacillusacetotolerans中的其中一种，基于这个意外的发现，本发明实现了Lactobacillus sp.或Lactobacillus acetotolerans作为天然内标在白酒发酵体系中细菌菌群的绝对定量中的应用。
为了解决上述问题，本发明提供了白酒发酵系统中的天然内标及其应用方法，天然内标包括一种未培养微生物Lactobacillus sp.和Lactobacillus acetotolerans。并具体提供了天然内标绝对定量的方法，包括两对特异性引物以及具体应用。
本发明的第二个目的是提供一种白酒发酵体系中菌群含量的绝对定量方法，所述方法是利用Lactobacillus sp.和/或Lactobacillus acetotolerans作为内标来进行绝对定量。
当所有白酒发酵体系的待测样本中，都存在Lactobacillus sp.或Lactobacillusacetotolerans时，则用Lactobacillus sp.或Lactobacillus acetotolerans中的其中1个作为内标即可；当所有白酒发酵体系的待测样本中，部分没有Lactobacillus sp.时，该没有Lactobacillus sp.的待测样本使用Lactobacillus acetotolerans作为内标来进行绝对定量；当所有白酒发酵体系的待测样本中，部分没有Lactobacillus acetotolerans时，该没有Lactobacillus acetotolerans的待测样本使用Lactobacillus sp.作为内标来进行绝对定量。
在一种实施方式中，所述白酒发酵体系的待测样本，为白酒发酵酒醅。
在一种实施方式中，所述白酒，可以是如下任意一种或者多种：清香型白酒、酱香型白酒、浓香型白酒、豉香型白酒、芝麻香型白酒、复合香型白酒。
在一种实施方式中，所述待测样本中，需要绝对定量的待测菌群，包括如下任意一种或者多种：总菌群、任意一个菌种，或者任意多个菌种。
在一种实施方式中，所述白酒发酵体系中菌群，是指白酒发酵体系中的细菌菌群。
在一种实施方式中，所述绝对定量方法，包括：(1)对待测样本中的内标进行绝对定量；(2)确定待测样本中，需要绝对定量的待测菌群与内标的相对含量；(3)根据(1)和(2)，换算得到待测菌群的绝对含量。
在一种实施方式中，所述(1)中，对待测样本中的内标进行绝对定量，可通过荧光定量PCR(qPCR)来实现。
在一种实施方式中，所述荧光定量PCR所用的引物为内标的特异性引物。
在一种实施方式中，内标Lactobacillus acetotolerans的特异性引物是基于转录调控因子基因序列设计，基因序列NCBI登录号为WP_082137158.1；内标Lactobacillussp.的特异性引物是基于16s rRNA基因序列设计，基因序列GeneBank编号为KU674948.1。
在一种实施方式中，内标Lactobacillus acetotolerans的特异性引物为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2。
在一种实施方式中，内标Lactobacillus sp.的特异性引物为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4。
在一种实施方式中，所述(2)中，确定待测菌群与内标的相对含量，可以通过现有的扩增子测序来实现。
在一种实施方式中，扩增子测序结果中的相对含量是利用通用细菌测序引物基于任何测序平台测序所得。
在一种实施方式中，所述(3)中，换算可以是结合扩增子测序结果和荧光定量PCR结果来实现：计算方法为Ax＝Lg(10^(a*Ct+b)/Ri*Rx)，其中Ax代表待测样本的菌群中x分类单元的绝对含量，a代表内标的特异性引物所对应的荧光定量PCR标准曲线的斜率，Ct代表以待测样本DNA为模板对待测样本中内标进行qPCR检测的Ct值，b代表内标的特异性引物所对应标准曲线的截距，Ri代表内标OTU(Operational Taxonomic Units)在菌群中所占的总体比例，Rx代表x分类单元在菌群中所占的总体比例。
所述x分类单元，可以是前面提及的总菌群、任意一个菌种、任意多个菌种等。
本发明的一种实施方式中，所述的荧光定量PCR结果中的Ct值是通过利用内标特异性引物基于任何荧光定量PCR仪检测所得。
本发明的一种实施方式中，所述的内标特异性引物的标准曲线是通过带有目标片段的质粒与在其为模板的荧光定量PCR检测中Ct值之间的线性关系。
本发明的第三个目的在于提供能够用于白酒发酵体系中菌群含量的绝对定量天然内标的特异性引物；所述天然内标为Lactobacillus sp.和/或Lactobacillusacetotolerans；所述天然内标的特异性引物包括：根据NCBI登录号为WP_082137158.1的序列设计的适用于内标Lactobacillus acetotolerans的特异性引物，根据GeneBank编号为KU674948.1的序列设计的适用于内标Lactobacillus sp.的特异性引物。
在一种实施方式中，内标Lactobacillus acetotolerans的特异性引物为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2。该引物扩增产物长度为123bp，两段在DNAMAN中检测并不存在自我成环结构。
在一种实施方式中，内标Lactobacillus sp.的特异性引物为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4。该引物扩增产物长度455bp，两段在DNMAN中检测均不存在自我成环结构。
在本发明中，所述的白酒发酵体系包括清香型白酒、浓香型白酒、酱香型白酒、芝麻香型白酒、豉香型白酒、凤香型白酒、馥郁香型白酒、药香型白酒、特香型白酒、米香型白酒、兼香型白酒、老白干型白酒的发酵体系。
在一种实施方式中，清香型白酒发酵体系样本来自于青海省、河南省、山西省、湖北省、河北省。
在一种实施方式中，所示的酱香型白酒发酵体系样本来自于贵州省。
在一种实施方式中，所示的浓香型白酒发酵体系样本来自于河南省、山东省、安徽省、四川省。
在一种实施方式中，所示的豉香型白酒发酵体系样本来自于广东省。
在一种实施方式中，所示的馥郁香型白酒发酵体系样本来自河南省、安徽省。
在一种实施方式中，所示的芝麻香型白酒发酵体系样本来自山东省、江苏省。
本发明的第四个目的在于保护所述天然内标或者天然内标的特异性引物在白酒发酵系统中的菌群绝对定量中的应用。
在一种实施方式中，所述的应用涉及清香型白酒发酵系统、浓香型白酒发酵系统、芝麻香型发酵系统。
在一种实施方式中，清香型白酒发酵系统样本来自山西省。
在一种实施方式中，浓香型白酒发酵系统样本来自贵州省。
在一种实施方式中，芝麻香型白酒发酵系统样本来自于山东省。
本发明的有益效果：
本发明首次构建一种基于天然内标计算微生物菌群绝对含量的方法，为发酵食品体系中微生物菌群绝对定量提供借鉴。
本发明所提供的天然内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.是中国白酒体系天然内标，克服了现有外源添加内标的方法所存在的操作不便、会对原始的菌群结构研究产生干扰的缺陷，对于菌群绝对定量方法具有重要意义。
本发明所提供的天然内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的特异性引物可以在白酒发酵系统中检测和定量内标。进一步地，本发明针对内标的分布范围进行统计，结果显示内标广泛分布在清香型、酱香型、浓香型、豉香型、芝麻香型白酒发酵系统中。通过对内标的绝对定量，能够对不同香型的菌群含量进行计算，具有操作方便、应用范围广的特点。
附图说明
图1：Lactobacillus acetotolerans引物的特异性验证。
图2：Lactobacillus sp.引物的特异性验证。
图3：Lactobacillus acetotolerans引物的标准曲线。
图4：Lactobacillus sp.引物的标准曲线。
图5：清香型白酒发酵系统内标的分布特征，N.S代表未检测到目标菌。
图6：酱香型白酒发酵系统内标的分布特征。
图7：浓香型白酒发酵系统内标的分布特征。
图8：豉香型白酒发酵系统内标的分布特征，N.S代表未检测到目标菌。
图9：馥郁香型白酒发酵系统内标的分布特征。
图10：芝麻香型白酒发酵系统内标的分布特征。
图11：白酒发酵系统细菌总菌群含量的计算方法。
具体实施方式：
以下将结合附图对本发明进行说明。
实施例1：Lactobacillus acetotolerans特异性引物的设计
(1)使用美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的Blast功能从Lactobacillus acetotolerans全基因组(AP014808.1)中手动筛选出特异性基因WP_082137158.1(NCBI登录号)，功能注释为转录调控因子。比对结果仅有Lactobacillus acetotolerans(AP014808.1)的基因组序列具有100％的相似度，表明转录调控因子的核苷酸序列是Lactobacillus acetotolerans的高度特异性序列。
(2)利用Batchprimer在线软件设计特异性引物，参数设定为：引物长度18-27bp，最优20bp；退火温度57-62℃，最优60℃；GC含量40-60％，最优50％；引物对之间的温度差设定为小于5℃；扩增产物100-300bp，最优150bp。
(3)从所获得的对引物对中，利用DNAMAN软件挑选不能够自身成环(self-
complementarity)序列号为SEQ ID NO.1的上游引物GCGAGTTGAATCTGCCAGGA和序列号为SEQ ID NO.2下游AGCCAGCTAATTCCGCCAAT作为可能性目的引物对，PCR产物长度123bp，Tm为60℃。
(4)所获得的引物对在NCBI中进行primer-blast特异性检验，比对数据库选择Nr数据库，比对结果只与Lactobacillus acetotolerans具有100％相似度，这表明所设计的引物可以区分任何微生物，具备特异性。
实施例2：Lactobacillus sp.特异性引物的设计
(1)由于Lactobacillus sp.是一种未培养微生物，所以特异性引物设计选取仅有的16S rRNA差异区序列(GenBank：KU674948.1)，差异序列通过比对以下序列所得：1)根据Blast比对结果(相似度如菌种名字后面括号所示)，选择相似度高的菌株的16S rRNA序列：Lactobacillus caviae(90％),Lactobacillusfructivorans(90％)，Lactobacillushomohiochii(90％)，Lactobacillus ixorae(89％)，Lactobacillus reuteri(89％)，Lactobacillus vespulae(89％)，Lactobacillus ozensis(88％)；2)白酒酿造体系中出现频率较高的Lactobacillus brevis(88％)，Lactobacillus acetotolerans(87％)。16SrRNA核酸序列差异区的筛选通过利用DNAMAN生物信息学软件与其他乳杆菌的16S rRNA比对完成。
(2)利用差异区域设计候选引物，利用DNAMAN软件挑选不能够自身成环(self-
complementarity)序列号为SEQ ID NO.3的上游引物CGCACTCCCGTAGATGATTTTGA和序列号为SEQ ID NO.4下游引物TCACTACCAAGCCATTTCCTAC作为可能性目的引物对，PCR产物长度439bp，Tm为60℃。
(5)所获得的引物对在NCBI中进行primer-blast特异性检验，比对数据库选择Nr数据库，比对结果只与Lactobacillus sp.具有100％相似度，这表明所设计的引物可以区分任何微生物，具备特异性。
实施例3：Lactobacillus acetotolerans特异性引物验证
(1)选择一株目的Lactobacillus acetotolerans进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillusbuchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus brevis,Lactobacilluscrustorum,Lactobacillusplantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillusacidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcuspentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus reuteri,Lactobacilluspanis,Lactobacillusfermentum,Lactobacillusjohnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissellaviridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostocpseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcusfaecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillustequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacterpasteurianus,Enterococcusfaecium，空白对照为无菌水。
(2)以上所有微生物使用培养基MRS培养基筛选培养，MRS培养基配方为：培养基的配制：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏8.0g/L、酵母提取物4.0g/L、葡萄糖18.0g/L、无水山梨醇油酸酯0.8mL/L、K2HPO42.5g/L、三水合乙酸钠6.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、MgSO4·7H2O0.3g/L、MnSO4·4H2O 0.08g/L、琼脂20.0g/L调节pH为6.8±0.3，添加1000mL蒸馏水配制成主溶液，121℃灭菌15min；筛选培养条件为30℃，厌氧培养48h。
(3)37种微生物纯培养物分别使用基因抽提试剂盒DNeasy Tissue Kit(QiagenSciences,Valencia,CA)提取单菌基因组。阴性对照实验中36个微生物的基因组混合方式为1:1等质量混合，每份取100ng。
(4)选取特异性基因WP_082137158.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示)。
(5)qPCR反应体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA100ng(无空白组添加2μL无菌水)，无菌水补齐20μL。
(6)qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(7)结果如图1所示，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus acetotolerans作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lacetobacillus acetotolernas的特异性。
实施例4：Lactobacillus sp.特异性引物验证
(1)选择已知存在目标菌株的芝麻香型白酒发酵出池样本进行qPCR验证，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的37个微生物：Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus buchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillusplantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcusacidilactici,Pediococcuspentosaceus,Lactobacillus brevis；Lactobacillusmurinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus reuteri,Lactobacilluspanis,Lactobacillusfermentum,Lactobacillusjohnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissellaparamesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostocpseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcusfaecalis,Bacilluscoagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacterpasteurianus,Enterococcusfaecium,空白对照为无菌水。
(2)以上所有微生物使用培养基MRS培养基筛选培养，MRS培养基配方为：培养基的配制：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏8.0g/L、酵母提取物4.0g/L、葡萄糖18.0g/L、无水山梨醇油酸酯0.8mL/L、K2HPO42.5g/L、三水合乙酸钠6.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、MgSO4·7H2O0.3g/L、MnSO4·4H2O 0.08g/L、琼脂20.0g/L调节pH为6.8±0.3，添加1000mL蒸馏水配制成主溶液，121℃灭菌15min；筛选培养条件为30℃，厌氧培养48h。
(3)37种微生物纯培养物分别使用基因抽提试剂盒DNeasy Tissue Kit(QiagenSciences,Valencia,CA)提取单菌基因组。阴性对照实验中36个微生物的基因组混合方式为1:1等质量混合，每份取100ng。
(4)选取特异性基因KU674948.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示)。
(5)qPCR反应体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA100ng(无空白组添加2μL无菌水)，无菌水补齐20μL。
(6)qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃ 5s，55℃ 30s,72℃ 30s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(7)结果如图2所示，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以已知存在目标菌株的芝麻香型白酒发酵出池样本DNA作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰,通过测序序列NCBI数据库比对结果显示为目标微生物。证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus sp.的特异性。
实施例5：内标Lactobacillus acetotolerans的定量方法
(1)质粒构建：利用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以Lactobacillusacetotolerans的DNA为模板进行目标片段的扩增，扩增片段结果取0.5mLPCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果。目标片段经胶回收后与pMD19-T载体连接，转化到感受态大肠杆菌DH5α中，通过蓝白斑筛选挑取白斑菌落，接种到LB培养基中过夜培养。利用质粒抽提试剂盒抽提质粒，并使用引物扩增测序验证是否转化成功。成功构建的质粒作为标准品，使用蛋白核酸定量仪测定质粒浓度，并计算标准品质粒的拷贝数。
(2)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。
(3)qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(4)使用Lactobacillus acetotolerans特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
(5)通过10倍梯度稀释标准品质粒，建立Ct值与目标片段拷贝数之间的标准曲线，如图3，R2>0.99。
实施例6：内标Lactobacillus sp.的定量方法
(1)质粒构建：利用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以存在目标菌株的芝麻香型白酒发酵出池样本的DNA为模板进行目标片段的扩增，扩增片段结果取0.5mLPCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果。目标片段经胶回收后与pMD19-T载体连接，转化到感受态大肠杆菌DH5α中，通过蓝白斑筛选挑取白斑菌落，接种到LB培养基中过夜培养。利用质粒抽提试剂盒抽提质粒，并使用引物扩增测序验证是否转化成功。成功构建的质粒作为标准品，使用蛋白核酸定量仪测定质粒浓度，并计算标准品质粒的拷贝数。
(2)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。
(3)qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃ 5s，55℃ 30s，72℃ 30s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(4)使用Lactobacillus sp.特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
(5)通过10倍梯度稀释标准品质粒，建立Ct值与目标片段拷贝数之间的标准曲线，如图4，R2>0.99。
实施例7：清香型白酒发酵系统内标的分布特征
(1)清香型白酒发酵系统选择来自于山西省、河南省、河北省、湖北省、青海省的样本。
(2)提取白酒酒醅样本的宏基因组DNA，提取方法：称取8g酒醅于50mL离心管中，加入15mLPBS缓冲液，涡旋振荡5min，300×g离心，取上清。上清菌液采用试剂盒E.Z.N.A.
soil DNAKit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)进行抽提。
(3)qPCR体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng，无菌水补齐20μL。
(4)内标Lactobacillus acetotolerans的定量qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃；内标Lactobacillus sp.的定量qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃5s，55℃30s，72℃ 30s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(5)内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的含量根据所得的Ct值和各自的标准曲线计算所得，结果如图5所示，具体为：Lactobacillus acetotolerans在山西省、河南省、河北省、湖北省、青海省的样本中的含量为6.62±0.18Lg(copies/g)、5.51±0.69Lg(copies/g)、5.37±0.45Lg(copies/g)、6.31±0.39Lg(copies/g)、7.19±0.29Lg(copies/g)，Lactobacillus sp.在山西省、河南省、河北省、湖北省、青海省的样本中的含量为0Lg(copies/g)、5.99±0.41Lg(copies/g)、5.35±0.41Lg(copies/g)、3.74±0.31Lg(copies/g)、5.61±0.30Lg(copies/g)。
实施例8：酱香型白酒发酵系统内标的分布特征
(1)酱香型白酒发酵系统选择来自于贵州省的样本。
(2)提取白酒酒醅样本的宏基因组DNA，提取方法：称取8g酒醅于50mL离心管中，加入15mLPBS缓冲液，涡旋振荡5min，300×g离心，取上清。上清菌液采用试剂盒E.Z.N.A.
soil DNAKit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)进行抽提。
(3)qPCR体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng，无菌水补齐20μL。
(4)内标Lactobacillus acetotolerans的定量qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃；内标Lactobacillus sp.的定量qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃ 5s，55℃30s，72℃ 30s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(5)内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的含量根据所得的Ct值和各自的标准曲线计算所得，结果如图6所示，分别为6.19±0.17Lg(copies/g)和7.28±0.05Lg(copies/g)。
实施例9：浓香型白酒发酵系统内标的分布特征
(1)浓香型白酒发酵系统选择来自于河南省、安徽省、山东省、四川省的样本。
(2)提取白酒酒醅样本的宏基因组DNA，提取方法：称取8g酒醅于50mL离心管中，加入15mLPBS缓冲液，涡旋振荡5min，300×g离心，取上清。上清菌液采用试剂盒E.Z.N.A.
soil DNAKit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)进行抽提。
(3)qPCR体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng，无菌水补齐20μL。
(4)内标Lactobacillus acetotolerans的定量qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃；内标Lactobacillus sp.的定量qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃5s，55℃30s，72℃ 30s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(5)内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的含量根据所得的Ct值和各自的标准曲线计算所得，结果如图7所示。具体为Lactobacillus acetotolerans在河南省、安徽省、山东省和四川省的样本中的含量为3.25±0.14Lg(copies/g)、3.10±0.46Lg(copies/g)、6.16±0.69Lg(copies/g)和5.53±0.15Lg(copies/g)；Lactobacillussp在河南省、安徽省、山东省和四川省的样本中的含量为6.52±0.51Lg(copies/g)、6.18±0.29Lg(copies/g)、6.15±0.06Lg(copies/g)和5.45±0.22Lg(copies/g)。
实施例10：豉香型白酒发酵系统内标的分布特征
(1)豉香型白酒发酵系统选择来自于广东省的样本。
(2)提取白酒酒醅样本的宏基因组DNA，提取方法：称取8g酒醅于50mL离心管中，加入15mLPBS缓冲液，涡旋振荡5min，300×g离心，取上清。上清菌液采用试剂盒E.Z.N.A.
soil DNAKit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)进行抽提。
(3)qPCR体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng，无菌水补齐20μL。
(4)内标Lactobacillus acetotolerans的定量qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃；内标Lactobacillus sp.的定量qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃5s，55℃30s，72℃ 30s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(5)内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的含量根据所得的Ct值和各自的标准曲线计算所得，结果如图8所示，具体为Lactobacillus acetotolerans的含量为3.92±0.15Lg(copies/g)，Lactobacillus sp的含量为0Lg(copies/g)。
实施例11：馥郁香型白酒发酵系统内标的分布特征
(1)馥郁香型白酒发酵系统选择来自于安徽省、河南省的样本。
(2)提取白酒酒醅样本的宏基因组DNA，提取方法：称取8g酒醅于50mL离心管中，加入15mLPBS缓冲液，涡旋振荡5min，300×g离心，取上清。上清菌液采用试剂盒E.Z.N.A.
soil DNAKit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)进行抽提。
(3)qPCR体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng，无菌水补齐20μL。
(4)内标Lactobacillus acetotolerans的定量qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃；内标Lactobacillus sp.的定量qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃5s，55℃30s，72℃ 30s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(5)内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的含量根据所得的Ct值和各自的标准曲线计算所得，结果如图9所示。具体为Lactobacillus acetotolerans在安徽省和河南省样本中的含量为6.16±0.14Lg(copies/g)和5.98±0.17Lg(copies/g)；Lactobacillus sp.在安徽省和河南省样本中的含量为2.73±0.25Lg(copies/g)和5.58±0.17Lg(copies/g)。
实施例12：芝麻香型白酒发酵系统内标的分布特征
(1)芝麻香型白酒发酵系统选择来自于山东省、江苏省的样本。
(2)提取白酒酒醅样本的宏基因组DNA，提取方法：称取8g酒醅于50mL离心管中，加入15mLPBS缓冲液，涡旋振荡5min，300×g离心，取上清。上清菌液采用试剂盒E.Z.N.A.
soil DNAKit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)进行抽提。
(3)qPCR体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng，无菌水补齐20μL。
(4)内标Lactobacillus acetotolerans的定量qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃；内标Lactobacillus sp.的定量qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃5s，55℃30s，72℃ 30s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(5)内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的含量根据所得的Ct值和各自的标准曲线计算所得，结果如图10所示。具体为Lactobacillus acetotolerans的含量在山东省和江苏省样本中的含量为6.19±0.04Lg(copies/g)和7.28±0.05Lg(copies/g)；Lactobacillus sp的含量在山东省和江苏省样本中的含量为7.04±0.03Lg(copies/g)和1.31±0.415Lg(copies/g)。
实施例13：测定芝麻香型白酒发酵系统中细菌菌群含量
测定来自山东省的白酒发酵系统发酵结束出池的样本中细菌的总菌群含量。
一、测定样本中内标的绝对含量：
参考实施例12的方法来测定，具体如下：
(1)提取白酒酒醅样本的宏基因组DNA，提取方法：称取8g酒醅于50mL离心管中，加入15mLPBS缓冲液，涡旋振荡5min，300×g离心，取上清。上清菌液采用试剂盒E.Z.N.A.
soil DNAKit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)进行抽提。
(2)qPCR体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng，无菌水补齐20μL。
(3)内标Lactobacillus acetotolerans的定量qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃；内标Lactobacillus sp.的定量qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃5s，55℃30s，72℃ 30s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(4)内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的含量根据所得的Ct值和各自的标准曲线计算所得，内标Lactobacillus acetotolerans的含量为6.19Lg(copies/g)，
Lactobacillussp的含量为7.04Lg(copies/g)。
二、扩增子测序确定样本中内标与其他菌群的相对含量
扩增子测序可委托测序公司来实现即可，例如上海美吉生物医药科技有限公司、北京奥维森基因科技有限公司、北京诺禾致源生物信息科技有限公司等。本实施例中，扩增子测序服务是通过委托北京奥维森基因科技有限公司完成，具体操作如下：
利用通过的16S rRNA片段V3-V4区通用引物扩增样本DNA，各微生物的reads数通过Illumina HiSeq测序平台统计所得。扩增体系为25μL：DNA样本30ng，上游引物(GTACTCCTACGGGAGGCAGCA)和下游引物(GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT)各5μM，BSA3μL，2xTaqPCRMaterMix 12.5μL。扩增反应条件为95℃5min，95℃45s，50℃45s，72℃10min，反应循环数为25Cycle。测序结果显示内标Lactobacillus acetotolerans在总细菌菌群中的相对含量为11.1％；Lactobacillus sp.在总细菌菌群中的相对含量为78.9％。
三、计算样本中细菌总菌群含量
根据内标Lactobacillus sp.的绝对含量，以及内标Lactobacillus sp.与其他菌群的相对含量，来计算总菌群含量，如图11所示，具体是：Lg((10^AI*RX)/RI)＝Lg((10^7.04*100％)/78.9％)＝7.14Lg(copies/g)，其中RI：内标的相对含量；RX：菌群总的相对含量；AI：内标的绝对含量；AX：菌群的绝对含量。
同上方法，根据内标Lactobacillus acetotolerans的绝对含量所计算菌群的含量为7.14Lg(copies/g)。
实施例14：测定清香香型白酒发酵系统中细菌菌群含量
测定来自山西省的白酒发酵系统发酵结束出池的样本中细菌的总菌群含量。
一、测定样本中内标的绝对含量：
参考实施例7的方法来测定，具体如下：
(1)提取白酒酒醅样本的宏基因组DNA，提取方法：称取8g酒醅于50mL离心管中，加入15mLPBS缓冲液，涡旋振荡5min，300×g离心，取上清。上清菌液采用试剂盒E.Z.N.A.
soil DNAKit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)进行抽提。
(2)qPCR体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng，无菌水补齐20μL。
(3)内标Lactobacillus acetotolerans的定量qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃；内标Lactobacillus sp.的定量qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃5s，55℃30s，72℃ 30s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(4)内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的含量根据所得的Ct值和各自的标准曲线计算所得，内标Lactobacillus acetotolerans的含量为6.62Lg(copies/g)，Lactobacillussp的含量为0Lg(copies/g)。
二、扩增子测序确定样本中内标与其他菌群的相对含量
同实施例13中的方法来测定，结果显示内标Lactobacillus acetotolerans在总细菌菌群中的相对含量为82.2％。
三、计算样本中总菌群含量
计算方法同实施例13，计算样本中菌群绝对含量为6.67Lg(copies/g)。
实施例15：测定浓香香型白酒发酵系统中细菌菌群含量
测定来自河南省的白酒发酵系统发酵结束出池的样本中细菌的总菌群含量。
一、测定样本中内标的绝对含量：
参考实施例9的方法来测定，具体如下：
(1)提取白酒酒醅样本的宏基因组DNA，提取方法：称取8g酒醅于50mL离心管中，加入15mLPBS缓冲液，涡旋振荡5min，300×g离心，取上清。上清菌液采用试剂盒E.Z.N.A.
soil DNAKit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)进行抽提。
(2)qPCR体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng，无菌水补齐20μL。
(3)内标Lactobacillus acetotolerans的定量qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃；内标Lactobacillus sp.的定量qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃5s，55℃30s，72℃ 30s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(4)内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的含量根据所得的Ct值和各自的标准曲线计算所得，内标Lactobacillus acetotolerans的含量为3.25Lg(copies/g)，Lactobacillussp的含量为6.52Lg(copies/g)。
二、扩增子测序确定样本中内标与其他菌群的相对含量
同实施例13中的方法来测定，结果显示内标Lactobacillus acetotolerans在总细菌菌群中的相对含量为70.0％，内标Lactobacillus sp.在总细菌菌群中的相对含量为0.04％。
三、计算样本中总菌群含量
计算方法同实施例13，基于内标Lactobacillus acetotolerans计算样本中菌群绝对含量为6.68Lg(copies/g)；基于Lactobacillus sp.计算样本中菌群绝对含量为6.68Lg(copies/g)。
实施例16：测定酱香香型白酒发酵系统中细菌菌群含量
测定来自贵州省的白酒发酵系统发酵结束出池的样本中细菌的总菌群含量。
一、测定样本中内标的绝对含量：
参考实施例8的方法来测定，具体如下：
(1)提取白酒酒醅样本的宏基因组DNA，提取方法：称取8g酒醅于50mL离心管中，加入15mLPBS缓冲液，涡旋振荡5min，300×g离心，取上清。上清菌液采用试剂盒E.Z.N.A.
soil DNAKit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)进行抽提。
(2)qPCR体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng，无菌水补齐20μL。
(3)内标Lactobacillus acetotolerans的定量qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃ 5s，60℃ 20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃；内标Lactobacillus sp.的定量qPCR的反应程序：预变性95℃ 5min，循环阶段：95℃5s，55℃30s，72℃ 30s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。
(4)内标Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus sp.的含量根据所得的Ct值和各自的标准曲线计算所得，内标Lactobacillus acetotolerans的含量为6.19Lg(copies/g)，Lactobacillussp的含量为7.28Lg(copies/g)。
二、扩增子测序确定样本中内标与其他菌群的相对含量
具体操作方法同实施例13，测序结果显示内标Lactobacillus acetotolerans在总细菌菌群中的相对含量为1.9％；Lactobacillus sp.在总细菌菌群中的相对含量为93.1％。
三、计算样本中总菌群含量
计算方法同实施例13，具体为：以Lactobacillus acetotolerans为内标，计算样本中菌群绝对含量为7.31Lg(copies/g)；以Lactobacillus sp.为内标，计算样本中菌群绝对含量为7.31Lg(copies/g)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种菌群绝对定量方法及在中国白酒发酵过程中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcgagttgaa tctgccagga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agccagctaa ttccgccaat 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcactcccg tagatgattt tga 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcactaccaa gccatttcct ac 22
Claims (11)
1.一种白酒发酵体系中菌群含量的绝对定量方法，其特征在于，所述方法是利用Lactobacillus sp.和/或Lactobacillus acetotolerans作为内标来进行绝对定量；当所有白酒发酵体系的待测样本中，都存在Lactobacillus sp.或Lactobacillus acetotolerans时，则用Lactobacillus sp.或Lactobacillus acetotolerans中的其中1个作为内标即可；当所有白酒发酵体系的待测样本中，部分没有Lactobacillus sp.时，该没有Lactobacillus sp.的待测样本使用Lactobacillus acetotolerans作为内标来进行绝对定量；当所有白酒发酵体系的待测样本中，部分没有Lactobacillus acetotolerans时，该没有Lactobacillus acetotolerans的待测样本使用Lactobacillus sp.作为内标来进行绝对定量；
所述白酒是如下任意一种或者多种：清香型白酒、浓香型白酒、酱香型白酒、芝麻香型白酒、豉香型白酒、馥郁香型白酒；
所述绝对定量方法，包括：（1）对待测样本中的内标进行绝对定量；（2）确定待测样本中，需要绝对定量的待测菌群与内标的相对含量；（3）根据（1）和（2），换算得到待测菌群的绝对含量；内标Lactobacillus acetotolerans的特异性引物为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2；内标Lactobacillus sp.的特异性引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白酒发酵体系的待测样本，为白酒发酵酒醅。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本中，需要绝对定量的待测菌群，包括如下任意一种或者多种：总菌群、任意一个菌种，或者任意多个菌种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述（1）中，对待测样本中的内标进行绝对定量是通过荧光定量PCR来实现。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白酒发酵体系的待测样本，为白酒发酵酒醅；所述（1）中，对待测样本中的内标进行绝对定量是通过荧光定量PCR来实现。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本中，需要绝对定量的待测菌群，包括如下任意一种或者多种：总菌群、任意一个菌种，或者任意多个菌种；所述（1）中，对待测样本中的内标进行绝对定量是通过荧光定量PCR来实现。
7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR所用的引物为内标的特异性引物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，内标Lactobacillus acetotolerans的特异性引物是基于转录调控因子基因序列设计，基因序列NCBI登录号为WP_082137158.1；内标Lactobacillus sp.的特异性引物是基于16s rRNA基因序列设计，基因序列GeneBank编号为KU674948.1。
9.天然内标或者天然内标的特异性引物在白酒发酵系统中的菌群绝对定量中的应用，其特征在于，所述天然内标为Lactobacillus sp.；所述白酒是如下任意一种或者多种：清香型白酒、浓香型白酒、酱香型白酒、芝麻香型白酒、豉香型白酒、馥郁香型白酒；
内标Lactobacillus sp.的特异性引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
10.天然内标或者天然内标的特异性引物在白酒发酵系统中的菌群绝对定量中的应用，其特征在于，所述天然内标为Lactobacillus acetotolerans；所述白酒是如下任意一种或者多种：清香型白酒、浓香型白酒、酱香型白酒、芝麻香型白酒、豉香型白酒、馥郁香型白酒；
内标Lactobacillus acetotolerans的特异性引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
11.天然内标或者天然内标的特异性引物在白酒发酵系统中的菌群绝对定量中的应用，其特征在于，所述天然内标为Lactobacillus sp.和Lactobacillus acetotolerans；所述白酒是如下任意一种或者多种：清香型白酒、浓香型白酒、酱香型白酒、芝麻香型白酒、豉香型白酒、馥郁香型白酒；
内标Lactobacillus acetotolerans的特异性引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
内标Lactobacillus sp.的特异性引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
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|---|---|---|---|
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| 芝麻香型白酒发酵过程中乳酸菌多样性及其演替规律;邢敏钰等;《微生物学通报》;20180120;第45卷(第1期);7-8 * |
| 邢敏钰等.芝麻香型白酒发酵过程中乳酸菌多样性及其演替规律.《微生物学通报》.2018,第45卷(第1期),19-28页. * |
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